KR20210141600A - 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물의 제조 방법 - Google Patents

글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물의 제조 방법 Download PDF

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산딥 아닥
마노즈 본테
찬드라칸트 쿨칼니
스와미 비라나라야나
니브루띠 족단드
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엔진 바이오사이언스 리미티드
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Abstract

본 발명은 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물을 제조하기 위한 방법과 관련된다. 본 발명은 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드를 제조하기 위한 방법과 더 관련된다. 본 발명은 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 작용제 및 이의 유사물을 제조하기 위한 방법과 특이적으로 관련되고, 여기에서 생성된 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드는 실질적으로 순수하다. 본 발명은 고체 및 용액 상 방법에 의한 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 작용제 및 이의 유사물의 제조와 또한 관련된다.

Description

글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물의 제조 방법
본 발명은 의약품에 관한 것이다. 특이적으로, 본 발명은 글루카곤 유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1, glp-1) 수용체 작용제, 이의 유사물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 특이적으로, 본 발명은, 리라글루티드(liraglutide), D-리라글루티드, 세마글루티드(semaglutide) 및 D-세마글루티드를 포함한 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물를 제조하기 위한 방법과 특이적으로 관련되며, 여기에서 생성된 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드는 실질적으로 순수하다. 본 발명은 고체 상 및 용액 상 방법에 의한 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물의 제조와 또한 관련된다.
배경 설명은 본 발명을 이해하는 데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 여기에 제공된 임의의 정보가 현재 청구된 본 발명의 선행 기술이거나 이와 관련된 것임을 인정하거나 또는 구체적으로 또는 암묵적으로 참조된 임의의 간행물이 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.
글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1)은 장에 의해 생성되고, 포도당 의존적 방식으로 글루카곤 분비를 억제하면서 인슐린 분비를 자극하고, 식욕 및 에너지 섭취량을 감소시키며 위 배출을 지연시킨다. 상기 의약품 종류는 2형 당뇨병을 앓는 환자에게 유익할 수 있는 체중 감소를 촉진하고 SBP를 감소시키는 것으로 또한 입증되었으며, 글루카곤 유사 펩티드-1 수용체 작용제(Glucagon-like peptide-1 receptor agonist, GLP-1 RA)는 새로운 치료제 분류로서 제2형 진성 당뇨병(type 2 diabetes mellitus, T2DM)의 관리에서 임상적 사용을 위해 2005년에 시장에 출시되었다. 2005년 이후, 시장에는 6개의 승인된 제품이 있으며, 최신 제품은 세마글루티드이다. GLP-1R 작용제 세마글루티드는 2형 당뇨병을 치료하도록 최근에 등록되었다. 세마글루티드는 인간 GLP-1(Aib(8), Arg(34))과 비교하여 2개의 아미노산 치환을 갖고, 리신 26에서 유도체화된다.
화학식 (I)로 나타내는 리라글루티드는 인간 GLP-1의 유사물이고, GLP-1 수용체 작용제로 작용한다. 이는 혈당 조절을 개선하기 위해 2형 당뇨병 환자의 치료에 필요하다. 리라글루티드의 펩티드 전구체는 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에서 제조합 DNA의 발현을 포함하는 방법에 의해 일반적으로 생성되며, 34번 위치에서 리신을 아르기닌으로 치환함으로써 천연 인간 GLP-1에 대해 97% 상동성을 갖도록 조작되었다.
리라글루티드 및 세마글루티드 제조를 위한 상이한 방법이 보고되었다. US7572884는 재조합 기술 후 아실화 및 N-말단 연장의 제거에 의해 리라글루티드를 제조하는 방법을 개시한다. WO2017162650은 디이소프로필 에테르 및 아세토니트릴을 포함하는 항-용매와 이를 혼합함으로써 리라글루티드 펩티드 또는 전구체 펩티드의 침전을 포함한 리라글루티드의 제조를 위한 또 다른 방법을 개시한다. WO2014199397은 왕 수지(Wang resin)를 사용하여 고체 상 합성에 의해 리라글루티드를 수득하는 방법을 개시한다. 상기 방법은, 매우 특이적이거나, 산업적 수준으로 구현되기에 복잡하거나, 최종 제품의 만족스럽지 못한 순도 프로필 및 수율 또는 상업적 비실행 가능성 중 어느 하나와 같은 하나 이상의 제한을 겪는다.
GLP1 수용체 작용제의 제조를 위해 공지된 합성 방법이 존재하나, 확장 가능하고 경제적으로 실행 가능한 새로운 합성 반응식을 탐구할 필요성이 여전히 존재한다. 보다 특히 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드를 포함한 상이한 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물을 제조하는 데 적합한 포괄적인 반응식으로 조정 가능하면서 특히 개선된 순도 프로필 및 산업 규모로 적용 가능한 본 발명의 상기 합성 반응식과 같이 공지된 기술과 관련된 하나 이상의 결함을 극복할 수 있는 합성 반응식에 대한 충족되지 않는 필요성이 여전히 존재한다.
발명의 목적
본 발명의 목적은, 기존 필요성을 충족시킬 수 있고 당업계에 존재하는 것으로 발견되는 하나 이상의 결함을 극복할 수 있는 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 이의 제형을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은, 경제적으로 실행 가능한 반응식으로 조정될 수 있는 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은, 산업적으로 확장 가능한 반응식으로 조정될 수 있는 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은, 실질적으로 순수한 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 유사물을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드를 제조하기 위한 화학적 합성 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제, 이의 유사물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하기 위한 방법과 관련된다.
일 측면에서, 본 발명은 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드에서 선택된 실질적으로 순수한 (glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물의 제조와 관련된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 고체 상 방법에 의해 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드에서 선택된 (glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물의 제조와 관련된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 용액 상 방법에 의해 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드에서 선택된 (glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물의 제조와 관련된다.
게다가 또 다른 측면에서, 본 발명은, FMOC 전략을 이용하는 고체 상 또는 용액 상 방법에 의해 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드에서 선택된 (glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물의 제조를 위한 방법과 관련된다.
게다가 또 다른 측면에서, 본 발명은, 반복적인 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH 및 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH에 의해 합성된 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드에서 선택된 (glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물 제조를 위한 방법과 관련된다.
일 측면에서, 본 발명은:
a) 수지에 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 고정, 이를 캡핑하는 단계; 및
b) 상기 고정된 단편이 연속적인 결합의 복수의 주기의 대상이 되는 단계;
여기에서,
복수의 주기는:
- 아미노기를 선택적으로 탈보호하고, 결합제의 존재 하에 N-말단에서 고정되고 탈보호된 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 C-말단을 결합시키는 단계,
- 아미노기를 선택적으로 탈보호하고, 결합제의 존재 하에 옆의 N-보호된 아미노산의 C-말단에 생성된 단편을 결합시키는 단계,
- 상기 결합 단계를 반복하여 원하는 선형 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 유사물의 아미노산 서열을 포함하는 원하는 선형 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물의 아미노산 서열을 수득하는 단계
를 포함하고;
c) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤, Fmoc를 탈보호하고, 수지에 부착된 펩티드의 N-말단을 장쇄 지방산과 결합시키고, 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제의 원하는 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제를 수득하는 단계; 및
d) 선택적으로 상기 미정제 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제를 정제하는 단계;
를 포함하는 (glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물의 제조를 위한 방법을 제공한다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 디펩티드 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 N-말단에서 (b) 단계의 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
d) (c) 단계 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
e) 결합제의 존재 하에 (d) 단계의 단편에 옆의 N-보호된 아미노산의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
f) d) 및 e) 단계를 반복하여 리라글루티드의 각 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 형성하는 단계;
g) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-Glu-OtBu와 (f) 단계의 펩티드 단편을 결합시킨 뒤, Fmoc를 탈보호하고, 수지에 부착된 상기 펩티드의 N-말단을 팔미트산과 결합시키는 단계;
h) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 리라글루티드를 수득하는 단계;
i) 선택적으로 상기 미정제 리라글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 리라글루티드의 제조를 위한 방법과 관련된다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) (a) 단계 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH에; 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH에; 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Ala-OH 및 Boc-His(Trt)-OH에 순차적으로 결합시켜 선형 미정제 리라글루티드의 아미노산 서열을 수득하는 단계;
d) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 (c) 단계의 펩티드 단편을 Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 수지에 부착된 상기 펩티드의 N-말단을 팔미트산과 결합시키는 단계;
e) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 리라글루티드를 수득하는 단계; 및
f) 선택적으로 상기 미정제 리라글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 리라글루티드 제조를 위한 방법과 관련된다.
하나 이상의 측면에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 디펩티드 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
d) (c) 단계 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
e) 결합제의 존재 하에 (d) 단계의 단편에 옆의 N-보호된 아미노산의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
f) d) 및 e) 단계를 반복하여 D-리라글루티드의 각 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 형성하는 단계;
g) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤, Fmoc를 탈보호하고, 수지에 부착된 상기 펩티드의 N-말단을 팔미트산과 결합시키는 단계;
h) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 D-리라글루티드를 수득하는 단계; 및
i) 선택적으로 상기 미정제 D-리라글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 D-리라글루티드 제조를 위한 방법을 제공한다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH에, 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH에, 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-D-Ala-OH 및 Boc-His(Trt)-OH에 순차적으로 결합시켜 선형 미정제 D-리라글루티드의 아미노산 서열을 수득하는 단계;
d) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 수지에 부착된 상기 펩티드의 N-말단을 팔미트산과 결합시키는 단계;
e) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 D-리라글루티드를 수득하는 단계; 및
f) 선택적으로 상기 미정제 D-리라글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 D-리라글루티드 제조를 위한 방법과 관련된다.
