CN114945580A

CN114945580A - 用于合成南吉博肽的方法

Info

Publication number: CN114945580A
Application number: CN202180006396.9A
Authority: CN
Inventors: 卡布瑞; 维奥拉; 瑞奇; 奥兰丁; 德帕奥拉
Original assignee: Beijing Fresenius Kabi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Beijing Fresenius Kabi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-01-15
Filing date: 2021-01-14
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2041-01-14
Also published as: WO2021144388A1; CN114945580B

Abstract

本发明涉及一种用于南吉博肽（nangibotide）的基于片段的制造方法，所述南吉博肽为一种有前景的具有抗炎活性的肽药物。本发明还公开了涉及于以高产率和纯度得到产物的方法中的肽中间体。

Description

用于合成南吉博肽的方法

技术领域

本发明涉及一种用于肽，特别地南吉博肽(nangibotide)和其相关中间体的制造方法。

背景技术

南吉博肽(SEQ ID No 1)也称为LR12，由式(I)表示：

并且还指示为：

LQEEDAGEYGCM。

南吉博肽为靶向免疫受体TREM-1(在骨髓细胞上表达的触发受体-1)的第一临床阶段药剂，并且正在作为用于急性发炎性病症例如脓毒性休克的新颖疗法进行研究(《英国临床药理学杂志(Br J Clin Pharmacol)》(2018)，84，2270-2279，2270)。

法国国家健康与医学研究院(Inserm)的WO2011124685首先公开了所述产品，而似乎没有描述具体制备。因此，需要提供一种以工业规模制造南吉博肽的有效方法。本发明的方法满足了这种需要。

发明内容

已经发明出一种南吉博肽的SPPS(固相肽合成)制剂，并在此对其进行了报道。特别地，公开了一种南吉博肽的基于片段的合成，所述合成以高产率和纯度产生了粗肽。

所述合成提供了一种高效、简单并且可行的方法，允许获得南吉博肽并且具有重要的工业应用。

本发明提供了一种通过会聚性的基于片段的固相缩合来制备南吉博肽的方法。

用于制备呈固相的南吉博肽(I)的方法包含以下步骤：

a)使N端南吉博肽片段A与C端南吉博肽片段B偶合，其中，

具有片段A的活性羧酸属于非手性氨基酸，并且其中，片段B与树脂连接；其中，彼此偶合的两个片段产生具有南吉博肽的氨基酸序列的肽；

b)使南吉博肽脱保护并且从所述树脂中裂解。

具体实施方式

术语“肽片段”或“片段”描述了具有部分南吉博肽氨基酸序列的肽，其可以在其C端氨基酸处游离或连接至树脂并且可以在其N端α-氨基处和在氨基酸侧链处独立地受保护或未受保护。术语“受保护的片段”或“受保护的肽片段”描述了独立地带有末端保护基团或侧链保护基团或其两者的片段。

片段也可以用具体氨基酸序列如

aa¹-aa²-…-aaⁿ指示

其中，aa^x为X位中氨基酸的三字母代码，并且其中，在侧链上或在α-氨基上存在或不存在保护基团未确定。在某些条件下合成肽期间保护氨基酸侧链的必要性为所属领域中已知的，并且已经描述了鉴别合适保护策略的各种策略。

如果在本说明书中针对具体氨基酸序列(片段)，特定地提及了在括号内伴随氨基酸的三字母代码的侧链保护基团，则应当理解，在所述片段中以简单的三字母代码表示的剩余氨基酸为不受保护的。

当片段用

aa¹-aa²-…-aaⁿ-OH指示时，

预期C端氨基酸aaⁿ具有游离羧酸。

当片段用

H-aa¹-aa²-…-aaⁿ指示时，

预期N端氨基酸aa¹具有游离α-氨基。

术语“树脂”或“固体载体”描述了可以与氨基酸或肽片段连接并且适用于延伸氨基酸直到获得完整期望序列的功能化不溶性聚合物。

SPPS可以定义为其中通过连续添加构成肽序列的任选地受保护的氨基酸来组装通过肽C端氨基酸锚定到树脂的肽的过程。其包含将第一受α-氨基保护的氨基酸或肽装载到树脂上，之后重复称为循环或延伸步骤的一系列步骤，所述步骤由α-氨基保护基团的裂解和后续受保护的氨基酸的偶合组成。

