KR20070015537A

KR20070015537A - 엡티피바타이드 및 관련 중간체 화합물의 제조 방법

Info

Publication number: KR20070015537A
Application number: KR1020067020842A
Authority: KR
Inventors: 구오지 호; 앙투아네트 디. 파온; 루시아노 포르니; 캐터린 데톨레나에레; 브라이스 보네트
Original assignee: 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드
Priority date: 2004-04-08
Filing date: 2005-04-08
Publication date: 2007-02-05
Also published as: WO2005100381A3; ES2328713T3; JP4926942B2; SI1735345T1; US20100105609A1; SI2204383T1; DK2204383T3; EP1735345B1; CN1972960B; CA2562157C; US7674768B2; DE602005014956D1; CY1109357T1; ATE433997T1; CA2562157A1; DK1735345T3; RS51929B; CY1111904T1; JP2012111756A; EP2204383B1

Abstract

본 발명은 2-6 엡티피바타이드 단편을 활성화된 시스테인아미드 잔기에 커플링시켜 2-7 엡티피바타이드 단편을 형성시키는 단계, 메르캅토프로피온산 잔기를 2-7 엡티바타이드 단편에 디술피드 결합 형성을 통해 부착시키는 단계, 펩티드를 분자 내에서 커플링시키는 단계, 및 보호기를 제거하여 엡티피바타이드를 형성시키는 단계가 수반되는 엡티피바타이드의 수렴성 제조 방법을 특히 제공한다. 본 발명은 기술된 방법에 의해 제조된 생성물, 엡티피바타이드의 제조를 위한 합성 중간체로서 사용될 수 있는 신규 화합물, 및 엡티피바타이드와 구조적으로 유사한 신규 화합물을 또한 제공한다.

엡티피바타이드, 엡티피바타이드의 수렴성 제조 방법, 엡티피바타이드 제조용 합성 중간체, 엡티피바타이드의 정제 방법

Description

엡티피바타이드 및 관련 중간체 화합물의 제조 방법{PROCESSES FOR PREPARING EPTIFIBATIDE AND PERTINENT INTERMEDIATE COMPOUNDS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2004년 4월 8일 출원된 미국 특허 가출원번호 제60/560,453호를 우선권으로 청구하며, 상기 출원은 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함된다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 심혈관 질환의 치료에 사용되는 약물인 엡티피바타이드의 신규 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 엡티피바타이드에 대한 합성 중간체로서 사용될 수 있는 화합물, 엡티피바타이드와 구조적으로 유사한 화합물, 및 엡티피바타이드의 정제 방법에 관한 것이다.

엡티피바타이드는 혈소판 당단백질 IIb/IIIa의 고도로 특이적인 고리형 헵타펩티드 길항제이다. 이는 불안정 협심증의 치료를 위한 경피 관상동맥 중재술 동안 및 급성 심근 경색 치료용 혈전용해제에 대한 보조약으로서 사용되는 단기 작용 비경구 항혈전제이다. 예를 들어, [Phillips et al., Journal of Biological Chemistry (1993), 268(2), 1066-73]; 및 [Scarborough, American Heart Journal (1999), 138(6, Pt. 1), 1093-1104] 참조. 엡티피바타이드는 미국에서 매년 백만 명 이상의 사람들이 후보자인 시술인 풍선 혈관성형술을 받는 환자에게 또한 투여된다.

엡티피바타이드는 혈소판 응집을 저해함으로써, 특히 혈소판 수용체 GP IIb-IIIa를 차단함으로써 작용하는 것으로 여겨진다. 혈소판의 응집은 심장으로의 혈액 공급을 폐쇄하여, 불안정 협심증 및 가능하게는 심근 경색 (심장 마비)을 야기할 수 있다. 엡티피바타이드의 효과는 혈소판에 특이적이어서, 다른 정상 심혈관 프로세스에 대한 간섭이 방지되고, 엡티피바타이드 사용이 중지되면 효과가 역전될 수 있다.

엡티피바타이드는 미국에서 등록상표 INTEGRILIN®로 판매되고, 의학적으로 살아가는 환자 및 경피 관상동맥 중재술 ("PCI(percutaneous coronary intervention)")을 받은 환자들을 포함하여 급성 관상동맥 증후군 (불안정 협심증 및 비-Q파 MI(non-Q-wave myocardinal infarction)) 환자를 치료하는데 사용된다. 또한 엡티피바타이드는 관상동맥내 스텐트삽입이 수반되는 시술이 포함되는 경피 관상동맥 중재술에서 사용이 지시된다.

엡티피바타이드에 대한 많은 보고된 합성 접근법에서는, 예를 들어, 미국 특허 제5,318,899호; 제5,686,570호 및 제5,747,447호에 기술된 바와 같이, 공지된 고체-상 펩티드 합성 기술이 사용되어 왔다. 상업 규모의 액체 상 공정 또한 [1999 IBC Conference on Peptide Technologies, "Peptisyntha's Method of Producing GMP Peptides on an Industrial Scale"]에서 보고되었다. 상업적인 공정은 Mpa-Har-Gly 및 Asp-Trp-Pro의 두 단편을 개별적으로 제조하는 것이 수반되는 수렴성 합성이다. 이러한 두 단편을 커플링시키면 엡티피바타이드에 필요한 7개의 잔기 중 6개가 제공된다. 부착되는 마지막 잔기는, 예를 들어, 미국 특허 제5,506,362호에 기술된 바와 같은 S-트리틸-보호된 시스테인아미드이다. S-트리틸 보호기 (시스테인아미드 및 메트캅토프로피오닐 잔기 상에 존재)의 제거 후, 디술피드 결합 형성에 의해 고리가 닫힌다. 상업적인 공정에 의해 수득된 조(粗) 엡티피바타이드의 보고된 순도는 약 80 ％이다. 2회의 컬럼 크로마토그래피 단계는 순도를 99 ％ 초과로 개선시킨다.

일반적으로 액체-상 합성이 엡티피바타이드의 대규모 제조를 위해 고체-상 합성보다 더욱 실행가능한 것으로 고찰되어 왔다. 그러나, 가용성 문제 및 복합 반응 혼합물의 생성은 대규모 액체 상 공정에 대한 난제를 제시한다. 복합 반응 혼합물은, 예를 들어, 생성물의 정제를 더욱 어렵게 한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,954,616호에 기술된 바와 같이 퍼실릴화(persilylated) 아미노산 및 상 전이 시약을 사용하는 것 및 광범위한 크로마토그래피 정제와 같이, 이러한 문제점을 극복하기 위한 방법이 존재하지만, 이같은 수단들은 전체적인 공정에 비용을 추가한다.

따라서, 엡티피바타이드의 대안적인 제조 방법이 요구된다.

발명의 개요

본 발명은 엡티피바타이드의 제조 방법을 특히 제공한다. 본 발명의 특정 방법은 하기 화학식 II의 화합물을 제공하는 단계:

[식중, Har은 호모아르기닐이고; Gly는 글리실이고; Asp는 아스파르틸이고; Trp는 트립토파닐이고; Pro는 프롤릴이고; CyS-NH₂는 시스테인아미드이고; Mpa는 메르캅토프로피온산이고; P₂는 카르복실 보호기이다];

Har과 Mpa 잔기를 커플링시켜 하기 화학식 III의 화합물을 형성시키는 단계:

; 및

P₂를 화학식 III의 화합물의 Asp 잔기로부터 제거하여 엡티피바타이드를 형성시키는 단계를 포함한다.

본 발명은 아미노-말단 보호된 호모아르기닌 잔기가 글리신 잔기와 커플링되어 하기 화학식의 2-3 엡티피바타이드 단편이 형성되는 방법을 또한 제공한다:

P₁-Har-Gly-OH.

보호된 카르복실 측쇄를 갖는 아스파르트산 잔기가 트립토파닐-프롤릴 디펩티드에 디펩티드의 트립토파닐 잔기를 통해 커플링되어, 하기 화학식의 보호된 4-6 엡티피바타이드 단편이 형성되는 방법이 또한 제공된다:

P₃-Asp(O-P₂)-Trp-Pro-OH.