일 측면에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
d) (c) 단계 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
e) 결합제의 존재 하에 (d) 단계의 단편에 옆의 N-보호된 아미노산의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
f) d) 및 e) 단계를 반복하여 세마글루티드의 각 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 형성하는 단계;
g) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-PEG2-CH2-COOH 서열, Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤, Fmoc를 탈보호하고, 옥사옥타데칸산과 결합시키는 단계;
h) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 세마글루티드를 수득하는 단계; 및
i) 선택적으로 상기 미정제 세마글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 세마글루티드 제조를 위한 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH에, 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH에, 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-D-Ala-OH 및 Boc-His(Trt)-OH에 순차적으로 결합시켜 세마글루티드의 아미노산 서열을 갖는 선형 미정제 펩티드를 수득하는 단계;
d) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-PEG2-CH2-COOH 서열, Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 옥사옥타데칸산과 결합시키는 단계;
e) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 세마글루티드를 수득하는 단계; 및
f) 선택적으로 상기 미정제 세마글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 세마글루티드 제조를 위한 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
d) (c) 단계 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
e) 결합제의 존재 하에 (d) 단계의 단편에 옆의 N-보호된 아미노산의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
f) d) 및 e) 단계를 반복하여 D-세마글루티드의 각 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 형성하는 단계;
g) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-PEG2-CH2-COOH 서열, Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤, Fmoc를 탈보호하고, 옥사옥타데칸산과 결합시키는 단계;
h) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 D-세마글루티드를 수득하는 단계; 및
i) 선택적으로 상기 미정제 D-세마글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 D-세마글루티드 제조를 위한 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH에, 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH에, 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-D-Ala-OH 및 Boc-His(Trt)-OH에 순차적으로 결합시켜 선형 미정제 D-세마글루티드의 아미노산 서열을 수득하는 단계;
d) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-PEG2-CH2-COOH 서열, Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 옥사옥타데칸산과 결합시키는 단계;
e) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 D-세마글루티드를 수득하는 단계; 및
f) 선택적으로 상기 미정제 D-세마글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 D-세마글루티드 제조를 위한 방법을 제공한다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 제조를 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은:
e) Fmoc-Arg(Pbf)-OH를 수지에 고정하고 이를 캡핑하는 단계;
f) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
g) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 글리신 알킬 에스테르를 결합시키는 단계;
h) 수지로부터 (c) 단계에서 수득된 디펩티드 단편을 절단하는 단계;
i) 선택적으로 미정제 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 정제하는 단계;
를 포함한다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은:
a) Fmoc-Glu(OtBu) -OH를 수지에 고정하고 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 글리신 알킬 에스테르를 결합시키는 단계;
d) 수지로부터 (c) 단계에서 수득된 디펩티드 단편을 절단하는 단계;
e) 선택적으로 미정제 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 정제하는 단계;
를 포함하는 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH의 제조를 위한 방법과 관련된다.
본 발명 주제의 다양한 목적, 특징, 측면 및 장점이 하기 바람직한 구현예의 상세한 기재로부터 보다 명백해질 것이다.
발명의 장점
본 발명은 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드를 포함한 상이한 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물을 제조하는 데 적합한 합성 반응식을 제공한다.
본 발명은 경제적으로 실행 가능한 반응식으로 조정될 수 있는 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물을 제조하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 산업적으로 확장 가능한 반응식으로 조정될 수 있는 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물을 제조하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 실질적으로 순수한 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물을 제조하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물의 제조를 위한 방법을 제공하고, 여기에서 2개의 디펩티드 단편, 즉 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH 및 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH의 사용이 각각의 엔도-Gly 불순물의 감소를 돕는다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 측면을 더 예시하기 위해 포함된다. 본 발명은 여기에 제시된 특정 구현예의 상세한 기재와 함께 도면을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1은 예시적인 구현예 중 하나에 따라 반응식 1에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 리라글루티드의 제조를 위한 프로토콜을 도시하는 플로 차트이다.
도 2는 예시적인 구현예 중 하나에 따라 반응식 2에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 리라글루티드의 제조를 위한 프로토콜을 도시하는 플로 차트이다.
도 3은 예시적인 구현예 중 하나에 따라 반응식 3에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 D-리라글루티드의 제조를 위한 프로토콜을 도시하는 플로 차트이다.
도 4는 예시적인 구현예 중 하나에 따라 반응식 4에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 D-리라글루티드의 제조를 위한 프로토콜을 도시하는 플로 차트이다.
도 5는 예시적인 구현예 중 하나에 따라 반응식 5에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 세마글루티드의 제조를 위한 프로토콜을 도시하는 플로 차트이다.
도 6은 예시적인 구현예 중 하나에 따라 반응식 6에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 세마글루티드의 제조를 위한 프로토콜을 도시하는 플로 차트이다.
도 7은 예시적인 구현예 중 하나에 따라 반응식 7에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 D-세마글루티드의 제조를 위한 프로토콜을 도시하는 플로 차트이다.
도 8은 예시적인 구현예 중 하나에 따라 반응식 8에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 D-세마글루티드의 제조를 위한 프로토콜을 도시하는 플로 차트이다.
하기는 본 발명 구현예의 상세한 설명이다. 구현예는 본 발명을 명확하게 전달할만큼 충분히 상세하다. 그러나, 제공된 세부 사항의 양은 예상되는 구현예의 예상되는 변형을 제한하려는 의도가 아니라; 그와 반대로 첨부된 청구 범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범위 내에 속하는 모든 변형들, 등가물들 및 대안들을 포함하도록 의도된다.
여기의 모든 간행물은, 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조에 의해 포함된 것으로 표시된 것과 같은 동일한 정도로 참조로 포함된다. 포함된 참고 문헌의 용어 정의 또는 사용이 여기에 제공된 상기 용어의 정의와 일치하지 않거나 상반되는 경우, 여기에 제공된 상기 용어의 정의가 적용되고, 참고 문헌의 상기 용어 정의는 적용되지 않는다.
본 명세서 전체에 “일 구현예(one embodiment)” 또는 “구현예(an embodiment)”에 대한 언급은, 상기 구현예와 관련하여 기재된 특정 특징, 구조 또는 특성이 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 곳에서 “일 구현예에서(in one embodiment)” 또는 “구현예에서(in an embodiment)”라는 구절의 출현이 모두 동일한 구현예를 반드시 지칭하는 것은 아니다. 게다가, 특정 특징, 구조 또는 특성이 하나 이상의 구현예에서 적합한 임의의 방식으로 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 특정 구현예를 기재 및 청구하는 데 사용된 성분의 양을 표현하는 수, 특징, 예컨대 농도, 반응 조건 등은 용어 “약(about)”에 의해 일부 경우 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 기재된 설명 및 첨부된 청구 범위에 제시된 수치 파라미터는, 특정 구현예에 의해 수득될 것으로 시도된 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 일부 구현예에서, 수치 파라미터는 보고된 유효 숫자 수를 고려하고 통상의 반올림 기술을 적용함으로써 이해되어야 한다. 본 발명의 일부 구현예의 넓은 범위를 제시하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 제시된 수치 값은 실행 가능한만큼 정확한 것으로 보고된다. 본 발명의 일부 구현예에 제시된 수치 값은, 각 테스트 측정에서 발견된 표준 편차에서 필연적으로 발생하는 특정 오차를 함유할 수 있다.
여기의 기재 및 하기 청구 범위 전체에 사용된 바와 같이, “a”, “an” 및 “the”의 의미는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 또한, 여기의 기재에 사용된 바와 같이, “in”의 의미는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 “in” 및 “on”을 포함한다.
문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 하기 명세서 전체에서, 단어 “포함하다(comprise)” 및 이의 변형, 예컨대 “포함하다(comprises)” 및 “포함하는(comprising)”은 개방적이고 포괄적인 의미로, 즉 “포함하나 이에 국한되지 않는(including, but not limited to)”으로 이해되어야 한다.
여기에서 값의 범위의 인용은, 상기 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 약칭 방법으로서의 역할만이 의도된다. 여기에서 달리 지시하지 않는 한, 각각의 개별 값은, 그것이 여기에 개별적으로 인용된 것과 같이 명세서에 포함된다. 여기에 기재된 모든 방법은, 여기에 달리 지시되거나 문맥상 달리 명확하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 여기의 특정 구현예에 관하여 제공된 임의의 및 모든 실시예 또는 예시적인 언어(예를 들어, “예컨대(such as)”)의 사용은 본 발명을 보다 잘 설명하기 위한 것으로만 의도되고, 달리 청구된 본 발명의 범위에 제한을 제기하는 것은 아니다. 명세서의 어떤 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 비청구된 임의의 요소를 나타내는 것으로 이해되어서는 안된다.
