CN109641946A - 胰高血糖素样肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备胰高血糖素样肽的方法，通过与含有二异丙醚和乙腈的反溶剂混合，沉淀肽或前体肽。此外，本发明还涉及与固相缀合的肽和包含可根据本发明的方法获得的利拉鲁肽的药物组合物。

Description

胰高血糖素样肽的制备方法
本发明涉及工业或实验室规模的肽合成领域，公开了一种改进方法，用于制备胰高血糖素样肽，特别是用于制备胰高血糖素样肽1类似物，如利拉鲁肽(Liraglutide)。更具体地，本发明涉及有效制备胰高血糖素样肽(如利拉鲁肽)的方法，以及合成后分离粗肽的方法。
作为优选的实施方案，本发明涉及一种制备利拉鲁肽的方法。该方法包括将利拉鲁肽或前体肽与包含二异丙醚和乙腈的反溶剂混合来沉淀利拉鲁肽或前体肽。此外，本发明涉及一种与固相结合的利拉鲁肽肽前体，以及包含可从根据本发明的方法获得的利拉鲁肽的药物组合物。
人类GCG基因(HGNC：4191)编码多种相关肽，包括胰高血糖素，胰高血糖素样肽1(GLP-1)和胰高血糖素样肽2(GLP-2)。它们之间具有相当大的序列同源性(参见图1)，参与控制血糖稳态，肠细胞增殖和饱腹感。具有生物活性的GLP-1形式已知的有GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)，其为酰胺，通过激活GLP-1受体发挥其作用。在其他生理功能中，GLP-1是葡萄糖依赖性胰岛素有效的抑制激素(tropic hormone)，强烈抑制胰高血糖素分泌，对胰岛β细胞具有保护和增殖作用，并抑制胃肠分泌和运动。已发现GLP-1功能异常与肥胖，餐后反应性低血糖和2型糖尿病有关。因此，GLP-1类似物在药物研究中具有相当大的意义。
吉拉毒蜥(Heloderma suspectum)的肽激素exendin-4的变体和衍生物，以及GLP-1肽本身的变体和衍生物正在被广泛研究。
已经上市的药物化合物有艾塞那肽(Exenatide)和利西拉来(Lixisenatide)，两者均自exendin-4肽衍生，以及自GLP-1衍生的利拉鲁肽。利拉鲁肽(N-ε-(γ-Glu(N-α-hexadecanoyl)))-Lys26Arg34-GLP-1(7-37)，也称为NN2211，已被批准用于治疗2型糖尿病和治疗有相关合并症的成人肥胖症。该化合物通过半合成技术可以工业规模生产。EP-B 0944 648描述了使重组表达的前体肽与Nα-十六烷酰基-Glu(ONSu)-OtBu反应以获得利拉鲁肽(参见其实施例35)。
然而，人们希望有用于大规模制备的更好方法，完全化学合成胰高血糖素样肽，如利拉鲁肽。
总体上，肽的化学合成是本领域公知的(参见手册《固相肽合成，倍肯-肽开拓合作伙伴》“Solid Phase Peptide Synthesis Bachem-Pioneering Partner for Peptides”，Global Marketing，Bachem group，2014年6月出版)。在合成期间，第一氨基酸的α氨基与第二氨基酸的α羧基之间的肽键的形成应优于非其它副反应。这通常通过使用“永久”和“临时”保护基团来实现。前者用于阻断例如反应性氨基酸侧链和生长中肽链的C末端羧基的反应，并在整个合成结束时才除去。后者用于在偶联步骤中阻断例如第二氨基酸的α氨基，从而避免例如在多个第二氨基酸之间形成肽键。肽的化学合成区分为两种标准方法，即液相肽合成(LPPS)和固相肽合成(SPPS)。
LPPS，也称为溶液肽合成，在均相反应介质中进行。连续偶联产生所需的肽。对于液相肽合成，不存在标准合成方案，必须仔细规划，从各种可能的保护基团组合，偶联方法和溶剂中进行选择。LPPS通常涉及分离，定性，以及在需要时每次偶联后，纯化中间体。较长的肽通常通过会聚的方法合成，即几个肽片段先并行合成，再最终组合以产生最终产物。
在标准SPPS中，按既定序列连续加入经保护的氨基酸，形成C-末端锚定于不溶性聚合树脂上的肽，即合成从肽的C-末端进行到N-末端，进行连续的氨基酸添加循环，每个循环由以下步骤组成：a)从树脂结合的肽中切割Nα-保护基团，b)洗涤步骤，c)保护的氨基酸的偶联，和d)洗涤步骤。因为生长链与不溶性载体结合，所以可以通过简单过滤除去过量的试剂和可溶性副产物。采用适当的溶剂的洗涤步骤可以确保在脱保护步骤a)之后完全除去裂解剂，以及消除由偶联步骤c)产生的过量的试剂和可溶性副产物。在合成结束时，肽从树脂上裂解并除去保护基团(参见手册《固相肽合成，倍肯-肽开拓合作伙伴》“Solid PhasePeptide Synthesis Bachem-Pioneering Partner for Peptides”，Global Marketing，Bachem group，2014年6月出版)。所谓的Fmoc SPPS，是指使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)作为临时氨基保护基团的方法，为最常见的SPPS形式。与LPPS相反，肽纯化只能在合成结束后，从树脂上切割后进行。这对于大肽的合成通常是不利的，其中除了在脱保护期间或由于降解而形成的副产物之外，各种树脂结合的副产物可以累积。结果，最终产品的纯化可能非常具有挑战性。因此，在开发用于工业规模的SPPS方法时，必须优化粗肽产物的纯度。
除LPPS和SPPS之外，可以使用混合方法，其中肽片段首先通过上述技术之一合成，然后使用另一种技术连接在一起。该策略通常用于具有挑战性序列的大肽。上述方法的共同之处在于需要从溶液中回收最终和/或中间肽产物。根据所选择的合成策略的不同，所述肽溶液的其他组分可以变化，通常包括含有TFA和清除剂的裂解组合物。
TFA裂解后肽分离的标准方法是所谓的冷醚后处理：将肽溶液与作为反溶剂的冷醚混合以引起肽沉淀，并通过过滤和/或离心收集沉淀物。
二乙醚，二异丙醚或甲基叔丁基醚。丁醚(MTBE)通常用于冷醚后处理。将抗溶剂加入肽溶液中的方法，称为“经典”沉淀方案；将肽溶液加入到反溶剂中的方法，则称为“反向”沉淀方案。
沉淀物的性质通常在实验室和工业制造中具有一些影响，因为它影响粗肽的质量以及进一步加工。理想地，沉淀几乎完全，相关杂质减少且TFA含量低。此外，有效过滤需要沉淀物有合适稠度和粒度，以避免过滤器堵塞或粘附在容器壁上的材料损失。
尽管先前已经认识到沉淀方案可以改善粗肽的纯度和处理(US 2005/0165216)，但令人惊讶的是，该步骤的细节很少受到关注。
专利文献CN-A 103275209，CN-A 103275208，CN-A 104045706，CN-A 104045705，CN-A 103145828，CN-A 103980358和EP-A 2 757 107公开了用于合成利拉鲁肽的SPPS或混合方法。在这些专利文献中，都使用冷乙醚作为反溶剂，从包含TFA和清除剂的溶液中沉淀出粗利拉鲁肽。
WO2014/199397和WO2016/005960公开了用于合成利拉鲁肽的SPPS和/或混合方法。使用冷MTBE或二异丙醚作为反溶剂，从包含TFA和清除剂的溶液中沉淀出粗利拉鲁肽。
EP-B 1 987 052公开了用于合成胰高血糖素样肽的SPPS方法，其中使用冷MTBE从包含TFA和清除剂的溶液中沉淀粗肽。
US-A 2005/0165216公开了使用具有三个或更多个碳原子的醇来沉淀肽。
WO2012/171984，WO2012/171982和WO2012/171987涉及用LPPS制备肽时沉淀期间遇到的问题。据披露，从LPPS中使用的极性非质子溶剂直接沉淀会导致形成粘性的胶状沉淀物。避免这种问题的方法是首先将目标肽提取到2-甲基四氢呋喃或甲苯中，然后从提取相中沉淀肽。乙腈，乙醚，二异丙醚，正庚烷和甲苯被认为是从提取相中诱导肽沉淀的合适抗溶剂。
在个别的情况下，已有报道在用于制备短肽时，用乙腈和二异丙醚的混合物进行沉淀。US2010/0280221描述了通过LPPS制备八肽(长度：8个氨基酸)。该方法包括在环境温度下通过乙腈/二异丙醚从乙酸/二恶烷中沉淀肽。WO 2015/154031描述了通过乙腈和二异丙醚的混合物沉淀AMG 614的方法，AMG 614是由七个D-氨基酸和经二硫键键合的单个L-Cys组成的高极性人工肽化合物。
在现有技术来看，较大尺寸肽的制备方法仍然需要改进，例如制备胰高血糖素样肽，如利拉鲁肽。尤其是，粗肽产物的合成和纯化需要优化，使获得的粗肽产物的纯度和宏观性质得到改善。本发明人开发了用于合成和沉淀粗利拉鲁肽的改进方法，其可以工业规模使用。
令人惊讶的是，本发明发现较大尺寸的肽，如胰高血糖素样肽(如利拉鲁肽)，用包含二异丙醚和乙腈的抗溶剂沉淀效果特别好，特别是当二异丙醚∶乙腈的体积比在(3∶1)到(10∶1)时。
因此，总体而言，本发明的一个方面涉及一种胰高血糖素样肽或其盐的制备方法，包括以下步骤：
(i)提供含有粗胰高血糖素样肽的溶液S.