탈보호 후, 이번에는 2-3 엡티피바타이드 단편과 4-6 엡티피바타이드 단편이 2-3 엡티피바타이드 단편의 Gly 잔기가 4-6 엡티피바타이드 단편의 Asp 잔기에 부착되는 것을 통해 커플링되어, 하기 화학식의 2-6 엡티피바타이드 단편이 형성될 수 있다:

P₁-Har-Gly-Asp(O-P₂)-Trp-Pro-OH

[식중 Har은 호모아르기닐이고; Gly는 글리실이고; Asp는 아스파르틸이고; Trp은 트립토파닐이고; Pro는 프롤릴이고; P₁은 아미노 보호기이고; P₂는 카르복실 보호기이다]. 바람직한 실시양태에서, 2-6 엡티피바타이드 단편이 활성화된 시스테인아미드 잔기에 2-6 엡티피바타이드 단편의 Pro 잔기를 통해 커플링되어, 하기 화학식의 2-7 엡티피바타이드 단편이 형성된다:

P₁-Har-Gly-Asp(O-P₂)-Trp-Pro-ACys-NH₂

[식중 ACyS-NH₂는 활성화된 시스테인아미드 잔기이다]. 메르캅토프로피온산 잔기가 2-7 엡티피바타이드 단편에 메르캅토프로피온산 잔기와 2-7 엡티피바타이드 단편의 ACys-NH₂ 잔기 사이의 디술피드 결합을 통해 부착되어, 하기 화학식 I의 화합물이 형성될 수 있다:

[식중 Mpa는 메르캅토프로피온산이고; CyS-NH₂는 시스테인아미드이다]. 화학식 I의 화합물의 Har 잔기로부터 P₁을 제거하면 하기 화학식 II의 화합물이 제공된다:

[화학식 II]

.

이 화합물의 N-말단 Har과 C-말단 Mpa 잔기를 커플링시키면 하기 화학식 III의 화합물이 제공되고:

[화학식 III]

이어서 Asp 잔기로부터 P₂를 제거하면 엡티피바타이드가 수득된다.

본 발명은 상기 기술된 방법에 의해 제조된 생성물, 예컨대 하기 화학식 IV의 화합물을 또한 제공한다:

[식중, R₁은 수소 또는 P₁이고; P₁은 아미노 보호기이고; P₂는 카르복실 보호기이다]. 다른 대표적인 본 발명의 화합물로는 Fmoc-Har-Gly-OH, Fmoc-Har-Gly-O-P₄, 및 Fmoc-Har-Gly-Asp(O-P₅)-Trp-Pro-OH [식중 P₄ 및 P₅는 카르복실 보호기이다]가 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 엡티피바타이드 및 1 ％ 미만의 특정 공정 불순물을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 본 발명 은 엡티피바타이드의 정제 방법을 제공한다.

한 양상에서, 본 발명은 2-3 엡티피바타이드 단편의 제조, 4-6 엡티피바타이드 단편의 제조, 및 2-3 엡티피바타이드 단편과 4-6 엡티피바타이드 단편의 커플링으로 2-6 엡티피바타이드 단편을 형성시키는 것이 수반되는 엡티피바타이드의 수렴성 제조 방법을 제공한다. 이러한 방법 중 일부는 2-6 엡티피바타이드 단편을 활성화된 시스테인아미드 잔기에 커플링시켜 2-7 엡티피바타이드 단편을 형성시키는 것, 메르캅토프로피온산과 2-7 엡티피바타이드 단편 사이에 디술피드 결합을 형성시켜 전구체 A를 형성시키는 것, 전구체 A를 분자내 펩티드 커플링시키는 것, 및 커플링 생성물로부터 보호기를 제거하여 엡티피바타이드를 형성시키는 것을 수반한다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명은 기술된 엡티피바타이드 제조 방법에 의해 제조된 생성물에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 엡티피바타이드의 제조를 위한 중간체로서 사용될 수 있는 신규 화합물에 관한 것이다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 엡티피바타이드와 구조적으로 유사한 화합물에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 추가적인 실시양태에서, 엡티피바타이드의 정제 방법을 제공한다.

본원에서 사용된 용어 "카르복실 보호기"는 원하는 반응에 대한 허용불가능하게 불리한 영향 없이, 선택적으로 카르복실 기에 부착되고 이로부터 제거되어 카르복실 기가 원치 않는 화학 반응에 참여하는 것을 예방할 수 있는 부분을 지칭한다. 카르복실 보호기의 예로는 에스테르, 예컨대 메틸, 에틸, t-부틸, (비)치환 벤질, 및 실릴 에스테르가 특히 포함된다. 기타 카르복실 보호기는 당업계에 주지되어 있고, [Protecting Groups in Organic Synthesis, Theodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, 3rd Edition, 1999, John Wiley and Sons, Inc.]에 상세하게 기술되어 있다.

본원에서 사용된 용어 "아미노 보호기"는 원하는 반응에 대한 허용불가능하게 불리한 영향 없이, 선택적으로 질소 원자에 부착되고 이로부터 제거되어 질소 원자가 원치 않는 화학 반응에 참여하는 것을 예방할 수 있는 부분을 지칭한다. 아미노 보호기의 예로는 특히 카르바메이트, 예컨대 Boc, Cbz, Fmoc, alloc, 메틸 및 에틸 카르바메이트; 고리형 이미드 유도체, 예컨대 프탈이미드; 아미드, 예컨대 포르밀, (비)치환 아세틸, 및 벤조일; 및 트리알킬 실릴 기, 예컨대 t-부틸디메틸실릴 및 트리이소프로필실릴이 포함된다. 기타 아미노 보호기는 당업계에 주지되어 있고, [Protecting Groups in Organic Synthesis, Theodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, 3rd Edition, 1999, John Wiley and Son, Inc.]에 상세하게 기술되어 있다.

본원에서 사용된 용어 "커플링" 및 이의 변형은 연결될 부분들 사이에서의 임의 수단에 의한 아미드 결합의 형성을 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "부착" 및 이의 변형은 연결될 부분들 사이에서의 아미드 또는 디술피드 결합을 형성시키는데 사용될 수 있는 임의의 수단에 의한 아미드 또는 디술피드 결합의 형성을 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "활성화된 시스테인아미드 잔기"는 메르캅토프로피온산과 디술피드 결합을 형성할 수 있는 시스테인아미드 잔기를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "Gly-엡티피바타이드"는 엡티피바타이드와 구조적으로 유사하지만 단일 글리신 잔기보다는 2개의 인접한 글리신 잔기를 함유하는 화합물을 지칭한다.

본원에서 언급된 모든 아미노산 잔기는 L-배열을 갖는 천연 아미노산이다.

엡티피바타이드는 하기의 화학 구조를 갖는다:

엡티피바타이드를 또한 하기와 같이 아미노산 명칭을 사용하여 나타낼 수 있고:

식중 아미노산 명칭은 하기에 제시된 화학 도면에 상응한다:

편리한 기술(記述)을 위해, 또한 잔기에 (1)에서 (7)까지 번호를 매길 수 있다. 잔기 (1)은 메르캅토프로피온산이고; (2)는 호모아르기닐 (Har)이고; (3)은 글리실 (Gly)이고; (4)는 아스파르틸 (Asp)이고; (5)는 트립토파닐 (Trp)이고; (6)은 프롤릴 (Pro)이고; (7)은 시스테인아미드 (CyS-NH₂)이다.

특정 실시양태에 따르면, 본 발명은 엡티피바타이드의 수렴성 제조 방법에 관한 것이다. 단계들 중 첫번째 순서에서, 아미노산 (2) 및 (3)을 함유하는 2-3 엡티피바타이드 단편이 제조된다. 두번째 순서에서는, 아미노산 (4), (5) 및 (6)을 함유하는 4-6 엡티피바타이드 단편이 제조된다. 이어서 두 단편이 커플링되어 펜타펩티드인 단일 2-6 단편이 제공된다. 엡티피바타이드의 2-6 단편은 Har 잔기의 아미노-말단 및 아스파르틸 측쇄 카르복실 기에서 보호된다. 하기 반응식 1에서 2-6 엡티피바타이드 단편의 예시적인 제조 방법이 개요된다:

엡티피바타이드의 2-6 단편의 제조

반응식 1의 순서 A는 2-3 엡티피바타이드 단편의 제조를 나타내고, 순서 B는 4-6 엡티피바타이드 단편의 제조를 나타낸다. 두 순서가 수렴되어 엡티피바타이드의 2-6 단편이 제공된다. 반응식 1에서는 예시적인 아미노산 보호기가 제시되지만, 펩티드 합성 기술의 당업자는 다른 공지된 아미노산 보호기를 또한 사용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, Fmoc (9-플루오레닐메톡시카르보닐) 기 대신에, 다른 카르바메이트 보호기 예컨대 Cbz (벤질옥시카르보닐), RCbz (방향족 고리 상에서 치환된 벤질옥시카르보닐 기), 9(2-술포)플루오레닐메틸카르바메이트, 9(2,7-디브로모)플루오레닐메틸카르바메이트, 2-클로로-3-인데닐메틸카르바메이트, 벤즈[f]인덴-3-일메틸카르바메이트, 또는 Alloc (알릴옥시카르보닐) 기를 사용할 수 있다.