여기에 개시된 본 발명의 대안적인 요소 또는 구현예의 그룹화는 제한으로 이해되어서는 안된다. 각 그룹 멤버는 개별적으로 또는 여기에서 발견되는 상기 그룹의 다른 멤버 또는 다른 요소와 임의의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 멤버가 편의성 및/또는 특허성의 이유로 그룹에 포함되거나 그룹에서 삭제될 수 있다. 상기 임의의 포함 또는 삭제가 발생할 경우, 명세서는 변형된 상기 그룹을 함유하여 첨부된 청구 범위에 사용된 모든 마쿠시 그룹의 기재된 설명을 수행하는 것으로 여기에서 간주된다.
하기 설명 및 그 안에 기재된 구현예는, 본 발명의 원리 및 측면의 실시예 또는 실시예들, 특정 구현예에 대한 예시로 제공된다. 상기 실시예들은 상기 원리 및 본 발명의 제한이 아닌 설명을 위해 제공된다.
본 발명이, 시스템, 방법 또는 장치를 포함한 다양한 방식으로 구현될 수 있음이 또한 인식되어야 한다. 본 명세서에서, 상기 구현 또는 본 발명이 취할 수 있는 임의의 기타 형태가 방법으로 지칭될 수 있다. 일반적으로, 개시된 방법의 단계 순서가 본 발명의 범위 내에서 변경될 수 있다.
여기에 제공된 본 발명의 제목 및 요약은 단지 편의성을 위한 것이며, 구현예의 범위 또는 의미를 설명하지 않는다.
하기 논의는 본 발명 주제의 많은 실시예, 구현예를 제공한다. 각각의 구현예가 발명 요소의 단일 조합을 나타내나, 본 발명의 주제는 개시된 요소의 모든 가능한 조합을 포함하는 것으로 간주된다. 따라서, 일 구현예가 A, B, 및 C 요소를 포함하고, 제2 구현예가 B 및 D 요소를 포함하는 경우, 이어서 본 발명의 주제는 명백하게 개시되지 않았더라도 A, B, C, 또는 D의 남은 기타 조합을 포함하는 것으로 또한 간주된다.
여기에 사용된 바와 같은 다양한 용어가 하기에 도시된다. 청구 범위에 사용된 용어가 하기에 정의되지 않는 한, 출원 시에 인쇄된 간행물 및 발행된 특허에 반영된 바와 같은 상기 용어가 주어진 관련 분야의 당업자에게 가장 넓은 정의로 주어져야 한다.
본 발명은 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제, 이의 유사물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하기 위한 방법과 관련된다.
일 구현예에서, 본 발명은 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드에서 선택된 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제를 실질적으로 순수한 형태로 제조하기 위한 방법과 관련된다.
화학식 (I)로 나타낸 리라글루티드는 인간 GLP-1의 유사물이고 GLP-1 수용체 작용제로 작용한다. 이는 혈당 조절을 개선하기 위해 2형 당뇨병 환자의 치료에 필요하다. 리라글루티드의 펩티드 전구체는 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에서 제조합 DNA의 발현을 포함하는 방법에 의해 일반적으로 생성되며, 34번 위치에서 리신이 아르기닌으로 치환됨으로써 천연 인간 GLP-1에 대해 97% 상동성으로 조작되었다. 리라글루티드는 펩티드 전구체의 26번 위치에 남아 있는 리신 잔기 상에 글루탐산 스페이서를 갖는 C-16 지방산(팔미트산)을 부착함으로써 제조된다.
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys (γ-Glu-팔미토일)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
화학식 (I)
D-리라글루티드는 화학식 (II)로 나타낸 리라글루티드의 유사물이고, GLP-1 수용체 작용제로 작용한다. 이는 천연 리라글루티드의 2번 위치의 아미노산을 D-알라닌으로 교체함으로써 제조된다.
H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-팔미토일)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
화학식 (II)
화학식 (III)으로 나타낸 세마글루티드는 인간 GLP-1의 유사물이고, GLP-1 수용체 작용제로 작용한다. 세마글루티드의 서열은 31개의 아미노산을 함유하는 주사슬을 갖는다. PEG, 글루탐산 및 옥타데칸산 지방족 사슬이 26번 위치의 Lys에 부착될 것이며, 비천연 아미노산 아미노이소부티르산이 이의 8번 위치에 위치한다. 세마글루티드의 아미노산 서열은 하기와 같다:
H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys (PEG2-PEG2-Glu-18 옥소옥타데카노일)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH.
화학식 (III)
화학식 (IV)로 나타낸 D-세마글루티드는 세마글루티드의 유사물이고, GLP-1 수용체 작용제로 작용한다. 상기는 천연 세마글루티드의 2번 위치 아미노산을 D-알라닌으로 교체함으로서 제조된다.
H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(PEG2-PEG2-Glu-18옥소옥타데카노일)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH.
화학식 (IV)
구현예에서, 본 발명은 고체 상 또는 용액 상 방법에 의해 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드에서 선택된 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제의 제조를 위한 방법과 관련된다.
구현예에서, 본 발명은 Fmoc 전략을 이용하는 고체 상 또는 용액 상 방법에 의해 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드에서 선택된 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제의 제조를 위한 방법과 관련된다.
게다가 또 다른 구현예에서, 본 발명은, 반복적인 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH 및 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH에 의해 합성된 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 및 D-세마글루티드에서 선택된 (glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물의 제조를 위한 방법과 관련된다.
구현예에서, 본 발명은:
a) 수지에 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 고정, 이를 캡핑하는 단계; 및
b) 상기 고정된 단편이 연속적인 결합의 복수의 주기의 대상이 되는 단계;
여기에서,
복수의 주기는:
- 아미노기를 선택적으로 탈보호하고, 결합제의 존재 하에 N-말단에서 고정되고 탈보호된 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 C-말단을 결합시키는 단계,
- 아미노기를 선택적으로 탈보호하고, 결합제의 존재 하에 옆의 N-보호된 아미노산의 C-말단에 상기 생성된 단편을 결합시키는 단계,
- 상기 결합 단계를 반복하여 원하는 선형 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 유사물의 아미노산 서열을 포함하는 원하는 선형 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물의 아미노산 서열을 수득하는 단계
를 포함하고;
c) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤, Fmoc를 탈보호하고, 수지에 부착된 상기 펩티드의 N-말단을 장쇄 지방산과 결합시키고; 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제의 원하는 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제를 수득하는 단계; 및
d) 선택적으로 상기 미정제 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제를 정제하는 단계;
를 포함하는 (glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물의 제조를 위한 방법을 제공한다.
여전히 또 다른 구현예에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 디펩티드 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 N-말단에서 (b) 단계의 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
d) (c) 단계 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
e) 결합제의 존재 하에 (d) 단계의 단편에 옆의 N-보호된 아미노산의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
f) d) 및 e) 단계를 반복하여 리라글루티드의 각 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 형성하는 단계;
g) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-Glu-OtBu와 (f) 단계의 펩티드 단편을 결합시킨 뒤, Fmoc를 탈보호하고, 수지에 부착된 상기 펩티드의 N-말단을 팔미트산과 결합시키는 단계;
h) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 리라글루티드를 수득하는 단계;
i) 선택적으로 상기 미정제 리라글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 리라글루티드의 제조를 위한 방법과 관련된다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은:
g) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
h) (a) 단계 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
i) 결합제의 존재 하에 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH에; 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH에; 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Ala-OH 및 Boc-His(Trt)-OH에 순차적으로 결합시켜 선형 미정제 리라글루티드를 수득하는 단계;
j) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 (c) 단계의 상기 펩티드 단편을 Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 수지에 부착된 상기 펩티드의 N-말단을 팔미트산과 결합시키는 단계;
k) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 리라글루티드를 수득하는 단계; 및
l) 선택적으로 상기 미정제 리라글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 리라글루티드의 제조를 위한 방법과 관련된다.
하나 이상의 구현예에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 디펩티드 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
d) (c) 단계 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
e) 결합제의 존재 하에 (d) 단계의 단편에 옆의 N-보호된 아미노산의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
f) d) 및 e) 단계를 반복하여 D-리라글루티드의 각 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 형성하는 단계;
g) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤, Fmoc를 탈보호하고, 수지에 부착된 상기 펩티드의 N-말단을 팔미트산과 결합시키는 단계;
h) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 D-리라글루티드를 수득하는 단계; 및
i) 선택적으로 상기 미정제 D-리라글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 D-리라글루티드의 제조를 위한 방법을 제공한다.
여전히 또 다른 구현예에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH에, 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH에, 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-D-Ala-OH 및 Boc-His(Trt)-OH에 순차적으로 결합시켜 선형 미정제 D-리라글루티드의 아미노산 서열을 수득하는 단계;
d) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 수지에 부착된 상기 펩티드의 N-말단을 팔미트산과 결합시키는 단계;
e) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 D-리라글루티드를 수득하는 단계; 및
f) 선택적으로 상기 미정제 D-리라글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 D-리라글루티드의 제조를 위한 방법과 관련된다.