(ii)将步骤(i)的肽与包含二异丙基醚和乙腈的反溶剂混合，沉淀步骤(i)的肽，其中二异丙基醚∶乙腈的体积比在(3∶1)至(10∶1)的范围内；和
(iii)分离步骤(ii)得到的沉淀，优选采用过滤和/或离心方法分离。
本发明的一个实施例涉及制备利拉鲁肽或其盐的方法，包括：
(i)提供溶液S，其含式I的肽：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-B1-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中B1是Lys(棕榈酰-Glu-OH)或Lys(H-Glu-OH)；
(ii)将溶液S与包含二异丙基醚和乙腈的反溶剂混合，沉淀步骤(i)的肽，其中二异丙基醚∶乙腈的体积比在(3∶1)至(10∶1)的范围内；和
(iii)分离步骤(ii)得到的沉淀，优选采用过滤和/或离心方法分离。
本领域技术人员会理解，式I还包括上述多肽链的盐。本领域技术人员也会理解，本发明所用的肽可任选地带有本领域已知的任何抗衡离子，例如阴离子或阳离子，例如氯离子，乙酸根离子，碳酸根离子，碳酸氢根离子，钠离子，钾离子，镁离子，裂解溶液的任何离子(例如，TFA离子，溴离子，高氯酸根离子，铵离子)和/或保护基残留的阳离子或阴离子。此外，肽可任选地与痕量的一种或多种清除剂共价或非共价缔合，例如三异丙基硅烷(TIPS)，二硫苏糖醇(DTT)，二硫赤藓醇(DTE)，苯甲醚，茴香硫醚或1，2-乙二硫醇。
本发明的方法可有利地用于改善粗胰高血糖素样肽(特别是利拉鲁肽)的制备，产率和/或纯度，特别是用于其大规模制备。特别有益的是一种方法，包含进行胰高血糖素样肽前体的固态合成(SPPS)，将所述前体从树脂上裂解以获得在裂解组合物中的粗胰高血糖素样肽，再将裂解的粗胰高血糖素样肽与裂解组合物分离。
常规地，在本发明中使用几种缩写和定义：
缩写：
Boc 叔丁氧羰基(tert.butyl ester)
CLEAR 交联聚氧乙烯酯丙烯酸酯(cross-linked ethoxylate acrylate)
DBU 二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene)
DEPBT 3-(二乙氧基-磷酰氧基)-3H-苯并[d][1，2，3]三嗪-4-酮(3-(diethoxy-
phosphoryloxy)-3H-benzo[d][1，2，3]triazin-4-one)
DIC 二异丙基碳二亚胺(diisopropylcarbodiimide)
DIPEA 二异丙基乙胺(diisopropylethylamine)
Dmb 1，4-二甲氧基苄基(2，4-dimethoxybenzyl)
DMF N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide)
DTE 1，4-二硫代红霉素(1，4-dithioerythriol)
DTT 1，4-二硫苏糖醇(1，4-dithiothreitol)
EDT 1，2-乙二硫醇(1，2-ethanedithiol)
Fmoc 9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)
Hmb 2-羟基-4-甲氧基苄基(2-hydroxy-4-methoxybenzyl)
HOBt 羟基苯并三唑(hydroxybenzotriazole)
HPLC 高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography)
IPE 二异丙醚(diisopropyl ether)
LPPS 液相肽合成(Liquid Phase Peptide Synthesis)
MALDI-MS 基质辅助激光解吸电离质谱(Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization
Mass Spectrometry)
MTBE 甲基叔丁醇丁基醚(methyl tert.butyl ether)
MTT 4-甲基三苯甲基(4-methyltrityl)
NMP N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidone)
OMpe 3-甲基戊基-3-酯(3-methylpent-3-yl ester)
OtBu 叔丁酯(tert.butyl ester)
ONSu＝OSu N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)
氰基-羟基亚氨基-乙酸乙酯(cyano-hydroxyimino-acetic acidethyl ester)
PEG 聚乙二醇(polyethylene glycol)
PEGA 丙烯酰胺-聚乙二醇共聚物(acrylamide-PEG co-polymer)
Pbf 1，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(2，2，4，6，7-
Pentamethyldihydrobenzofurane-5-sulfonyl)
RT 室温(room temperature)
SPPS 固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)
tBu 叔丁基(tert.butyl)
TBTU (苯并三唑基)四氟硼酸四甲基脲(benzotriazolyl)tetramethyluronium
tetrafluoroborate)
TES 三乙基硅烷(triethylsilane)
THF 四氢呋喃(tetrahydrofuran)
TIPS 三异丙基硅烷(triisopropylsilane)
Trt 三苯甲基(trityl)
TFA 三氟乙酸(trifluoroacetic acid)
UHPLC 超高效液相色谱(Ultra High Performance Liquid Chromatography)
除非另有说明，液体混合物限定由体积百分比和体积比定义。在本发明中，术语“肽”和“多肽”可以互换。
除非另有说明，肽序列在本发明中以N-末端(左)开始并以C-末端(右)结束。
表1说明了不同的表示法，它们是等同的，并且在本说明书中可互换使用。
氨基酸表示法可以是其全名(例如：丙氨酸)，或根据WIPO的标准ST.25的3字母代码(如Ala)或单字母代码(如A)，三者可互换。在没有明确说明的情况下，对映体形式通常是L-氨基酸。
然而，应该理解，本发明也可以使用D-氨基酸和其他立体异构体进行实践。
表1.肽的表示法
本发明采用以下被广泛接受的氨基酸衍生物表示法：α氨基(Nα)上的取代基用氨基酸符号的左侧并用连字符分隔的符号表示，α羧基上的取代基用氨基酸符号的右侧并用连字符分隔的符号表示，侧链上的取代基则在氨基酸符号右侧的括号中表示。对于未修饰的α-氨基酸，α氨基(Nα)上的取代基是质子(H-)，α羧基上的取代基是羟基(-OH)。
对于支链二肽，该表示法遵循嵌套形式。例如，Fmoc-Lys(Boc-Glu-OtBu)-OH是指具有Fmoc保护的α氨基和游离α羧基的Lys衍生物，其侧链被谷氨酰基取代，谷氨酰基具有Boc保护的α氨基和OtBu保护的羧基。谷氨酰基通过其γ-羧基与Lys侧链形成酰胺键。
类似的表示法用于取代的氨基酸，它们是肽的一部分。例如，Aaa1-Aaa2-Lys(Boc-Glu-OtBu)-Aaa4-Aaa5是指支链五肽，其中3位的Lys侧链经酰胺键被谷氨酰基取代，谷氨酰基上有Boc保护的α氨基和OtBu保护羧基。因此，所述酰胺键位于Lys的ε-氨基和Glu的γ-羧基之间。
作为表达肽中取代氨基酸的另一个实例，Lys(棕榈酰-Glu-OH)是指掺入肽的Lys残基及其ε氨基(Nε)，即侧链，侧链与一棕榈酰-Glu部分通过其γ羧基(Cγ)结合，从而在Lys的Nε和Glu的Cγ之间形成酰胺键。在棕榈酰-Glu部分中，棕榈酰残基与Glu的α氨基(Nα)结合。Lys(棕榈酰-Glu-OH)部分也可称为Lys(十六酰基-Glu-OH)，Lys(N-ε-(γ-Glu-(Nα-十六酰基)))或Lys(Nε-(γ-)谷氨酰基-(Nα-十六酰基)))。
作为又一个实例，Lys(H-Glu-OH)部分，在表达肽序列时，是指Lys残基，其ε氨基(Nε)与未保护的Glu残基通过其γ羧基结合(Cγ)。因此，在Lys的Nε和Glu的Cγ之间形成酰胺键。在Glu残基中，α氨基(Nα)是游离的。Lys(H-Glu-OH)部分也可称为Lys(N-ε-(γ-Glu(H)-OH)，Lys(N-ε-(γ-Glu-OH)或Lys(Nε-)(γ谷氨酰-OH)。
本领域技术人员会立即理解式I的肽是普通利拉鲁肽的衍生物，以单字母代码书写：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG(序列编号：4)，
其中氨基酸序列第20位的赖氨酰部分(Lys20，K20)被修饰。更详细地，Lys20的ε氨基通过酰胺键与谷氨酰基部分的γ羧基残基(γ-Glu，γ-E)结合。该谷氨酰基部分通常具有游离的α羧基。谷氨酰基部分可以通过其氨基与棕榈酸即十六烷酸部分结合，或者可以带有游离的-NH2(α氨基，Nα)。
优选地，式I的肽(基本上)不含任何保护基团，并且除了Lys20的部分之外在氨基酸侧链上没有其他修饰。因此，式I的肽优选是完全未保护的肽，优选不进一步修饰。
或者，可以修饰式I肽的N-末端(例如，酰化(例如，乙酰化))。间或，可修饰C末端(例如，酰胺化)。
间或，一个或多个氨基酸残基侧链可与荧光团结合。任选地，式I的肽还可以放射性标记(例如，通过3H，32P，35S，14C，99mTc或镧系元素(例如，64Gd))或可以用自旋标记物标记，例如一种或多种重同位素，例如，13C，可通过核磁共振(NMR)检测。
在步骤(i)的溶液中存在的胰高血糖素样肽通常由天然L-氨基酸组成。然而，备选地，肽还可以包含一种或多种非天然氨基酸，例如D-氨基酸，β氨基酸，甲基化氨基酸(例如，N-甲基化氨基酸)或者甚至可以全部由这些非天然氨氨基酸组成。
本领域技术人员会理解，在极性环境中，特别是在水性环境中，式I肽或任何其他胰高血糖素样肽的肽链可以形成盐，例如在末端和/或一些氨基酸侧链通过结合质子或其他阳离子和/或阴离子，释放质子或其他阳离子和/或阴离子。
本发明所用的术语“胰高血糖素样肽”或GLP是指衍生自GCG基因(HGNC：4191)的同源肽，毒蜥外泌肽及其类似物以及任何前述物质的衍生物。图1显示原型胰高血糖素样肽之间的序列比对。
术语“胰高血糖素样肽1类似物”和“GLP-1类似物”在发明中可互换使用，均指涉及能够结合GLP-1受体的肽。GLP-1(7-37)和exendin-4(1-39)的衍生物和类似物如艾塞那肽，利西拉肽和利拉鲁肽是优选的GLP-1类似物。示例性地，GLP-1类似物可包含与SEQ ID NO：4具有至少80％同源性的多肽链，更优选与SEQ ID NO：4具有至少90％同源性的多肽链，特别是与SEQ ID NO：4具有至少95％同源性的多肽链。任选地，还在与SEQ ID NO：4的Lys20同源的赖氨酸上有修饰。在本发明中同源性优选是在SEQ ID NO：4的整个长度上测定的序列同源性。
在本发明中，序列同源性可以指本领域已知的序列同源性的任何定义。特别地，序列同源性可以理解为由国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLAST(基本局部比对搜索工具)在本申请提交日期时的版本可确定的序列同源性。
本发明所用的术语“类似”或“类似物”是指从第一肽序列衍生的肽，衍生是通过取代第一肽中高达50％氨基酸残基，和/或从第一肽删除高达10％的氨基酸残基，和/或添加多达10个氨基酸残基到第一肽。优选的类似物，是通过取代多达20％的氨基酸残基，和/或通过删除多达10％的氨基酸残基，和/或通过添加多至10个氨基酸残基，自第一肽衍生。
本文所用的术语“衍生”或“衍生物”是指可通过化学反应从第一化合物获得的化合物。衍生的结果可以通过取代基的存在或不存在而区别于第一化合物。例如，用于SPPS的氨基酸衍生物通常与衍生它们的氨基酸不同，至少是因为氨基保护基团的存在。
术语“提供包含式I的肽的溶液S”在最广泛的意义上可以理解为获得含有式I肽的任何液体组合物。式I的肽可以通过本领域已知的任何方法提供。示例性地，它可以从固相肽合成(SPPS)或液相肽合成(LPPS)或其组合方法获得。或者，普通多肽链也可以是从生物技术方法获得的，随后通过化学/合成方法修饰所获得的多肽链。优选地，式I的肽由SPPS，LPPS或其组合获得。更优选地，式I的肽从由包括SPPS或由SPPS组成的方法获得。
