CN111670194B - 制备胰高血糖素肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纯化胰高血糖素肽的方法，所述方法包含二维反相高效液相色谱方案，其中使用包含磷酸三乙铵(TEAP)缓冲液和乙腈的移动相进行第一步骤，且使用包含乙酸水溶液和乙腈的移动相进行第二步骤。
Description
本发明大体上涉及以工业或实验室规模制备肽的领域。本发明涉及有效合成和纯化胰高血糖素肽的方法。
人类胰高血糖素是GCG基因(HGNC：4191)的产物。所述肽具有3482.80g/mol的平均分子量，且由以单字母代码书写的以下29个氨基酸的序列组成：
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO:1)
内分泌胰高血糖素由胰腺的α细胞产生，且为中枢分解代谢激素。
胰高血糖素用作药物，尤其用作严重低血糖症的紧急治疗。出于治疗性目的，首先从牛和猪的胰腺提取和纯化胰高血糖素。如今，大多通过重组技术(并且最近也通过化学肽合成)以工业规模生产胰高血糖素。
化学肽合成已广泛地描述于文献中。化学肽合成的两种标准方法比较突出，即液相肽合成(liquid phase peptide synthesis,LPPS)和固相肽合成(solid phase peptidesynthesis,SPPS)。此外，可利用混合式方法，其中首先由以上技术中的一种合成片段且接着使用另一种技术接合在一起。LPPS(也称为液相肽合成)在同质反应介质中发生。连续偶合得到所需肽。在SPPS中，通过连续添加构成肽序列的经保护的氨基酸而组装成锚定于不溶性聚合物树脂的肽。最通常地，肽通过其C端氨基酸锚定，且合成从C端行进至N端。
由于生长链结合至不溶性支撑物，因此过量的试剂和可溶性副产物可通过简单过滤去除。但是，树脂结合副产物可在肽链伸长的每个循环期间积聚，尤其对于大型肽的合成而言。因此，最终产物的纯化可极具挑战性。
由于胰高血糖素肽倾向于聚集，导致胰高血糖素肽纯化的要求特别高。众所周知的是胰高血糖素倾向于在酸性pH下聚集(例如欧洲生物化学杂志(European J.Biochem.)11(1969)37-42)。本发明提供生产和纯化胰高血糖素肽的方法。
尽管胰高血糖素作为治疗剂的历史久远，但关于其制备和纯化的文献有限。
专利US 4,033,941公开了一种从天然来源富集胰高血糖素的方法。所述方法依赖于使用pH为约9至约11的进料溶液和移动相进行重复尺寸排阻色谱。教导了避免在酸性pH下进行纯化步骤，因为胰高血糖素倾向于在酸性溶液中形成凝胶和原纤维。
专利KR-B 0149955报道了胰高血糖素肿瘤坏死因子融合蛋白在大肠杆菌中的重组表达。融合蛋白被裂解，且通过HPLC使用C18固定相纯化胰高血糖素。未给出纯化的细节。
Yoshida和Terakoka(盐野义研究实验室年度报告(Annual Report of ShionogiResearch Laboratories)第45期,1-18,1998)教导了用人类干扰素γ纯化呈融合蛋白形式的重组胰高血糖素。通过溶解和裂解融合蛋白而从包涵体取出胰高血糖素。公开了各种纯化方案。据报道使用C18逆相HPLC，接着进行离子交换DEAE-HPLC的两步法得到的产率并不令人满意。改进的方案涉及S-琼脂糖色谱步骤，接着使用Sephadex G-15柱进行去盐并使用Sephacryl-S100柱进行尺寸排阻色谱。对于大规模生产最优选的是依赖于差示等电沉淀的纯化方案。
Ishizaki等人(应用微生物学与生物技术(Appl Microbiol Biotechnol)(1992)36:483-486)描述大量重组胰高血糖素的纯化。以重组方式表达的胰高血糖素融合蛋白从包涵体分离，用特定蛋白酶裂解，且通过采用含32-42％的线性梯度的乙腈的0.1三氟乙酸溶液的C18反相HPLC来纯化裂解产物。含有胰高血糖素肽的洗脱份的纯度为约90％，且随后通过使用含0-0.1M的线性梯度的NaCl的10mM TRIS-HCl，pH 8.5，20％乙腈的离子交换HPLC进行纯化。未公开最终产物的纯度。
Mollerup等人(文摘集(Book of Abstracts),第211届ACS全国会议(211th ACSNational Meeting),New Orleans,LA,1996年3月24-28日)教导了生产重组胰高血糖素的另一种方法。胰高血糖素在酿酒酵母(S.Cerevisiae)中表达且在一系列色谱步骤中纯化。
以上方法已对从包涵体溶解且蛋白酶裂解之后的以重组方式表达的胰高血糖素的纯化进行了最优化。应注意，此类样品的复杂度低于由化学肽合成(尤其是SPPS)而产生的样品。
专利申请CN-A 103333239公开了胰高血糖素的Fmoc SPPS，其中在高温下进行偶合。任选地，使用假脯氨酸二肽。
专利申请CN-A 103694338描述通过SPPS获得的粗胰高血糖素制剂的纯化(参见实例1-3)。粗肽被溶解于30％乙酸和5％乙腈水溶液中，过滤、稀释并通过三步程序来纯化。首先，使用十八烷基硅烷键结二氧化硅作为固定相且使用包含硫酸和过氯酸水溶液的移动相中的乙腈梯度来进行反相色谱。第二步骤包含在用氨调节pH之后进行盐析。接着再将沉淀物溶解于过氯酸水溶液中。在第三步骤中，进行阴离子交换。将步骤二的溶解沉淀物负载于C18固定相上，用含乙腈和乙酸铵的水溶液的移动相洗涤，且用含盐酸的水溶液洗脱。
据称所述方法得到良好产率和高于99.0％的纯度。但是，未公开因此制备的胰高血糖素的杂质概况。此外，过氯酸有危险的腐蚀性，易于形成可能爆炸的混合物，且受到广泛监管。出于工艺和产品安全性起见，因此需要避免使用过氯酸。
仍需要使得能够工业生产高纯度胰高血糖素的改进方法。确切地说，需要经济上可行的胰高血糖素纯化方法，其允许去除相关物质，如des-Thr5-、des-Ser2和Glu24-胰高血糖素，同时避免肽聚集。
出人意料地，已发现制备高纯度胰高血糖素的简单方法。已发现采用两个连续色谱步骤是有利的，其使用烃键合的二氧化硅作为固定相，且在第一步骤中使用包含磷酸三乙铵和乙腈的第一移动相，接着是在第二步骤中使用包含乙酸水溶液和乙腈的第二移动相。出人意料地，发现两个纯化步骤的纯化模式互补。在进行的实验中，可实现所收集洗脱份的可再现高产率和高于99.0％和甚至99.3％的高纯度，且所获得产物的胶凝被良好控制。
一般来说，在整个本发明中使用若干缩写和定义：
埃(0.1nm)
ACN 乙腈
AcOH 乙酸
Boc 叔丁氧羰基
DBU 二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯
DEPBT 3-(二乙氧基-磷酰氧基)-3H-苯并[d][1,2,3]三嗪-4-酮
DIC 二异丙基碳化二亚胺
DIPEA 二异丙基乙胺
Dmb 2,4-二甲氧基苯甲基
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DTE 1,4-二硫赤藓醇
DTT 1,4-二硫苏糖醇
EDT 1,2-乙二硫醇
Fmoc 9-芴基甲氧羰基
GLP-1 胰高血糖素样肽1
GLP 胰高血糖素样肽
HOBt 羟基苯并三唑
HPLC 高效液相色谱
如本文所用的术语HPLC包括UHPLC。
IPE 二异丙醚
LC-MS 液相色谱-质谱
LOD 检测极限
LPPS 液相肽合成
MTBE 甲基叔丁醚
MTT 4-甲基三苯甲基
NH4OAc 乙酸铵
NMP N-甲基吡咯烷酮
OMpe 3-甲基戊-3-基酯
OtBu 叔丁酯
ONSu N-羟基丁二酰亚胺(也称为(also known as/aka.)OSu)
Oxyma 氰基-羟亚胺基-乙酸乙酯(也称为)
Pbf 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
RP-HPLC 反相高效液相色谱
RT 室温
SEC 尺寸排阻色谱
SPPS 固相肽合成
tBu 叔丁基
TBTU (苯并三唑基)四甲基脲鎓四氟硼酸盐
TEAP 磷酸三乙铵
TES 三乙基硅烷
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TIPS＝TIS 三异丙基硅烷
Trt 三苯甲基
UHPLC 超高效液相色谱
除非另外规定，否则液体混合物由环境温度下的体积百分比和体积比定义。
除非另行说明，否则针对使用的水溶液各自的温度来指定pH值。按照定义，可仅针对水溶液(例如针对制备移动相中所用的水性组分)来指定pH值。
如在本申请的上下文中所用，术语“约”用于指示与任何给定数值偏差至多10％。
如在本申请的上下文中所用，如“组合物C”或“组合物GC”的表述可理解为与“组合物(C)”或“组合物(GC)”同义，即“C”和“GC”可理解为参考标记。
如本文所用的术语“保护基”可在最广泛意义上理解为如下基团：通过官能团的化学修饰引入至分子中以阻止所述基团在后续工艺步骤中反应，例如防止氨基酸侧链的副反应。氨基保护基的实例为Boc和Fmoc基团，羧酸保护基的实例为无反应酯，如甲酯、苯甲酯或叔丁酯。