일 구현예에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
d) (c) 단계 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
e) 결합제의 존재 하에 (d) 단계의 단편에 옆의 N-보호된 아미노산의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
f) d) 및 e) 단계를 반복하여 세마글루티드 서열의 각 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 형성하는 단계;
g) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-PEG2-CH2-COOH 서열, Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤, Fmoc를 탈보호하고, 옥사옥타데칸산과 결합시키는 단계;
h) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 세마글루티드를 수득하는 단계; 및
i) 선택적으로 상기 미정제 세마글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 세마글루티드의 제조를 위한 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH에; 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH에; 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-D-Ala-OH 및 Boc-His(Trt)-OH에 순차적으로 결합시켜 세마글루티드의 아미노산 서열을 갖는 선형 미정제 펩티드를 수득하는 단계;
d) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-PEG2-CH2-COOH 서열, Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 옥사옥타데칸산과 결합시키는 단계;
e) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 세마글루티드를 수득하는 단계; 및
f) 선택적으로 상기 미정제 세마글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 세마글루티드의 제조를 위한 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
d) (c) 단계 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
e) 결합제의 존재 하에 (d) 단계의 단편에 옆의 N-보호된 아미노산의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
f) d) 및 e) 단계를 반복하여 D-세마글루티드의 각 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 형성하는 단계;
g) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-PEG2-CH2-COOH 서열, Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤, Fmoc를 탈보호하고, 옥사옥타데칸산과 결합시키는 단계;
h) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 D-세마글루티드를 수득하는 단계; 및
i) 선택적으로 상기 미정제 D-세마글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 D-세마글루티드의 제조를 위한 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은:
a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고, 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH에; 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH에; 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-D-Ala-OH 및 Boc-His(Trt)-OH에 순차적으로 결합시켜 선형 미정제 D-세마글루티드의 아미노산 서열을 수득하는 단계;
d) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-PEG2-CH2-COOH 서열, Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 옥사옥타데칸산과 결합시키는 단계;
e) 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 D-세마글루티드를 수득하는 단계; 및
f) 선택적으로 상기 미정제 D-세마글루티드를 정제하는 단계;
를 포함하는 D-세마글루티드의 제조를 위한 방법을 제공한다.
여전히 또 다른 구현예에서, 본 발명은 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 제조를 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은:
a) Fmoc-Arg(Pbf)-OH를 수지에 고정하고 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 글리신 알킬 에스테르를 결합시키는 단계;
d) 수지로부터 (c) 단계에서 수득된 상기 디펩티드 단편을 절단하는 단계;
e) 선택적으로 상기 미정제 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 정제하는 단계;
를 포함한다.
여전히 또 다른 구현예에서, 본 발명은:
a) Fmoc-Glu(OtBu)-OH를 수지에 고정하고 이를 캡핑하는 단계;
b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
c) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 글리신 알킬 에스테르를 결합시키는 단계;
d) 수지로부터 (c) 단계에서 수득된 상기 디펩티드 단편을 절단하는 단계;
e) 선택적으로 미정제 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 정제하는 단계;
를 포함하는 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH의 제조를 위한 방법과 관련된다.
구현예에서, 아미노기의 탈보호는 아르기닌에서 수행된다.
일 구현예에서, 고체 상은 수지이다.
일 구현예에서, 수지는 2-클로로트리틸 클로라이드(2-Chlorotrityl chloride, 2-CTC), Sasrin, entaGel S, TentaGel TGA, Rink, Wang, AmphiSpheres 및 기타 적합한 수지에서 선택되나 이에 국한되지 않는다.
일 구현예에서, 캡핑은 N,N-디이소프로필에틸아민(Diisopropylethylamine, DIPEA), 메탄올, 아세트산 무수물 및 이의 조합물에서 선택되나 이에 국한되지 않는 캡핑제로 수행된다.
일 구현예에서, 결합제는 1-히드록시벤조트리아졸(Hydroxybenzotriazole, HOBt), N,N-디이소프로필카르보디이미드(diisopropylcarbodiimide, DIC), 헥사플루오로포스페이트 벤조트리아졸 테트라메틸 우로늄(Hexafluorophosphate Benzotriazole Tetramethyl Uronium, HBTU), N,N-디이소프로필에틸아민(Diisopropylethylamine, DIPEA), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸-아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU) 및 이의 조합물에서 선택되나 이에 국한되지 않는다.
일 구현예에서, 결합 반응을 위한 용매는 DMF, 피리딘, 아세트산 무수물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 디클로로에탄, 1,4-디옥산, 2-메틸 테트라히드로푸란, N-메틸-2-피롤리디논(N-methyl-2-pyrrolidinone, NMP), 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 아세톤, 기타 같은 종류의 것 또는 이의 조합물에서 선택되나 이에 국한되지 않는다.
일 구현예에서, Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH 및 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH와 같은 하나 이상의 반복 디펩티드 단편이 용액 상 방법에 의해 합성된다.
일 구현예에서, 아미노기는, 예를 들어 DMF와 같은 적절한 용매 중 피페리딘, DBU 및 디클로로메탄의 혼합물을 사용하여 당업계에 공지된 방법에 의해 선택적으로 탈보호될 수 있다.
일 구현예에서, 형성된 펩티드는 디플루오로아세트산, 트리플루오로아세트산 등에서 선택되나 이에 국한되지 않는 화학물질을 사용하여 수지에서 절단될 수 있다.
일 구현예에서, 리라글루티드, D-리라글루티드, 세마글루티드 또는 D-세마글루티드에서 선택된 GLP-1 유사물의 정제 방법은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 정제 방법은 분취 역상 HPLC, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 친화도 크로마토그래피 등에서 선택될 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명은 임의의 앞선 청구 범위의 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물을 정제하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은:
a) 미정제 GLP1 수용체 작용제 또는 이의 유사물이 pH 8.5-9.5를 갖는 중탄산 암모늄 및 아세토니트릴을 포함하는 이동상을 갖는 제1 HPLC 정제의 대상이 되는 단계;
b) (a) 단계 유래 풀링(Pooling) 분획이 수집 및 조합되고, 30% B 내지 45% B의 선형 구배로 트리플루오로아세트산 및 아세토니트릴을 포함하는 용출 이동상을 갖는 제2 HPLC 정제의 대상이 되는 단계;
c) (b) 단계의 제2 HPLC 정제에서 수득된 분획이 수산화 암모늄, 아세토니트릴, 아세트산 암모늄 및 정제수를 포함하는 이동상을 갖는 제3 HPLC 정제의 대상이 되는 단계;
d) (c) 단계의 제3 HPLC 정제에서 수득된 분획이 농축되고, 동결 건조의 대상이 되어 정제된 glp-1 수용체 작용제 또는 이의 유사물을 제공하는 단계;
를 포함한다.
일 구현예에서, Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH 및 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH에서 선택된 2개의 디펩티드 단편의 사용이 각각의 엔도-Gly 불순물의 감소를 돕는다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 반응식 1에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 리라글루티드의 제조를 위한 방법과 관련된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 반응식 2에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 리라글루티드의 제조를 위한 방법과 관련된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 반응식 3에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 D-리라글루티드의 제조를 위한 방법과 관련된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 반응식 4에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 D-리라글루티드의 제조를 위한 방법과 관련된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 반응식 5에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 세마글루티드의 제조를 위한 방법과 관련된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 반응식 6에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 세마글루티드의 제조를 위한 방법과 관련된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 반응식 7에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 D-세마글루티드의 제조를 위한 방법과 관련된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 반응식 8에 도시된 바와 같은 단계를 포함하는 D-세마글루티드의 제조를 위한 방법과 관련된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물의 제조를 위한 방법과 관련되고, 여기에서 2개의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH 및 Fmoc-Glu(tBu)-Gly-OH의 사용이 각각의 엔도-Gly 불순물의 감소를 돕는다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물을 정제하기 위한 방법을 또한 제공하고, 상기 방법은:
a) 미정제 GLP1 수용체 작용제 또는 이의 유사물이 pH 8.5-9.5를 갖는 중탄산 암모늄 및 아세토니트릴을 포함하는 이동상을 갖는 제1 HPLC 정제의 대상이 되는 단계;
b) (a) 단계 유래 풀링 분획이 수집 및 조합되고, 30% B 내지 45% B의 선형 구배로 트리플루오로아세트산 및 아세토니트릴을 포함하는 용출 이동상을 갖는 제2 HPLC 정제의 대상이 되는 단계;
c) (b) 단계의 제2 HPLC 정제에서 수득된 분획이 수산화 암모늄, 아세토니트릴, 아세트산 암모늄 및 정제수를 포함하는 이동상을 갖는 제3 HPLC 정제의 대상이 되는 단계;
d) (c) 단계의 제3 HPLC 정제에서 수득된 분획이 농축되고, 동결 건조의 대상이 되어 정제된 glp-1 수용체 작용제 또는 이의 유사물을 제공하는 단계;
를 포함한다.
본 발명은 실질적인 순도를 갖는 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물을 제공하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 산업적 수준으로 확장 가능하다.