通常，肽合成(基于SPPS和LPPS)涉及各种保护基团和活化酯的使用。因此，在式I肽的合成过程中，可以使用各种保护基团和活化酯。
本发明所用的术语“保护基团”可以在最广泛的意义上理解为通过官能团的化学改性引入分子中的基团，其阻止所述官能团在随后的工艺步骤中参与反应，例如，防止氨基酸侧链的副反应。氨基保护基团的实例是Boc和Fmoc基团，羧酸保护基团的实例是非反应性酯，例如甲酯，苄基酯或叔丁基酯。
在本发明中，术语“活化酯”可以在最广泛的意义上理解为适合与氨基自发反应的酯。活化酯的实例是对硝基苯基，五氟苯基和琥珀酰亚胺酯。
尽管用于获得式I的肽的其他方法，特别是其他合成方法，也包括在本发明的范围内，但式I的肽优选通过固相肽合成(SPPS)获得。另一方面，本发明公开的SPPS方法还可以与不同的肽分离方案组合，用于生产利拉鲁肽。
在SPPS中，式I肽的前体肽在树脂上合成(这里的步骤(i-a))，即在“固相”上，其通常为珠状结构，可通过过滤的方式容易地与液相分离。在合成树脂完成肽合成后，肽从树脂中释放并除去保护基团。因此，本发明的步骤(i)可包括以下步骤
(i-a)提供固相结合的胰高血糖素样肽，其中至少Glu，Asp和Lys的侧链带有保护基团，
(i-b)肽从树脂上切下，并任选地除去保护基团。
因此，在优选的实施方案中，本发明方法的步骤(i)包括：
(i-a)提供下式的固相结合的胰高血糖素样肽：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-B2-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-[树脂]，其中B2是Lys(棕榈酰-Glu-OR1)或B2是Lys(R2-Glu-OR1)，R1是羧酸保护基，R2是氨基保护基；其中至少Glu，Asp和Lys的侧链带有保护基团；和
(i-b)将前体肽从树脂上切下。
在优选的实施方案中，B2是Lys(棕榈酰-Glu-OtBu)或Lys(Boc-Glu-OtBu)。Lys(棕榈酰-Glu-OtBu)部分也可称为Lys(十六烷酰基-Glu-OtBu)。
在本发明中，术语“树脂”和“[树脂]”可以在最广泛的意义上理解为可用于SPPS的珠状结构。术语“树脂”，“固相”和“载体”在发明中可互换使用。
SPPS通常在凝胶相而不是固相支撑体上进行。合适的树脂可以基于聚苯乙烯，聚苯乙烯-PEG复合材料，PEG，PEGA，交联的乙氧基化丙烯酸酯(CLEAR)，聚酰胺，聚二甲基丙烯酰胺，或具有所需物理和化学性质的任何其他载体。基于具有1％二乙烯基苯的珠状聚苯乙烯的树脂是常规使用的载体，通常具有200-400目或100-200目的尺寸分布。聚苯乙烯基4-烷氧基苄醇(Wang)树脂，二苯基重氮甲烷(PDDM)树脂，4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基甲基-聚苯乙烯(Rink)树脂，2-甲氧基-4-烷氧基苄醇(Sasrin)树脂，尤其是2-氯三苯甲基氯(CTC)树脂，都是特别适用于本发明的方法的树脂，并且可从供应商如Sigma-Aldrich，Bachem和EMD Millipore购获。当然，可以使用任何其他适用于SPPS的树脂。
作为通过C-末端羧基固定的替代方案，肽也可以通过(优选末端)氨基酸的侧链与树脂结合。
作为另一种选择，肽也可以通过N-末端与树脂结合，并从N-末端到C-末端合成(即反向肽合成)。
本领域技术人员会意识到有多种可选的SPPS方法。通常，任何类型的SPPS都可以用于本发明的方法。可以采用各种类型的设备进行SPPS。有手动，半自动和全自动合成器，可用于分批或连续操作的SPPS。对于任何给定的设备，可以选择适当的树脂以满足设备要求的机械性能。
本领域技术人员会充分意识到树脂负载可能影响SPPS的效率，特别是在工业SPPS中。对于长的，易于聚集的肽序列(例如胰高血糖素样肽)，这个影响可能特别大：一方面，工艺效率随着树脂负载的增加而增加；另一方面，必须通过减少树脂负荷来减少在树脂上的沉淀。因此，对于任何一个给定的SPPS方案，需要通过常规实验建立最佳树脂负荷，以满足其微妙的平衡。变化树脂负载的方法有，例如，通过使用市售的不同取代度的树脂，或者通过相对于第一个氨基酸以摩尔不足的方式偶联第二个氨基酸，然后乙酰化，即封闭未反应的第一个氨基酸。同样地，第一个氨基酸可以以摩尔不足的形式与树脂偶联，然后进行封闭步骤。在本发明的优选实施方案中，使用约0.2mmol/g至约0.9mmol/g的树脂载荷，例如约0.2mmol/g，0.3mmol/g，0.4mmol/g，0.5mol/g，0.6mmol/g，0.7mmol/g，0.8mmol/g，or0.9mmol/g。在这种情况下，可以注意到，在SPPS期间，树脂在所用各种溶剂中的溶胀和收缩会导致树脂体积的显着波动，从而导致树脂上肽浓度的显着波动。
在本发明的一个优选实施方案中，胰高血糖素样肽通过Fmoc-SPPS制备。合适的受保护的氨基酸衍生物(即与一个或多个保护基团缀合的氨基酸部分)，例如Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pmc)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Mtt)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Asp(OMpe)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Mmt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gln(Mtt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-His(1-Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，和Fmoc-Val-OH，可从各种厂商购获。应该注意的是，非天然氨基酸衍生物如Aib(α-氨基异丁酸)，Nle(正亮氨酸)或Orn(鸟氨酸)在合成胰高血糖素样肽中的用途同样包括在本发明的范畴。在优选的实施方案中，采用了氨基酸衍生物Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Asp(OMpe)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Boc-His(Boc)-OH，Fmoc-His(1-Trt)-OH Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，和Fmoc-Val-OH。Fmoc-Trp(Boc)-OH与Fmoc-Arg(Pbf)-OH的使用，可以在肽从树脂切割时抑制阳离子对色氨酸部分的磺酰基修饰。然而，由于TFA从树脂上的裂解可能导致副产物如氨基甲酸酯的形成，因此将粗肽进行脱羧反应可能是有好处的。这可以，示例性地，通过使粗肽经受高pH处理来实现，例如pH至少7.2，至少8.0，至少8.5，至少9，至少9.5，至少10，至少10.5，至少11，或至少11.5。间或，脱羧反应可在温和的酸性条件下进行，例如，pH为6.0至7.0，pH为5.5至6.5，或pH为5.0至6.0。任选地，所述处理可以伴随热处理，例如，在30-70℃的温度下，例如在30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，或70℃。
本领域技术人员非常了解基于Fmoc合成方案的SPPS方法。向树脂中添加氨基酸的每个循环通常以Fmoc裂解开始，即从树脂结合的肽链中除去Fmoc保护基团。这是通过将肽树脂与碱在能够使树脂溶胀并溶解试剂的溶剂中温育来实现的。用于此目的的常用碱包括例如仲胺，如哌啶和4-甲基哌啶。合适的溶剂包括例如DMF，NMP，二甲基亚砜，二氯甲烷，四氢呋喃，乙腈，甲苯及其混合物。该反应通常在环境温度下进行，例如，在15-30℃的温度范围内。通常，碱不稳定和酸稳定的Fmoc在含有5-50％(体积百分比)，优选20％，哌啶的DMF中，通过短时间处理(2至15分钟，如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15分钟)而分离出来。
必要时，可以重复和/或稍微延长上述处理(7至30分钟，例如7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30分钟)。对于合成具有难以切割的片段的大肽，Fmoc切割的持续时间以及重复的次数可以逐渐增加。例如，切割时间可以是15-75分钟，如15，30，45，60或75分钟，切割可重复多达8次，例如，2，3，4，5，6，或8次。而且，温度也可以增加，例如，温度在30℃到45℃之间。在这些条件下，在大多数情况下可以实现完全切割。间或，可以改变用于Fmoc的切割试剂。
经发现，即使试剂的轻微变化也可以显着加速切割，例如，使用含1-5％DBU的DMF，含20％哌啶和1-5％DBU的DMF，含20％哌啶的NMP，或在45℃下含20％哌啶的DMF。此外，可以通过微波处理实现切割反应的加速。另一方面，肽的性质可使得使用更温和的处理更为有利。特别地，温和的切割条件有0.1M HOBt及20％哌啶的DMF溶液，50％吗啉的DMF溶液，和2％HOBt，2％六亚甲基亚胺及50％DMSO(其含25％N-甲基吡咯烷)的NMP溶液。普通技术人员会在合成的每个步骤中常规地优化和控制Fmoc切割条件。
在一个优选的实施方案中，将Fmoc保护基团从与固相缀合的生长肽链上切下所使用试剂是下述溶液的混合物：5-50％哌啶或4-甲基哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，5-50％哌啶或4-甲基哌啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液，1-5％二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)的DMF溶液，和50％吗啉DMF溶液，所述百分比均为体积百分比。
在Fmoc去除后，通常要小心地洗掉切割试剂。DMF和任选的IPA可用于将产物洗涤至中性pH。为了确保完全除去碱，在稍后的洗涤循环中加入少量HOBt可能是有好处的。
氨基酸衍生物与树脂肽的偶联，即延伸步骤，是SPPS循环的核心步骤之一。
偶联反应的速率和产率可受各种参数的影响，例如溶剂的选择，空间位阻和活化羧酸的反应性。溶剂不仅可以确定前体肽-树脂的溶胀，因此可以影响反应位点的可及性；也可能直接影响偶联反应的动力学。合适的溶剂能够溶胀树脂并溶解试剂，包括例如DMF，NMP，二甲基亚砜，二氯甲烷，四氢呋喃，乙腈，甲苯，以及它们的混合物。空间位阻由氨基酸侧链及其保护基团的性质决定。活化的羧酸的反应性决定酰化速率，以及副反应的程度，例如外消旋化。取决于所选择的合成策略，可以使用肽衍生物，如假脯氨酸二肽衍生物，二肽或三肽衍生物或支链二肽衍生物，代替单个氨基酸衍生物。
在本发明的某些实施方案中，氨基酸活化在作为溶剂的DMF中进行，即将氨基酸或肽衍生物，偶联剂和任选的添加剂溶解在DMF中，进行混合。可用DIC作为偶联剂同时用或HOBt作为添加剂。或者，可用TBTU或DEPBT在碱(优选DIPEA)的存在下，将Fmoc氨基酸转化为活性OBt或ODhbt酯。在加入树脂之前，将选择的氨基酸衍生物与上述试剂一起孵育1-30分钟而预活化，如2，3，4，5，6，7，8，9，10，...，28，29，或30分钟。偶合反应可进行1至74小时，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，...，71，72，73，或74小时。相对于与树脂结合的胺基团的量，所用的氨基酸衍生物的量可以是0.4-3摩尔比，如摩尔比为0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，或3.0。在一段时间后，如10，20，30，40，or 60分钟后，将第二部分活化剂或碱加入反应混合物中可能有利于实现完全偶联。预活化和偶联步骤通常在室温下进行，但也可以在其他温度下进行。可以进行一个或多个重复偶联步骤以实现氨基的接近完全的转化。