아스파르틸 잔기 상의 t-부틸 에스테르는 산 처리에 의해 절단될 수 있는 임의의 다른 보호기 예컨대 ODpm (디페닐메틸 에스테르) 또는 수소첨가분해에 의해 절단될 수 있는 보호기 예컨대 OBzl (벤질 에스테르)로 대체될 수 있다.

반응식 1의 순서 A에 묘사된 엡티피바타이드 내의 Fmoc-Har 부분은 R_NP1-Har로 대체될 수 있고, 식중 R_NP1은 아미노 보호기 예컨대 Cbz (벤질옥시카르보닐) 기, RCbz (방향족 고리 상에서 치환된 벤질옥시카르보닐) 기, 또는 Alloc (알릴옥시카르보닐) 기이다. 유사하게, 순서 B에 묘사된 엡티피바타이드 내의 Z-Asp (또는 Cbz- Asp) 부분은 R_NP2-Asp로 대체될 수 있고, 식중 R_NP2는 염기성 조건에서 절단될 수 있는 아미노 보호기 예컨대 Fmoc (플루오레닐메틸옥시카르보닐)이거나, 또는 R_NP2는 수소첨가분해에 의해 절단될 수 있는 아미노 보호기 예컨대 RCbz (치환된 방향족 고리를 갖는 벤질옥시카르보닐 보호기) 기이다. 또한, 반응식 1에 묘사된 -OtBu 기는 R_cp로 대체될 수 있고, 식중 R_cp는 산 처리에 의해 절단될 수 있는 카르 복실 보호기, 예컨대 ODpm (디페닐메틸 에스테르) 기이다. Pfp (펜타플루오로페닐)는 R_L1으로 대체될 수 있고, 식중 R_L1은 카르복실 활성화 기이다; Su (숙신이미드)는 R_L2로 대체될 수 있고, 식중 RL₂는 카르복실 활성화 기이다. 단편의 성질과 독립적으로, Pfp와 Su 모두가 다른 안정한 활성 에스테르 예컨대 모노 및 디니트로페닐 에스테르, 트리- 및 펜타페닐 에스테르로 대체될 수 있다. 특정 보호기의 선택은 동일한 화합물 상에 존재하는 다른 보호기의 신원에 좌우된다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 특정 보호기는 다른 보호기에 영향을 미치지 않는 반응 조건 하에서 선택적으로 제거될 수 있도록 선택된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 보호된 2-6 엡티피바타이드 단편이 이어서 "활성화된" 시스테인아미드 (7), 예컨대 3-니트로-2-피리딘술페닐-시스테인아미드 (H-Cys(Npys)-NH₂); Nps (2-니트로-페닐-술페닐); 페닐 고리가 치환된 S-페닐티오시스테인아미드; S-알킬티오시스테인아미드; 또는 시스테인아미드의 S-술포네이트 및 S-술페닐티오카르보네이트에 커플링되어, 엡티피바타이드의 2-7 헥사펩티드 단편이 형성된다. 나머지 엡티피바타이드 잔기는 메르캅토프로피온산 또는 Mpa-OH (1)이다. Mpa-OH는 1과 2-7 단편 사이에 디술피드 결합을 형성시키는 조건 하에 2-7 헥사펩티드 단편에 부착된다. 본원에서 전구체 A로 명명된, 생성된 디술피드 조각은 엡티피바타이드 제조를 위한 중요한 신규 전구체이다. 전구체 A의 구조가 하기에 제시된다:

[식중, P₁은 아미노 보호기이고, P₂는 카르복실 보호기이다]. 바람직하게는, P₂ 기는 P₁ 기의 제거에 적절한 조건 하에 안정적이다. 오직 한 기만이 선택적으로 제거되도록 하는 혼화성인 P₁ 및 P₂ 기의 선택은 당업계에 주지되어 있다. 보호기의 혼화성 쌍의 한 예는 P₁은 염기성 조건 하에 제거될 수 있는 Fmoc이고, P₂는 동일한 조건 하에 안정적인 t-부틸인 것이다.

하기 반응식 2에서는 전구체 A의 예시적인 제조 방법이 개요된다:

2-6으로부터의 전구체 A의 제조

반응식 1에서와 같이, 반응식 2에 제시된 Fmoc 및 t-부틸 기는 펩티드 합성에 유용한 것으로 일반적으로 인정되는 기타 공지된 보호기로 대체될 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 전구체 A로부터 P₁ 보호기를 제거하면 또다른 전구체인 하기의 전구체 B가 제공되고, 이는 엡티피바타이드의 2-7-1 부분이다.:

.

전구체 B는 분자내 펩티드 커플링을 통해 하기의 전구체 C로 전환될 수 있다:

.

분자내 펩티드 커플링은, 예를 들어, 유기 용매 내에서 적절한 커플링 시약, 예컨대 O-[시아노(에톡시카르보닐)메틸렌아미노]-N,N, N' , N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TOTU), HBTU, 또는 TBTU (각각 2-(1H-벤조트리아졸-1일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 및 테트라플루오로보레이트)와 같지만 이에 한정되지 않는 우로늄 유형의 시약; DCC (디시클로헥실카르보디이미드), DIC (디이소프로필카르보디이미드), 또는 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이밈드)와 같지만 이에 한정되지 않는 카르보디이미드 유형 시약; 활성 에스테르; 또는 포스포늄 유형 커플링 시약 예컨대 Bop (벤조트리아졸-1-일옥시-트리(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트) 또는 PyBOP (벤조트리아졸-1-일옥 시-트리(피롤리디노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트)의 존재 하에서 이루어질 수 있다. 펩티드 커플링은, 예를 들어, 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함되는 [Humphrey and Chamberlin, Chem. Rev. 1997, 97, 2243-2266]에 기술되어 있다.

전구체 C로부터 P₂ 보호기를 제거하면 엡티피바타이드가 제공된다. P₂의 제거는, 예를 들어, 유기 용매 내에서 산, 염기, 또는 보호기가 불안정한 임의의 기타 시약 또는 시약 시스템의 존재 하에 이루어질 수 있다. 반응식 3에서는 전구체 A로부터의 엡티피바타이드의 예시적인 제조방법이 개요된다:

전구체 A로부터의 엡티피바타이드의 제조

Fmoc 보호기의 제거 후, 2-7-1 단편의 분자내 펩티드 커플링에 의해 엡티피바타이드의 t-부틸 에스테르가 제공된다. 아스파르틸 잔기로부터 부틸 기가 제거되어 엡티피바타이드가 산출된다.

특정 실시양태에서, 또한 본 발명은 엡티피바타이드와 구조적으로 유사하고 상기 기술된 엡티피바타이드의 제조 방법과 유사한 방법에 따라 제조되는 화합물에 관한 것이다. 이같은 화합물에는, 예를 들어, 엡티피바타이드에서와 같은 단일 글리신 잔기 대신 2개의 인접한 글리신 잔기를 함유하는 하기 화학식의 -Gly-엡티피바타이드가 포함된다:

.

Gly-엡티피바타이드는, 예를 들어, 글리신이 호모아르기닌에 커플링되어 2-3 엡티피바타이드 단편이 형성되기보다는 Gly-Gly 디펩티드가 호모아르기닌에 커플링되어 2-3 엡티피바타이드 단편에 상응하는 것이 형성되는 것을 제외하고는, 상기 기술된 엡티피바타이드 제조 절차에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 이러한 변형된 절차에 따르면, 반응식 1에 제시된 H-Gly-OtBu (3) 기가 H-Gly-Gly-OtBu로 대체된다.