본 발명의 다양한 구현예가 상기에 기재되나, 본 발명의 다른 및 추가 구현예가 이의 기본적 범위를 벗어나지 않고 고안될 수 있다. 본 발명의 범위는 하기 청구 범위에 의해 결정된다. 본 발명은, 당업자에게 이용 가능한 정보 및 지식과 조합될 경우 당업자가 본 발명을 제조 및 이용하는 것이 가능하도록 포함된 기재된 구현예, 버전 또는 실시예에 국한되지 않는다.
실시예
본 발명은 하기 실시예의 형태로 더 설명된다. 그러나, 하기 실시예는 단지 예시적이고, 본 발명의 범위에 대한 제한으로 받아들여져서는 안됨이 이해되어야 한다.
약어:
Boc: t-부틸옥시카르보닐(t-Butyloxycarbonyl)
DCM: 디클로로메탄(Dichloromethane)
DIC: N,N′-디이소프로필카르보디이미드(N,N′-Diisopropylcarbodiimide)
DIPEA: 디이소프로필에틸아민(Diisopropylethylamine)
DMF: 디메틸포름아미드(Dimethylformamide)
DODT: 2,2′-(에틸렌디옥시)디에탄티올(2,2′-(Ethylenedioxy)diethanethiol)
Fmoc: 9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)
HBTU: 헥사플루오로포스페이트 벤조트리아졸 테트라메틸우로늄(Hexafluorophosphate benzotriazole tetramethyluronium)
HOBt: N-히드록시벤조트리아졸(N-Hydroxybenzotriazole)
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography)
MTBE: 메틸-t-부틸 에테르(Methyl-t-butyl ether)
Obt: O-벤조트리아졸(O-Benzotriazole)
OtBu: t-부틸 에스테르(tert-Butyl ester)
tBu: t-부틸(tert-Butyl)
TFA: 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid)
Trt: 트리틸(Trityl)
2-CTC: 2-클로로트리틸 클로라이드(2-Chlorotrityl chloride)
HCl: 염산
NaHCO3: 중탄산나트륨
Na2SO4: 황산나트륨
TLC: 박층 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography)
LiOH: 수산화리튬(Lithium hydroxide)
mL: 밀리리터
g: 그램
℃: 섭씨 온도
h: 시간(hour)
min: 분(minutes)
IPA: 이소프로판올(Isopropanol)
vol: 부피
RT: 실온(Room Temperature)
Mmol: 밀리몰(Milli mole)
W/v: 중량/부피(weight/volume)
TIPS: 트리이소프로필실란(Triisopropylsilane)
Ao: 옹스트롬(Angstrom)
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography)
실시예 1
리라글루티드의 합성
1 단계: Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH (1) 단편의 제조
Figure pct00001
Fmoc-Arg(Pbf)-OH (1a) (20 mmol, 12.96 g)의 혼합물에, 100 mL DMF, DIPEA (40 mmol, 7.0 mL) 중 용해된 HBTU (30 mmol, 11.38 g) 및 HOBT (30 mmol, 4.6 g)가 첨가되었다. 실온에서 5 분 동안 혼합물이 교반된 후, 글리신 메틸에스테르 히드로클로라이드 또는 글리신 에틸에스테르 히드로클로라이드(1b) (40 mmol, 5.6 g)가 첨가되었다. 상기 반응이 2-3 h 동안 더 교반되었다. 반응의 진행이 TLC에 의해 모니터링되었다. 이어서 60 mL의 물을 첨가하여 반응을 ?칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합된 유기 상이 수성 0.5N HCl 용액, 수성 5% NaHCO3 용액, 염수로 세척, Na2SO4 상에서 건조, 농축 및 플래시 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제되어 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OMe 또는 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OEt (1c) (12.5 g, 86%)가 수득되었다.
0 ℃에서 THF-물(4:1) (200 mL) 중 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OMe 또는 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OEt (1c) (12.5 g)의 용액에 대해, 40 mL 물 중 LiOHH2O(1.58 g, 38 mmol)의 용액이 10 분의 기간에 걸쳐 조금씩 첨가되었다. 40 분 동안 더 0 ℃에서 교반 후, 반응 혼합물이 2.5%(w/v) 시트르산 용액을 첨가함으로써 pH 3-4로 조정되었고, 에틸 아세테이트를 사용하여 추출되었다. 조합된 유기 상이 염수로 세척, Na2SO4 상에서 건조, 농축 및 플래시 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제되어 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH(1) 단편이 흰색 고체(8.5 g, 71%)로 수득되었다.
2 단계: Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH (2) 단편의 제조
Figure pct00002
Fmoc-Glu(OtBu)-OH (2a) (20 mmol, 8.5 g)의 혼합물에, 100 mL DMF, DIPEA(40 mmol, 7.0 mL) 중 용해된 HBTU(30 mmol, 11.38 g) 및 HOBT(30 mmol, 4.6 g)가 첨가되었다. 실온에서 5 분 동안 혼합물이 교반된 후, HCl.Gly-OMe 또는 Hcl.Gly-OEt (1b) (40 mmol, 5.6 g)가 첨가되었다. 상기 반응이 2-3 h 동안 더 교반되었다. 반응의 진행이 TLC에 의해 모니터링되었다. 이어서 60 mL의 물을 첨가하여 반응을 ?칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합된 유기 상이 수성 0.5N HCl 용액, 수성 5% NaHCO3 용액, 염수로 세척, Na2SO4 상에서 건조, 농축 및 플래시 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제되어 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OMe 또는 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OEt (2b) (8.0 g, 89%)가 수득되었다.
0 ℃에서 THF-물(4:1) (200 mL) 중 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OMe 또는 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OEt (2b) (8.0 g)의 용액에 대해, 40 mL 물 중 LiOHH2O(1.58 g, 38 mmol)의 용액이 10 분의 기간에 걸쳐 조금씩 첨가되었다. 40 분 동안 더 0 ℃에서 교반 후, 반응 혼합물이 2.5%(w/v) 시트르산 용액을 첨가함으로써 pH 3-4로 조정되었고, 에틸 아세테이트를 사용하여 추출되었다. 조합된 유기 층이 염수로 세척, Na2SO4 상에서 건조, 농축 및 플래시 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제되어 Fmoc-Glu(tBu)-Gly-OH (2)가 흰색 고체(5.6 g, 70%)로 수득되었다.
3 단계: 수지 상에 단편 (1)의 고정
Figure pct00003
수지(50 g, 치환=1.0 mmol/g 수지)를 펩티드 합성 플라스크 안에 채우고, 디클로로메탄(500 mL, 10 vol)으로 2회 세척하였다. 상기 수지를 30 분 동안 교반하지 않고 디클로로메탄(dichloromethane, DCM) (500 mL, 10 vol) 중에 현탁했다. 수지를 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH (1) (2.0 당량), DIPEA (3.0 당량) 및 DMF (500 mL, 10 vol)의 투명 혼합물로 첨가했다. 현탁액을 질소 버블링 및 2.0 시간 동안 25-30 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 이어서 반응물을 빼냈고, 수지를 DMF (3 x 10 vol) 및 DCM (3 x 10 vol)으로 세척했다. 수지를 메탄올 중 10% DIPEA의 혼합물로 첨가하였다. 현탁액이 30 분 동안 교반 및 배수되었다. 수지를 DMF (5 x 10 vol)로 세척했다. 이는 Fmoc 수지 단편 (3)을 제공한다.
4 단계: 탈보호된 단편 (4)의 제조
Figure pct00004
Fmoc 수지 단편 (3)을 DMF 로트-1 (10 vol) 중 20% 피페리딘의 투명 혼합물로 첨가했다. 현탁액을 질소 버블링 및 10 분 동안 25-30 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 용매를 빼주었고, 수지를 DMF 로트-2 (10 vol) 중 20% 피페리딘의 투명 혼합물로 첨가하였다. 현탁액을 10 분 동안 25-30 ℃에서 교반했다. 용매를 빼주었고, 수지를 DMF (2 x 10 vol) 및 IPA (1 x 10 vol) 및 DMF (2 x 10 vol)로 세척했다. 탈보호된 단편 (4)를 수득하기 위한 Fmoc-탈보호의 완료가 Kaiser 색상 테스트에 의해 확인되었다.
5 단계: Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-CTC (5) 단편의 제조
Figure pct00005
DMF (10 vol) 중 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH (1) (2.0 당량), N,N-디이소프로필카르보디이미드(DIC) (2.0 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt) (2.0 당량)의 투명 혼합물이 탈보호된 단편 (4)에 결합되었다. 현탁액을 질소 버블링 및 2.0 시간 동안 25-30 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 반응의 진행이 Kaiser 색상 테스트로 모니터링되었다. 반응 완료 후에 반응 용매를 빼냈고, 수지를 DMF (4 x 10 vol)로 세척했다.
6 단계: 기타 Fmoc-보호된 아미노산 (6)의 순차적 결합
DMF (10 vol) 중 Fmoc-보호된 아미노산[Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH 및 Boc-His(Trt)-OH] (2.0 당량), N,N-디이소프로필카르보디이미드(DIC) (2.0 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt) (2.0 당량)의 투명 혼합물이 수지에 첨가되었다. 현탁액을 질소 버블링 및 20-45 분 동안 45-55 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 반응의 진행이 Kaiser 색상 테스트로 모니터링되었다. 반응 완료 후에 반응 용매를 빼냈고, 수지를 DMF (4 x 10 vol)로 세척했다.