两个氨基酸之间或氨基酸与肽片段之间或两个肽片段之间形成肽键为偶合步骤，实际上可以涉及以下两个步骤：首先，活化游离羧基，这可能花费在5分钟与2小时之间的任何时间；然后，在活化的羧基处亲核性攻击氨基。

可以依次重复循环直到获得期望肽序列。

最后，使肽脱保护和/或从树脂中裂解。

作为SPPS参考，请参见例如Knud J.Jensen等人(编)，肽合成和应用(PeptideSynthesis and Applications)中的用于固相肽合成的连接子、树脂和通用程序(Linkers，Resins，and General Procedures for Solid-PhasePeptide Synthesis)，《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》，第1047卷，施普林格科学(Springer Science)，2013。

因为南吉博肽为肽酰胺(即，其具有作为C端官能团的酰胺)，因此必须使用酸敏感树脂用于南吉博肽制备，其在裂解后得到肽酰胺并且选自Rink酰胺、Pal和Sieber树脂。更优选地，使用Rink酰胺MBHA树脂用于本发明的南吉博肽制备和C端片段B制备。

对于在参与另一个偶合步骤之前从固体载体裂解的片段A或任何南吉博肽片段的SPPS制备，可以使用其它树脂。所述树脂选自2-氯三苯甲基氯(CTC)树脂和三苯甲基氯树脂。优选地，使用CTC树脂用于片段A制备，并且片段A在与片段B偶合之前从树脂中裂解。

在本发明的一个优选实施例中，将第一C端氨基酸装载到树脂上是任选地在存在碱的情况下在合适的溶剂，优选地DMF中溶胀树脂之后和在过滤树脂以除去过量溶剂或将受保护的氨基酸与活化剂例如碳二亚胺的溶液直接添加到树脂中来进行。在使用三苯甲基氯树脂的情况下，或特别地当使用CTC树脂时，在合适的溶剂，优选地DCM中溶胀树脂之后，添加受保护的氨基酸与有机碱，优选地二异丙基乙胺(DIPEA)的溶液。

在本发明的另一个优选实施例中，在已经将第一C端氨基酸装载到树脂上之后，执行了用于封闭未反应位点的额外步骤，这通常称为“封端”，这将避免截短序列并防止任何副反应。

封端是通过用大量过量的高反应性未受阻试剂对装载树脂进行短暂处理来实现，所述试剂是根据要封端的未反应位点来加以选择的。当使用王氏树脂(Wang resin)时，未反应位点为羟基，所述羟基优选地通过在碱性介质中用酸衍生物例如酸酐进行处理，例如用DMF/DIEA/Ac₂O混合物或Ac₂O 10％DMF溶液进行处理来进行封端。

当使用CTC树脂时，未反应位点为氯原子，所述氯原子优选地通过在碱性介质中用醇进行处理，例如用DCM/DIPEA/MeOH混合物进行处理来进行封端。然后，在用DCM洗涤后，用DCM/DIEA/Ac₂O混合物进一步处理树脂，以封端可能由氯化物水解产生的羟基。

作为第一C端氨基酸装载的替代方案，可以使用预装载的树脂用于肽片段制备中。这些预装载的树脂为带有连接的受Fmoc保护的L-氨基酸或D-氨基酸的市售王氏树脂/CTC树脂。

在本发明的一个优选实施例中，将第一C端氨基酸装载到树脂上是通过分光光度法测定的，例如描述于Knud J.Jensen等人(编)，肽合成和应用(Peptide Synthesis andApplications)，《分子生物学方法》，第1047卷，施普林格科学，2013中。