在本发明的其他实施方案中，氨基酸活化在由NMP，二甲基亚砜，二氯甲烷，四氢呋喃，乙腈，甲苯及其混合物组成的溶剂中进行，并可任选地加入DMF。
在一个优选的实施方案中，本发明的步骤(i-a)包括使用适当保护的氨基酸衍生物或二肽衍生物进行的基于Fmoc的固相肽合成(SPPS)，其中所述受保护的氨基酸衍生物或二肽衍生物通过一个或多个偶联剂/添加剂活化。每个步骤独立地从下述的组中选择一个或多个偶联剂/添加剂混合物
(A)TBTU/DIPEA；
(B)DIC/OximaPure(氰基-羟基亚氨基-乙酸乙酯)；
(C)DEPBT/DIPEA；和
(d)DIC/HOBt。
优选进行组氨酸(His)衍生物的偶联以避免外消旋化。这种副反应可以通过三种不同的方法来减少：1)阻断咪唑环的N3，2)通过吸电子基团如Boc或Tos阻断咪唑环的N1，和3)使用Fmoc-His(1-Trit)-OH优化偶联条件。因此，引入N末端His时，建议使用Fmoc-His(1-Trit)-OH，Boc-His(1-Trt)-OH，或Boc-His(Boc)-OH，最优选Boc-His(Boc)-OH，并与DEPBT/DIPEA组合。
因此，在优选的实施方案中，使用选自Boc-His(Boc)-OH，Boc-His(1-Trt)-OH，和Fmoc-His(1-Trt)-OH组氨酸衍生物并以DEPBT/DIPEA作为偶联剂/添加剂混合物，将N-末端组氨酸引入与固相缀合的前体肽中。
可以进行封端(capping)以阻断未反应的胺在随后的合成步骤中形成肽键，即避免形成待合成序列的缺失变体。这可以通过用大量的过量高反应性、无阻碍酸衍生物和碱短时间地处理肽树脂来实现，其中无阻碍酸衍生物可以选自N-羟基琥珀酰亚胺，乙酸酐或苯甲酰氯；碱可选自如吡啶，可力丁或DIPEA。任选地，这种处理可以在添加剂如OxymaPure或HOBt存在下进行。封端通常会产生截短的序列，其通常与最终的肽显着不同，可以容易地分离掉。优选地，系统地进行双偶联之后封端。在封端步骤结束时，通常将试剂过滤掉，并小心地洗涤树脂，例如，使用DMF和任选的IPA，然后再进行下一次脱保护步骤。
优选地，在SPPS期间可防止胰高血糖素样肽，如利拉鲁肽，在树脂上聚集。
像利拉鲁肽这样的胰高血糖素样肽本身倾向于聚集，这对它们的有效合成构成额外的挑战。一旦树脂结合的肽发生聚集，Fmoc-SPPS的步骤可能变得困难甚至失败。
有许多可能的选择可用来减轻这种聚集，如通过控制偶联密度来控制树脂负荷，控制洗涤步骤中的树脂收缩，添加诸如DMSO的溶剂，添加离液盐，添加非离子洗涤剂和碳酸亚乙酯，在高温/微波处理下进行偶联反应，和超声处理偶联反应混合物。
进一步可能的措施还包括向丝氨酸或苏氨酸中引入至少一个O-异酰基肽键，引入至少一个假脯氨酸二肽，或通过2-羟基-4-甲氧基苄基(Hmb)或2，4-二甲氧基苄基(Dmb)对至少一个肽键进行N-烷基化。因此，至少一种包含O-异酰基肽键的二肽衍生物如Boc-Ser(Val-Fmoc)-OH或Boc-Thr(Gly-Fmoc)-OH可用于此目的。间或，可以使用至少一种具有N-烷基化肽键的二肽，例如Fmoc-Glu(OtBu)-(Dmb)Gly-OH和Fmoc-Ala-(Dmb)Ala-OH。
令人惊讶地发现，使用至少一种Fmoc假脯氨酸二肽有利地抑制肽聚集并因此抑制由于低效合成而形成副产物。优选地，引入假脯氨酸二肽的位置与式I肽的Gly4-Thr5，Phe6-Thr7，Thr7-Ser8，Val10-Ser11或Ser11-Ser12的位置相应或相同。
因此，假脯氨酸残基的引入提供了一种固与相缀合的胰高血糖素样肽，优选与固相缀合的利拉鲁肽，其特征在于相关杂质的百分比降低。多种假脯氨酸二肽衍生物是本领域技术人员已知的，参见“假脯氨酸二肽，BACEM-肽的先驱合作伙伴”，全球营销，(“Pseudoproline Dipeptides Bachem-Pioneering Partner for Peptides”，GlobalMarketing，2015年11月，Bachem集团出版)。因此，在优选的实施方案中，可在式I肽的Gly4-Thr5，Phe6-Thr7，Thr7-Ser8，Val10-Ser11或Ser11-Ser12的位置引入一种或多种假脯氨酸二肽。
在特别优选的实施方案中，采用了一种或多种选自Fmoc-Gly-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Phe-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Val-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH，和Fmoc-Ser(tBu)-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH组中的假脯氨酸二肽衍生物。
根据一个优选的实施方案，在与式I肽的Gly4-Thr5，Phe6-Thr7或Thr7-Ser8的位置相同或相应的位置引入一个或多个假脯氨酸二肽。优选地，在与式I肽的Thr7-Ser8相应或相同的位置引入单个假脯氨酸二肽。在另一个优选的实施方案中，在与Phe6-Thr7相应或相同的位置引入单个假脯氨酸二肽。在一个特别优选的实施方案中，采用了一种或多种选自Fmoc-Gly-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Phe-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，和Fmoc-Thr(tBu)-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH组的假脯氨酸二肽
根据优选的实施方案，仅在与式I肽的Gly4-Thr5，Phe6-Thr7或Thr7-Ser8的位置相同或对应的位置引入一个或多个假脯氨酸二肽。在一个特别优选的实施方案中，所有引入的假脯氨酸二肽均选自Fmoc-Gly-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Phe-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，或Fmoc-Thr(tBu)-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH。
根据优选的实施方案，仅在与式I肽的Gly4-Thr5，Phe6-Thr7，Thr7-Ser8，Val10-Ser11或Ser11-Ser12的位置相同或对应的位置引入一个单一假脯氨酸二肽，其中优选的位置是Gly4-Thr5，Phe6-Thr7和Thr7-Ser8。在特别优选的实施方案中，所述单一假脯氨酸二肽选自Fmoc-Gly-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Phe-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，或Fmoc-Thr(tBu)-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH。
本文所用的术语“假脯氨酸二肽”是指临时性脯氨酸模拟物，其可从Ser和Thr经形成恶唑烷很容易地获得，也可从Cys经形成噻唑烷很容易地获得。本领域技术人员熟知这种假脯氨酸二肽。这些二肽是在SPPS期间减轻树脂上聚集的一种可能选择。因为2，2-二甲基恶唑烷可被TFA顺利裂解，因此特别适用于Fmoc-SPPS。由此，可以特别选用Fmoc-Phe-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Gly-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Val-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH，或Fmoc-Ser(tBu)-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH。
如本文所用的术语“相应/对应于式I肽的Gly4-Thr5，Phe6-Thr7，Thr7-Ser8，Val10-Ser11或Ser11-Ser12位置的位置”是指胰高血糖素样肽的一级序列内的位置，基于所述胰高血糖素样肽与式I肽的序列比对，该位置被认为与式I肽的Gly4-Thr5，Phe6-Thr7，Thr7-Ser8，Val10-Ser11或Ser11-Ser12的位置同源。通常，在这种比对显示中，彼此叠加的位置被认为是同源的，即彼此相应/对应。典型的序列比对工具如BLAST或ClustalW是本领域技术人员公知的。
如上所述，利拉鲁肽可以包含与氨基酸位置20处的赖氨酰残部的ε氨基(Lys20)结合的谷氨酰残基缀合的棕榈酸，即Lys(棕榈酰-Glu-OH)。这可以通过任何方式引入。
有各种方案可用于引入(N-ε-(γ-谷氨酰基(Nα-脂肪酸酯)))取代的Lys侧链(参见，例如US-B 6,451,974，EP-A 2 757 107，WO 2013/171135)。在本发明中，在SPPS期间至少部分地引入所述基团，优选使用下述式2的支链二肽结构单元进行引入，其中R3是氨基保护基团，R1是羧酸保护基团，R2是氨基保护基或脂肪酸残部，特别是棕榈酰[CH3(CH2)14CO-]基团。
式2：
特别优选地，使用Fmoc-Lys(palmitoyl-Glu-OtBu)-OH结构单元(可从IrisBiotech GmbH或Peptides International商购)或Fmoc-Lys(Boc-Glu-OtBu)-OH结构单元(可从Active Peptide商购)进行SPPS。
在使用后者的情况下，所得肽在谷氨酰基部分的α氨基官能团可以进行N-棕榈酰化。各种活化的棕榈酸酯，例如，对硝基苯和琥珀酰亚胺酯可用于此目的。在优选的实施方案中，使用N-琥珀酰亚胺基棕榈酸酯。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括一个使肽与活化棕榈酸酯，优选N-琥珀酰亚胺基棕榈酸酯，进行反应的步骤，这通常会产生式I的肽。
在一个更优选的实施方案中，该方法包括使活化棕榈酸酯，优选N-琥珀酰亚胺基棕榈酸酯，与式I肽的Lys(H-Glu-OH)或Lys(H-Glu-OR1)反应的步骤。其中式I肽由步骤(i-a)中提供的前体肽经切割氨基保护基团R2而获得。
甚至更优选地，该方法包括使活性的棕榈酸酯，优选N-琥珀酰亚胺基棕榈酸酯，与Lys(H-Glu-OR1)反应的步骤，该Lys(H-Glu-OR1)可从步骤(i-a)中提供的前体肽切除氨基保护基团R2而获得，特别地，步骤(i-a)中提供的前体肽至少在Glu，Asp和Lys的侧链上带有保护基团。
任选地，可以经进程控制来监测SPPS反应的进展，以确保有效的Fmoc去除，偶联和/或封端步骤。另一方面，Fmoc的测定和游离胺的测定可以提供补充信息。总之，这些方法可以实现SPPS过程的每个步骤的有效监控。下面举例说明可用于本发明的一些常用监测方法。
任选地，从树脂结合肽切割的Fmoc的量可以容易地量化，例如通过光谱测定法。可以收集从树脂中排出的Fmoc裂解试剂，通过测量301nm处的吸光度测定其中的Fmoc浓度。基于Fmoc裂解的量，可以计算树脂负载，即树脂上Fmoc肽的原始量。此外，为了评估Fmoc去除的完整性，可以对Fmoc去保护后的树脂小样品进行另外的严格Fmoc切割处理，以确定通过该处理去除的残留Fmoc的量。或者，可以对来自树脂样品的肽进行小规模裂解测试，以评估Fmoc去除的彻底性。可以使用标准梯度经分析型RP-HPLC分析所得肽，其中Fmoc保护的和游离肽序列通常会被很好地分离。间或，肽样品可以通过质谱法分析，例如，采用LC-MS或MALDI-MS。同样，薄层色谱也可以检测微量的Fmoc肽。
树脂上游离胺的量可通过各种测定来评估，包括比色Kaiser(即茚三酮)，TNBS，氯醌和溴酚蓝测试法。这对于本领域技术人员来说是公知的。