또한 Gly-엡티피바타이드는, 본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 기술된 엡티피바타이드의 제조 방법에 따라 엡티피바타이드를 제조하는 동안에 제조된다. 본 발명의 특정 실시양태는 99 ％ 이상의 엡티피바타이드 및 약 0.01 ％ 내지 약 1 ％ 범위의 Gly-엡티피바타이드를 포함하는 조성물, 및 99 ％ 이상의 엡티피바타이드 및 약 0.01 ％ 내지 약 0.1 ％ 범위의 Gly-엡티피바타이드를 포함하는 조성물이 포함되는, 엡티피바타이드 및 Gly-엡티피바타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 예를 들어, 엡티피바타이드 용액을 실리카에 부착된 옥타데실 탄소 사슬을 예를 들어 포함하는 고정상에 접촉시키는 단계, 엡티피바타이드 용 액과 접촉된 고정상을 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 용액으로 세정하는 단계, 임의로 엡티피바타이드 용액과 접촉된 고정상을 아세트산/아세토니트릴 용액으로 세정하는 단계, 및 엡티피바타이드 용액과 접촉된 고정상을 암모늄 산/아세토니트릴 용액으로 세정하는 단계를 포함하는 엡티피바타이드의 정제 방법을 제공한다. 역 고정상은 당업계에 주지되어 있고, 옥타데실 탄소를 기재로 하는 실리카는 다른 이같은 상으로 치환될 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 엡티피바타이드 용액과 접촉된 고정상은 초기 농도가 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 95 ％ 및 아세토니트릴 용액 5 ％이고 최종 농도가 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 50 ％ 및 아세토니트릴 용액 50 ％인 구배로 세정된다.

본 발명은 엡티피바타이드 용액과 접촉된 고정상이 초기 농도가 0.5 ％ 아세트산 수용액 95 ％ 및 아세토니트릴 용액 5 ％이고 최종 농도가 0.5 ％ 아세트산 수용액 50 ％ 및 아세토니트릴 용액 50 ％인 구배로 세정되는 실시양태를 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 고정상은 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 구배로 1회 이상 세정된 후, 아세트산/아세토니트릴 구배로 세정된다.

본 발명은 암모늄 산/아세토니트릴 용액이 100 mM 암모늄 산 용액 95 ％ 및 아세토니트릴 용액 5 ％를 포함하는 용액인 실시양태를 또한 제공한다. 본 발명의 특정 양상에서, 고정상은 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 구배 및/또는 아세트산/아세토니트릴 구배로 세정된 후, 암모늄 산/아세토니트릴 용액으로 세정된다.

상기 기술된 방법에서 발생하는 아미노산 잔기의 커플링은 당업자에게 익숙한 공지된 펩티드 합성 방법을 통해 달성될 수 있다. 펩티드의 형성을 위한 임의의 적절한 커플링 절차를 사용할 수 있다.

하기의 실시예는 본 발명의 특정 실시양태의 실례이고, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.

실시예 1: Z- Asp ( OtBu )- Trp - Pro - OH 의 제조

Z-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH를, 예를 들어, 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함되는 [Bodanszky, M. (1979), Active esters in peptide synthesis, The peptides, Vol. 1 (ed. E. Gross and J. Meienhofer), Chapter 3. Academic Press, London]에 기술된 바와 같이, 시판되는 Z-Asp(OtBu)-OSu 및 H-Trp-Pro-OH로부터 출발하여 공지된 절차에 의해 수득하였다.

실시예 2: H- Asp (O- tBu )- Trp - Pro - OH 의 제조

약 20 ℃의 디메틸아세트아미드 (DMAC, 1.2 ℓ)가 충전된 2 리터 반응기에 약 20 ℃의 온도를 유지시키면서 0.300 ㎏의 출발 원료 Z-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH를 첨가하였다. Z-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH가 용해되도록 한 후, 반응 혼합물을 질소 대기로 퍼징시키고(purged) 밀봉하였다(blanketed). 탄소 상의 팔라듐 (5 중량 ％) (0.015 ㎏)을 반응 혼합물에 첨가한 후, 반응 혼합물을 약 20 ℃에서 유지시키면서 2 바의 압력에서 수소첨가시켰다.

2 시간 후, 및 그 후 매시간 마다 반응물로부터의 샘플을 HPLC에 의해 분석 하였다. HPLC 분석은 Purospher Star C18 55*4 ㎜ 컬럼 상에서 10 분 동안 98:2 물/아세토니트릴에서 2:98 물/아세토니트릴으로의 구배로 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 (TFA)을 함유하는 물/아세토니트릴 용매 혼합물을 사용하여 수행하였다. HPLC 검출은 215 nm에서였고, 유속은 2.0 ㎖/분이었으며, 온도는 40 ℃였다.

출발 원료가 생성물 면적 백분율에 비해 0.2 ％ 이하인 것을 HPLC 분석이 나타낼 때 반응이 완료된 것으로 간주하였다. HPLC에 의해 반응이 완료된 것으로 나타났을 때, p-톨루엔술폰산의 수용액 (물 0.150 ℓ 중 0.094 ㎏ p-TsOH)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 이어서 반응 혼합물을 DMAC로 미리 세정된 Celite® (0.6 ℓ로 3회 세정된 Celite®)로 여과하였다. 반응 혼합물의 여과 후, 여과 케이크를 신선한 DMAC (0.3 ℓ)로 3회 세정하였다. 마지막 세정 후 HPLC 분석을 수행하여, 생성물이 여과 케이크 내에 잔존하지 않음을 확인하였다.

합친 여액들을 약 20 ℃의 새로운 용기로 옮기고, 이 온도에서 N-에틸모르폴린 (0.066 ℓ)을 첨가하였다. 첨가하는 동안 온도를 약 22 ℃ 미만으로 유지시켰다. 이어서 혼합물을 약 8-12 ℃로 냉각하고, 온도가 약 15 ℃ 미만으로 유지되도록 물 (3 ℓ)을 천천히 첨가하였다. 이어서 혼합물을 약 8-12 ℃에서 약 30 분 동안 교반하고, 이 온도에서 8 시간 동안 유지시켰다. 이 시간 동안 생성물이 용액으로부터 결정화되었다. 상층액을 HPLC에 의해 분석하여 여전히 용액 내에 있는 생성물의 양을 결정하고, 추가적인 냉각이 필요한지 여부를 결정하였다. 수득된 슬러리를 여과하고, 수집된 고체를 물:DMAC의 2:1 용액으로 2회 세정하였다 (각각 0.9 ℓ). 이어서 고체를 아세토니트릴로 2회 세정하고 (각각 0.9 ℓ), 일정한 질량이 될 때까지 진공 하에 약 25 ℃ 미만에서 건조시켰다. 건조 후의 수함량은 3.5 ％였다 (칼-피셔(Karl-Fisher) 분석).

생성물을 역상 HPLC에 의해 수성 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 구배를 사용하여 분석하였다.

LC/MS 분석으로 H-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-OH의 질량 [M+H] 473.0이 확인되었다.

회수율은 93.2 ％ (0.218 ㎏)이었고; 순수율은 93.1 ％였다 (질소 함량: 95.4 ％를 기초로 함).

실시예 3: Fmoc - Har - Gly - Asp (O- tBu )- Trp - Pro - OH 의 제조

THF:DMAC (각각 0.717 ℓ 및 0.179 ℓ) 내의 Fmoc-Har-Gly-OH (0.163 ㎏ 순량; 펩티드 함량: 90.5 ％를 기초로 함)의 슬러리에 메탄술폰산 (0.027 ℓ) 및 펜타플루오로페놀 (0.083 ㎏)을 첨가하였다. 혼합물을 약 20 ℃에서 고체가 용해될 때까지 교반하였다. N-에틸모르폴린 (NEM) (0.030 ℓ)을 적가한 후, THF (0.179 ℓ) 내의 디시클로헥살카르보디이미드 (DCC) (0.072 ㎏)를 적가하고, 혼합물을 약 20 ℃에서 교반하였다. Fmoc-Har-Gly-OPfp의 형성 후, HPLC 분석하였다. 약 17 시간 후, Fmoc-Har-Gly-OH/Fmoc-Har-Gly-OPfp 비율은 1.5/98.5였다.

반응 혼합물에 H-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-OH (0.146 ㎏, 약 3.5 w/w ％ H₂O) 및 NEM (0.049 ℓ)을 첨가하였다. 혼합물을 약 20 ℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 이 시간에, HPLC 분석은 혼합물이 약 87 ％의 생성물, <2 ％의 Fmoc-Har-Gly- OPfp, 6 ％의 Fmoc-Har-Gly-OH, 약 0.5 ％의 H-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-OH, 및 약 5.5 ％의 Fmoc-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-OH ("d.a. 불순물")로 확인된 불순물을 함유하는 것을 나타냈다. HPLC 분석은 Purospher Star C18 55*4 ㎜ 컬럼 상에서 10 분 동안 98:2 물/아세토니트릴에서 2:98 물/아세토니트릴으로의 구배로 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 (TFA)을 함유하는 물/아세토니트릴 용매 혼합물을 사용하여 수행하였다. HPLC 검출은 215 nm에서였고, 유속은 2.0 ㎖/분이었으며, 온도는 40 ℃였다.