在本发明的一个优选实施例中，每个氨基酸可以在其α-氨基和/或其侧链官能团处受到保护。

如本文所用，术语“末端保护基团”是指氨基酸或肽或肽片段的α-氨基的保护基团。所用末端保护基团的类型取决于所用树脂的类型和侧链保护所需的保护基团。优选地，用于SPPS的末端保护基团是氨基甲酸酯类型。最优选的保护基团为9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基团，其可以在碱性条件下被除去。在本文中，对于片段A和片段B两者，末端保护基团优选为9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)。

氨基酸侧链官能团任选地受在偶合步骤期间和在除去α-氨基保护基团期间一般稳定并且本身在合适条件下可除去的基团保护。所述合适的条件一般与使α-氨基脱保护的条件正交。本文所使用的氨基酸侧链官能团的保护基团一般在酸性条件下可除去，与一般用于使Fmoc保护基团脱保护的碱性条件正交。

在本发明的一个优选方面中，每个出现在南吉博肽序列中的单独氨基酸的所述侧链保护基团是规定的，如下：

酪氨酸(Tyr)的羟基优选地受选自由以下组成的组的基团保护：三苯甲基(Trt)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)和叔丁基(tBu)；更优选地，使用叔丁基(tBu)基团；

谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)的羧基优选地受选自由以下组成的组的酯保护：2-苯基异丙酯(O-2-PhiPr)、tBu酯(OtBu)、苄酯(OBzl)和烯丙酯(OAll)；更优选地，使用tBu酯；

谷氨酰胺(Gln)的酰胺基团优选地受选自由以下组成的组的基团保护：2，4，6-三甲氧基苄基(Tmob)、苄基(Bzl)和三苯甲基(Trt)；更优选地，使用三苯甲基(Trt)；

半胱氨酸(Cys)的巯氢基优选地受选自由以下组成的组的基团保护：4-甲氧基三苯甲基、苄基(Bzl)、叔丁基(tBu)和三苯甲基(Trt)；更优选地，使用三苯甲基(Trt)。

通常使用市售的受保护的L-氨基酸。

在本发明的一个优选方面中，偶合步骤是在存在偶合剂的情况下执行。

优选地，偶合剂选自由以下组成的组：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和乙基-二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDC)。更优选地，反应是在存在N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)的情况下进行。

在本发明的一个优选方面中，偶合步骤也在存在添加剂的情况下执行。当用于偶合反应中时，添加剂的存在已经被描述为减少了羧酸残基处的构型损失，提高了偶合速率并降低了外消旋化风险。

优选地，添加剂选自由以下组成的组：1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-羟基吡啶N-氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、内-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰胺、5-(羟基亚氨基)1，3-二甲基嘧啶-2，4，6-(1H，3H，5H)-三酮(Oxyma-B)和2-氰基-2-羟基亚氨基-乙酸乙酯(OxymaPure)。更优选地，添加剂选自由以下组成的组：1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-羟基吡啶N-氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、内-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰胺和2-氰基-2-羟基亚氨基-乙酸乙酯(OxymaPure)。甚至更优选地，反应是在存在2-氰基-2-羟基亚氨基-乙酸酯(OxymaPure)的情况下进行。

特别优选地在存在DIC和OxymaPure的情况下进行偶合步骤。

在本发明的一个优选方面中，偶合步骤是在选自由DMF、DCM、THF、NMP、DMA或其混合物组成的组的溶剂中执行。更优选地，偶合步骤是在DMF中进行。

偶合步骤一般在10℃与70℃之间的温度下进行；优选地，在约20℃(通常称为室温)与约50℃之间的温度下进行，更优选地，温度是在20-35℃范围内。

在本发明的一个优选方面中，α-氨基保护基团是在碱性条件下被裂解。特别地，Fmoc保护基团是通过用选自由哌啶、吡咯烷、哌嗪、叔丁胺和DBU组成的组的合适仲胺或伯胺、优选地用哌啶处理来进行裂解。更优选地，Fmoc脱保护是通过使用20％哌啶/DMF溶液来进行。