氨基酸将通过其全称(例如：丙氨酸)、根据WIPO标准ST.25的3字母代码(例如Ala)或1字母代码(例如A)可互换地提及。只要未明确指定对映异构形式，则一般是指L-氨基酸。但是，应注意，本发明同样可使用D-氨基酸和其它立体异构体来实践。
如本文所用，术语“肽”和“多肽”可以可互换地理解。它是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。在α氨基酸的情况下，肽键可为一个氨基酸的α羧基与下一个氨基酸的α氨基之间的酰胺键。应注意，术语“肽”或“多肽”包括分支和环状肽、含非天然氨基酸的肽、同位素标记的肽形式和肽衍生物。分支肽可通过例如通过氨基酸侧链连接两个肽链(直接或通过分子连接子连接)而产生。环状肽可例如由分子内二硫键形成，或由末端或氨基酸侧链处的官能团之间的分子内缩合反应而产生。
肽衍生物包括例如在末端或氨基酸侧链处具有酰化、乙酰化、酰胺化和/或另外修饰的官能团的肽。
除非另外规定，否则本文中指示的肽序列起始于N端(左侧)且结束于C端(右侧)。表1说明不同符号，其为等同的且将在整个本文件中可互换地使用。
表1：肽的符号
本文中通过以阿拉伯数字(任选地以上标)指示位置编号来指代肽序列内的特定氨基酸。作为实例，在肽Gly-Leu-Ala-Phe-Ala(SEQ ID NO:6)(也称为GLAFA)的位置3的氨基酸Ala(也称为A)将称为Ala3或Ala3或A3或A3。这些符号可互换使用。
以下符号将用于氨基酸衍生物：α氨基处的取代基(Nα)指示为在氨基酸符号左侧且通过连字符分离，α羧基处的取代基指示为在氨基酸符号右侧且通过连字符分离，侧链处的取代基以紧挨在氨基酸符号右侧的括号指示。
His的侧链处的取代基通常位于咪唑环的1位中的氮原子处。取代基的位置通常未明确指定。因此，例如Fmoc-His(Trt)-OH尤其涵盖Fmoc-His(1-Trt)-OH。对于未修饰的α-氨基酸，α氨基处的取代基(Nα)为质子(H-)，且α羧基处的取代基为羟基(-OH)。类似符号用于经取代的氨基酸，其为肽的一部分。
如本文所用的术语“类似物”用于肽，其序列衍生自第一肽序列通过置换至多三个氨基酸部分，和/或通过缺失所述第一肽序列的至多三个氨基酸部分，和/或通过添加至多三个氨基酸部分而得。
如本文所用的术语“衍生物(derivative/derivatives)”是指可从第一化合物通过化学反应而获得的化合物。因此，衍生物与第一化合物的不同之处可在于存在或不存在取代基。例如，用于SPPS的氨基酸衍生物与衍生其的氨基酸的不同之处通常至少为存在氨基保护基。肽衍生物尤其包括酰化、酰胺化、聚乙二醇化和其他经标记形式的肽。
如本文所用的术语“胰高血糖素样肽”或GLP是指衍生自GCG基因(HGNC：4191)的同源肽、促胰岛素分泌肽和其类似物以及前述中的任一种的衍生物。
术语“胰高血糖素样肽1类似物”和“GLP-1类似物”在本文中可互换使用。如本文所用，其涉及能够结合至GLP-1受体的肽。GLP-1(7-37)和促胰岛素分泌肽4(1-39)的衍生物和类似物，如艾塞那肽(Exenatide)、利司那肽(Lixisenatide)、司美鲁肽(Semaglutide)和利拉鲁肽(Liraglutide)是优选的GLP-1类似物。
如本文所用，表述“胰高血糖素”和“胰高血糖素肽”可互换使用，以指SEQ ID NO:1(His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr)的肽，或其衍生物或类似物。
在特别优选的实施例中，胰高血糖素肽(将根据本发明的方法制备)是SEQ ID NO:1的肽。
或者，本发明的胰高血糖素肽也可以是通过添加、插入、缺失和/或取代至多三个氨基酸而不同于SEQ ID NO:1的肽。这意味着基于所讨论的肽与SEQ ID NO:1的肽的序列比对，至多三个氨基酸位置可视为与SEQ ID NO:1不同，无论其归因于氨基酸残基的添加、插入、缺失和/或取代。典型的序列比对工具，如BLAST或ClustalW已为所属领域的技术人员所熟知。包括至多三个氨基酸的添加、插入、缺失和/或取代的此类胰高血糖素肽优选包含于粗胰高血糖素肽混合物中，所述粗胰高血糖素肽也包含所关注的胰高血糖素肽(尤其是SEQID NO:1的胰高血糖素肽)。但是，应理解，包括至多三个氨基酸的添加、插入、缺失和/或取代的此类胰高血糖素肽也可替代地为所关注的胰高血糖素肽。因此，包括至多三个氨基酸的添加、插入、缺失和/或取代的此类胰高血糖素肽也可任选地为待制备(和纯化)的胰高血糖素肽。然后，滞留时间将不同。所属领域的技术人员将相应地调试条件。
如本文所用，序列同源性可指所属领域中已知的序列同源性的任何定义。确切地说，序列同源性可理解为通过本申请的申请日的版本的美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST(基本局部比对搜索工具)测定的序列同源性。
优选地，胰高血糖素肽(呈可溶形式，即，一旦从其树脂裂解)(基本上)不含任何保护基且氨基酸侧链处不具有修饰。因此，胰高血糖素肽优选为完全不受保护的肽，其优选不经进一步修饰。
或者，胰高血糖素肽的N端可经修饰(例如酰化，尤其是乙酰化)。或者或另外，C端可经修饰(例如酰胺化)。
或者或另外，一个或多个氨基酸部分侧链可与荧光团结合。任选地，胰高血糖素肽也可经放射性标记(例如用3H、32P、35S、14C、99mTc或镧系元素(例如64Gd))，或可经可通过核磁共振(NMR)检测的自旋标记，如一种或多种重同位素，例如13C。
胰高血糖素肽通常由天然L-氨基酸组成。但是，替代地，所述肽还可包含一种或多种非天然氨基酸或甚至可以由其组成，如D-氨基酸、β氨基酸、甲基化氨基酸(例如N-甲基化或α-甲基化氨基酸)。
所属领域的技术人员将注意到，在极性环境中，尤其在水性环境中，胰高血糖素肽的肽链可形成盐，例如借助于结合质子或其它阳离子和/或阴离子、在末端和/或一些氨基酸侧链处释放质子或其它阳离子和/或阴离子。
所属领域的技术人员应了解，如本文所用的胰高血糖素肽可任选地带有所属领域中已知的任何相对离子，如阴离子或阳离子，如氯离子、乙酸根离子、碳酸根离子、碳酸氢根离子、钠离子、钾离子、镁离子、裂解溶液的任何离子(例如TFA离子、溴离子、过氯酸根离子、铵离子)和/或其余保护基的阳离子或阴离子。另外，肽可任选地与痕量的一种或多种清除剂(如三异丙基硅烷(TIS)、二硫苏糖醇(DTT)、苯甲醚、硫代苯甲醚或1,2-乙二硫醇)共价或非共价结合。
本发明涉及有效合成和纯化胰高血糖素肽的方法。
确切地说，本发明的一个方面涉及一种制备胰高血糖素肽的方法，包括：
a)提供包含胰高血糖素肽和至少一种非所需组分的液体组合物C；
b)对所述组合物C进行第一反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，其中烃键合的二氧化硅被用作固定相，使用包含磷酸三乙铵和乙腈的水性移动相，且通过逐渐增加移动相内的乙腈浓度，同时收集含有胰高血糖素肽的洗脱份来实现洗脱；和
c)对步骤b)中获得的收集的含有胰高血糖素肽的洗脱份进行第二反相HPLC纯化，其中烃键合的二氧化硅被用作固定相，使用包含乙酸和乙腈的移动相，且通过逐渐增加所述移动相内的乙腈浓度，同时收集含有纯化的胰高血糖素肽的洗脱份来实现洗脱。
在一个实施例中，本发明方法进一步包含以下步骤：
d)进行阴离子交换，优选地，其中乙酸根被氯离子置换，和/或其中通过冻干、超滤、透析、固相萃取、反相色谱或通过离子交换色谱来实现所述阴离子交换。
术语“提供包含胰高血糖素和至少一种非所需组分的液体组合物C”可在最广泛意义上理解为获得含有胰高血糖素和至少一种非所需组分的任何液体组合物。胰高血糖素可以所属领域中已知的任何方法提供。示例性地，其可获自生物技术方法、固相肽合成(SPPS)或液相肽合成(LPPS)或其组合。液体组合物C可基本上包含粗胰高血糖素肽或可包含部分纯化的胰高血糖素肽。
在本发明的一个优选实施例中，步骤a)包含以下步骤：
(a-i)提供与固相结合的胰高血糖素肽，其中至少Glu、Asp和Lys的侧链带有保护基；和
(a-ii)将所述胰高血糖素肽从所述固相裂解，并且优选地，从所述胰高血糖素肽去除所述保护基。
出于本申请的目的，术语“原始”和“粗”可互换使用，以指示如胰高血糖素的肽制剂，其基本上为合成和分离工艺的直接产物，且尚未经过特定纯化步骤，如色谱。化学合成通常产生具有约40至70％纯度的粗胰高血糖素制剂。然而，应理解，液体组合物C的特征可在于低于100％的任何程度的纯度(例如高于30、40、50、60、70、80、90或95％的纯度)，且本发明的实施例也可有利地适用于部分纯化的胰高血糖素组合物。
术语“步骤b中获得的收集的含有胰高血糖素的洗脱份”可理解为涉及步骤b中获得的合适纯度的含有胰高血糖素的洗脱份的集合体。可基于对所获得洗脱份中的胰高血糖素含量和纯度的分析来选择待收集(即合并)以进一步加工的洗脱份。