Fmoc-탈보호를 위해 단계-4와 동일한 방법 후에 상기 모든 아미노산 단편 탈보호가 수행되었다.
7 단계: N-[1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸](Dde) 탈보호된 수지 단편 (7)의 제조
Figure pct00006
수지 단편 (6)을 DMF 로트-1 (10 vol) 중 3% 히드라진 수화물의 투명 혼합물로 첨가했다. 현탁액을 질소 버블링 및 10 분 동안 25-30 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 용매를 빼주었고, 수지를 DMF 로트-2 (10 vol) 중 3% 히드라진 수화물의 투명 혼합물로 첨가하였다. 현탁액을 10 분 동안 25-30 ℃에서 교반했다. 용매를 빼주었고, 수지를 DMF (2 x 10 vol) 및 IPA (1 x 10 vol) 및 DMF (2 x 10 vol)로 세척했다. Dde-탈보호의 완료가 Kaiser 색상 테스트에 의해 확인되었다.
8 단계: Fmoc-Glu-OtBu 및 팔미트산의 결합
Figure pct00007
(8a) 단계: Fmoc-Glu-OtBu의 결합
DMF (10 vol) 중 Fmoc-Glu-OtBu (2.0 당량), N,N-디이소프로필카르보디이미드(DIC) (2.0 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt) (2.0 당량)의 투명 혼합물이 수지에 첨가되었다. 현탁액을 질소 버블링 및 30 분 동안 45-55 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 반응의 진행이 Kaiser 색상 테스트로 모니터링되었다. 반응 완료 후에 반응 용매를 빼냈고, 수지를 DMF (4 x 10 vol)로 세척했다.
(8b) 단계: Fmoc-탈보호
수지를 DMF 로트-1 (10 vol) 중 20% 피페리딘의 투명 혼합물로 첨가했다. 현탁액을 질소 버블링 및 10 분 동안 25-30 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 용매를 빼주었고, 수지를 DMF 로트-2 (10 vol) 중 20% 피페리딘의 투명 혼합물로 첨가하였다. 현탁액을 10 분 동안 25-30 ℃에서 교반했다. 용매를 빼주었고, 수지를 DMF (2 x 10 vol) 및 IPA (1 x 10 vol) 및 DMF (2 x 10 vol)로 세척했다. Fmoc-탈보호의 완료가 Kaiser 색상 테스트에 의해 확인되었다.
(8c) 단계: 팔미트산의 결합
DMF (10 vol) 중 팔미트산(2.0 당량), N,N-디이소프로필카르보디이미드(DIC) (2.0 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt) (2.0 당량)의 투명 혼합물이 수지에 첨가되었다. 현탁액을 질소 버블링 및 30 분 동안 45-55 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 반응의 진행이 Kaiser 색상 테스트로 모니터링되었다. 반응 완료 후에 반응 용매를 빼냈고, 수지를 DMF (4 x 10 vol)로 세척했다.
9 단계: 미정제 리라글루티드 (9)의 제조
Figure pct00008
2-CTC 수지 결합 보호된 단편 (8)이 펩티드 합성 플라스크에 채워졌다. 수지를 10 분 동안 교반하지 않고 디클로로메탄(DCM) (10 vol) 중에 현탁했다. 수지를 TFA:TIPS:DODT:물(8.5:0.5:0.5:0.5 vol)의 혼합물로 첨가했다. 현탁액을 질소 버블링 및 3.0 시간 동안 25-30 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 수지를 소결 깔때기를 통해 여과했다. 여과액을 0-10 ℃에서 MTBE의 사전 냉각된 혼합물에 첨가했다. 완전한 첨가 후, 반응 혼합물이 0-35 ℃에서 1.0 시간 동안 교반되어 회백색 고체가 침전되었다. 이어서 침전된 고체를 Buckner 깔때기를 통해 여과하고 MTBE로 세척했다. 이어서 흡입 건조된 고체를 일정한 중량까지 35-40 ℃의 진공 오븐에서 건조시켰다.
10 단계: 미정제 리라글루티드의 정제
(10a) 단계: 정제-1
전체 탈보호 후 수득된 3.6 g 미정제 D-리라글루티드 (9)를 300 mL 완충제 A에 용해시켰고, ~0.5 mL의 수산화 암모늄 용액을 사용하여 8.5-9.5로 pH를 조정했고, 하기 파라미터에 따라 정제를 수행했다:
i) 컬럼 사양: 250 x 50 mm SS
ii) 배지 사양: C-18 (3 세대), 10 μ, 100 A˚ 또는 C-18 (3 세대), 10 μ, 120 A˚
iii) 이동상 A: 0.01M 중탄산 암모늄, 이동상 B: 아세토니트릴
iv) 물질 용출을 위한 구배 프로그램: 30 내지 45% B 유량: 50 내지 120 ml/min(150 내지 360 cm/Hr 선형 유량)
v) 풀링 기준: UPLC 순도 ≥ 85% 및 단일 최대 불순도 ≤ 3%인 분획이 정제 2를 위해 풀링되었다.
vi) UPLC 순도 ≤ 85% 및 ≥ 60%인 분획이 추가 정제를 위해 풀링되었다.
(10b) 단계: 정제-2
펩티드 함량 900 mg을 갖는 정제-1 유래 풀링된 분획이 동량의 정제수로 더 희석되었고, 추가 정제가 하기 파라미터에 따라 수행되었다:
i) 컬럼 사양: 250 x 50 mm SS
ii) 배지 사양: C-18 (3 세대), 10 μ, 100 A˚ 또는 C-18 (3 세대), 10 μ, 120 A˚
iii) 이동상 A: 물 중 0.1% TFA, 이동상 B: 아세토니트릴
iv) 물질 용출을 위한 구배 프로그램: 30 내지 45% B 유량: 50 내지 120 ml/min(150 내지 360 cm/Hr 선형 유량)
v) 풀링 기준: HPLC 순도 ≥ 96% 및 단일 최대 불순도 ≤ 0.5%인 분획이 정제 3을 위해 풀링되었다.
vi) HPLC 순도 ≤ 96% 및 ≥ 85%인 분획이 재정제를 위해 풀링되었다.
(10c) 단계: 정제-3
펩티드 함량 1200 mg을 갖는 정제-2 유래 풀링된 분획이 동량의 정제수로 더 희석되었고, 재정제가 하기 파라미터에 따라 수행되었다:
i) 컬럼 사양: 250 x 50 mm SS
ii) 배지 사양: C-18 (3 세대), 10 μ, 100 A˚ 또는 C-18 (3 세대), 10 μ, 120 A˚
iii) 이동상 A: 물 중 0.05% 수산화 암모늄, 이동상 B: 아세토니트릴, 이동상 C: 물 중 3% 아세트산 암모늄, 이동상 D: 정제수
iv) 물질 용출을 위한 구배 프로그램: 20 내지 35% B 유량: 50 내지 120 ml/min(150 내지 360 cm/Hr 선형 유량)
v) 풀링 기준: HPLC 순도 ≥ 98% 및 단일 최대 불순도 ≤ 0.3%인 분획이 정제를 위해 풀링되었다.
vi) HPLC 순도 ≤ 98% 및 ≥ 96%인 분획이 재정제 후에 풀링되었다.
vii) 정제-3 유래 풀링된 분획이 농축되고 동결 건조의 대상이 되어 회백색 내지 흰색 분말로 순수한 리라글루티드 (I)을 수득했다.
viii) 수득된 리라글루티드는 99.0% 이상의 HPLC 순도를 가졌고, 단리된 수율은 9-12% 범위 내였다.
실시예 2
D-리라글루티드의 합성
D-리라글루티드가 하기 방법에 따라 합성되었다.
1 단계 내지 10 단계: 리라글루티드의 합성을 위해 실시예 1에 기재된 동일한 방법이, 단계-6에 사용된 Fmoc-Ala-OH 단편이 Fmoc-D-Ala-OH로 대체된 것을 제외하고 D-리라글루티드의 제조를 위해 수행되었다.
실시예 3
세마글루티드의 합성
세마글루티드가 하기 방법에 따라 합성되었다.
1 단계 내지 7 단계: 단편 1-8이 리라글루티드의 합성을 위해 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 제조되었다.
8 단계: Fmoc-PEG2-CH 2 -COOH, Fmoc-PEG2-CH 2 -COOH, Fmoc-Glu-OtBu 및 18-tBu-18-옥사옥타데칸산의 결합
결합이 단계적 방식으로 하기 반응식에 따라 수행되었다.
Figure pct00009
(8a) 단계: Fmoc-PEG2-CH 2 -COOH의 결합
DMF (10 vol) 중 Fmoc-PEG2-CH2-COOH (2.0 당량), N,N-디이소프로필카르보디이미드(DIC) (2.0 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt) (2.0 당량)의 투명 혼합물이 수지에 첨가되었다. 현탁액을 질소 버블링 및 30 분 동안 45-55 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 반응의 진행이 Kaiser 색상 테스트로 모니터링되었다. 반응 완료 후에 반응 용매를 빼냈고, 수지를 DMF (4 x 10 vol)로 세척했다.