在本发明的一个优选方面中，一旦已经根据如上所描述的SPPS(逐步或基于片段)获得期望肽片段或最终肽并且所述期望肽片段或最终肽仍与其固体载体连接，就以单一步骤或依序执行最终脱保护和/或从所述固体载体裂解，从而得到粗肽。优选地，进行单一步骤，并且通过使用针对所用树脂和保护基团而个性化的特定混合物，更优选地在酸性或微酸性条件下执行所述步骤。

当使用CTC树脂时，可以例如通过用HFIP∶DCM(30∶70v/v)或1-2v/v％TFA溶液/DCM的混合物处理来执行裂解步骤。特别地，当使用CTC树脂用于片段A或另一个南吉博肽片段制备中时，所述裂解不会除去α-氨基保护基团或侧链保护基团，因此产生完全受保护的片段，准备在其游离C端羧酸处发生反应。

任选地，使用清除剂。清除剂为能够在裂解环境中最小化敏感性脱保护侧链的改性或破坏的物质例如苯甲醚、茴香硫醚、三异丙基硅烷(TIPS)、3，6-二氧杂-1，8-辛二硫醇(DODT)、1，2-乙二硫醇和苯酚。

从MBHA树脂中裂解最终南吉博肽/使最终南吉博肽脱保护步骤可以例如通过使用例如呈90/4/3/3的TFA/DODT/TIPS/水的混合物来执行。

通过从树脂中裂解获得的粗靶肽任选地被纯化以进一步提高其纯度。

为此目的，将肽溶液装载到具有合适固定相、优选地C18或C8改性二氧化硅的HPLC柱上，并且使包含有机溶剂、优选地乙腈或甲醇的水性移动相通过柱。如有必要，则应用移动相梯度。收集具有期望纯度的肽并任选地进行冻干。

因此，本发明提供了一种用于在固相合成中制备南吉博肽的会聚性方法，其中所述方法包含最终使N端片段A与C端片段B偶合，之后同时或依序脱保护并从固体载体中裂解，并且任选地通过色谱法进行最终纯化。

本发明进一步提供了中间体片段A和B以及其制备方法，优选地根据如上所描述的SPPS进行的制备方法。

根据本发明，片段A的反应性羧酸属于非手性氨基酸。可以在7位中的甘氨酸与10位中的甘氨酸之间选择所述非手性氨基酸。因此，片段A选自

PG-Leu-Gln-Glu-Glu-Asp-Ala-Gly-OH(片段1，1-7，SEQ ID No 2)和

PG-Leu-Gln-Glu-Glu-Asp-Ala-Gly-Glu-Tyr-Gly-OH(片段5，1-10，SEQ ID No3)；

其中，PG为α-氨基保护基团或氢，优选地Fmoc基团。

根据本发明，使N端片段A与C端片段B偶合，特别地与选自以下的片段B偶合：

H-Glu-Tyr-Gly-Cys-Met-树脂(片段2，8-12，SEQ ID No 4)和

H-Cys-Met-树脂(片段4，11-12)。

根据本发明制备南吉博肽的方法涉及与树脂连接的片段B的偶合，其中所述树脂优选为Rink酰胺MBHA树脂。

在一个实施例中，所述方法包含为PG-Leu-Gln-Glu-Glu-Asp-Ala-Gly-Glu-Tyr-Gly-OH(片段5，1-10)的片段A与为H-Cys-Met-树脂(片段4，11-12)的片段B之间的偶合。

甚至更优选地，所述方法包含

Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH与H-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂之间的偶合。