术语“非所需组分”在本文中在最广泛意义上用于任何被视为杂质的化合物。特别优选的是在合成和储存胰高血糖素期间所形成类型的杂质，且可示例性选自由氨基酸、肽和其衍生物组成的群组。尤其涵盖选自由以下组成的群组的杂质：氨基酸、肽和其衍生物，其可由例如以下的方法产生：肽合成期间的过早链终止、在肽合成期间省略或意外添加至少一个氨基酸、保护基的不完全去除、在氨基酸偶合或Fmoc去除保护基步骤期间发生的副反应、分子间或分子内缩合反应、在肽从固体支撑物裂解期间的副反应、外消旋作用、任何其它类型的异构体形成、去酰胺、(部分)水解和聚集体形成。所属领域中众所周知的是胰高血糖素易于形成聚集体，且低pH值通常促进此过程，即低pH值表示不稳定条件(参见例如Wang等人,分子药剂学(Mol.Pharm)12:411-419)。由例如上文概述的方法产生的肽污染有时称为“相关物质”。
在特别优选的实施例中，非所需组分为肽杂质。如本文所用，表述“肽杂质”是指非所需肽化合物且尤其包含HMW(高分子量)杂质、待纯化的肽的衍生物、待纯化的肽的截短变异体、待纯化的肽的缺失变异体和此类截短和缺失变异体的衍生物。通过合适的分析型色谱方法(包括RP-UHPLC)常规地测定肽杂质。
在一个实施例中，非所需组分包含待纯化的胰高血糖素肽的共价或非共价聚集体。此类非所需组分为生理上无活性的或具有未知的生理效应，且具有高于5000Da的分子量。其在本文中称为“高分子量(HMW)杂质”。在另一实施例中，非所需组分为待纯化的肽的衍生物，例如氨基酸外消旋作用、氨基酸侧链的氧化或水解的结果和/或在肽合成期间形成的副产物。在另一实施例中，非所需组分为待纯化的肽的截短变异体或此类截短变异体的衍生物。如本文所用，表述“截短变异体”是指给定肽的连续片段，即无间隙的子序列，其在肽序列的N端和/或C端处缺少一个或多个氨基酸。在另一优选实施例中，非所需组分包含待纯化的肽的缺失变异体或此类缺失变异体的衍生物。如本文所用，表述“缺失变异体”用于指待纯化的肽的变异体，两者的不同之处在于所述变异体的一级序列缺少单个或多个氨基酸。“被省略的”氨基酸可位于原始肽序列内的任何位置。因此，截短变异体可视为特定类型的缺失变异体。
在最优选实施例中，根据本发明的方法允许去除肽杂质以得到基本上纯的胰高血糖素制剂。已展示本发明的方法得到含有不超过0.5％的任何个别肽杂质的基本上纯的胰高血糖素肽，如关于通过分析型色谱，优选地伴以205至230nm的波长下的UV检测观察到的相对峰面积所评估。
在一些实施例中，非所需组分包含至少一种Met(O)27-胰高血糖素，和/或缺少Ser2或Thr5的胰高血糖素缺失变异体和/或Glu24-胰高血糖素。
在一个实施例中，非所需组分包含des-Thr5-胰高血糖素(SEQ ID NO:2)、des-Ser2-胰高血糖素(SEQ ID NO:3)和/或Glu24胰高血糖素(SEQ ID NO:4)。
本文所述的本发明的实施例可有利地用于来自合成之后获得的粗制剂的胰高血糖素纯化。尽管本发明绝不限于胰高血糖素合成的特定方法，但优选实施例涉及化学合成的胰高血糖素肽的纯化。可例如通过使用适当经保护的氨基酸和二肽衍生物合成Fmoc固相肽来合成胰高血糖素肽。
优选地，组合物C包含胰高血糖素肽或其盐，所述组合物通过包含以下步骤(a-i)-(a-ⅲ)的方法制备：
(a-i)胰高血糖素肽的固相合成；
(a-ii)从固相裂解胰高血糖素肽，并且优选地，从胰高血糖素肽去除保护基；和
(a-iii)将胰高血糖素肽与裂解溶液的组分分离。
因此，在一个实施例中，根据本发明的方法的步骤a)可包含进行以上步骤(a-i)、(a-ii)和(a-ⅲ)。
术语“固相”、“树脂”、“[树脂]”和“支撑物”在本文中可互换使用。其可在最广泛意义上理解为可用于SPPS的任何结构，例如珠粒样结构。
SPPS通常在凝胶相而不是固相支撑物上进行。合适的树脂可基于聚苯乙烯、聚苯乙烯-PEG复合物、PEG、PEGA、交联乙氧基化物丙烯酸酯(CLEAR)、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、或任何其它具有所需物理和化学特性的支撑物。常规使用的支撑物中包含基于具有1％二乙烯基苯的珠粒状聚苯乙烯的树脂，其通常具有200-400目或100-200目的尺寸分布。基于聚苯乙烯的2-氯三苯甲基氯(CTC)树脂、二苯基重氮甲烷(PDDM)树脂、4-(2′,4′-二甲氧基苯基-Fmoc-胺甲基)-苯氧基甲基-聚苯乙烯(Rink)树脂、2-甲氧基-4-烷氧基苯甲醇(Sasrin)树脂和尤其4-烷氧基苯甲基醇(Wang)树脂特别适用于本发明的方法，且可商购自如Sigma-Aldrich、Bachem和EMD Millipore的供应商。但是，可使用任何其它适合于SPPS的树脂。
作为通过C端羧基进行固定化的一个替代方案，肽也可通过(优选末端)氨基酸的侧链结合至树脂。作为另一替代方案，肽也可通过N端结合至树脂且从N端至C端合成(逆向肽合成)。
所属领域的技术人员将了解多种SPPS方法。一般来说，任何类型的SPPS可用于本发明的情形中。各种类型的设备可用于SPPS。已有手动、半自动和自动合成器可用于分批或连续流SPPS。对于任何给定设备，可恰当地选择树脂以满足所述设备强加的机械要求。
所属领域的技术人员深知如下事实：树脂负载可影响SPPS，尤其是工业SPPS的有效性。当处理长、易聚集的肽序列，如胰高血糖素肽时，这可能特别有影响：一方面，工艺效率随着树脂负载的增加而增加。另一方面，必需通过降低树脂负载来减少树脂上的沉淀。因此，可通过对任何给定SPPS方案进行常规试验来满足微妙平衡并且建立最佳树脂负载。可以例如通过使用市售的不同取代度的树脂来改变树脂负载，或通过相对于第一氨基酸以摩尔不足的方式偶合第二氨基酸，随后乙酰化(即封闭)未反应的第一氨基酸来改变树脂负载。同样，第一氨基酸可以摩尔不足的方式与偶合树脂，接着进行封闭步骤。
在本发明的优选实施例中，使用的树脂负载为约0.2mmol/g至约0.9mmol/g范围内，例如约0.2mmol/g、0.3mmol/g、0.4mmol/g、0.5mol/g、0.6mmol/g、0.7mmol/g、0.8mmol/g或0.9mmol/g。在此背景下，可注意到在SPPS期间，树脂在使用的各种溶剂中的溶胀和收缩可引起树脂体积相当大的波动，且因此引起树脂上肽浓度相当大的波动。
在本发明的一个优选实施例中，进行Fmoc SPPS。所属领域的技术人员熟知基于Fmoc合成方案的SPPS方法。氨基酸添加至树脂的每个循环通常从Fmoc裂解(即从树脂结合肽链去除Fmoc保护基)开始。这通过将肽树脂与碱一起在能够溶胀树脂且溶解试剂的溶剂中孵育来实现。用于此目的的受欢迎的碱包含例如仲胺，如哌啶和4-甲基哌啶。合适的溶剂包含例如DMF、NMP、二甲亚砜、二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、甲苯和其混合物。反应通常在环境温度下，例如在15-30℃的温度范围内进行。通常，碱不稳定和酸稳定Fmoc通过用含5-50％(优选20％)(v/v)哌啶的DMF短暂处理(2至15分钟，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分钟)来分裂。必要时，此处理被重复和/或略微延长(7至30分钟，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30分钟)。对于具有难以裂解的伸长段的大型肽的合成，Fmoc裂解的持续时间以及重复次数可逐渐增加。例如，裂解时间可为15-75分钟，例如15、30、45、60或75分钟，且裂解可重复至多8次，例如2、3、4、5、6、7或8次。此外，温度可增加，例如增加至30℃至45℃的温度。在那些条件下，大多数情况下可实现完全去封闭。另外或替代地，用于Fmoc裂解的试剂可变化。
已发现试剂的即便略微的变化也可显著加速裂解，例如在45℃下使用：含1至5％DBU的DMF、含20％哌啶和1-5％DBU的DMF、含20％哌啶的NMP或含20％哌啶的DMF。此外，可通过加热/微波处理来实现裂解反应加速。
另一方面，肽的性质可使得使用更温和处理更为有利。特定的温和裂解条件为例如DMF中20％哌啶加上0.1M HOBt、DMF中50％吗啉、NMP中50％DMSO中25％N-甲基吡咯啶加上2％六亚甲基亚胺加上2％HOBt。熟练的技术人员将在每个合成步骤处常规地最优化和控制Fmoc裂解条件。
在优选实施例中，使用选自由以下组成的群组的混合物将Fmoc保护基从结合至固相的生长肽链裂解：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中5-50％(v/v)哌啶或4-甲基哌啶、N-甲基吡咯烷酮(NMP)中5-50％(v/v)哌啶或4-甲基哌啶、DMF中1-5％(v/v)二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)和DMF中50％(v/v)吗啉。