(8b) 단계: Fmoc-탈보호
수지를 DMF 로트-1 (10 vol) 중 20% 피페리딘의 투명 혼합물로 첨가했다. 현탁액을 질소 버블링 및 10 분 동안 25-30 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 용매를 빼주었고, 수지를 DMF 로트-2 (10 vol) 중 20% 피페리딘의 투명 혼합물로 첨가하였다. 현탁액을 10 분 동안 25-30 ℃에서 교반했다. 용매를 빼주었고, 수지를 DMF (2 x 10 vol) 및 IPA (1 x 10 vol) 및 DMF (2 x 10 vol)로 세척했다. Fmoc-탈보호의 완료가 Kaiser 색상 테스트에 의해 확인되었다.
(8c) 단계: Fmoc-PEG2-CH 2 -COOH의 결합
DMF (10 vol) 중 Fmoc-PEG2-CH2-COOH (2.0 당량), N,N-디이소프로필카르보디이미드(DIC) (2.0 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt) (2.0 당량)의 투명 혼합물이 수지에 첨가되었다. 현탁액을 질소 버블링 및 30 분 동안 45-55 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 반응의 진행이 Kaiser 색상 테스트로 모니터링되었다. 반응 완료 후에 반응 용매를 빼냈고, 수지를 DMF (4 x 10 vol)로 세척했다.
(8d) 단계: Fmoc-탈보호
수지를 DMF 로트-1 (10 vol) 중 20% 피페리딘의 투명 혼합물로 첨가했다. 현탁액을 질소 버블링 및 10 분 동안 25-30 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 용매를 빼주었고, 수지를 DMF 로트-2 (10 vol) 중 20% 피페리딘의 투명 혼합물로 첨가하였다. 현탁액을 10 분 동안 25-30 ℃에서 교반했다. 용매를 빼주었고, 수지를 DMF (2 x 10 vol) 및 IPA (1 x 10 vol) 및 DMF (2 x 10 vol)로 세척했다. Fmoc-탈보호의 완료가 Kaiser 색상 테스트에 의해 확인되었다.
(8e) 단계: Fmoc-Glu-OtBu의 결합
DMF (10 vol) 중 Fmoc-Glu-OtBu (2.0 당량), N,N-디이소프로필카르보디이미드(DIC) (2.0 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt) (2.0 당량)의 투명 혼합물이 수지에 첨가되었다. 현탁액을 질소 버블링 및 30 분 동안 45-55 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 반응의 진행이 Kaiser 색상 테스트로 모니터링되었다. 반응 완료 후에 반응 용매를 빼냈고, 수지를 DMF (4 x 10 vol)로 세척했다.
(8f) 단계: Fmoc-탈보호
수지를 DMF 로트-1 (10 vol) 중 20% 피페리딘의 투명 혼합물로 첨가했다. 현탁액을 질소 버블링 및 10 분 동안 25-30 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 용매를 빼주었고, 수지를 DMF 로트-2 (10 vol) 중 20% 피페리딘의 투명 혼합물로 첨가하였다. 현탁액을 10 분 동안 25-30 ℃에서 교반했다. 용매를 빼주었고, 수지를 DMF (2 x 10 vol) 및 IPA (1 x 10 vol) 및 DMF (2 x 10 vol)로 세척했다. Fmoc-탈보호의 완료가 Kaiser 색상 테스트에 의해 확인되었다.
(8g) 단계: 18-tBu-18-옥사옥타데칸산의 결합
DMF (10 vol) 중 18-tBu-18-옥사옥타데칸산 (2.0 당량), N,N-디이소프로필카르보디이미드(DIC) (2.0 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt) (2.0 당량)의 투명 혼합물이 수지에 첨가되었다. 현탁액을 질소 버블링 및 30 분 동안 45-55 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 반응의 진행이 Kaiser 색상 테스트로 모니터링되었다. 반응 완료 후에 반응 용매를 빼냈고, 수지를 DMF (4 x 10 vol)로 세척했다.
9 단계: 미정제 세마글루티드 (9)의 제조
Figure pct00010
2-CTC 수지 결합 보호된 단편 (8)이 펩티드 합성 플라스크에 채워졌다. 수지를 10 분 동안 교반하지 않고 디클로로메탄(DCM) (10 vol) 중에 현탁했다. 수지를 TFA:TIPS:DODT:물(8.5:0.5:0.5:0.5 vol)의 혼합물로 첨가했다. 현탁액을 질소 버블링 및 3.0 시간 동안 25-30 ℃에서 가벼운 교반 하에 부드럽게 저어주었다. 수지를 소결 깔때기를 통해 여과했다. 여과액을 0-10 ℃에서 MTBE의 사전 냉각된 혼합물에 첨가했다. 완전한 첨가 후, 반응 혼합물이 0-35 ℃에서 1.0 시간 동안 교반되어 회백색 고체의 세마글루티드가 침전되었다. 이어서 침전된 고체를 Buckner 깔때기를 통해 여과하고 MTBE로 세척했다. 이어서 흡입 건조된 고체를 일정한 중량까지 35-40 ℃의 진공 오븐에서 건조시켰다.
실시예 4
D-세마글루티드의 합성
세마글루티드가 하기 방법에 따라 합성되었다.
1 단계 내지 10 단계: 세마글루티드의 합성을 위해 실시예 3에 기재된 바와 동일한 방법이, 단계-6에 사용된 Fmoc-Ala-OH 단편이 Fmoc-D-Ala-OH로 교체된 것을 제외하고 D-세마글루티드의 제조를 위해 수행되었다.
상기 실시예는 단지 예시적이고, 본 발명의 범위에 대한 제한으로 받아들여져서는 안된다. 개시된 구현예에 대한 다양한 변화 및 변형이 당업자에게 명백할 것이다. 상기 변화 및 변형이 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ENZENE BIOSCIENCES LIMITED <120> PROCESS OF PREPARATION OF GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-1 (GLP-1) RECEPTOR AGONISTS AND THEIR ANALOGS <130> PCT-IN-5893 <140> PCT/IB2020/052504 <141> 2020-03-19 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> H-His <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys(gamma-Glu-palmitoyl) <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Gly-OH <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> H-His <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys(gamma Glu plamitoyl) <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Gly-OH <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> H-His <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys(PEG2-PEG2-Glu-18oxooctadecanoyl) <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Gly-OH <400> 3 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> H-HIS <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys(PEG2-PEG2-Glu-18oxooctadecanoyl) <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Gly-OH <400> 4 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Boc-His(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Asp(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Tyr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gln(trt) <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys(Dde) <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Trp(Boc) <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Gly-O-2-CTC <400> 5 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Boc-His(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Asp(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Tyr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gln(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys(NH2) <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Trp(Boc) <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Gly-O-2-CTC <400> 6 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Boc-His(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Asp(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Tyr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gln(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys(Glu-OtBu-Palmitoyl) <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Trp(Boc) <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Gly-O-2-CTC <400> 7 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Boc-His(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Asp(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Tyr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gln(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys(Dde) <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Trp(Boc) <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Gly-O-2-CTC <400> 8 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Boc-His(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Asp(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Tyr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gln(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys(NH2) <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Trp(Boc) <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Gly-O-2-CTC <400> 9 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 10 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Boc-His(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Asp(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Tyr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gln(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys(Glu-OtBu-Palmitoyl) <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Trp(Boc) <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Gly-O-2-CTC <400> 10 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Boc-His(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Glu(Otbu) <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Asp(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Tyr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gln(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys(PEG2-PEG2-Glu-OtBu-18-tBu-oxooctadecanoyl) <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Trp(Boc) <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Gly-O-2-CTC <400> 11 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Boc-His(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Thr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Asp(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Ser(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Tyr(tBu) <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Glu(OtBu) <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gln(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys(PEG2-PEG2-Glu-Otbu-18-tBu-oxooctadecanoyl) <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> OtBu <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Trp(Boc) <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Gly-O-2-CTC <400> 12 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30

Claims (14)

  1. 글루카곤 유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1, glp-1) 수용체 작용제(agonist) 또는 이의 유사물의 제조를 위한 방법으로서,
    상기 방법은:
    a) 수지에 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 고정하고, 이를 캡핑(capping)하는 단계; 및
    b) 상기 고정된 단편이 순차적 결합의 복수의 주기의 대상이 되는 단계;
    여기에서,
    상기 복수의 주기는:
    c) 선택적으로 아미노기를 탈보호하고, 결합제의 존재 하에 N-말단에서 상기 고정되고 탈보호된 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 C-말단을 결합하는 단계,
    - 선택적으로 아미노기를 탈보호하고, 결합제의 존재 하에 다음의 N-보호된 아미노산의 C-말단에 상기 생성된 단편을 결합하는 단계,