在一个优选实施例中，所述方法包含

为PG-Leu-Gln-Glu-Glu-Asp-Ala-Gly-OH(片段1，1-7)的片段A与为

H-Glu-Tyr-Gly-Cys-Met-树脂(片段2，8-12)的片段B之间的偶合。

甚至更优选地，所述方法包含

Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-OH与

H-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂之间的偶合。

片段A和B优选地通过SPPS，逐步或通过基于片段的方法来制备。

特别优选的是选自以下的片段A：

Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-OH和

Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH。

在本发明的一个优选实施例中，制备南吉博肽的方法进一步包含制备片段B，特别地通过使以下偶合：

PG-Glu-Tyr-Gly-OH(片段3，8-10)和

H-Cys-Met-树脂(片段4，11-12)，

获得PG-Glu-Tyr-Gly-Cys-Met-树脂，之后使PG基团脱保护。

当PG为Fmoc时，如上所描述在碱性条件下执行脱保护。

片段B的SPPS制备优选地通过使用Rink酰胺MBHA树脂来执行，并且优选的片段B选自

H-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂和

H-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂。

甚至更优选地，制备片段B的方法包含

Fmoc-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH与H-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂之间的偶合，获得

Fmoc-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂，之后进行Fmoc脱保护。

在一个最优选实施例中，根据本发明制备南吉博肽的方法包含以下步骤：分别地，使为

Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-OH或

Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH的肽片段A

与为

H-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂或

H-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂的肽片段B偶合。

本发明的特别优选的方法为制备南吉博肽的方法，其中，片段A为Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-OH，并且片段B为H-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂。

本发明的另一种优选方法为制备南吉博肽的方法，其中，片段A为Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH，并且片段B为H-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂。

本发明的另一个实施例为以上段落的肽片段用于制备南吉博肽的用途。

在整个说明书中，作为南吉博肽的部分序列的片段A和B的肽序列适用于涉及在片段A的C端处通过位点与非手性氨基酸偶合的偶合策略。

缩写

SPPS 固相肽合成

MBHA树脂甲基二苯甲基酰胺树脂

CTC 2-氯三苯甲基氯

Fmoc 9-芴基甲氧基羰基

Boc 叔丁氧基羰基

Trt 三苯甲基

tBu 叔丁基

Pbf 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基

HPLC 高效液相色谱法

DIEA/DIPEA 二异丙基乙胺

TFA 三氟乙酸

Ac₂O 乙酸酐

ACN 乙腈

DMF 二甲基甲酰胺

DCM 二氯甲烷

MeOH 甲醇

DIPE 二异丙醚

HFIP 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇

TIPS 三异丙基硅烷

DODT 3，6-二氧杂-1，8-辛二硫醇

DIC N，N’-二异丙基碳二亚胺

DCC N，N’-二环己基碳二亚胺

EDC N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺

HOBt 1-羟基苯并三唑

HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑

TBTU N，N，N′，N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲四氟硼酸盐

PyBOP (苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐

Oxyma/OxymaPure 乙基-2-氰基-2-羟基亚氨基乙酸酯

HBTU 3-[双(二甲氨基)甲基鎓基]-3H-苯并三唑-1-氧化物六氟磷酸盐

HATU 2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐

Eq 当量

Conc. 浓度

Min 分钟

实例

适合于制备本发明的南吉博肽的详细实验条件由以下实例提供，所述实例旨在说明而非限制本发明的所有可能实施例。

除非另外指出，否则所有材料、溶剂和试剂都是从商业供应商处获得，级别最高，并且无需进一步纯化即使用。

纯度(％)是通过HPLC来计算。考虑到所获得的最终摩尔数除以初始摩尔数来计算摩尔产率(％)。

实例1

通过全SPPS制备南吉博肽(参考)

步骤1：将第一氨基酸装载到Rink酰胺树脂上

使用16mL DMF溶胀2g MBHA树脂(1.0-1.3mmol/g)30分钟。将2eq Fmoc-Met-OH(2.4mmol，2.67g)、2eq DIC(2.4mmol，1.136mL)和2eq OxymaPure(2.4mmol，1.023g)以0.3M浓度溶解于8mL DMF中并且5分钟之后添加到树脂中。除非有不同描述，否则所有偶合步骤都以此方式进行。装载步骤进行1.5小时。装载后，过滤树脂并用12mL DMF洗涤3次。Fmoc脱保护步骤是通过添加12mL 20％哌啶/DMF溶液来进行，持续两个10分钟循环。对所有氨基酸残基类似地执行这一步骤。通过肽基树脂的紫外吸收计算的装载量为0.8mmol/g。