通常在Fmoc去除之后小心地洗掉裂解试剂。DMF和任选地IPA用于洗涤直至中性pH。为了确保完全去除碱，可能有利的是在后续洗涤循环中添加少量HOBt。
氨基酸衍生物至肽树脂的偶合(即伸长步骤)是SPPS循环的中心步骤之一。
Fmoc-SPPS的合适的经保护氨基酸衍生物，如Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Mtt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OMpe)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Mtt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-His(1-Trt)-OH、Boc-His(Trt)-OH(有时称为Boc-His(1-Trt)-OH)、Boc-His(Boc)-OH(有时称为Boc-His(1-Boc)-OH)、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Val-OH可商购自各种来源。应注意，本发明的方法同样涵盖在胰高血糖素样肽的合成中使用非天然氨基酸衍生物，如Aib(α-氨基异丁酸)、Nle(正亮氨酸)或Orn(鸟氨酸)。
在优选实施例中，使用氨基酸衍生物Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OMpe)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Val-OH。在另一优选实施例中，使用氨基酸衍生物Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OMpe)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Val-OH。
偶合反应的速率和产率可受各种参数影响，如溶剂的选择、位阻和活化羧酸的反应性。溶剂不仅可决定前体肽树脂的溶胀且可因此影响反应位点的可及性；其还可直接影响偶合反应的动力学。合适的溶剂能够溶胀树脂且溶解试剂，且包含例如DMF、NMP、二甲亚砜、二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、甲苯和其混合物。位阻由氨基酸侧链和其保护基的性质决定。活化羧酸的反应性决定酰化速率，以及副反应(如外消旋作用)的程度。取决于所选的合成策略，可使用单一氨基酸衍生物来代替肽衍生物，如假脯氨酸二肽衍生物、二肽或三肽衍生物或分支链二肽衍生物。
在本发明的某些实施例中，在作为溶剂的DMF中进行氨基酸活化，即在DMF中溶解且混合氨基酸或肽衍生物、偶合试剂和任选地添加剂或碱。DIC与作为添加剂的或HOBt组合可用作偶合试剂，。在替代方案中，TBTU或DEPBT可用于在碱(优选地DIPEA)存在下将Fmoc氨基酸转化为活性OBt或ODhbt酯。
如本文所用，术语“偶合试剂混合物”涉及包含偶合试剂和任选地添加剂或碱的组合物。用于本发明的优选的偶合试剂混合物包含TBTU加上DIPEA、DIC加上Oxyma、DEPBT加上DIPEA或DIC加上HOBt。
在添加至树脂之前所选氨基酸衍生物与以上试剂一起孵育1-30分钟(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、......、28、29或30分钟)进行预活化。偶合反应可进行1至74小时，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、......、71、72、73或74小时。相对于树脂结合胺基的量，可以0.4-3摩尔比(例如以0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0的摩尔比)使用氨基酸衍生物。为了实现完全偶合，可能有利的是在一定时间之后，例如在10、20、30、40或60分钟之后将第二部分的活化剂或碱添加至反应混合物。预活化和偶合步骤通常在室温下进行，但也可在其它温度下进行。可能有利的是进行一个或多个再偶合步骤，以便实现氨基的接近完全的转化。
在本发明的其它实施例中，在由NMP、二甲亚砜、二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、甲苯和其混合物，任选地以及DMF组成的溶剂中进行氨基酸活化。
在本发明的一个实施例中，步骤a)包含使用经适当保护的氨基酸衍生物或二肽衍生物进行胰高血糖素肽的基于Fmoc的固相肽合成，其中所述经保护的氨基酸衍生物或二肽衍生物借助于一种或多种偶合试剂混合物来活化，所述混合物包含独立地选自由以下组成的群组的用于每一步骤的试剂：
(A)(苯并三唑基)四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)加上二异丙基乙胺(DIPEA)；
(B)二异丙基碳化二亚胺(DIC)加上氰基-羟亚胺基-乙酸乙酯(Oxyma)；
(C)3-(二乙氧基-磷酰氧基)-3H-苯并[d][1,2,3]三嗪-4-酮(DEPBT)加上DIPEA；和
(D)DIC加上羟基苯并三唑(HOBt)。
在本发明的一个实施例中，步骤a)包含使用经适当保护的氨基酸衍生物或二肽衍生物进行胰高血糖素肽的基于Fmoc的固相肽合成，其中所述经保护的氨基酸衍生物或二肽衍生物借助于一种或多种用于每一步骤的偶合试剂混合物来活化，所述混合物独立地选自由以下组成的群组：
(A)(苯并三唑基)四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)加上二异丙基乙胺(DIPEA)；
(B)二异丙基碳化二亚胺(DIC)加上氰基-羟亚胺基-乙酸乙酯(Oxyma)；
(C)3-(二乙氧基-磷酰氧基)-3H-苯并[d][1,2,3]三嗪-4-酮(DEPBT)加上DIPEA；和
(D)DIC加上羟基苯并三唑(HOBt)。
优选进行His衍生物的偶合以避免外消旋作用。可通过三种不同方法来减少此副反应：1)封闭咪唑环的N3，2)通过吸电子基团，如Boc或Tos来封闭咪唑环的N1，和3)当使用Fmoc-His(1-Trt)-OH时，使偶合条件最优化。因此推荐使用Fmoc-His(1-Trt)-OH、Boc-His(1-Trt)-OH或Boc-His(1-Boc)-OH，最优选Boc-His(1-Boc)-OH，与DIC/Oxyma或DEPBT/DIPEA组合以引入N端His。
因此，在优选实施例中，使用选自由以下组成的群组的氨基酸衍生物将N端组氨酸部分引入至与固相结合的胰高血糖素肽中：Boc-His(Boc)-OH、Boc-His(Trt)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH，和包含DEPBT加上DIPEA或DIC加上Oxyma的偶合试剂混合物。
已出人意料地发现，使用至少两种Fmoc假脯氨酸二肽有利地抑制肽聚集且因此抑制由低效合成所致的副产物形成。优选地，在与选自由以下组成的群组的两个位置对应或相同的两个位置处引入两个假脯氨酸二肽：SEQ ID No:1的肽的(Gly4-Thr5和Phe6-Thr7)、(Gly4-Thr5和Thr7-Ser8)、(Gly4-Thr5和Tyr10-Ser11)、(Gly4-Thr5和Asp15-Ser16)、(Phe6-Thr7和Tyr10-Ser11)、(Phe6-Thr7和Asp15-Ser16)、(Thr7-Ser8和Tyr10-Ser11)、(Thr7-Ser8和Asp15-Ser16)和(Tyr10-Ser11和Asp15-Ser16)。
因此，在本发明的一个方面中，步骤a)，即提供包含胰高血糖素肽和至少一种非所需组分的液体组合物C的步骤包含：
(a-i)提供与固相结合的胰高血糖素肽，其中至少Glu、Asp和Lys的侧链带有保护基，且其中与固相结合的胰高血糖素肽包含两个假脯氨酸二肽，优选地，其中两个假脯氨酸二肽在与选自由以下组成的群组的位置对应或相同的位置处引入：SEQ ID No:1的肽的Gly4-Thr5和Phe6-Thr7、Gly4-Thr5和Thr7-Ser8、Gly4-Thr5和Tyr10-Ser11、Gly4-Thr5和Asp15-Ser16、Phe6-Thr7和Tyr10-Ser11、Phe6-Thr7和Asp15-Ser16、Thr7-Ser8和Tyr10-Ser11、Thr7-Ser8和Asp15-Ser16或Tyr10-Ser11和Asp15-Ser16；和
(a-ii)将所述胰高血糖素肽从所述固相裂解，并且优选地，从所述胰高血糖素肽去除所述保护基。
如在本发明的上下文中所使用，假脯氨酸二肽可被视为保护基团。优选地，因此也在本发明方法的步骤(a-ii)中去除此类保护基团。