    - 상기 결합 단계를 반복하여, 원하는 선형 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 또는 유사물의 아미노산 서열을 포함하는 원하는 선형 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물의 아미노산 서열을 수득하는 단계;
    를 포함하고;
    d) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-Glu-OtBu 장쇄 지방산과 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 상기 수지에 부착된 펩티드의 N-말단을 장쇄 지방산과 결합시키고; 상기 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 원하는 선형 미정제 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제를 수득하는 단계; 및
    e) 선택적으로 상기 미정제 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제를 정제하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  2. 리라글루티드의 제조를 위한 방법으로서,
    상기 방법은:
    a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고 이를 캡핑하는 단계;
    b) 상기 고정된 디펩티드 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
    c) 결합제의 존재 하에 N-말단에서 (b) 단계의 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
    d) (c) 단계의 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
    e) 결합제의 존재 하에 (d) 단계의 단편에 다음의 N-보호된 아미노산의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
    f) d) 및 e) 단계를 반복하여 리라글루티드의 각 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 형성하는 단계;
    g) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 (f) 단계의 상기 펩티드 단편을 Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 상기 수지에 부착된 N-말단 펩티드를 팔미트산과 결합시키는 단계;
    h) 상기 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 리라글루티드를 수득하는 단계;
    i) 선택적으로 상기 미정제 리라글루티드를 정제하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 리라글루티드의 제조를 위한 방법으로서,
    상기 방법은:
    a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고 이를 캡핑하는 단계;
    b) (a) 단계의 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
    c) 결합제의 존재 하에, 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH에; 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH에; 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Ala-OH 및 Boc-His(Trt)-OH에 순차적으로 결합시켜 선형 미정제 리라글루티드를 수득하는 단계;
    d) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 (c) 단계의 펩티드 단편을 Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 상기 수지에 부착된 N-말단 펩티드를 팔미트산과 결합시키는 단계;
    e) 상기 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 리라글루티드를 수득하는 단계; 및
    f) 선택적으로 상기 미정제 리라글루티드를 정제하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. D-리라글루티드의 제조를 위한 방법으로서,
    상기 방법은:
    a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고 이를 캡핑하는 단계;
    b) 상기 고정된 디펩티드 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
    c) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
    d) (c) 단계 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
    e) 결합제의 존재 하에 (d) 단계의 단편에 다음 N-보호된 아미노산의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
    f) d) 및 e) 단계를 반복하여 D-리라글루티드의 각 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 형성하는 단계;
    g) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 상기 수지에 부착된 펩티드의 N-말단을 팔미트산과 결합시키는 단계;
    h) 상기 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 D-리라글루티드를 수득하는 단계; 및
    i) 선택적으로 상기 미정제 D-리라글루티드를 정제하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. D-리라글루티드의 제조를 위한 방법으로서,
    상기 방법은:
    a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고 이를 캡핑하는 단계;
    b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
    c) 결합제의 존재 하에 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH, Fmoc-D-Ala-OH 및 Boc-His(Trt)-OH 단편에서 선택된 아미노산 단편을 순차적으로 결합시켜 선형 미정제 D-리라글루티드 아미노산 서열을 수득하는 단계;
    d) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 상기 수지에 부착된 펩티드의 N-말단을 팔미트산과 결합시키는 단계;
    e) 상기 수지에서 상기 펩티드를 절단하여 선형 미정제 D-리라글루티드를 수득하는 단계; 및
    f) 선택적으로 상기 미정제 D-리라글루티드를 정제하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 세마글루티드의 제조를 위한 방법으로서,
    상기 방법은:
    a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고 이를 캡핑하는 단계;
    b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
    c) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
    d) (c) 단계 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
    e) 결합제의 존재 하에 (d) 단계의 단편에 다음 N-보호된 아미노산의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
    f) d) 및 e) 단계를 반복하여 세마글루티드 서열의 각 아미노산을 갖는 펩티드 서열을 형성하는 단계;
    g) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-PEG2-CH2-COOH 서열, Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 옥사옥타데칸산과 결합시키는 단계;
    h) 상기 수지에서 펩티드를 절단하여 선형 미정제 세마글루티드를 수득하는 단계; 및
    i) 선택적으로 상기 미정제 세마글루티드를 정제하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 세마글루티드의 제조를 위한 방법으로서,
    상기 방법은:
    j) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고 이를 캡핑하는 단계;
    k) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
    l) 결합제의 존재 하에 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH에; 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH에; 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-D-Ala-OH 및 Boc-His(Trt)-OH에 순차적으로 결합시켜 세마글루티드의 아미노산 서열을 갖는 선형 미정제 펩티드를 수득하는 단계;
    m) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-PEG2-CH2-COOH 서열, Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 옥사옥타데칸산과 결합시키는 단계;
    n) 상기 수지에서 펩티드를 절단하여 선형 미정제 세마글루티드를 수득하는 단계; 및
    o) 선택적으로 상기 미정제 세마글루티드를 정제하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. D-세마글루티드의 제조를 위한 방법으로서,
    상기 방법은:
    a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고 이를 캡핑하는 단계;
    b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
    c) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 하나 이상의 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
    d) (c) 단계의 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
    e) 결합제의 존재 하에 (d) 단계의 단편에 다음의 N-보호된 아미노산의 카르복시 말단을 결합시키는 단계;
    f) d) 및 e) 단계를 반복하여 D-세마글루티드의 각 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 형성하는 단계;
    g) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-PEG2-CH2-COOH 서열, Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 옥사옥타데칸산과 결합시키는 단계;
    h) 상기 수지에서 펩티드를 절단하여 선형 미정제 D-세마글루티드를 수득하는 단계; 및
    i) 선택적으로 상기 미정제 D-세마글루티드를 정제하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. D-세마글루티드의 제조를 위한 방법으로서,
    상기 방법은:
    a) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 수지에 고정하고 이를 캡핑하는 단계;
    b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
    c) 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH에; 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH에; 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 아미노산 단편 Fmoc-D-Ala-OH 및 Boc-His(Trt)-OH에 순차적으로 결합시켜 D-세마글루티드의 아미노산 서열을 갖는 선형 미정제 펩티드를 수득하는 단계;
    d) 리신 측쇄 보호기를 제거한 뒤 Fmoc-PEG2-CH2-COOH 서열, Fmoc-Glu-OtBu와 결합시킨 뒤 Fmoc를 탈보호하고, 옥사옥타데칸산과 결합시키는 단계;
    e) 상기 수지에서 펩티드를 절단하여 선형 미정제 D-세마글루티드를 수득하는 단계; 및
    f) 선택적으로 상기 미정제 D-세마글루티드를 정제하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH의 제조를 위한 방법으로서,
    상기 방법은:
    a) 수지에 Fmoc-Arg(Pbf)-OH를 고정하고 이를 캡핑하는 단계;
    b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
    c) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 글리신 알킬 에스테르를 결합시키는 단계;
    d) 상기 수지로부터 (c) 단계에서 수득된 디펩티드 단편을 절단하는 단계;
    e) 선택적으로 상기 미정제 디펩티드 단편 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH를 정제하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH의 제조를 위한 방법으로서,
    상기 방법은:
    a) 수지에 Fmoc-Glu(OtBu)-OH를 고정하고 이를 캡핑하는 단계;
    b) 상기 고정된 단편의 아미노기를 선택적으로 탈보호하는 단계;
    c) 결합제의 존재 하에 (b) 단계의 단편에 글리신 알킬 에스테르를 결합시키는 단계;
    d) 상기 수지로부터 (c) 단계에서 수득된 디펩티드 단편을 절단하는 단계;
    e) 선택적으로 상기 미정제 디펩티드 단편 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH를 정제하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합제는 1-히드록시벤조트리아졸(Hydroxybenzotriazole, HOBt), N,N-디이소프로필카르보디이미드(diisopropylcarbodiimide, DIC), 헥사플루오로포스페이트 벤조트리아졸 테트라메틸 우로늄(Hexafluorophosphate Benzotriazole Tetramethyl Uronium, HBTU), N,N-디이소프로필에틸아민(Diisopropylethylamine, DIPEA), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸-아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU)에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 반응을 위한 용매는 디메틸포름아미드(Dimethylformamide, DMF), 피리딘, 아세트산 무수물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 디클로로에탄, 1,4-디옥산, 2-메틸 테트라히드로푸란, N-메틸-2-피롤리디논(N-methyl-2-pyrrolidinone, NMP), 에틸 아세테이트, 아세토니트릴 및 아세톤에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 또는 이의 유사물을 정제하기 위한 방법으로서,
    상기 방법은:
    a) 미정제 GLP1 수용체 작용제 또는 이의 유사물이 pH 8.5-9.5를 갖는 중탄산 암모늄 및 아세토니트릴을 포함하는 이동상을 갖는 제1 HPLC 정제의 대상이 되는 단계;
    b) (a) 단계로부터 풀링 분획(pooled fractions)이 수집 및 조합되고, 30% B 내지 45% B의 선형 구배로 트리플루오로 아세트산 및 아세토니트릴을 포함하는 용출 이동상을 갖는 제2 HPLC 정제의 대상이 되는 단계;
    c) (b) 단계의 제2 HPLC 정제에서 수득된 분획이 수산화 암모늄, 아세토니트릴, 아세트산 암모늄 및 정제수를 포함하는 이동상을 갖는 제3 HPLC 정제의 대상이 되는 단계;
    d) (c) 단계의 제3 HPLC 정제에서 수득된 분획이 농축되고, 동결 건조의 대상이 되어 정제된 glp-1 수용체 작용제 또는 이의 유사물을 제공하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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