步骤2：肽延伸

对于参与南吉博肽合成的所有氨基酸的偶合，以0.3M浓度通过3eq溶解于DMF中的DIC和OxymaPure活化3eq每个氨基酸。在肽延伸结束时，如已经描述，在进行到裂解步骤之前执行最终Fmoc脱保护。

步骤3：粗南吉博肽的裂解和沉淀

使用在0℃下冷却的16mL呈90/4/3/3比率的TFA/DODT/TIPS/水的溶液从树脂中裂解出南吉博肽。在30分钟内逐份添加肽基树脂，保持内部温度在25℃下。裂解进行3.5小时，然后过滤树脂并用10mL TFA洗涤10分钟。

使用DIPE沉淀肽，将12体积(300mL)逐滴添加到肽TFA溶液中，保持温度在20℃下。在古氏漏斗(gooch funnel)上过滤具有南吉博肽的悬浮液，用100mL DIPE再次洗涤肽，然后在真空下干燥过夜。摩尔产率40％。纯度61％。

实例2

通过三片段缩合制备南吉博肽

在使用三个片段的方法中，只有半胱氨酸残基与rink酰胺树脂上的甲硫氨酸偶合以制备片段11-12，而使用2-CTC树脂合成受保护的肽片段1-7和8-10。

步骤1：合成片段11-12

使用16mL DMF溶胀2g MBHA树脂(1.0-1.3mmol/g)30分钟。将2eq Fmoc-Met-OH(2.4mmol，2.67g)、2eq DIC(2.4mmol，1.136mL)和2eq OxymaPure(2.4mmol，1.023g)以0.3M浓度溶解于8mL DMF中并且添加到树脂中。装载步骤进行1.5小时。装载后，过滤树脂并用12mL DMF洗涤3次。Fmoc脱保护步骤是通过添加12mL 20％哌啶/DMF溶液来进行，持续两个10分钟循环。对Fmoc-Cys(Trt)-OH偶合重复相同程序以获得树脂连接的Fmoc脱保护的片段11-12。相对于插入的第一氨基酸，通过肽基树脂的紫外吸收计算的装载量为0.8mmol/g。

步骤2：合成片段1-7和8-10

对于两个片段的合成，使用溶解于30mL DCM中的0.8eq Fmoc-Gly-OH(6.40mmol，1.90g)并添加3eq DIPEA(24mmol，4.19mL)按5g(1.6mmol/g)执行2-氯三苯甲基氯树脂装载。装载步骤进行1小时，然后用30mL DCM洗涤树脂三次，并且用两种不同的封端溶液封端最终Cl-基团：首先用30mL甲醇/DIPEA/DCM(1∶2∶7)，然后用30mL呈相同比率的Ac₂O/DIPEA/DCM。在用这些溶液处理15分钟并随后用DCM洗涤之后，用DMF洗涤树脂三次，之后进行Fmoc脱保护并评估树脂装载量。一般来说，这一方案产生了装载有1.1mmol/g Fmoc-Gly-OH的树脂。按对应顺序对所有氨基酸同样执行Fmoc脱保护和偶合步骤方案：对于片段8-10，为Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Glu(tBu)-OH；并且对于片段1-7，为Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH两次、Fmoc-Gln(Trt)-OH和Fmoc-Leu-OH。