반응 혼합물을 여과하고, 고체를 THF/DMAC의 5/1 혼합물로 2회 세정하였다 (2 × 0.489 ℓ). 여액을 35 ℃ 이하에서 감압 (약 20 mBar) 하에 약 0.815 ℓ로 농축하였다. 농축된 혼합물을 천천히 1 시간에 걸쳐 중탄산나트륨 (0.059 ㎏)을 함유하는 아세토니트릴/H₂O의 1/4 혼합물 (4.1 ℓ)에 첨가하였다. 첨가 속도를 주의깊게 조절하여 고무질 침전물이 형성되는 것을 방지하였다. 약 3.5 ％의 용액을 약 15 분에 걸쳐 첨가하고, 첨가를 중단하고 슬러리를 약 20 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 페이스트성 침전물이 백색 슬러리로 변화되었다. 추가로 7.5 ％의 용액을 15 분 내지 30 분에 걸쳐 첨가하고, 다시 첨가를 중단하고 슬러리를 약 20 ℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 나머지 89 ％의 용액을 약 2 시간에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물을 약 20 ℃에서 12 시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 고체를 아세토니트릴/H₂O의 1/4 혼합물 (3 × 0.7 ℓ), 아세토니트릴/디-이소프로필에테르 (DIPE)의 2/3 혼합물 (3 × 0.7 ℓ) 및 DIPE (2 × 0.7 ℓ)로 세정하였다. 고체 생성물을 T ≤ 30 ℃에서 일정한 질량이 달성될 때까지 건조시켰다. 건조 후 수함량은 3.3 ％였다 (칼-피셔 분석).

LC/MS 분석으로 Fmoc-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH의 질량 [M+H] 922.5가 확인되었다.

회수율은 81.8 ％ (0.234 ㎏)이었고; 순수율은 82.3 ％였다 (질소 함량: 96.0 ％를 기초로 함).

실시예 4: Fmoc - Har - Gly - Asp (O- tBu )- Trp - Pro - Cys ( NPys )- NH ₂ 의 제조

약 20 ℃의 펩티드 합성 등급 DMF (0.675 ℓ)가 충전된 반응기에 Fmoc-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH (0.225 ㎏)를 첨가하였다. 혼합물을 약 0 ℃로 냉각하고, H-Cys(NPys)-NH₂를 고체 히드로클로라이드 염 (0.080 ㎏)으로서 첨가하였다. O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU) (0.082 ㎏)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 온도를 약 0 ℃에서 유지시키면서, 디이소프로필에틸아민 (DIPEA) (0.112 ℓ)을 조금씩 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 6.5 내지 7.0으로 조정하였다. 혼합물을 이 온도에서 교반하고, 약 45 분마다 생성물 형성에 대해 샘플을 HPLC에 의해 분석하였다. 반응 혼합물의 pH를 필요하다면 DIPEA를 첨가하여 pH 6.5 내지 7.0으로 유지시켰다. HPLC 분석은 Platinum EPS 100-5 C18 5μ 250*4.6 ㎜ 컬럼 상에서 수행하였다; 용매 A: 수 중 TFA 0.1 ％; 용매 B: 아세토니트릴 중 TFA 0.1 ％; 구배: 15 분 동안 12 ％에서 98 ％ B로 상 승. HPLC 검출은 215 nm에서였고, 유속은 2.0 ㎖/분이었고, 온도는 40 ℃였다. 펜타펩티드 및 Cys(NPys)-NH₂ 출발 원료가 각각 HPLC에 의해 1 ％ 미만인 것으로 나타났을 때 반응이 완료된 것으로 간주하였다. 다르게는, 혼합물 내에 부족한 것으로 나타난 추가적인 TBTU, DPEA 및 출발 원료를 첨가하였다.

반응 혼합물을 약 5 ℃ 온도의 물 (4.5 ℓ)을 함유하는 또다른 용기에 첨가하였다. 교반하면서 첨가하는 동안 이 온도를 유지시켰다. 약 5 ℃에서 10 분 동안 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 고체를 물로 5회 세정하였다 (각각 0.9 ℓ). 이어서 고체를 톨루엔으로 3회 세정하였다 (각각 0.675 ℓ). 톨루엔으로의 세정은 디이소프로필 에테르로의 세정으로 대체할 수 있다. 고체를 진공 하에 35 ℃ 이하에서 일정한 중량이 달성될 때까지 건조시켰다. 건조 후 수 함량은 1.2 ％였다 (칼-피셔 분석).

LC/MS 분석으로 Fmoc-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NPys)NH₂의 질량 [M+H] 1178.4가 확인되었다.

회수율은 102.4 ％ (0.295 ㎏)이었고, 순수율은 87.7 ％였다 (펩티드 함량: 82.0 ％를 기초로 함).

실시예 5: Fmoc - Har - Gly - Asp (O- tBu )- Trp - Pro - Cys ( NH ₂ )- Mpa (Fmoc[2-7-1])의 제조

질소 대기 하에 약 20 ℃인 HPLC 등급 아세토니트릴 (0.570 ℓ) 및 펩티드 합성 등급 DMF (0.285 ℓ)가 충전된 반응기에 0.285 ㎏의 Fmoc-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NPys)NH₂ (Fmoc[2-7])을 진탕하면서 천천히 첨가하였다. Fmoc[2-7]의 용해 후, 혼합물을 약 -3 ℃로 냉각하였다. 약 20 ℃에서 제조된 아세토니트릴 (0.057 ℓ) 내의 메르캅토프로피온산 (Mpa, 0.023 ㎏)의 용액을 반응 온도가 약 -3 ℃에서 유지되도록 하는 속도로 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응을 HPLC 분석에 의해 모니터링하고, 분석이 Fmoc[2-7-1]에 비해 1 ％ 미만의 Fmoc[2-7]을 나타낼 때 완료된 것으로 간주하였다. HPLC 분석은 Purospher Star C18 55*4 ㎜ 컬럼 상에서 10 분 동안 98:2 물/아세토니트릴에서 2:98 물/아세토니트릴으로의 구배로 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 (TFA)을 함유하는 물/아세토니트릴 용매 혼합물을 사용하여 수행하였다. HPLC 검출은 215 nm에서였고, 유속은 2.0 ㎖/분이었으며, 온도는 40 ℃였다.

반응 혼합물을 약 20 ℃의 HPLC 등급 아세토니트릴 (5.7 ℓ) 및 N-에틸모르폴린 (NEM, 0.033 ℓ)이 충전된 제 2 용기에 첨가하였다. 첨가가 완료된 후, 반응 혼합물을 이 온도에서 약 30 분 동안 교반하였다. 슬러리를 약 0 ℃로 천천히 냉각하고, 이 온도에서 약 45 분 동안 계속 교반하였다. 이어서 하기의 절차를 3회 수행하였다: (a) 진탕을 정지시켜 침전물과 상층액이 분리되도록 하였다; (b) 상층액을 용기로부터 펌프로 제거하였다; (c) 0 ℃에서, 신선한 HPLC 등급 아세토니트릴 (1.425 ℓ)을 반응기에 첨가하고 다시 진탕을 시작하였다; (d) 슬러리를 약 5 분 동안 약 0 ℃에서 교반하였다. 잔존하는 슬러리를 여과하고, 고체를 HPLC 등급 아세토니트릴으로 2회 (각각 1.140 ℓ), 그리고 톨루엔으로 1회 (1.425 ℓ) 세정하였다. 톨루엔으로의 세정은 디이소프로필 에테르로의 세정으로 대체할 수 있다. 고진공 하에 20 ℃ 이하에서 고체를 건조시켰다.

LC/MS 분석으로 Fmoc-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH₂)-Mpa의 질량 [M+H] 1128.4가 확인되었다.

회수율은 93.8 ％ (0.256 ㎏)이었고; 순수율은 정량적이었다 (펩티드 함량: 87.4 ％를 기초로 함).