这些测试可有利地用于评估Fmoc切割后游离氨基官能团的产生，及其在偶联Fmoc保护性氨基酸衍生物后和/或封端步骤后的消失。优选地，可以并行进行至少两种比色测试，例如Kaiser和TNBS测试。Kaiser测试基于茚三酮与胺的反应。对于伯胺来说，这是一种非常敏感的测试，强烈的蓝色易于观察，但对于仲胺稍微不太合适，其产生棕红色。颜色通常主要在珠子中发生，部分在上清液中发生。当有意对未反应的氨基的量进行光谱定量时，颜色可以完全转移到溶液中。颜色的强度取决于待检测的氨基末端的性质。使用N-末端侧链保护的Asp，Asn，Cys，Ser和Thr获得非特异性色调，且N-末端Pro则产生棕红色珠。由于树脂样品通常被加热，“隐藏的”NH2基团可能变得更容易接近并因此可检测。
然而，应避免长时间加热或过热，因为可能导致Lys(Boc)的裂解或Fmoc的去除(通过吡啶)。TNBS(2，4，6-三硝基苯磺酸)试验几乎与Kaiser试验一样灵敏，但只能用于检测伯氨基。珠子只会变成橙红色，并且颜色的强度不依赖于N-末端氨基酸的性质。由于通过简单的目视检查无法检测到珠子核心中的略微橙色染色，因此建议使用更灵敏的检测，例如，在显微镜下检查珠子。
当通过SPPS合成前体肽完成时，它仍然与树脂缀合。因此，它是固相结合物的并且至少部分地受到侧链保护。为了获得式I的肽，例如，利拉鲁肽或本发明的任何其他胰高血糖素样肽，肽要从树脂上裂解下来。这在本说明书中由步骤(i-b)表示，即将前体肽从树脂上裂解下来。
最优选地，在该步骤期间，大多数或所有侧链保护基团同时从肽上裂解，即肽被去保护，从而提供式I的肽。
因此，优选地，通过与包含TFA和一种或多种清除剂的裂解组合物一起温育，同时进行树脂的脱保护和裂解(步骤(i-b))。
为了将肽从树脂上裂解，可以使用任何适合于该目的的组合物。优选地，用于切割和去保护的裂解组合物含有超过50％的TFA，更优选超过75％的TFA，特别是至少80％(v/v)或甚至至少90％的TFA。更高的组合物进行。该组合物还可含有水和/或一种或多种清除剂。优选地，该组合物包含TFA，水和一种或多种清除剂。特别有利的清除剂是硫醇清除剂，如EDT，和/或硅烷清除剂，如TIPS。裂解组合物可包含至少80％TFA，优选至少90％TFA，和EDT。裂解组合物可包含至少80％TFA，优选至少90％TFA，水和EDT。裂解组合物可包含至少80％TFA，优选至少90％TFA，水和TIPS。裂解组合物可包含至少80％TFA，优选至少90％TFA，水，TIPS和EDT。示例性地，用于本发明的裂解组合物可选自TFA/水/TIPS(90∶5∶5)，TFA/水/苯酚(90∶5∶5)，TFA/water/EDT/TIPS(90∶5∶2.5∶2.5)，TFA/water/EDT/TIPS(90∶4∶3∶3)，TFA/水/EDT(90∶5∶5)，TFA/茴香硫醚/茴香醚/EDT(90∶5∶3∶2)和TFA/茴香硫醚/水/苯酚/EDT(82.5∶5∶5∶5∶2.5)。上述提到的百分比和数字比分别为体积百分比和体积比。
将前体肽从树脂上裂解的步骤(步骤(i-b))可以在适合于该目的的任何条件下进行。优选地，将洗涤过的树脂与裂解组合物一起(优选在惰性气体下)温育约1至4小时和/或在0至32℃的温度下进行裂解。
示例性地，在进行裂解时，可以将洗涤过的树脂与裂解组合物一起温育(优选在惰性气体下)长至1，1.5，2，2.5，3，3.5，4小时或超过4小时，温度约在0-4℃，4-10℃，10-15℃，15-25℃或25-35℃。示例性地，在进行裂解时，可以将洗涤过的树脂与裂解组合物一起孵育(优选在惰性气体下)长至1，1.5，2，2.5，3，3.5，4小时或超过4小时，温度约为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，或32℃。
或者，可以采用另一种裂解组合物。例如，从2-氯三苯甲基树脂切割受保护的肽片段时，可以通过使用TFE/AcOH/DCM(1∶1∶3)，0.5％TFA/DCM，或HFIP/DCM实现。
本领域技术人员会根据所给定肽的氨基酸组成常规地优化适用于本发明的裂解组合物，并且可以设想任选使用一种或多种清除剂，例如DTE，EDT，TES，TIPS，2-巯基乙醇，乙基甲基硫醚，间-或对-甲酚，2-甲基吲哚，Ac-Trp-OMe或色胺。
在本发明中，术语“清除剂”是指，在SPPS后肽从树脂上裂解期间和/或除去保护基团期间，加入反应混合物中用于抑制副反应发生的化合物。用于裂解组合物的典型清除剂是“硫醇清除剂”(例如EDT，DTE，DTT和β-巯基乙醇)和“硅烷清除剂”(例如TES和TIPS)。其它常用的清除剂包括乙基甲基硫醚，茴香硫醚，苯甲醚，间-或对-甲酚，2-甲基吲哚，Ac-Trp-OMe或色胺。本领域技术人员清楚地知道可用的各种清除剂。
根据以上所述，从步骤(i)获得的溶液S还优选地包含TFA(通常至少80％(体积比)或至少90％(体积比))，从肽上切下的保护基团的残基和，更优选地，水和一种或多种清除剂。
然后，通常通过过滤从步骤(i)，即从树脂上裂解肽的步骤，得到的溶液S中分离树脂。在本发明的一个实施方案中，从步骤(i)获得的溶液S包含利拉鲁肽和用于切割的试剂(例如，TFA，水，清除剂和从肽上切下的保护基团的残基)。任选地，在过滤后漂洗树脂，例如，用浓缩的TFA或浓缩的TFA加清除剂进行漂洗。
任选地，所述漂洗溶液也可以作为步骤(i)获得的溶液S的一部分，即，它们可以与从树脂上裂解肽后直接获得的溶液合并。
因此，在优选的实施方案中，从步骤(i)获得的溶液S还包含三氟乙酸(TFA)，水和一种或多种清除剂。
在更优选的实施方案中，从步骤(i)获得的溶液S包含三氟乙酸(TFA)，水和一种或多种选自硫醇清除剂和/或硅烷清除剂的清除剂。
清除剂可用于防止与敏感氨基酸如Cys，Met，Ser，Thr，Trp和Tyr发生不利的副反应。不希望受任何理论的束缚，据信抑制所述副反应是通过捕获在裂解反应期间产生的高反应性碳阳离子实现的。
本领域技术人员知道，一般希望从溶液S中分离出式I的肽，从而获得粗肽(通常作为TFA盐存在)。在本发明特别优选的实施方案中，这是通过用含有二异丙醚(IPE)和乙腈(ACN)的反溶剂沉淀步骤(i)的肽来实现的，其中IPE∶ACN的体积比在(3∶1)到(10∶1)的范围内；然后再分离所得的沉淀物。
这里，IPE和ACN的混合物用作反溶剂。该术语是本领域技术人员很好理解的。如本文所用，术语“反溶剂”可以在最广泛的意义上理解为当与肽溶液混合时诱导肽沉淀的任何试剂。示例性的反溶剂包括二乙醚，IPE，MTBE，以及IPE与ACN的混合物。根据本发明，反溶剂包括选自(3∶1)体积比至(10∶1)体积比范围的IPE和ACN。更优选地，反溶剂包括IPE和ACN，其中IPE∶ACN体积比在(3∶1)至(5∶1)的范围内。令人惊奇地发现，当使用包含IPE和ACN的反溶剂时，从裂解组合物中回收粗肽的效果特别好，所述反溶剂的体积比选自(3∶1)至(10∶1)，优选的体积比为(3∶1)至(5∶1)，如比例为(3∶1)，(3,5∶1)，(4∶1)，(4,5∶1)或(5∶1)。
本发明发现使用所述反溶剂可改善沉淀物的纯度和物理性质，从而能够有效地从裂解组合物中分离肽产物。
有利地，本发明能够快速地回收粗肽，这是通过形成非粘性的沉淀物其尺寸分布有利快速过滤。进一步有利的是，沉淀物的纯度和低TFA含量。
在优选的实施方案中，步骤(ii)中使用的反溶剂包含至少50％(体积比)由二异丙醚和乙腈组成的混合物M。优选地，反溶剂包含至少75％(体积比)的所述混合物M，更优选地，反溶剂基本上是由二异丙醚和乙腈的混合物组成。
在特别优选的实施方案中，反溶剂基本上由二异丙基醚和乙腈的混合物组成，其中二异丙基醚∶乙腈的体积比在(3∶1)至(5∶1)的范围内。
可以通过任何合适的方式将反溶剂与溶液S混合。在优选的实施方案中，步骤(ii)包括通过以下方式将反溶剂与步骤(i)的溶液S混合：
(ii-a)预混合二异丙醚和乙腈，然后将其与步骤(i)得到的溶液S混合；
(ii-b)首先将二异丙醚与步骤(i)得到的溶液S混合，然后将乙腈与含有溶液S和二异丙醚的混合物混合；或者
(ii-c)首先将乙腈与步骤(i)得到的溶液S混合，然后将二异丙醚与包含溶液S和乙腈的混合物混合。
换句话说，可以将反溶剂分成含乙腈部分和含二异丙醚的部分，随后使所述部分与包含肽的溶液接触。或者，反溶剂合为单一液体混合物。
总之，最终获得了本发明的(IPE∶ACN)体积比范围。本领域技术人员会理解，乙腈和二异丙醚也可分批地与溶液S混合，只要最终达到本发明要求的体积比范围即可。
优选地，溶液S与反溶剂的体积比为1∶5至1∶15，如1∶5，1∶8，1∶10，1∶12，或1∶15。换句话说：一个体积的溶液S与一定量的反溶剂混合，该一定量为5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，或15个体积。
从溶液S中沉淀出式I肽的步骤(步骤(ii))可以在适合于该目的的任何温度和任何时间间隔进行。示例性地，步骤(ii)在-5℃至25℃下进行，例如，约-5-0℃，0-10℃，10-20℃或20-25℃。
对于本申请而言，术语“约”用于表示与任何给定数值的偏差可高达10％。
在优选的实施方案中，式I的肽(步骤(ii))的沉淀在-5℃至10℃，优选0℃至10℃的温度下进行。合适的温度范围可以是-5-0℃，-2.5-2.5℃，0-5℃，2.5-7.5℃或5-10℃。
示例性地，步骤(ii)进行约30至360分钟的时间，如约30，60，90，120，150，180，210，240，270，300，330，或360分钟。
因此，优选的沉淀条件的特征在于温度在约-5℃至25℃的范围内，例如约-5-0℃，0-10℃，10-20℃或20-25℃，反应时间约为30-360分钟，例如约30，60，90，120，150，180，210，240，270，300，330，或360分钟。
在特别优选的实施方案中，制备利拉鲁肽或其盐的方法包括：
(i)提供包含式I的肽的溶液S，式I为：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-B1-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，
其中B1是Lys(棕榈酰-Glu-OH)或Lys(H-Glu-OH)；
其中提供溶液S的步骤包括：
(i-a)提供与固相缀合的前体肽：
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-B2-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-[树脂]，
其中B2是Lys(棕榈酰-Glu-OtBu)或Lys(Boc-Glu-OtBu)，并且其中至少Glu，Asp和Lys的侧链带有保护基团；和
(i-b)通过用含有三氟乙酸(TFA)的裂解组合物将前体肽从树脂上裂解下来，
其中从步骤(i)得到的所述溶液S包括三氟乙酸(TFA)，水和一种或多种选自硫醇清除剂和/或硅烷清除剂的清除剂；
(ii)将溶液S与由二异丙基醚和乙腈组成的反溶剂混合，沉淀步骤(i)的肽，其中二异丙基醚∶乙腈体积比在(3∶1)至(5∶1)的范围内；和
(iii)分离步骤(ii)得到的沉淀，优选通过过滤和/或离心分离方法。
由步骤(i)得到的溶液S和反溶剂可以通过本领域已知的任何方法混合。由步骤(i)得到的溶液S和反溶剂可以以任何顺序混合。
根据优选的实施方案，步骤(ii)使用经典的沉淀方案进行，即将反溶剂加入到从步骤(i)获得的溶液S中。这可以通过一次添加或通过逐滴添加和/或通过缓慢流入添加来实现。
根据另一个优选的实施方案，步骤(ii)使用反向沉淀方案进行，即将步骤(i)得到的溶液S加入到反溶剂中。这可以通过一次添加或通过逐滴添加和/或通过缓慢流入添加来实现。本领域技术人员熟知如何进行这种沉淀步骤。
然后，含有利拉鲁肽的沉淀物和反溶剂中形成悬浮液，所述悬浮液还包含裂解组合物的试剂(例如，TFA，水和清除剂)以及从肽上切下的保护基团的残留物。然后可以通过本领域已知用于此目的的任何方法从粗悬浮液中分离得到由(或基本上由)利拉鲁肽组成的沉淀物。
因此，本发明还包括分离步骤(iii)，分离从步骤(ii)得到的沉淀物。
根据优选的实施方案，该步骤(iii)通过过滤和/或离心完成。
对于本发明而言，术语“分离”可以在最广泛的意义上理解为用于获得目的产物的任何手段，例如，从更复杂的组合物得到粗肽沉淀物。粗肽沉淀物可包含至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，特别是至少95％，或者甚至100％处于干燥状态的利拉鲁肽。通常，粗肽沉淀物包含40-70％干燥状态的利拉鲁肽。上述百分比均为体积百分比。