对于每次偶合，以0.3M浓度通过溶解于DMF中的3eq DIC和3eq OxymaPure活化3eq氨基酸。

通过使用6体积(30mL)1.5％TFA/DCM溶液从树脂中裂解5次持续2分钟而获得片段Fmoc-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH(8-10)。通过稀释于30mL甲醇中的1.2eq吡啶(15.89mmol，1.3mL)中和最终TFA溶液。将最终溶液在真空下浓缩至50mL，然后用水和盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并进一步浓缩，之后在0℃下用5体积石油醚使三肽结晶。过滤肽，用石油醚洗涤并在37℃下的真空烘箱中干燥过夜。摩尔产率65％。纯度90％。

通过使用6体积(30mL)1.5％TFA/DCM溶液从树脂中裂解5次持续2分钟而获得片段Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-OH(1-7)。通过稀释于30mL甲醇中的1.2eq吡啶(15.89mmol，1.3mL)中和最终TFA溶液。蒸发DCM并用甲醇代替，添加并蒸发30mL甲醇几次直至达到体积的三分之一。通过在0℃下向甲醇溶液中添加5体积(150mL)水来沉淀肽片段，并在搅拌30分钟后过滤。用水洗涤完全受保护的七肽并在37℃下的真空烘箱中干燥过夜。摩尔产率85％。纯度89％。

步骤3：合成片段8-12(片段缩合1)

进行Fmoc-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH(8-10)与H-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂(11-12)之间的片段缩合，在40℃下通过使用2eq OxymaPure(1.6mmol，0.22g)和2eq DIC(1.6mmol，0.25mL)活化溶解于6mLDMF中的2eq(1.6mmol，1.12g)片段8-10持续10分钟。将三肽8-10的活化酯添加到树脂连接的片段11-12中并在40℃下搅拌3小时。过滤后，用15mLDMF洗涤树脂三次，然后用12mL 10％Ac₂O/DMF封端15分钟。用12mL DMF洗涤树脂三次，之后进行Fmoc脱保护，最终获得树脂连接的受Fmoc保护的片段8-12。摩尔产率91％。纯度89％。

步骤4：合成南吉博肽(片段缩合2)

进行片段1-7与H-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂(8-12)之间的片段缩合，在40℃下通过使用2eq OxymaPure(2.25mmol，0.32g)和2eq DIC(2.25mmol，0.35mL)活化溶解于25mL DMF中的1.5eq(2.25mmol，2.64g)片段1-7持续15分钟。将片段1-7的活化酯添加到树脂连接的片段8-12中并在40℃下搅拌3.5小时。过滤后，用12mL DMF洗涤树脂三次，之后用上述标准程序进行Fmoc脱保护。在Fmoc脱保护之后，用DMF和DCM再次洗涤树脂，然后在真空泵下干燥。

步骤5：粗南吉博肽的裂解和沉淀

使用DIPE沉淀肽，将12体积(300mL)逐滴添加到肽TFA溶液中，保持温度在20℃下。在古氏漏斗上过滤具有南吉博肽的悬浮液，用100mL DIPE再次洗涤肽，然后在真空泵下干燥过夜。摩尔产率61％。纯度73％。

实例3

通过两片段缩合制备南吉博肽

在使用两个片段的方法中，如实例2步骤1中所描述，继续在MBHA树脂上进行SPPS延伸直到连接Glu⁸，得到片段8-12，然后得到片段1-7，如实例2步骤2中所描述在2-CTC树脂上进行合成，如实例2步骤4中所描述与树脂连接的片段8-12偶合。

步骤1：合成片段8-12

使用16mL DMF溶胀2g MBHA树脂(1.0-1.3mmol/g)30分钟。将2eq Fmoc-Met-OH(2.4mmol，2.67g)、2eq DIC(2.4mmol，1.136mL)和2eq OxymaPure(2.4mmol，1.023g)以0.3M浓度溶解于8mL DMF中并且添加到树脂中。装载步骤进行1.5小时。装载后，过滤树脂并用12mL DMF洗涤3次。Fmoc脱保护步骤是通过添加12mL 20％哌啶/DMF溶液来进行，持续两个10分钟循环。对于Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH偶合重复相同程序，获得片段8-12。相对于插入的第一氨基酸，通过肽基树脂的紫外吸收计算的装载量为0.8mmol/g。摩尔产率88％。纯度83％。

步骤2：合成南吉博肽(片段缩合2)

如实例2步骤4中所描述执行最终片段缩合。

步骤3：粗南吉博肽的裂解和沉淀

如实例2步骤5中所描述从树脂中裂解南吉博肽。摩尔产率60％。纯度70％。

SEQUENCE LISTING

<110> 费森尤斯卡比依普莎姆有限责任公司(Fresenius Kabi iPSUM S.r.l.)