실시예 6: H- Har - Gly - Asp (O- tBu )- Trp - Pro - Cys ( NH ₂ )- Mpa ([2-7-1])의 제조

약 20 ℃의 펩티드 합성 등급 DMF (0.750 ℓ)가 충전된 반응기에 0.250 ㎏의 Fmoc-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH₂)-Mpa (Fmoc[2-7-1])를 진탕하면서 천천히 첨가하였다. 혼합물을 약 10 ℃로 냉각하고, 이 온도에서 디에틸아민 (0.034 ℓ)을 첨가하였다. 디에틸아민의 첨가 후, 혼합물의 온도를 약 20 ℃로 상승시켰다. 반응의 진행을 매 시간마다 취한 샘플의 HPLC 분석으로 모니터링하였다. HPLC 분석은 Platinum EPS 100-5 C18 5μ 250*4.6 ㎜ 컬럼 상에서 수행하였다; 용매 A: 수 중 TFA 0.1 ％; 용매 B: 아세토니트릴 중 TFA 0.1 ％; 구배: 15 분 동안 22 ％에서 98 ％ B로 상승. HPLC 검출은 215 nm에서였고, 유속은 2.0 ㎖/분이었으며, 온도는 40 ℃였다. [2-7-1]과 관련하여 Fmoc[2-7-1]의 백분율이 약 0.5 ％ 미만일 때 반응이 완료된 것으로 간주하였다. 반응은 일반적으로 3 시간 내에 완료되었다.

반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (5.0 ℓ)가 충전된 제 2 용기에 첨가하고, 약 10 ℃로 냉각하였다. 생성된 현탁액을 10 분 동안 약 10 ℃에서 교반하였다. 이어서 하기의 절차를 2회 반복하였다: (a) 진탕을 정지시키고, 약 15 분 동안 침전물이 상층액으로부터 분리되도록 하였다; (b) 상층액을 용기로부터 펌프로 제거하였다; (c) 신선한 에틸 아세테이트 (0.750 ℓ)를 약 10 ℃에서 첨가하였다; (d) 현탁액을 약 10 ℃에서 약 5 분 동안 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 고체를 에틸 아세테이트로 6회 세정하였다 (각각 0.750 ℓ). 디이소프로필 에테르로 추가적으로 세정하여 에틸 아세테이트의 잔류물을 제거할 수 있다. 고체를 고 진공 하에 25 ℃ 이하에서 최대 18 시간 동안 건조시켰다.

LC/MS 분석으로 H-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH₂)-Mpa의 질량 [M+H] 906.3이 확인되었다.

GC 분석은 3.4 ％ 잔여 디에틸아민을 나타냈다.

회수율은 106.1 ％ (0.213 ㎏)이었고, 순수율은 99.2 ％였다 (펩티드 함량: 81.9 ％를 기초로 함).

실시예 7: [ MPA - Har - Gly - Asp (O- tBu )- Trp - Pro - Cys ]( NH ₂ ) ( 시클로 -[1-7]( OtBu )- NH ₂ )의 제조

반응기에 펩티드 합성 등급 DMF (0.768 ℓ)를 충전하고, 용액을 약 10 ℃로 냉각하였다. 온도를 15 ℃ 미만으로 유지하면서, O-[시아노(에톡시카르보닐)메틸렌아미노]-N,N, N' , N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TOTU) (0.070 ㎏)를 첨가한 후, 펩티드 합성 등급 디클로로메탄 (1.536 ℓ)으로 희석하였다. 생성된 용액을 약 -6 ℃로 냉각하고, 온도를 약 -6 ℃로 유지하면서 NEM (0.024 ℓ)을 조금씩 첨가하였다. NEM의 첨가 전후에 pH를 측정하였다. HPLC 분석을 위해 샘플을 취하였다.

HPLC 분석은 Phenomenex Luna C18(2) 컬럼, 5um, 150*4.6㎜ 상에서 수행하였고, 구배는 15 분 동안 12 ％에서 98 ％ B로 상승시켰다. 용매 A: 수 중 TFA 0.1 ％, 용매 B: 아세토니트릴 중 TFA 0.1 ％. 검출은 215 nm에서였고, 유속은 2.0 ㎖/분이었으며, 온도는 40 ℃였다.

별도의 반응기에 약 20 ℃의 펩티드 합성 등급 DMF (0.768 ℓ)를 충전한 후, 0.192 ㎏의 H-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH₂)-Mpa ([2-7-1])를 충전하였다. 고체가 용해되었을 때, 생성된 용액을 약 0 ℃로 냉각하였다. HOBt (0.026 ㎏)를 조금씩 첨가하였다 (HOBt의 중량은 순도를 위해 수정하였다). 생성된 용액을 펩티드 합성 등급 디클로로메탄 (0.384 ℓ)으로 희석하였다. HPLC 분석을 위해 샘플을 취하였다.

온도를 약 -6 ℃에서 유지하면서, [2-7-1]의 용액을 TOTU의 용액에 최소 3 시간에 걸쳐 첨가 펌프를 사용하여 매우 천천히 첨가하였다. 50 ％의 [2-7-1] 용 액을 첨가한 후, HPLC 분석을 위해 샘플을 취하였다. 또한 이 시점에 pH를 측정하였다. [2-7-1] 첨가가 완료되었을 때 HPLC 및 pH 샘플을 또한 취하였다. 온도를 약 -6 ℃로 유지하면서, 필요하다면 NEM을 첨가하여 pH를 7-7.5로 조정하였다.

온도를 약 -6 ℃로 유지하면서, pH를 매 15분마다 점검하고, 필요하다면 NEM을 첨가하여 7-7.5로 조정하였다. 고리화가 완료될 때까지 매 45분마다 HPLC 분석을 위해 샘플을 취하였다. 고리화 생성물에 비해 [2-7-1]의 면적 백분율이 <0.5 ％일 때 반응이 완료된 것으로 간주하였다.

반응이 지연되면, 온도를 -6 ℃로 유지하면서 [2-7-1]의 잔여량 당 1.1 당량의 TOTU를 첨가하고 필요하다면 pH를 7-7.5로 조정하였다.

반응이 완료되었을 때, 혼합물을 진공 하에 <40 ℃에서 약 0.8 ℓ의 최종 부피로 농축시켰다. 생성된 점성 용액을 약 5 ℃로 냉각하고, 급속하게 교반되는 약 0 ℃의 에틸 아세테이트 (7.0 ℓ)에 천천히 첨가하였다. 생성된 슬러리를 약 0 ℃에서 20 분 동안 교반하였다. 이어서 하기의 절차를 3회 수행하였다: (a) 진탕을 중지하여 침전물 및 상층액이 분리되도록 하였다; (b) 상층액을 용기로부터 펌프로 제거하였다; (c) 0 ℃에서, 신선한 에틸 아세테이트 (1.15 ℓ)를 반응기에 첨가하고 다시 진탕을 시작하였다; (d) 슬러리를 약 20 분 동안 약 0 ℃에서 교반하였다. 상기 절차를 마지막으로 수행하고, 소량의 에틸 아세테이트 (0.768 ℓ)를 반응물에 첨가하고, 10 분 동안 0 ℃에서 다시 진탕을 시작하였다. 생성된 슬러리를 여과하고, 고체를 에틸 아세테이트 (0.576 ℓ)로 1회 세정하고 디-이소프로 필 에테르 (0.576 ℓ)로 3회 세정하였다. 고체를 고 진공 하에 약 25 ℃에서 건조시켰다.

LC/MS 분석으로 (시클로-[1-7](OtBu)-NH₂)의 질량 [M+H] 888.2가 확인되었다.

회수율은 103.7 ％ (0.194 ㎏)이었고; 순수율은 정량적이었다 (펩티드 함량: 79.7 ％를 기초로 함).

실시예 8: [ MPA - Har - Gly - Asp - Trp - Pro - Cys ]( NH ₂ ) ( 시클로 -[1-7]- NH ₂ )의 제조

디클로로메탄 (0.573 ℓ), 아니솔 (0.086 ℓ) 및 TFA (0.122 ℓ)의 혼합물을 약 20 ℃에서 제조하였다. 생성된 용액을 15 ℃로 냉각하고, 고체 [1-7](OtBu)-NH₂ (0.191 ㎏)를 천천히 첨가하였다. [1-7](OtBu)-NH₂를 첨가하는 동안 온도는 20 ℃ 미만으로 유지시켰다. 반응 혼합물을 10 ℃로 더 냉각하고, 추가분의 TFA (0.365 ℓ)를 약 10 분 동안 첨가하였다. 첨가하는 동안 온도는 20 ℃ 미만으로 유지시켰다. TFA를 모두 첨가한 후, 반응물을 20 ℃에서 교반하고, 이어서 HPLC로 분석하였다.