过滤可以是本领域已知的任何过滤方法，例如，死端过滤(ead-end filtration)或错流过滤(cross-flow filtration)。如本文所用，术语“交叉流过滤”，“错流过滤”，“切向流过滤”或“切向过滤”可以互换。过滤器可以是本领域过滤中已知的任何材料，例如塑料(例如尼龙，聚苯乙烯)，金属，合金，玻璃，陶瓷，玻璃纸，纤维素或复合材料。过滤器可以是疏水的或亲水的。过滤器的表面可以是中性的或带正电的或带负电的。
离心可以在最广泛的意义上理解为使悬浮沉淀物的沉降加速的任何方式。示例性地，可用的离心力可达100xg，至少100xg，至少1,000xg，至少2,500xg，至少5,000xg，至少7,500xg，至少10,000xg，至少15,000xg，至少25,000xg，或至少50,000xg。通过离心，形成滤饼，其含有(或基本上只含有)利拉鲁肽粗肽。任选地，可以将滤饼重新悬浮在反溶剂中，该反溶剂可以与上述反溶剂相同或不同。任选地，可以重复离心和将沉淀重新悬浮在反溶剂中数次，这可以进一步提高粗利拉鲁肽的纯度。
优选地，通过本发明方法获得的粗肽可以通过一个或多个制备步骤进一步纯化。可任选地用于本发明的纯化和分离的方法包括如一种或多种电泳方法(例如，凝胶电泳或毛细管(CE)电泳)，一种或多种另外的基于沉淀的方法(例如，盐腌或盐析)，一种或多种透析方法(透析)，和/或一种或多种色谱方法，如凝胶渗透色谱(GPC)，尺寸排阻色谱，离子交换色谱(IEC)，高效液相色谱(HPLC)，反相HPLC(RP-HPLC)，快速蛋白液相色谱(FPLC)，快速色谱(闪光)，快速流化液相色谱(RRLC)，快速分离液相色谱(RSLC)，超快速液相色谱(UFLC)，反相UFLC(RP-UFLC)，超高效液相色谱(UPLC)或反相UPLC(RP-UPLC)。优选地，粗肽首先进行三维反相HPLC，然后进行尺寸排阻色谱摄影，离子交换色谱或超滤。
本领域技术人员会理解，本发明还包括具有改进纯度的粗利拉鲁肽沉淀物，由于其改进了粒度和稠度，特别易于处理。
因此，本发明的另一方面涉及经本发明的方法可获得的利拉鲁肽沉淀物。
在一个优选的实施方案中，可从根据本发明的方法获得的利拉鲁肽沉淀物的特征在于其平均粒度为大于280微米，大于300微米，大于350微米或大于400微米。
此外，可以根据本发明的方法获得的利拉鲁肽肽沉淀物的特征在于其肽纯度为至少50％，优选至少55％，更优选至少60％。
在优选的实施方案中，可以根据本发明的方法获得的利拉鲁肽沉淀物的特征在于包含N-末端和/或C-末端截短的利拉鲁肽变体。在一些实施方案中，可以根据本发明的方法获得的利拉鲁肽沉淀物的特征在于可以含有截短的变体利拉鲁肽21-31-OH，其可以被酰化，例如，在N-末端乙酰化。在其他实施方案中，可以根据本发明的方法获得的利拉鲁肽沉淀物的特征在于含有截短的变体利拉鲁肽1-30。
本发明所用的术语“截短的变体”是指所述肽的连续片段，即无间隙的子序列(subsequences)，其在N-末端或C-末端缺少一个或多个氨基酸。N-末端截短的变体可以被酰化，例如，乙酰化。
在进一步优选的实施方案中，通过本发明可获得的利拉鲁肽沉淀物的特征可在于粘性降低或甚至没有粘性和/或TFA含量低于20％(重量比)。在特别优选的实施方案中，通过本发明可获得的利拉鲁肽沉淀物的特征在于平均粒度高于350微米且纯度为至少55％。在另一个优选的实施方案中，通过本发明可获得的利拉鲁肽沉淀物的特征在于平均粒度大于400微米，纯度至少55％。在另一个优选的实施方案中，通过本发明可获得的利拉鲁肽沉淀物的特征在于平均粒度高于350微米且纯度为至少60％。在一个特别优选的实施方案中，通过本发明可获得的利拉鲁肽沉淀物的特征在于平均粒度大于350微米，纯度至少为55％，并且没有粘性。在另一个优选的实施方案中，通过本发明可获得的利拉鲁肽沉淀物的特征在于平均粒度大于350微米，纯度至少55％，和TFA含量低于20％(重量比)。
沉淀物的粒度可以通过本领域的任何方法测量，例如，通过如下所述的聚焦光束反射测量(FBRM)技术。
除非另有说明，肽纯度在本说明书中为“HPLC纯度”，即在分析型反相高效液相色谱(RP-HPLC)中观察到的相对峰面积，在205和230nmUV波长检测获得，即肽键最大吸收波长。换句话说，该值被确定为给定峰面积除以色谱图中所有在205和230nmUV波长观察到的峰面积之和后得到的面积％。该方法是本领域的常规，技术人员会常规地设计针对给定产品的RP-HPLC检测方案并根据美国药典中规定的既定指南进行定量。通过LC-MS测定峰纯度，可常规地评估给定RP-HPLC检测方案是否可用来检测肽纯度。假设由于它们的相似结构，所有肽组分具有相同的吸收，RP-HPLC纯度则可代表重量百分比纯度。
以上列出的所有定义适用于本发明利拉鲁肽沉淀的情况。本领域技术人员会注意到，所述沉淀物中的利拉鲁肽可以是盐的形式存在，特别是TFA盐。
任选地，本发明的利拉鲁肽的一个或多个氨基酸残基可在获得肽后进行脂化，磷酸化，硫酸化，环化，氧化，还原，脱羧，乙酰化，酰化，酰胺化，脱酰胺，生物素化或与一种或多种其他小分子和/或萜烯结合。任选地，本发明的利拉鲁肽可以被标记，可用的标记物有一种或多种小分子染料(例如Cy染料如，Cy3，Cy5，Cy5.5，Cy7)，Alexa染料(例如，AlexaFluor 488，Alexa Fluor 546，Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 680，Alexa Fluor 750)，VisEn染料(例如VivoTag680 VivoTag750)，S染料(例如，S0387)，DyLight荧光团(例如，DyLight 750，DyLight 800)，IRDyes(例如，IRDye 680，IRDye 800)，荧光素染料(例如荧光素，羧基荧光素，异硫氰酸荧光素(FITC))，罗丹明染料(例如罗丹明，四甲基罗丹明(TAMRA))或HOECHST染料，或一个或多个量子点。
如上所述，根据本发明方法的优选实施方案，利拉鲁肽在树脂上通过SPPS制备。
因此，本发明的另一方面涉及与树脂缀合的前体肽：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-B2-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-[树脂]，
其中B2是Lys(棕榈酰-Glu-OR1)或B2是Lys(R2-Glu-OR1)，R1是羧酸保护基，R2是氨基保护基，
其中至少Glu，Asp和Lys的侧链带有保护基团，和
其中至少有一个假脯氨酸二肽存在于Gly4-Thr5，Phe6-Thr7，Thr7-Ser8，Val10-Ser11或Ser11-Ser12的位置。
以上列出的所有定义也适用于前体肽。本领域技术人员会理解，本发明也包括所述前体肽的盐，特别是药学上可接受的盐。在优选的实施方案中，至少一种假脯氨酸存在于前体肽的Gly4-Thr5，Phe6-Thr7或Thr7-Ser8的位置。示例性地，它可以是本发明所述的假脯氨酸残基。
对本发明而言，术语“前体肽”可以在最广泛的意义上理解为可以转化成本发明所述肽的化合物，即胰高血糖素样肽，特别是利拉鲁肽。通常，这种前体是SPPS的产物，其侧链处被部分或完全保护，并与树脂缀合，即固相缀合。
此外，本发明提供固相缀合的胰高血糖素样前体肽(特别是利拉鲁肽的前体肽)，其中至少Glu，Asp和Lys的侧链带有保护基团，并且其中至少有一个与丝氨酸或苏氨酸相连的O-异酰基肽键，和/或至少一个假脯氨酸存在于Gly4-Thr5，Phe6-Thr7，Thr7-Ser8，Val10-Ser11或Ser11-Ser12的位置，和/或至少有一个肽键被2-羟基-4-甲氧基苄基(Hmb)或2，4-二甲氧基苄基(Dmb)N-烷基化。
特别优选地，前体肽包含至少一种选自如Fmoc-Gly-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Val-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH，和Fmoc-Phe-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH的假脯氨酸二肽。
本发明进一步涉及制备式I肽的方法，其中所述肽从上述与树脂缀合的前体肽(即，固相结合的，侧链保护的利拉鲁肽衍生物)经与含有TFA的裂解组合物孵育而获得。该孵育可以按如上所述的方法进行。
本发明还涉及利拉鲁肽，其可从如前所述从树脂上切下的前体肽获得。
此外，本发明提供了药物组合物，其包含根据本发明的方法产生的胰高血糖素样肽，或包含从本发明的固相缀合的胰高血糖素样肽切割产生的胰高血糖素样肽。
因此，本发明的另一方面涉及药物组合物，包含：
(A)可从根据本发明的方法获得的利拉鲁肽或可以从本发明的前体肽经裂解其固相而得到的利拉鲁肽
(B)药学上可接受的载体。
药学上可接受的载体可以是为此目的已知的任何添加剂或添加剂组合物。这种添加剂可以示例性地是无毒溶剂，例如水，二甲基亚砜(DMSO)，乙醇，植物油，石蜡油或其组合。此外，载体可含有一种或多种洗涤剂，一种或多种发泡剂(例如十二烷基硫酸钠(SLS)/二乙基硫酸钠(SDS))，一种或多种着色剂(例如，TiO2，食用色素)，一种或多种更多维生素，一种或多种盐(例如钠，钾，钙，锌盐)，一种或多种保湿剂(例如山梨糖醇，甘油，甘露醇，丙二醇，聚葡萄糖)，一种或多种酶，一种或多种防腐剂(例如，苯甲酸，甲基对苯二甲酸)，一种或多种变形剂(例如，羧甲基纤维素(CMC)，聚乙二醇(PEG)，山梨糖醇)，一种或多种乳化剂，一种或多种填充剂，一种或多种上光剂，一种或多种分离剂，一种或多种抗氧化剂，一种或多种草药和植物提取物，一种或多种稳定剂，一种或多种聚合物(例如羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)，聚乙烯亚胺(PEI)，羧甲基纤维素(CMC)，聚乙二醇(PEG))，一种或多种摄取介质(例如，聚乙烯亚胺(PEI)，二甲基亚砜(DMSO)，细胞穿透肽(CPP)，蛋白质转导结构域(PTD)，抗菌肽等)，一种或多种抗体，一种或多种甜味剂(如蔗糖，糖精钠，甜叶菊))，一种或多种复染染料(例如，荧光素，荧光素衍生物，Cy染料，Alexa Fluor染料，S染料，罗丹明，量子点等)，一种或多种顺势疗法(homeopathic)成分，一种或多种味觉物质，和/或一种或多种香料。
以下提供的附图和实施例，包括所进行的实验和所获得的结果，以及权利要求是用来描述本发明的。
附图简述
图1显示了所选胰高血糖素样肽的序列比对。其中，与GLP-1序列相同的部分以粗体表示。
图2显示了通过FBRM技术测量的肽沉淀物的粒度分布(在以下装置上进行：ParticleTrack G600L，Mettler Toledo，设置：Macro V1.1.11，立方体重量(cubeweight)，标准化(normalized)，平均值(立方体重量))。弦长是基于扫描速度和反向散射光的不同脉冲的数量和持续时间计算的每个粒子的距离。给出的百分比与检测到的颗粒的数量有关并进行标准化，这样在一次扫描内一定尺寸的最大颗粒数量是100％。这里，将实施例5的沉淀物EOP26a(抗溶剂：二乙醚；平均粒径：261μm)与实施例2的沉淀物EOP22a(反溶剂：IPE/ACN；平均粒径：422μm)进行了比较。
实施例
实施例1：
在100-200或200-400目H-Gly-2-氯三苯甲基树脂(Bachem no.4092098或4026823)上进行利拉鲁肽的逐步Fmoc-SPPS，采用下述标准Fmoc氨基酸衍生物：Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Asp(OMpe)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Boc-His(Boc)-OH，Fmoc-His(1-Trt)-OH Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，和Fmoc-Val-OH，以及前面所述结构单元Fmoc-Lys(Nε-(γ-谷氨酰基(OtBu)-(Nα-十六烷酰基)))(即Fmoc-Lys(棕榈酰--Glu-OtBu)-OH，参见WO2013/171135)，再加上至少一种选假脯氨酸二肽，其选自Fmoc-Gly-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Phe-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Val-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH，and Fmoc-Ser(tBu)-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH。偶联反应采用TBTU/DIPEA或DEPBT/DIPEA，偶联适当的时间(1.5-24.0小时)再Fmoc脱保护(0.5-4.0小时)。