如本文所用的术语“假脯氨酸二肽”是指临时脯氨酸模拟物，其易从例如含有Ser和Thr的二肽通过噁唑烷形成获得，和从含有Cys的二肽通过噻唑啶形成获得。所属领域的技术人员熟知此类假脯氨酸二肽。这些二肽是缓和SPPS期间的树脂上聚集的一个可能的选项。2,2-二甲基噁唑烷被TFA平稳裂解且因此尤其适合于Fmoc-SPPS。其在本文中缩写为(Psi(Me,Me)pro)。
在特别优选的实施例中，使用至少两种假脯氨酸二肽衍生物，其选自由以下组成的群组：Fmoc-Gly-Thr(Psi(Me,Me)pro)-OH、Fmoc-Phe-Thr(Psi(Me,Me)pro)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OH。因此，本文公开的方法的步骤a)可包含进行Fmoc SPPS。
如本文所用的术语“与选自由SEQ ID NO:1的肽的(Gly4-Thr5和Phe6-Thr7)、[......]和(Tyr10-Ser11和Asp15-Ser16)组成的群组的两个位置对应的位置”是指胰高血糖素肽的一级序列内的两个位置，基于所述胰高血糖素肽与SEQ ID NO:1的肽的序列比对，所述位置被视为与SEQ ID NO:1的肽的两个所选位置同源。通常，在此类比对中呈现于彼此顶部上的位置被视为同源，即彼此对应。所属领域的技术人员熟知典型序列比对工具，如BLAST或ClustalW。
因此，引入假脯氨酸部分得到固相结合的胰高血糖素肽，其特征在于降低的相关杂质的百分比。在一个方面中，本申请因此提供固相结合的胰高血糖素肽，其包含至少两个假脯氨酸二肽，且其中N端His部分的侧链经Boc或Trt保护基，尤其经1-Boc或1-Trt保护基保护。在另一方面中，本申请因此提供固相结合的胰高血糖素肽，其包含至少两个假脯氨酸二肽和N端Boc-His(Boc)部分。在另一方面中，本申请因此提供固相结合的胰高血糖素肽，其包含至少两个假脯氨酸二肽和N端Boc-His(1-Trt)部分。在优选实施例中，所述固相结合的胰高血糖素肽进一步表征为Glu24-胰高血糖素、des-Ser2-胰高血糖素和des-Thr5-胰高血糖素的含量低。在另一优选实施例中，所述固相结合的胰高血糖素肽的特征在于des-Ser2-胰高血糖素的相对含量低于0.70％，或des-Thr5-胰高血糖素的相对含量低于0.50％，或Glu24-胰高血糖素的相对含量低于0.70％。
在另一优选实施例中，所述固相结合的胰高血糖素肽的特征在于des-Ser2-胰高血糖素的相对含量低于0.70％，且des-Thr5-胰高血糖素的相对含量低于0.50％，且Glu24-胰高血糖素的相对含量低于0.70％。在另一优选实施例中，所述固相结合的胰高血糖素肽的特征在于任何单一缺失变异体的相对含量低于2.0％，所述变异体与所关注的胰高血糖素肽相差单个氨基酸。在另一优选实施例中，所述固相结合的胰高血糖素肽的特征在于以下中的每一种的相对含量低于2.0％：des-His1-胰高血糖素、des-Ser2-胰高血糖素、des-Gln3-胰高血糖素、des-Gly4-胰高血糖素、des-Thr5-胰高血糖素、des-Phe6-胰高血糖素、des-Thr7-胰高血糖素、des-Ser8-胰高血糖素、des-Asp9-胰高血糖素、des-Tyr10-胰高血糖素、des-Ser11-胰高血糖素、des-Lys12-胰高血糖素、des-Tyr13-胰高血糖素、des-Leu14-胰高血糖素、des-Asp15-胰高血糖素、des-Ser16-胰高血糖素、des-Arg17-胰高血糖素、des-Arg18-胰高血糖素、des-Ala19-胰高血糖素和des-Gln20-胰高血糖素。在另一优选实施例中，所述固相结合的胰高血糖素肽的特征在于以下中的每一种的相对含量低于1.0％：des-His1-胰高血糖素、des-Ser2-胰高血糖素、des-Gln3-胰高血糖素、des-Gly4-胰高血糖素、des-Thr5-胰高血糖素、des-Phe6-胰高血糖素、des-Thr7-胰高血糖素、des-Ser8-胰高血糖素、des-Asp9-胰高血糖素、des-Tyr10-胰高血糖素、des-Ser11-胰高血糖素、des-Lys12-胰高血糖素、des-Tyr13-胰高血糖素、des-Leu14-胰高血糖素、des-Asp15-胰高血糖素、des-Ser16-胰高血糖素、des-Arg17-胰高血糖素、des-Arg18-胰高血糖素、des-Ala19-胰高血糖素和des-Gln20-胰高血糖素。在另一优选实施例中，所述固相结合的胰高血糖素肽的特征在于以下中的至少2种的相对含量低于1.0％：des-His1-胰高血糖素、des-Ser2-胰高血糖素、des-Gln3-胰高血糖素、des-Gly4-胰高血糖素、des-Thr5-胰高血糖素、des-Phe6-胰高血糖素、des-Thr7-胰高血糖素、des-Ser8-胰高血糖素、des-Asp9-胰高血糖素、des-Tyr10-胰高血糖素、des-Ser11-胰高血糖素、des-Lys12-胰高血糖素、des-Tyr13-胰高血糖素、des-Leu14-胰高血糖素、des-Asp15-胰高血糖素、des-Ser16-胰高血糖素、des-Arg17-胰高血糖素、des-Arg18-胰高血糖素、des-Ala19-胰高血糖素和des-Gln20-胰高血糖素。
在另一优选实施例中，所述固相结合的胰高血糖素肽的特征在于以下中的至少4种的相对含量低于2.0％：des-His1-胰高血糖素、des-Ser2-胰高血糖素、des-Gln3-胰高血糖素、des-Gly4-胰高血糖素、des-Thr5-胰高血糖素、des-Phe6-胰高血糖素、des-Thr7-胰高血糖素、des-Ser8-胰高血糖素、des-Asp9-胰高血糖素、des-Tyr10-胰高血糖素、des-Ser11-胰高血糖素、des-Lys12-胰高血糖素、des-Tyr13-胰高血糖素、des-Leu14-胰高血糖素、des-Asp15-胰高血糖素、des-Ser16-胰高血糖素、des-Arg17-胰高血糖素、des-Arg18-胰高血糖素、des-Ala19-胰高血糖素和des-Gln20-胰高血糖素。
固相结合的胰高血糖素中所述杂质的相对含量优选地通过测量对应粗肽的分析型UHPLC中的相对峰面积(杂质的峰面积除以所有观察到的峰的总峰面积)来确定。
当进行SPPS时，可进行封端以阻止未反应的胺在以下合成步骤中形成肽键，即避免形成待合成的序列的缺失变异体。这可通过肽树脂与大量过量的高反应性非受阻酸衍生物(例如乙酸酐或苯甲酰氯)和碱(例如吡啶、三甲基吡啶或DIPEA)任选地在例如或HOBt的添加剂存在下的短暂处理来实现。尤其，可使用以下封端组合物：含1-15当量的N-乙酰咪唑的DCM；含乙酸酐/吡啶(1:1)的2,5至25体积的DMF[即(1:1:5)v/v/v至(1:1:50)v/v/v]；含乙酸酐/DIPEA(1:1)的1至10体积的DMF[即(1:12)v/v/v至(1:1:20)v/v/v]；含1-15当量乙酸酐和三乙胺的DCM；NMP/DCM(1:1)中的DIPEA和1-5当量N-(2-氯苯甲氧羰基)-丁二酰亚胺；和NMP中的1-15当量(Boc)2O及1-10当量DIPEA。封端通常将产生截短序列，其一般与最终肽显著不同且可容易地分离。优选地，封端在系统性双重偶合之后进行。在封端步骤结束时，通常滤出试剂且用例如DMF和任选地IPA小心地洗涤树脂，随后继续进行下一去除保护基步骤。
任选地，可使用过程控制监测SPPS反应的进展，以确保有效的Fmoc去除、偶合和/或封端步骤。一方面Fmoc测定和另一方面游离胺测定可产生互补信息。综上所述，这些方法可对SPPS方法的每一步骤进行有效监测。在本发明的上下文中可用的一些常用监测方法例示于下文。
任选地，可通过例如光谱测定或应用HPLC分析容易对从树脂结合肽裂解的Fmoc进行定量。
可收集从树脂排出的Fmoc裂解试剂且测定其中的Fmoc浓度，例如通过测量301nm处的吸光度。基于裂解的Fmoc的量，可计算树脂负载，即树脂上Fmoc肽的原始量。另外，为了评估Fmoc去除的完整性，可以对少量可能存在Fmoc脱保护的树脂样品进行额外的苛刻Fmoc裂解方案，以确定通过此处理去除的残余Fmoc的量。在替代方案中，可对树脂样品的肽进行小规模测试裂解以评估Fmoc去除的完整性。所得肽可通过分析型RP-HPLC，使用标准梯度进行分析，其中Fmoc保护的和游离肽序列通常可以很好地分离。另外或替代地，可通过质谱法(例如通过LC-MS或MALDI-MS)来分析肽样品。薄层色谱同样可以实现微量Fmoc肽的检测。
可通过各种分析，包括比色Kaiser(即，茚三酮)、TNBS、四氯醌和溴酚蓝测试来评估树脂上游离胺的量。这是所属领域的技术人员熟知的。