HPLC 분석은 Platinum EPS 100-5 C18 컬럼, 250*4.6㎜ 상에서 수행하였다. 구배는 15 분 동안 22 ％에서 98 ％ B로 상승되는 것이었고, 용매 A는 수 중 0.1 ％ TFA였고, 용매 B는 아세토니트릴 중 0.1 ％ TFA였다. 검출은 215 nm에서였고, 유속은 1.5 ㎖/분이었고, 온도는 40 ℃였다. 생성물에 비해 <3.0 면적％의 [1-7](OtBu)-NH₂가 남았을 때 반응이 완료되었다.

반응이 완료되었을 때, 혼합물을 10 ℃로 냉각하고, 10 ℃의 2/1 디-이소프로필 에테르 (DIPE)/아세토니트릴 (3.78 ℓ)의 용액을 첨가하였다. 생성된 슬러리를 10 분 동안 10 ℃에서 교반한 후, 진공 하에 여과하였다. 고체를 DIPE와 아세토니트릴의 7/3 혼합물 (0.573 ℓ)로 3회 세정하고, DIPE (0.573 ℓ)로 3회 세정하였다. 생성물을 25 ℃ 이하에서 건조시켰다.

LC/MS 분석으로 (시클로-[1-7]-NH₂)의 질량 [M+H] 832.3이 확인되었다.

회수율은 0.157 ㎏ (87.9 ％)이었고, 순수율은 87.2 ％였다 (펩티드 함량: 79.1 ％를 기초로 함).

순수한 API 내의 함량은 45.8 ％였다. 이러한 값은 하기의 HPLC 방법에 의해 수득하였다: Synergi Max-RP 4 ㎛ 80 Å 250*4.6 ㎜; 용매 A: 52 mM H₃PO₄/CH₃CN/100 mM H7SA (86/14/0.80); 용매 B: 52 mM H₃PO₄/CH₃CN/10O mM H7SA (50/50/0.80); 220 ㎜; 1.3 ㎖/분; 50 ℃; 구배: 45분에 걸쳐 0 ％ B, 이어서 13 분에 걸쳐 45 ％ B로, 이어서 1분에 걸쳐 100 ％ B로.

실시예 9: 엡티피바타이드의 정제

1차 정제:

1차 정제는 트리플루오로아세트산/아세토니트릴을 기초로 하는 정제였다. 개별적인 주분획에 적용된 노르말농도는 ≥92.0 ％였다. 고정상은 직경이 5 ㎝인 Kromasil C18, 10 μm, 100 A 컬럼이었다. 컬럼 압력은 50 바였고, 유속은 50 ㎖/분이었고, 검출 파장은 215 nm였다. 이동상은 하기와 같았다:

용매 A: 가공수(processed water)/CH₃CN (95/5) 내의 TFA 0.1 ％; 및

용매 B: 가공수/CH₃CN (50/50) 내의 TFA 0.1 ％.

컬럼을 15 분에 걸친 100 ％ 용매 A의 용출로 평형화시켰다. 정제 구배는 하기와 같았다: 10분에 걸친 100 ％ 용매 A의 용출; 구배: 60분에 걸쳐 15 ％ B에서 45 ％ B로 상승시킴; 및 15 분에 걸친 100 ％ 용매 B의 용출.

방법 MAD-009-SF323TG1을 사용하여 정제를 모니터링하였고, 표적 허용 기준은 하기와 같았다:

주분획 (F1): ≥92 ％; 및

부분획 (Fp): ≥60 ％ 및 <92 ％.

수집된 분획을 2 ℃ 내지 8 ℃에서 보관하였다.

2차 정제:

2차 정제는 아세트산/아세토니트릴을 기초로 하는 정제였다. 개별적인 주분획에 적용된 노르말농도는 단일 불순물 <0.3/0.5 ％이면서 >99.0 ％였다. 고정상은 직경이 5 ㎝인 Kromasil C18, 10 μm, 100 A 컬럼이었다. 컬럼 압력은 40 ± 5 바였고, 유속은 50 ㎖/분이었고, 검출 파장은 215 nm였다. 이동상은 하기와 같았다:

용매 A: 가공수/CH₃CN (95/5) 내의 AcOH 0.5 ％; 및

용매 B: 가공수/CH₃CN (50/50) 내의 AcOH 0.5 ％.

컬럼을 15 분에 걸친 100 ％ 용매 A의 용출로 평형화시켰다. 정제 구배는 하기와 같았다: 10분에 걸친 100 ％ 용매 A의 용출; 구배: 5분에 걸쳐 0 ％ B에서 15 ％ B로 상승시킴; 60 분에 걸쳐 15 ％ B에서 35 ％ B로 상승시킴; 및 15 분에 걸친 100 ％ 용매 B의 용출.

주분획 (F1): 불순물 <0.3/0.5 ％이면서 ≥99.0 ％; 및

부분획 (Fp): >80.0 ％ 및 <99.0 ％.

수집된 분획을 2 ℃ 내지 8 ℃에서 보관하였다.

탈염 /농축

암모늄 아세테이트 용액 내에서의 이중 탈염 단계를 농축 단계 전에 수행하여, 잔류 트리플루오로아세이트 카운터 이온을 제거하고, 아세테이트 형태의 펩티드를 수득하였다. 농축 단계에서는 가공 용액의 부피가 저하되었다.

NH₄OAc 탈염/AcOH 농축용 고정상은 직경 5 ㎝의 Kromasil C18, 10 ㎛, 100 A 컬럼이었다. 컬럼 압력은 40 ± 5 바였고, 유속은 50 ㎖/분이었고, 검출 파장은 215 nm였다. 이동상은 하기와 같았다:

용매 A: 가공수/CH₃CN (95/5) 내의 AcOH 0.5 ％;

용매 B: 가공수/CH₃CN (50/50) 내의 AcOH 0.5 ％; 및

용매 C: 가공수/CH₃CN (95/5) 내의 NH₄OAc 100 mM pH: 6.5.

컬럼을 15 분에 걸친 100 ％ 용매 A의 용출로 평형화시켰다. 컬럼 로딩(loading)을 위해, AcOH 정제로부터의 주분획을 2배 부피의 가공수로 희석하였다.

탈염은 하기와 같이 수행하였다: 용매 A 10분; 용매 C 10분; 용매 A 10분; 및 용매 C 10분.

농축은 하기와 같이 수행하였다: 용매 A 10 분 및 15 분에 걸친 50 ％ B.

탈염 및 농축을 방법 MAD-009-SF323TG1을 사용하여 모니터링하였고, 표적 허용 기준은 하기와 같았다:

주분획 (F1): 불순물 <0.3/0.5 ％이면서 ≥99.0 ％; 및

부분획 (Fp): >80.0 ％ 및 < 99.0 ％.

수집된 분획을 2 ℃ 내지 8 ℃에서 보관하였다.

본 문서에 인용된 또는 기술된 각 특허, 특허 출원 및 출판물의 전체 개시내용은 거명에 의해 본원에 포함된다.

Claims

하기 화학식 II의 화합물을 제공하는 단계; 및

Har과 Mpa 잔기를 커플링시켜 하기 화학식 III의 화합물을 형성시키는 단계

를 포함하는 방법.

[화학식 II]

[식중,

Har은 호모아르기닐이고;

Gly는 글리실이고;

Asp는 아스파르틸이고;

Trp는 트립토파닐이고;

Pro는 프롤릴이고;

CyS-NH₂는 시스테인아미드이고;

Mpa는 메르캅토프로피온산이고;

P₂는 카르복실 보호기이다]

[화학식 III]
제1항에 있어서, P₂가 t-부틸인 방법.
제1항에 있어서, P₂를 화학식 III의 화합물의 Asp 잔기로부터 제거하여 엡티피바타이드를 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 하기 화학식 I의 화합물의 Har 잔기로부터 P₁을 제거하여 화학식 II의 화합물을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법:

[화학식 I]

[식중, P₁은 아미노 보호기이다].
제4항에 있어서, P₂가 P₁의 제거에 적절한 조건 하에서 안정한 것인 방법.
제4항에 있어서, P₂가 t-부틸인 방법.
제4항에 있어서, P₁이 9-플루오레닐메톡시카르보닐 또는 벤질옥시카르보닐인 방법.
제4항에 있어서, Mpa 잔기를 하기 화학식의 2-7 엡티피바타이드 단편:

P₁-Har-Gly-Asp(O-P₂)-Trp-Pro-ACys-NH₂

[식중 ACyS-NH₂는 활성화된 시스테인아미드 잔기이다]