需要时，也用了含20％哌啶的NMP取代含20％哌啶的DMF，以提高脱保护率。在偶联步骤后，任选地使用乙酸酐进行乙酰化。在乙酰化或Fmoc脱保护后，采用DMF和IPA作为洗涤步骤的溶剂。通常在裂解和沉淀后获得粗利拉鲁肽，其U-HPLC纯度为约50％。
或者如下所述，使用逐步合成方案，包括使用Fmoc-Lys(Boc-Glu-OtBu)-OH作为结构单元，并对得到的纯化肽进行棕榈酰化。
逐步Fmoc SPPS一个一级氨基酸序列的完全受保护的肽：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Boc-Glu-OtBu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-[树脂]
是在自动合成仪中的H-Gly-2-氯三苯甲基树脂进行。使用各个相应的标准Fmoc氨基酸衍生物，用或TBTU/DIPEA作为偶联剂和DMF作为溶剂进行偶联反应。作为一个例外，Boc-His(Boc)-OH的偶联是使用DEPBT/DIPEA在DMF中进行。耦合时间不等，在1.5小时和4小时之间。Fmoc-Lys(Boc-Glu-OtBu)-OH结构单元的引入是手动进行的(偶联时间4小时)，而其余合成为全自动肽合成。使用20％哌啶DMF溶液(体积比)进行Fmoc脱保护。脱保护时间在15到90分钟之间不等。每次偶联后，使用乙酸酐进行系统的加帽步骤。
在Fmoc脱保护和乙酰化后，用DMF和/或IPA作为溶剂进行洗涤步骤。然后用由TFA/H2O/EDT(90∶5∶5，体积比)组成的裂解组合物孵育2.5小时，从固体支持物上切下肽，同时除去所有侧链保护基团，然后沉淀。使用C8键合的二氧化硅作为固定相，使用TEA作为第一维度洗脱液系统，也使用TFA作为第二维度洗脱液系统，对所得粗物质进行二维制备型反相HPLC。所得纯化前体肽的U-HPLC纯度通常为95％，并在含有66％THF的水溶液中与N-琥珀酰亚胺基棕榈酸酯进行反应。通过蒸发溶剂使所得产物沉淀，再加入50％AcOH的10％ACN/H2O溶液将其溶解并过滤。
实施例2：从裂解组合物中沉淀胰高血糖素样肽
一般程序：
将肽树脂(5g)悬浮在50mL裂解组合物中并在室温下搅拌3小时。然后滤出树脂并用TFA(2×3.5mL)洗涤。将裂解组合物和洗涤级分液合并，加入570mL相应的反溶剂以引发沉淀。将所得悬浮液再搅拌2小时，然后通过使用过滤漏斗或标准加压过滤设备(“袋式过滤器”)分离肽沉淀物。测定过滤时间和基于肽树脂的总收率。将沉淀物用相应的醚(3×15mL)洗涤，并在室温下真空干燥，得到粗肽。
或者，将肽树脂(3g)悬浮在30mL裂解组合物中并在室温下搅拌3小时。然后滤出树脂并用TFA(2×2.1mL)洗涤。将裂解组合物和洗涤级分液合并后加入342mL反溶剂中以引发沉淀。将所得悬浮液再搅拌2小时，然后通过使用过滤漏斗或标准加压过滤设备(“袋式过滤器”)分离肽沉淀物。测定过滤时间和基于肽树脂的总收率。将沉淀物用相应的醚(3×18mL)洗涤，并在室温下真空干燥，得到粗肽。
结果：
通过分析型反相UHPLC，分析干燥的肽沉淀物的纯度和TFA含量，并通过分析型尺寸排阻UHPLC测定聚集物含量。通过目视检查评估沉淀物的外观/粘性。
如表2所示，用IPE/ACN的混合物在1∶3-1∶10的范围内沉淀，不仅产生了可接受的产率和过滤时间，而且与纯醚反溶剂相比，还提高了沉淀物的纯度(比较第5-7行和第1-3行)。
当反溶剂不进行预混合，而是将ACN部分和IPE部分分开，并分别在随后与肽溶液接触，可进一步提高纯度至63.1％(数据未显示)。为了便于对各种沉淀方法作进一步比较，将性能得分P按如下方法计算：P＝P滤波时间x P纯度x P产量x P外观x P聚集物含量。由于每项得分范围为1-3，最大的可能得分为243，最小得分为1。通过该定量评估，发现IPE/ACN混合物与其他测试的抗溶剂相比明显有利。
表2.TFA/水/EDT/TIPS裂解组合物的利拉鲁肽沉淀
实施例3：肽溶液的组成
按上述实施例2，进行进一步的实验，不同的是使用由EP-A 2 757 107中公开的用于制备利拉鲁肽的裂解组合物，其组成为茴香硫醚/苯甲醚/EDT(90∶5∶3∶2，体积比)。观察到的性能评分为108(3×2×3×3×2)，表明IPE/ACN抗溶剂的有利效果不局限于一种特定的含肽溶液。
实施例4：沉淀温度
按上述实施例2，进行了进一步的实验，以分析沉淀的优选温度范围。
表3.沉淀温度
实施例5：对比例
按照EP-A 2 757 107所述的方法，通过与TFA/茴香硫醚/苯甲醚/EDT(90∶5∶3∶2，体积不)一起温育将利拉鲁肽从树脂上切下，并用冰冷的乙醚沉淀。按如上实施例2中采用的方法分析沉淀物。
表4.比较降水方案的性能
实验序号 性能得分 产量[％] 过滤时间[分钟] HPLC纯度[％] 外观
EOP26a 18(2x1x3x3x1) 38 22：30 44.89 细小的沉淀物
使用ParticleTrack G600L装置通过聚焦光束反射测量(FBRM)技术分析从实施例5(实验编号EOP26a)和实施例2(实验编号EOP22a)所获得的代表性悬浮液。FBRM技术可以基于反向散射激光的检测，确定沉淀后的粒度分布。
如图2所示，本发明的沉淀物的特征在于其粒度分布向较大的尺寸变化。根据本发明制备的沉淀物，平均粒径为422μm，而根据EP-A 2 757 107的方案制备的沉淀物的平均粒度为261μm。这导致过滤特征的显着差异。本发明获得沉淀物过滤速度快得多。因此，可以得出结论，根据本发明获得的沉淀物与现有技术中公开的沉淀物的不同之处不仅在于其改进的纯度和宏观性质，而且在于它们的粒度分布。
实施例6：肽沉淀的组成
通过分析型反相UHPLC和质谱法分析如上实施例2中获得的粗利拉鲁肽沉淀，用于检测截短的利拉鲁肽变体。所述粗利拉鲁肽沉淀中，可以检测到N末端截短的利拉鲁肽变体，特别是酰化的利拉鲁肽[21-31]。此外，观察到C末端截短的变体利拉鲁肽[1-30]。

Claims (15)

1.一种制备利拉鲁肽或其盐的方法，包括：
(i)提供溶液S，其含有式I的肽：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-B1-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中B1是Lys(棕榈酰-Glu-OH)or Lys(H-Glu-OH)；
(ii)将溶液S与含二异丙基醚和乙腈的反溶剂混合，沉淀步骤(i)的肽，其中二异丙基醚∶乙腈体积比在3∶1至10∶1的范围内；和
(iii)分离步骤(ii)得到的沉淀，优选通过过滤和/或离心分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)包括：
(i-a)提供与固相缀合的前体肽：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-B2-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-[树脂]，其中B2Lys(棕榈酰-Glu-OR1)或B2is Lys(R2-Glu-OR1)，R1是羧酸保护基，R2是氨基保护基；其中至少Glu，Asp，和Lys的侧链带有保护基团；和
(i-b)将前体肽从树脂切下。
3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(i-a)包括基于Fmoc的固相肽合成，其使用适当保护的氨基酸衍生物或二肽衍生物，其中所述受保护的氨基酸衍生物或二肽衍生物通过一种或多种偶联剂/添加剂的混合物进行活化，对于每个步骤，所述偶联剂/添加剂混合物均独立地选自如下的组：
(A)(苯并三唑基)四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)/二异丙基乙胺(DIPEA)
(B)二异丙基碳二亚胺(DIC)/氰基-羟基亚氨基-乙酸乙酯；
(C)3-(二乙氧基-磷酰氧基)-3H-苯并[d][1，2，3]三嗪-4-酮(DEPBT)/DIPEA；和
(D)DIC/羟基苯并三唑(HOBt)。
4.根据权利要求2或3的方法，其中一种或多种假脯氨酸二肽被引入到式I肽的Gly4-Thr5，Phe6-Thr7，Thr7-Ser8，Val10-Ser11或Ser11-Ser12的位置，优选地，其中所用一种或多种假脯氨酸二肽衍生物选自如下的组：Fmoc-Gly-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Phe-Thr(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH，Fmoc-Val-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH，和Fmoc-Ser(tBu)-Ser(Psi(Me，Me)pro)-OH。
5.根据权利要求2或3的方法，其中使用选自Boc-His(Boc)-OH，Boc-His(1-Trt)-OH，和Fmoc-His(1-Trt)-OH的氨基酸衍生物，并采用偶联剂/添加剂混合物DEPBT/DIPEA，将N-末端组氨酸残基引入与固相缀合的前体肽中。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中使用选自如下组的混合物从与固相缀合的生长肽链上切下Fmoc保护基团：含5-50体积％哌啶或4-甲基哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，含5-50体积％哌啶或4-甲基哌啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)，含1-5体积％二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯的DMF，和含50体积％吗啉的DMF。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括使活化的棕榈酸酯，优选N-琥珀酰亚胺基棕榈酸酯与式I肽的Lys(H-Glu-OH)反应或与Lys(H-Glu-OR1)反应的一个步骤，所述Lys(H-Glu-OR1)可通过从步骤(i-a)中提供的前体肽切割氨基保护基团R2后获得。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中从步骤(i)获得的溶液S还包含三氟乙酸(TFA)和一种或多种清除剂，优选地，所述清除剂选自硫醇清除剂和/或硅烷清除剂。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中使用的反溶剂包含至少50体积％，优选至少75体积％，最优选100体积％二异丙醚和乙腈的混合物M，并且所述混合物M中二异丙醚∶乙腈的体积比在3∶1至5∶1的范围内。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括通过以下方式将反溶剂与步骤(i)得到的溶液S混合：
(ii-a)预混合二异丙醚和乙腈，然后将其与步骤(i)得到的溶液S混合；
(ii-b)首先将二异丙醚与步骤(i)得到的溶液S混合，然后将乙腈与含有溶液S和二异丙醚的混合物混合；或
(ii-c)首先将乙腈与步骤(i)得到的溶液S混合，然后将二异丙醚与包含溶液S和乙腈的混合物混合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中步骤(ii)在-5℃至10℃，优选0℃至10℃的温度下进行，和/或步骤(ii)使用经典或反向沉淀方案进行。
12.一种利拉鲁肽肽沉淀物，其可由权利要求1-11中任一项的方法获得。