当完成通过SPPS合成胰高血糖素肽时，所述胰高血糖素肽仍结合至树脂。因此，其为固相结合且至少部分侧链保护的。为了获得胰高血糖素肽，需要从树脂裂解。因此，本发明的一个方面是提供一种产生胰高血糖素肽的方法，包括从固相裂解上述固相结合的胰高血糖素肽，和优选地，从胰高血糖素肽去除保护基。这例如由从固相裂解胰高血糖素肽的步骤(ii)或步骤(a-ii)表示。
最优选地，在此步骤期间，还伴随地将大部分或所有侧链保护基从胰高血糖素肽上裂解下来，即，将肽去保护。
因此，优选地，通过同与包含TFA和一种或多种清除剂的裂解组合物一起孵育，来伴随地进行树脂去保护和裂解，例如在步骤(a-ii)中。
在本申请的上下文中，术语“清除剂”用于指化合物，其添加至反应混合物以抑制SPPS之后肽从树脂裂解期间和/或去除保护基期间的副反应。裂解组合物中所用的典型清除剂为“硫醇清除剂”(例如EDT、DTE、DTT和β-巯基乙醇)和“硅烷清除剂”(例如TES和TIPS)。其他常用清除剂包含乙基甲基硫醚、硫代苯甲醚、苯甲醚、间甲酚或对甲酚、2-Me-吲哚、Ac-Trp-OMe或色胺。所属领域的技术人员深知多种可用的清除剂。
可使用任何适合于从树脂裂解肽并且优选地，从胰高血糖素肽去除保护基的组合物。优选地，借助于包含大于50％(v/v)TFA，更优选地大于75％(v/v)TFA，尤其至少80％(v/v)或甚至至少90％(v/v)TFA的组合物来进行裂解和去除保护基。组合物还可包含一种或多种清除剂。组合物还可包含水。优选地，组合物包含TFA、水和一种或多种清除剂。特别有利的清除剂是硫醇清除剂，如EDT和/或硅烷清除剂，如TIPS。裂解组合物可包含至少80％TFA，优选至少90％TFA，和EDT。裂解组合物可包含至少80％TFA，优选至少90％TFA；水；和EDT。裂解组合物可包含至少80％TFA，优选至少90％TFA；水；和TIPS。裂解组合物可包含至少80％TFA，优选至少90％TFA；水；TIPS和EDT。用于本发明的上下文的示例性组合物可选自由以下组成的群组：TFA/水/TIPS(90:5:5)v/v/v、TFA/水/TIPS(95:2:3)v/v/v、TFA/水/酚(90:5:5)v/v/v、TFA/间甲酚(95:5)v/v、TFA/间甲酚(92:8)v/v、TFA/水/EDT(90:5:5)v/v/v、TFA/TIPS/DTE/水(88/2/5/5)v/v/w/w；TFA/水/DTE(90/4/6)v/v/w；TFA/水/EDT/TIPS(90:5:2.5:2.5)v/v/v/v、TFA/水/EDT/TIPS(90:4:3:3)v/v/v/v、TFA/水/EDT(92:4:4)v/v/v、TFA/水/EDT(85:5:10)v/v/v、TFA/硫代苯甲醚/苯甲醚/EDT(90:5:3:2)v/v/v/v和TFA/硫代苯甲醚/水/酚/EDT(82.5:5:5:5:2.5)v/v/v/v/v。
所属领域的技术人员将取决于所讨论的胰高血糖素肽的氨基酸组成常规地最优化用于本发明的上下文的组合物，且将设想任选地使用一种或多种清除剂，例如尤其DTE、EDT、TES、TIPS、2-巯基乙醇、二甲硫、乙基甲基硫醚、间甲酚或对甲酚、2-Me-吲哚、Ac-Trp-OMe、酚或色胺。
从树脂裂解胰高血糖素肽并且优选地，从胰高血糖素肽去除保护基的步骤，例如步骤(a-ii)可在任何适合于此目的的条件下进行。优选地通过将洗涤的树脂与裂解组合物一起孵育约1至4小时和/或在0至32℃的温度下孵育来进行裂解(优选在惰性气体下)。示例性地，可通过将洗涤的树脂与裂解组合物一起在约0至4℃、4至10℃、10至15℃、15至25℃或25至35℃的温度下孵育至多1、至多1.5、至多2、至多2.5、至多3、至多3.5或至多4小时或长于4小时来进行裂解(优选在惰性气体下)。示例性地，可通过将洗涤的树脂与裂解组合物一起在约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32℃的温度下孵育至多1、至多1.5、至多2、至多2.5、至多3、至多3.5或至多4小时或长于4小时来进行裂解(优选在惰性气体下)。
可推荐将一种或多种选自由以下组成的群组的试剂添加至包含树脂的悬浮液：碘化盐(例如碘化铵)、二甲硫、1,4-二硫苏糖醇(DTT)、三甲基溴硅烷和抗坏血酸。此可例如在开始孵育肽树脂和裂解组合物时，或在将肽树脂与裂解组合物一起孵育一定时间之后进行。不希望受任何理论束缚，相信此可避免和/或恢复甲硫氨酸侧链的S-二甲硫基团的氧化。
树脂接着通常通过过滤从溶液S分离，所述溶液通过从树脂裂解肽并且优选地，从胰高血糖素肽去除保护基(例如在步骤(a-ii)中)获得。所述溶液S包含胰高血糖素肽和用于裂解的试剂(例如TFA、水、清除剂、还原剂和残余的从肽裂解的保护基)。
任选地，在过滤后冲洗树脂，例如用浓TFA或浓TFA加上清除剂。任选地，额外冲洗溶液还可形成溶液S的一部分，即，其可与在从树脂裂解肽之后直接获得的溶液合并。
所属领域的技术人员将注意到，从溶液S分离胰高血糖素肽，从而获得粗肽(通常以TFA盐形式存在)是所期望的。这优选地通过借助于反溶剂(anti-solvent)对胰高血糖素肽的沉淀来进行。优选的反溶剂包含二乙醚、异丙醚(IPE)、甲基叔丁醚(MTBE)和IPE与乙腈的混合物。在优选实施例中，使用IPE。优选地，溶液S与反溶剂的体积比在1:5至1:15范围内，例如1:5、1:8、1:10、1:12或1:15。换句话说：一体积的溶液S可与对应于例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15体积的量的反溶剂混合。
从溶液S沉淀胰高血糖素肽的步骤(步骤(a-iii))可在适合于此目的的任何温度和任何时间间隔下进行。示例性地，在约-5℃至10℃，优选约0℃至10℃范围内的温度下进行胰高血糖素肽沉淀(步骤(a-ⅲ))。合适的温度范围可为约-5至0℃、-2.5至2.5℃、0至5℃、2.5至7.5℃或5至10℃。示例性地，以约30至360分钟，例如约30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330或360分钟的时间间隔进行沉淀。通过从树脂裂解肽并且优选地，从胰高血糖素肽去除保护基(例如在步骤(a-ii)中)获得的溶液S和反溶剂可通过所属领域中已知的任何方法且按任何次序混合。例如，可将反溶剂添加至溶液S。这可通过将其一次性添加或通过将其逐滴和/或借助于缓慢流动添加来实现。或者，可将溶液S添加至反溶剂。这可通过将其一次性添加或通过将其逐滴和/或借助于缓慢流动添加来实现。所属领域的技术人员深知如何进行此类沉淀步骤。
包含胰高血糖素肽的沉淀物接着以反溶剂中的悬浮液形式形成，其中所述悬浮液进一步包含裂解组合物的试剂(例如TFA、水和清除剂)，以及残余的从肽裂解的保护基。
包含胰高血糖素肽(或基本上由其组成)的沉淀物可接着通过所属领域中已知用于此类目的的任何方法从粗悬浮液分离。
过滤可为所属领域中已知的任何过滤方法，如死端式过滤或交叉流过滤。如本文所用，术语“交叉流过滤(cross-flow filtration/crossflow filtration)”、“切向流过滤”或“切向过滤”可互换地理解。过滤器可为所属领域中在过滤的情况下已知的任何材料，如塑料(例如尼龙、聚苯乙烯)、金属、合金、玻璃、陶瓷、塞璐芬、纤维素或复合材料。过滤器可为疏水性或亲水性的。过滤器表面可为中性或带正电或带负电的。
离心可在最广泛意义上理解为其中悬浮沉淀物的沉降被加速的任何方法。示例性地，可使用至多100x g、至少100x g、至少1,000x g、至少2,500x g、至少5,000x g、至少7,500x g、至少10,000x g、至少15,000x g、至少25,000x g或至少50,000x g的离心力。借助于离心，形成包含粗胰高血糖素肽(或(基本上)由其组成)的滤饼。任选地，滤饼可再悬浮于反溶剂中，所述反溶剂可与上文提及的反溶剂相同或不同。任选地，离心和将沉淀颗粒再悬浮于反溶剂中可重复若干次，其可进一步增加粗胰高血糖素肽的纯度。
粗肽沉淀物可包含的呈干燥状态的胰高血糖素肽为至少30％(w/w)，优选至少40％(w/w)，更优选至少50％(w/w)，更优选至少60％(w/w)，更优选至少70％(w/w)，甚至更优选至少80％(w/w)，甚至更优选至少90％(w/w)，尤其至少95％(w/w)或甚至100％(w/w)。通常，粗肽沉淀物包含的呈干燥状态的胰高血糖素肽为40-70％(w/w)。
优选地，通过本发明方法获得的粗肽可通过制备方法的一个或多个步骤进一步纯化，以获得组合物C。