<120> 用于合成南吉博肽的方法

<130> FK19301-05-PAT-WO

<150> EP2020152030

<151> 2020-01-15

<150> EP2020156866

<151> 2020-02-12

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 南吉博肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> C端酰胺化

<400> 1

Leu Gln Glu Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Gly Cys Met

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 片段 A (1-7)

<400> 2

Leu Gln Glu Glu Asp Ala Gly

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 片段 A (1-10)

<400> 3

Leu Gln Glu Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 片段 B (8-12)

<400> 4

Glu Tyr Gly Cys Met

1 5

Claims

1.一种用于制备式I所示呈固相的南吉博肽(nangibotide)的方法

其包含以下步骤：

a)分别地，使选自以下的N端南吉博肽片段A：

PG-Leu-Gln-Glu-Glu-Asp-Ala-Gly-OH (片段1，1-7)和

PG-Leu-Gln-Glu-Glu-Asp-Ala-Gly-Glu-Tyr-Gly-OH (片段5，1-10)，

与选自以下的C端南吉博肽片段B偶合：

H-Glu-Tyr-Gly-Cys-Met-树脂 (片段2，8-12)和

H-Cys-Met-树脂 (片段4，11-12)，其中，PG为α-氨基保护基或氢；和

b)使南吉博肽脱保护并且从所述树脂中裂解。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述片段A为

PG-Leu-Gln-Glu-Glu-Asp-Ala-Gly-OH (片段1，1-7)和

所述片段B为

H-Glu-Tyr-Gly-Cys-Met-树脂 (片段2，8-12)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述片段A为

PG-Leu-Gln-Glu-Glu-Asp-Ala-Gly-Glu-Tyr-Gly-OH (片段5，1-10)，并且

所述片段B为H-Cys-Met-树脂 (片段4，11-12)。

4.根据权利要求2所述的方法，其进一步包含通过以下来制备片段B：

使PG-Glu-Tyr-Gly-OH(片段3，8-10)与H-Cys-Met-树脂(片段4，11-12)偶合，并且

裂解PG。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述树脂为MBHA树脂。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述偶合是在存在N，N’-二异丙基碳二亚胺的情况下进行。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述偶合是在存在乙基-2-氰基-2-羟基亚氨基乙酸酯的情况下进行。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述偶合是在存在N，N’-二异丙基碳二亚胺和乙基-2-氰基-2-羟基亚氨基乙酸酯的情况下进行。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，PG为Fmoc基团。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，分别地，片段A为

Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-OH或

Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH，

并且片段B为

H-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂或

H-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂。

11.根据权利要求4所述的方法，其中，所述片段B制备是通过以下来执行：

使Fmoc-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH与

H-Cys(Trt)-Met-MBHA树脂偶合，并且裂解Fmoc。

12.一种肽片段，其选自由以下组成的组：

PG-Leu-Gln-Glu-Glu-Asp-Ala-Gly-OH (片段1，1-7，SEQ ID No 2)、

PG-Leu-Gln-Glu-Glu-Asp-Ala-Gly-Glu-Tyr-Gly-OH (片段5，1-10，SEQ ID No 3)和

PG-Glu-Tyr-Gly-OH (片段3，8-10)。

13.根据权利要求12所述的肽片段，其选自由以下组成的组：

Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-OH、

Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH和

Fmoc-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH。

14.一种根据权利要求12或13所述的肽片段的用途，其用于制备南吉博肽。