13.根据权利要求12的利拉鲁肽肽沉淀物，其特征在于它含有截短的利拉鲁肽变体。
14.一种与树脂结合的前体肽：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-B2-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-[树脂]，
其中B2是Lys(棕榈酰-Glu-OR1)或B2is Lys(R2-Glu-OR1)，R1是羧酸保护基，R2是氨基保护基，
其中至少Glu，Asp和Lys的侧链带有保护基团，和
其中至少有一个假脯氨酸二肽存在于Gly4-Thr5，Phe6-Thr7，Thr7-Ser8，Val10-Ser11或Ser11-Ser12的位置。
15.一种药物组合物，包含：
(A)可从根据权利要求1-11中任一项的方法获得的利拉鲁肽，或可通过从权利要求14的前体肽固相切割获得的利拉鲁肽。
(B)药学上可接受的载体。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111670194A (zh) * 2018-01-30 2020-09-15 巴赫姆控股股份公司 制备胰高血糖素肽
CN114249808A (zh) * 2021-12-27 2022-03-29 杭州诺泰澳赛诺医药技术开发有限公司 一种Cagrilintide的合成方法
CN118146350A (zh) * 2024-03-13 2024-06-07 北京泽勤生物医药有限公司 Glp-2肽类似物的制备方法及应用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021514936A (ja) * 2017-12-19 2021-06-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｇｌｐ−１ペプチドの可溶性
JP7434169B2 (ja) 2018-04-10 2024-02-20 サノフィ－アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 固相からの固相結合ペプチドの切断方法
JP7332620B2 (ja) * 2018-04-10 2023-08-23 サノフィ－アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング キャップ付加を伴うリキシセナチドの合成
US11396533B2 (en) 2018-10-09 2022-07-26 Fresenius Kabi Ipsum S.R.L. Process for the manufacture of GLP-1 analogues
WO2020127476A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Krka, D.D., Novo Mesto Pharmaceutical composition comprising glp-1 analogue
JP2022526115A (ja) 2019-03-19 2022-05-23 エンゼン・バイオサイエンシズ・リミテッド グルカゴン様ペプチド－１（ｇｌｐ－１）受容体アゴニストとその類似体の製造プロセス
EP3753946A1 (en) * 2019-06-18 2020-12-23 Fresenius Kabi iPSUM S.r.l. Improved process for the preparation of high purity glucagon
EP3986919A1 (en) * 2019-06-18 2022-04-27 Fresenius Kabi iPSUM S.r.l. Process for the manufacture of glucagon
CN112279895B (zh) * 2019-07-27 2023-03-14 深圳市健元医药科技有限公司 一种化学合成酸性多肽的制备方法
WO2021123228A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Krka, D.D., Novo Mesto Pharmaceutical composition comprising glp-1 analogue
KR102221454B1 (ko) 2020-05-18 2021-03-02 대봉엘에스 주식회사 친환경 용매를 이용한 리라글루티드의 제조방법
US20230406900A1 (en) * 2022-06-01 2023-12-21 Scinopharm Taiwan, Ltd. Process for preparing glucagon-like peptide-1
EP4345104B1 (en) 2022-09-30 2024-08-28 Bachem Holding AG Method for preparing liraglutide

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101918027A (zh) * 2007-11-02 2010-12-15 森托科尔奥索生物科技公司 半合成GLP-1肽-Fc融合构造、方法及其用途
CN101918429A (zh) * 2007-11-21 2010-12-15 索尔维公司 肽的生产和纯化方法
WO2014199397A2 (en) * 2013-06-11 2014-12-18 Mylan Laboratories Ltd Process for the preparation of liraglutide
WO2016005960A1 (en) * 2014-07-11 2016-01-14 Dr. Reddy's Laboratories Limited Process for preparation of liraglutide

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1826216A1 (en) 1996-08-30 2007-08-29 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives
JP3788694B2 (ja) 1998-09-16 2006-06-21 株式会社ソニー・コンピュータエンタテインメント データ処理システム及び方法、並びにエンタテインメント装置
US6451974B1 (en) 1999-03-17 2002-09-17 Novo Nordisk A/S Method of acylating peptides and novel acylating agents
WO2005063793A1 (en) 2003-12-31 2005-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Process and systems for recovery of peptides
KR101297942B1 (ko) 2006-02-08 2013-08-19 론자 아게 글루카곤형 펩티드의 합성
CN101987868B (zh) 2009-07-30 2013-09-04 江苏豪森医药集团有限公司 Glp-1类似物的衍生物或其可药用盐和用途
WO2011089215A1 (en) 2010-01-22 2011-07-28 Ascendis Pharma As Dipeptide-based prodrug linkers for aromatic amine-containing drugs
SG184988A1 (en) * 2010-04-27 2012-11-29 Zealand Pharma As Peptide conjugates of glp-1 receptor agonists and gastrin and their use
EP2721048A1 (en) 2011-06-16 2014-04-23 Lonza Ltd A process for extraction of peptides and its application in liquid phase peptide synthesis
CN102286092B (zh) 2011-09-14 2014-01-01 深圳翰宇药业股份有限公司 利拉鲁肽的固相合成方法
EP2664374A1 (en) 2012-05-15 2013-11-20 F. Hoffmann-La Roche AG Lysin-glutamic acid dipeptide derivatives
CN103145828B (zh) 2012-12-12 2014-08-13 宁波盛泰生物医药科技有限公司 一种利拉鲁肽的全固相合成方法
CN104045705B (zh) 2013-03-12 2016-12-28 深圳翰宇药业股份有限公司 一种利拉鲁肽的合成方法
CN104045706B (zh) 2013-03-12 2017-09-05 深圳翰宇药业股份有限公司 一种利拉鲁肽的合成方法
CN103275209A (zh) 2013-05-27 2013-09-04 成都圣诺生物制药有限公司 制备利拉鲁肽的方法
CN103275208B (zh) 2013-05-27 2015-04-01 成都圣诺生物制药有限公司 利拉鲁肽的制备方法
GB201315335D0 (en) 2013-08-29 2013-10-09 Of Singapore Amino diacids containing peptide modifiers
CN103980358B (zh) 2014-01-03 2016-08-31 杭州阿诺生物医药科技股份有限公司 一种制备利拉鲁肽的方法
RS60187B1 (sr) * 2014-04-03 2020-06-30 Amgen Inc Metoda za pripremanje amg 416
GR20140100479A (el) * 2014-09-23 2016-05-05 Novetide, Ltd., Συνθεση λιραγλουτιδης
WO2016067271A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Auro Peptides Ltd A process for the preparation of liraglutide

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101918027A (zh) * 2007-11-02 2010-12-15 森托科尔奥索生物科技公司 半合成GLP-1肽-Fc融合构造、方法及其用途
CN101918429A (zh) * 2007-11-21 2010-12-15 索尔维公司 肽的生产和纯化方法
WO2014199397A2 (en) * 2013-06-11 2014-12-18 Mylan Laboratories Ltd Process for the preparation of liraglutide
WO2016005960A1 (en) * 2014-07-11 2016-01-14 Dr. Reddy's Laboratories Limited Process for preparation of liraglutide

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111670194A (zh) * 2018-01-30 2020-09-15 巴赫姆控股股份公司 制备胰高血糖素肽
CN111670194B (zh) * 2018-01-30 2024-01-26 巴赫姆控股股份公司 制备胰高血糖素肽
CN114249808A (zh) * 2021-12-27 2022-03-29 杭州诺泰澳赛诺医药技术开发有限公司 一种Cagrilintide的合成方法
CN118146350A (zh) * 2024-03-13 2024-06-07 北京泽勤生物医药有限公司 Glp-2肽类似物的制备方法及应用

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