에 Mpa 잔기와 2-7 엡티피바타이드 단편의 ACys-NH₂ 잔기 사이의 디술피드 결합을 통해 부착시켜, 화학식 I의 화합물을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 하기 화학식의 2-6 엡티피바타이드 단편을 2-6 엡티피바타이드 단편의 Pro 잔기를 통해 활성화된 시스테인아미드 잔기에 커플링시켜, 2-7 엡티바타이드 단편을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

P₁-Har-Gly-Asp(O-P₂)-Trp-Pro-OH.
제9항에 있어서, 활성화된 시스테인아미드 잔기가 H-Cys(Npys)-NH₂인 방법.
제9항에 있어서, 하기 화학식의 2-3 엡티피바타이드 단편:

P₁-Har-Gly-OH

과 하기 화학식의 4-6 엡티피바타이드 단편:

H-Asp(O-P₂)-Trp-Pro-OH

을 2-3 엡티피바타이드 단편의 Gly 잔기를 4-6 엡티피바타이드 단편의 Asp 잔기에 부착시키는 것을 통해 커플링시켜, 2-6 엡티피바타이드 단편을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 보호된 카르복실 측쇄를 갖는 아미노-말단 보호된 Asp 잔기를 Trp-Pro 디펩티드에 디펩티드의 Trp 잔기를 통해 커플링시고, Asp 잔기로부터 아미노-말단 보호기를 제거하여, 4-6 엡티피바타이드 단편을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 아미노-말단 보호된 Har 잔기와 보호 또는 비보호된 Gly 잔기를 커플링시켜 2-3 엡티피바타이드 단편을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
아미노-말단 보호된 호모아르기닌 잔기와 보호 또는 비보호된 글리신 잔기를 커플링시켜 하기 화학식의 2-3 엡티피바타이드 단편을 형성시키는 단계:

P₁-Har-Gly-OH;

보호된 카르복실 측쇄를 갖는 아미노-말단 보호된 아스파르트산 잔기를 트립토판-프롤린 디펩티드에 디펩티드의 트립토판 잔기를 통해 커플링시키고, 아스파르트산 잔기로부터 아미노-말단 보호기를 제거하여, 하기 화학식의 보호된 4-6 엡티피바타이드 단편을 형성시키는 단계:

P₃-Asp(O-P₂)-Trp-Pro-OH;

2-3 엡티피바타이드 단편과 4-6 엡티피바타이드 단편을, 2-3 엡티피바타이드 단편의 Gly 잔기를 4-6 엡티피바타이드 단편의 Asp 잔기에 부착시키는 것을 통해 커플링시켜, 하기 화학식의 2-6 엡티피바타이드 단편을 형성시키는 단계:

P₁-Har-Gly-Asp(O-P₂)-Trp-Pro-OH

[식중

Har은 호모아르기닐이고;

Gly는 글리실이고;

Asp는 아스파르틸이고;

Trp은 트립토파닐이고;

Pro는 프롤릴이고;

P₁ 및 P₃는 아미노 보호기이고;

P₂는 카르복실 보호기이다];

2-6 엡티피바타이드 단편을 활성화된 시스테인아미드 잔기에 2-6 엡티피바타이드 단편의 Pro 잔기를 통해 커플링시켜, 하기 화학식의 2-7 엡티피바타이드 단편을 형성시키는 단계:

P₁-Har-Gly-Asp(O-P₂)-Trp-Pro-ACys-NH₂

[식중 ACyS-NH₂는 활성화된 시스테인아미드 잔기이다];

메르캅토프로피온산 잔기를 2-7 엡티피바타이드 단편에 메르캅토프로피온산 잔기와 2-7 엡티피바타이드 단편의 ACys-NH₂ 잔기 사이의 디술피드 결합을 통해 부착시켜, 하기 화학식 I의 화합물을 형성시키는 단계:

[화학식 I]

[식중

Mpa는 메르캅토프로피온산이고;

CyS-NH₂는 시스테인아미드이다];

화학식 I의 화합물의 Har 잔기로부터 P₁을 제거하여, 하기 화학식 II의 화합물을 형성시키는 단계:

[화학식 II]

;

화학식 II의 화합물의 Har과 Mpa 잔기를 커플링시켜, 하기 화학식 III의 화합물을 형성시키는 단계:

[화학식 III]

; 및

화학식 III의 화합물의 Asp 잔기로부터 P₂를 제거하여, 엡티피바타이드를 형성시키는 단계

를 포함하는 방법.
제14항에 있어서, P₂가 P₁의 제거에 적절한 조건 하에서 안정한 것인 방법.
제14항에 있어서, P₂가 t-부틸인 방법.
제14항에 있어서, P₁이 9-플루오레닐메톡시카르보닐 또는 벤질옥시카르보닐인 방법.
제14항에 있어서, ACys-NH₂가 H-Cys(Npys)-NH₂인 방법.
하기 화학식 IV의 화합물:

[식중

R₁은 수소 또는 P₁이고;

P₁은 아미노 보호기이고;

P₂는 카르복실 보호기이다].
제19항에 있어서, P₂가 t-부틸인 화합물.
제19항에 있어서, R₁이 수소인 화합물.
제21항에 있어서, P₂가 t-부틸인 화합물.
제19항에 있어서, R₁이 P₁인 화합물.
제23항에 있어서, P₁이 9-플루오레닐메톡시카르보닐 또는 벤질옥시카르보닐인 화합물.
제24항에 있어서, P₂가 t-부틸인 화합물.
하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물:

Fmoc-Har-Gly-OH;

Fmoc-Har-Gly-O-P₄; 및

Fmoc-Har-Gly-Asp(O-P₅)-Trp-Pro-OH

[식중

Fmoc는 9-플루오레닐메톡시카르보닐이고;

Har은 호모아르기닌이고;

Gly는 글리신이고;

Asp는 아스파르트산이고;

Trp은 트립토판이고;

Pro는 프롤린이고;

P₄ 및 P₅는 카르복실 보호기이다].
제26항에 있어서, P₄가 펜타플루오로페놀인 화합물.
제26항에 있어서, P₅가 t-부틸인 화합물.
3-니트로-2-피리딘술페닐-시스테인아미드 (H-Cys(Npys)-NH₂).
하기 화학식의 화합물:

.
엡티피바타이드 및 Gly-엡티피바타이드를 포함하는 조성물.
제31항에 있어서, 99 ％ 이상의 엡티피바타이드 및 약 0.01 ％ 내지 약 1 ％ 범위의 Gly-엡티피바타이드를 포함하는 조성물.
제32항에 있어서, 99 ％ 이상의 엡티피바타이드 및 약 0.01 ％ 내지 약 0.1 ％ 범위의 Gly-엡티피바타이드를 포함하는 조성물.
제1항에 따른 방법에 의해 제조된 생성물.
제4항에 따른 방법에 의해 제조된 생성물.
제8항에 따른 방법에 의해 제조된 생성물.
제9항에 따른 방법에 의해 제조된 생성물.
제11항에 따른 방법에 의해 제조된 생성물.
제12항에 따른 방법에 의해 제조된 생성물.
제13항에 따른 방법에 의해 제조된 생성물.
엡티피바타이드 용액을 실리카에 부착된 옥타데실 탄소 사슬을 포함하는 고정상에 접촉시키는 단계;

엡티피바타이드 용액과 접촉된 고정상을 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 용액으로 세정하는 단계;

임의로, 엡티피바타이드 용액과 접촉된 고정상을 아세트산/아세토니트릴 용액으로 세정하는 단계; 및

엡티피바타이드 용액과 접촉된 고정상을 암모늄 산/아세토니트릴 용액으로 세정하는 단계

를 포함하는 엡티피바타이드의 정제 방법.
제41항에 있어서, 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 용액이 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 95 ％ 및 아세토니트릴 용액 5 ％를 포함하는 용액인 방법.
제42항에 있어서, 엡티피바타이드 용액과 접촉된 고정상을 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 50 ％ 및 아세토니트릴 용액 50 ％를 포함하는 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 용액으로 세정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제41항에 있어서, 아세트산/아세토니트릴 용액이 0.5 ％ 아세트산 수용액 95 ％ 및 아세토니트릴 용액 5 ％를 포함하는 용액인 방법.
제44항에 있어서, 엡티피바타이드 용액과 접촉된 고정상을 0.5 ％ 아세트산 수용액 50 ％ 및 아세토니트릴 용액 50 ％를 포함하는 아세트산/아세토니트릴 용액 으로 세정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제41항에 있어서, 암모늄 산/아세토니트릴 용액이 100 mM 암모늄 산 수용액 95 ％ 및 아세토니트릴 용액 5 ％를 포함하는 용액인 방법.