一般来说，任何肽从树脂的TFA裂解会产生副产物，如氨基甲酸酯和TFA酯。因此可有利的是对粗肽进行脱羧反应和/或酯水解。此可例如通过使粗肽经受高pH处理，如至少7.2、至少8.0、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10、至少10.5、至少11或至少11.5的pH来实现。或者或另外，可在轻度酸性条件，如6.0至7.0的pH、5.5至6.5的pH、5.0至6.0的pH、4.0至5.0的pH、3.0至4.0的pH或2.0至3.0的pH下进行脱羧反应。任选地，所述处理可伴有热处理，例如在25-70℃(例如在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃)的温度下。处理时间可在2至120分钟之间变化，例如2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120分钟。
取决于特定情况，可能有利的是使TFA裂解的产物经受涉及以下步骤中的一个或多个的方案：在pH 2.0-3.0、55℃下孵育大约30分钟；在pH 7-7,5、40℃下孵育大约40分钟；在45℃、2.0-4.0的pH下孵育大约60分钟；在50℃、2.0-4.0的pH下孵育大约90分钟；在30℃下在5.4-6.6的pH下孵育大约70分钟；在45℃、6.6-7.4的pH下孵育大约90分钟；在碱性pH(例如至少10.2的pH)、45-25℃下孵育10分钟；在pH 10.4、35℃下孵育10分钟；在30-40℃、pH 11.0下孵育2分钟；在25℃、pH 11.8下孵育5分钟。可能有利的是将粗肽沉淀物溶解于稀酸(例如盐酸、乙酸、三氟乙酸)或稀碱(例如NaOH水溶液、氨、磷酸盐、TEAP)中，以用于脱羧和/或TFA酯裂解。熟练的技术人员将常规地选择合适的条件。应注意，此段的教导同样适用于制备胰高血糖素样肽和其类似物和衍生物，例如制备GLP-1类似物和GLP-2类似物。
因此，在本发明的一个实施例中，步骤a)，即提供包含胰高血糖素肽和至少一种非所需组分的液体组合物C的步骤包含对胰高血糖素肽进行脱羧和/或酯水解反应。
在本发明的另一实施例中，步骤a)包含对包含胰高血糖素肽的样品进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，其中烃键合的二氧化硅被用作固定相，使用包含三氟乙酸和乙腈的水性移动相，且通过逐渐增加所述移动相内的乙腈浓度，同时收集含有所述胰高血糖素肽的洗脱份来实现洗脱。
此类预纯化步骤可优选地涉及使用包含0.1％(v/v)TFA水溶液的缓冲液A和包含60％(v/v)乙腈/0.1％TFA水溶液的缓冲液B进行RP-HPLC纯化。在一个实施例中，通过12％(v/v)至60％(v/v)的乙腈浓度的梯度实现洗脱。在一个实施例中，使用C18固定相。在一个实施例中，移动相包含0.5至0.2％TFA且通过12％(v/v)乙腈至60％(v/v)乙腈的线性梯度实现洗脱。
可任选地用于步骤a)的另外的纯化和分离方法包含例如一种或多种电泳方法(例如凝胶电泳或毛细管(CE)电泳)、一种或多种额外的基于沉淀的方法(例如盐溶或盐析)、一种或多种透析方法(透析)和/或一种或多种色谱方法(例如凝胶渗透色谱(GPC)、尺寸排阻色谱、离子交换色谱(IEC)、高效液相色谱(HPLC)、反相HPLC(RP-HPLC)、快速蛋白质液相色谱(FPLC)、急骤色谱(flash)、快速回流液相色谱(RRLC)、快速分离液相色谱(RSLC)、超快速液相色谱(UFLC)、反相UFLC(RP-UFLC)、超高效液相色谱(UPLC)或反相UPLC(RP-UPLC)、逆流色谱、连续色谱)。
在本发明的一个实施例中，步骤a)包含以下步骤：
a-i)通过使用经适当保护的氨基酸衍生物或二肽衍生物进行胰高血糖素肽的基于Fmoc的固相肽合成来提供与固相结合的胰高血糖素肽，其中至少Glu、Asp和Lys的侧链带有保护基，
其中所述经保护的氨基酸衍生物或二肽衍生物借助于一种或多种偶合试剂混合物来活化，所述混合物包含独立地选自由以下组成的群组的用于每一步骤的试剂：
(A)(苯并三唑基)四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)加上二异丙基乙胺(DIPEA)；
(B)二异丙基碳化二亚胺(DIC)加上氰基-羟亚胺基-乙酸乙酯(Oxyma)；
(C)3-(二乙氧基-磷酰氧基)-3H-苯并[d][1,2,3]三嗪-4-酮(DEPBT)加上DIPEA；和
(D)DIC加上羟基苯并三唑(HOBt)，
另外其中使用选自由以下组成的群组的氨基酸衍生物将N端组氨酸部分引入至与固相结合的胰高血糖素肽中：Boc-His(Boc)-OH、Boc-His(Trt)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH，
任选地，另外其中使用至少两种假脯氨酸二肽；
a-ii)通过与包含至少50％TFA和一种或多种清除剂的裂解组合物一起孵育而从固相裂解胰高血糖素肽(并且优选地，从胰高血糖素肽去除保护基)，和/或其中在裂解之后将一种或多种选自由碘化盐、二甲硫、1,4-二硫苏糖醇(DTT)、三甲基溴硅烷和抗坏血酸组成的群组的试剂添加至肽溶液；和
a-iii)通过沉淀将肽从所得溶液分离。
在本发明的另一实施例中，步骤a)包含所述步骤a-i)至a-iii)且另外包含步骤a-iv)对步骤a-iii)中获得的肽沉淀物进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，其中烃键合的二氧化硅被用作固定相，使用包含三氟乙酸和乙腈的水性移动相，且通过逐渐增加所述移动相内的乙腈浓度，同时收集含有所述胰高血糖素肽的洗脱份来实现洗脱。在一个实施例中，步骤a-iv)涉及使用包含0.1％(v/v)TFA水溶液的缓冲液A和包含60％乙腈/0.1％(v/v)TFA水溶液的缓冲液B进行RP-HPLC纯化。
在一个实施例中，通过12％(v/v)至60％(v/v)的乙腈浓度的梯度实现洗脱。在一个实施例中，C18固定相用于步骤a-iv)。在一些实施例中，以上流动相与C8固定相一起使用，所述固定相例如具有孔径和15-30微米粒度。在一些替代实施例中，以上流动相与C18固定相一起使用，所述固定相例如具有/>孔径和15-30微米粒度。
更优选地，通过以上方法获得组合物C中所含的全部量的胰高血糖素。
在本发明的一个优选实施例中，纯化方法的步骤a)涉及获得干燥的粗胰高血糖素肽沉淀物和溶解所述干燥的沉淀物，以获得包含胰高血糖素和至少一种非所需组分的液体组合物C。例如，液体组合物C可包含pH介于约2与约4之间的稀乙酸中的粗胰高血糖素肽。
在本发明的上下文中，术语“纯化”用于指示已经受特定纯化步骤(例如制备型色谱)的肽组合物。此类组合物可为高度纯化或部分纯化的。
除非另外指明，否则肽纯度在本文中指示为“HPLC纯度”，即在分析型反相高效液相色谱(RP-HPLC)伴以205至230nm的波长下(即肽键的吸收最大值下)的UV检测中观察到的相对峰面积。换句话说，值测定为给定峰面积除以通过分析型RP-HPLC伴以205至230nm的波长下的UV检测获得的色谱图中所有观察到的峰的面积总和的面积％。此测量是所属领域中的惯例，且熟练的技术人员将常规地设计产物特异性RP-HPLC方案且根据美国药典(theUnited States Pharmacopeia)中陈述的确立指南进行定量。通过LC-MS测定峰纯度来常规地评估RP-HPLC方案对于检测肽污染的适合性。
在假设所有肽组分由于结构类似而具有相同吸收的情况下，RP-HPLC纯度可用作表示为质量百分比[％(w/w)]的纯度的代表。
同样，肽(无论其为所需或非所需组分)的相对含量可测定为分析型反相高效液相色谱(RP-HPLC)伴以205至230nm的波长下(即肽键的吸收最大值下)的UV检测中观察到的相对峰面积。换句话说，使用以上陈述的合适方案将值测定为给定峰面积除以通过分析型RP-HPLC伴以205至230nm的波长下的UV检测获得的色谱图中所有观察到的峰的面积总和的面积％。
熟练的技术人员深知如何制备用于色谱纯化的样品。例如，可通过在水相中温和搅拌，同时按需要调节温度和pH来溶解干燥的粗胰高血糖素制剂。作为另外的实例，样品可保持于惰性气体下或经受超声处理，可经受脱羧反应，可经受TFA酯水解，和/或可通过过滤或离心与非液体组分分离。视具体情况，可尤其通过干燥、冻干、部分蒸发溶剂或超滤，和/或通过在样品负载缓冲液中溶解或稀释肽制剂来调节样品浓度。
反相高效液相色谱(RP-HPLC)是熟知的且广泛用于肽样品的肽纯化和分析，即用于制备以及分析目的。所述技术是基于样品的各种组分与疏水性固定相之间的疏水性缔合，所述缔合被移动相中所含的试剂(例如溶剂)破坏。通常通过逐渐增加移动相内的试剂(例如溶剂的浓度)来实现样品组分的差异性洗脱。
从实用的角度来看，通常通过改变构成移动相的第一和第二洗脱缓冲液的比例来获得此梯度：
第一缓冲液(按照惯例被称为缓冲液A)在合适的水性缓冲液中包含低量的溶剂，而第二缓冲液(按照惯例被称为缓冲液B)在所述水性缓冲液中包含高量的溶剂。因此，通过增加移动相中缓冲液B的比例，更疏水性的组分可从固定相洗脱。
如本文所用，术语HPLC还包括超高效液相色谱(UHPLC，也指定为UPLC)。在一个优选实施例中，HPLC为UHPLC。更优选地，UHPLC为反相UHPLC且因此也可指定为RP-UHPLC。因此，在特别优选的实施例中，HPLC为RP-UHPLC。
在本申请的上下文中，表述“烃键合的二氧化硅”是指由在表面处具有化学键结烃部分的多孔二氧化硅粒子或二氧化硅凝胶制成的固定色谱相。应理解，化学键的类型以及键结烃部分的化学性质可变化。例如，用于本申请的固定相可由具有4至18个，优选8至18个碳原子的化学键结烃部分的多孔二氧化硅粒子制成。此类烃部分优选为烷基直链。优选类型的烃键合的二氧化硅具有含四个(C4)、六个(C6)、八个(C8)、十个(C10)、十二个(C12)、十四个(C14)、十六个(C16)或十八个(C18)碳原子的烃部分。特别优选类型的烃键合的二氧化硅具有含四个(C4)、八个(C8)、十二个(C12)或十八个(C18)碳原子的未分支烷基链，即丁基、辛基、十二烷基或十八烷基部分。C8键结二氧化硅，尤其是正辛基键结二氧化硅，和/或C18键结二氧化硅，尤其是正十八烷基键结二氧化硅是用于根据本发明的方法的步骤b)、c)和任选地d)的甚至更优选的固定相。步骤b)和c)中所用的固定相可在每个步骤中相同或不同。优选地，固定相为相同的。尤其优选地，C18键结二氧化硅被用作步骤b)和/或步骤c)中的固定相，和/或其中相同固定相用于步骤b)和c)中，优选地其中相同柱用于步骤b)和c)。在步骤b)和c)中使用单一固定相(即，单一柱)的此选择可以获得特别有成本效益的方法。
在本申请的上下文中，表述“C8键结二氧化硅”用于指示由在表面处具有化学键结C8烃部分，优选地直链辛基，即正辛基部分的多孔二氧化硅粒子或二氧化硅凝胶制成的固定色谱相。另外，表述“C12键结二氧化硅”用于指示由在表面处具有化学键结C12烃部分，优选地直链十二烷基，即正十二烷基部分的多孔二氧化硅粒子或二氧化硅凝胶制成的固定色谱相。同样，术语“C18键结二氧化硅”或“ODS”在本文中可互换使用，以指代由在表面处具有化学键结C18烃部分，优选地直链十八烷基，即正十八烷基部分的多孔二氧化硅粒子或二氧化硅凝胶制成的固定色谱相。
大范围的烃键合的二氧化硅材料为可商购的。可用于本发明的固定相的实例为DaisogelTM C18 ODS、Daiso ODS-Bio、Daiso-ODS-A-HG C18、DaisogelTM C8-Bio、YMC ODS-A、YMC Triart C8-L、Luna C8、Luna C18、KromasilTM C18和KromasilTM C8，其分别由Daiso、YMC、Phenomenex和AkzoNobel生产。
二氧化硅粒子的直径可为2至200微米，优选地2.5至20微米，优选地5-15微米，且最优选地10微米，且孔径可为50至优选地80至/>优选地100至/>最优选地(约)/>
良好的做法是在操作之间用合适的溶液冲洗固定相以去除任何杂质，所述杂质仍结合至柱且可损害后续肽批次的质量。已描述用于此目的的各种此类清洗方案，包括用NaOH或甲酸的水溶液冲洗(参见例如WO 2004/089504)。本发明人发现在柱负载之前用包含乙腈的TFA水溶液冲洗固定相因其减少聚集而对纯化的胰高血糖素肽的质量有益。特别合适的是在水溶液中包含TFA和大于20％(例如30、40、50、60、70、80或90％(v/v))乙腈的混合物。TFA的浓度优选地选自0.05％(v/v)至1.0％(v/v)的范围。例如，混合物可包含大于50％ACN和0.05-1.0％TFA。
实例混合物包括但不限于以下：含1％(v/v)TFA和25％ACN的水；含1％(v/v)TFA和30％ACN的水；含1％(v/v)TFA和50％ACN的水；含1％(v/v)TFA和70％ACN的水；含1％(v/v)TFA和90％ACN的水；含0.5％(v/v)TFA和25％ACN的水；含0.5％(v/v)TFA和40％ACN的水；含0.5％(v/v)TFA和50％ACN的水；含0.5％(v/v)TFA和60％ACN的水；含0.5％(v/v)TFA和70％ACN的水；含0.5％(v/v)TFA和80％ACN的水；含0.1％(v/v)TFA和25％ACN的水；含0.1％(v/v)TFA和40％ACN的水；含0.1％(v/v)TFA和50％ACN的水；含0.1％(v/v)TFA和60％ACN的水；含0.1％(v/v)TFA和70％ACN的水；含0.1％(v/v)TFA和80％ACN的水；含0.1％(v/v)TFA和90％ACN的水；含0.05％(v/v)TFA和40％ACN的水；含0.05％(v/v)TFA和50％ACN的水；含0.05％(v/v)TFA和60％ACN的水；含0.05％(v/v)TFA和70％ACN的水；含0.05％(v/v)TFA和80％ACN的水。根据本发明的方法因此可包含在负载液体组合物C之前和/或在负载步骤b)中获得的收集的含有胰高血糖素肽的洗脱份之前，用包含TFA和乙腈的水溶液冲洗固定相的步骤。
本发明的此方面类似地适用于其它肽的纯化，尤其是胰高血糖素样肽，例如GLP-1和GLP-2的类似物和衍生物(如艾塞那肽(exenatide)、利司那肽(lixisenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)、司美鲁肽(semaglutide)、替度鲁肽(teduglutide)等)的纯化。
因此，本发明的一个方面涉及一种使色谱固定相再生的方法，其中所述色谱固定相在含有肽的样品的色谱纯化之后与包含三氟乙酸、水和乙腈的再生溶液接触。
本发明的另一方面涉及使用色谱固定相纯化的肽，所述色谱固定相使用以上方法再生。
本发明的RP-HPLC步骤中所用的流动相一般包含水性组分和乙腈(作为溶剂)。可存在额外组分，如有机改性剂。通常通过逐渐增加作为溶剂的乙腈的浓度来实现洗脱。
不希望受任何理论束缚，相信溶剂与组合物C的组分竞争结合至固定相。为了维持线速度，熟练的技术人员将取决于柱直径且考虑所用的设备和固定相的规格来调节移动相的流动速率。
根据本发明的方法的步骤b)，即RP-HPLC纯化方案的第一维度在6.5至7.5的pH值下(例如在6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH值下，优选在6.7至7.2的pH值下)进行。通过在移动相的水性组分中使用浓磷酸和三甲胺(TEA)，在将进行步骤的温度下调节pH值。优选地，磷酸根阴离子以5至50mM(例如约10、20、30、40或50mM)的浓度存在。应理解，可使用任何类型的乙腈梯度从固定相洗脱胰高血糖素且梯度谱图对在此步骤中可实现的纯化有影响。
在优选实施例中，通过将乙腈含量从2至4％(v/v)乙腈增加至30至50％(v/v)乙腈的梯度来实现步骤b)中的洗脱。
在另一优选实施例中，通过将乙腈含量从2至4％(v/v)乙腈增加至40至60％(v/v)乙腈的梯度来实现步骤c)中的洗脱。
在更优选实施例中，通过将乙腈含量从2至4％(v/v)乙腈增加至30至50％(v/v)乙腈的梯度来实现步骤b)中的洗脱，且通过将乙腈含量从2至4％(v/v)乙腈增加至40至60％(v/v)乙腈的梯度来实现步骤c)中的洗脱。
因此其将被熟练的技术人员根据特定实验设定常规地调适。在优选实施例中，在步骤b)中，通过3-20％乙腈至40-50％(v/v)乙腈的梯度(例如3至40％(v/v)乙腈，或7至43％(v/v)乙腈的梯度)洗脱胰高血糖素肽。特别优选的是线性梯度。
在更优选实施例中，通过3至40％(v/v)乙腈的梯度实现步骤b)中的洗脱，和/或其中通过3至50％(v/v)乙腈的梯度实现步骤c)中的洗脱。
根据本发明的方法的步骤c)，即RP-HPLC纯化方案的第二维度优选在选自约2至4、优选约2至3范围内(例如约2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0)的pH值下进行。可通过移动相的水性组分中存在的0.5-5％(v/v)乙酸来测定pH值。在优选实施例中，步骤c)中所用的移动相内的乙酸浓度选自0.5-5％(v/v)、优选1-3％(v/v)的范围内，例如1、2或3％(v/v)。应理解，任何类型的乙腈梯度可用于从固定相洗脱胰高血糖素且梯度谱图影响在此步骤中可实现的纯化。在优选实施例中，步骤c)中的梯度为3至50％(v/v)乙腈。特别优选的是3至50％(v/v)乙腈的线性梯度。例如，可使用3至50％乙腈的线性梯度。
在优选实施例中，方法进一步包含进行阴离子交换的步骤d)，优选地，其中乙酸根被氯离子置换和/或其中通过冻干、超滤、透析、固相萃取、反相色谱或通过离子交换色谱来实现阴离子交换。
步骤d)可通过肽制备领域中已知的任何阴离子交换方法来进行。
熟练的技术人员将常规地组合本发明的方法与合适的读出技术。例如，可通过根据洗脱液于205-230nm或280nm的波长处的紫外线吸光度，和/或通过根据洗脱液的导电性来监测色谱步骤。此外，色谱可与根据质谱、尺寸排阻UHPLC、离子交换UHLPC和/或反相UHPLC、酶联免疫吸附分析(ELISA)和/或基于细胞的功能分析的在线或离线分析组合。
为了避免肽质量劣化，熟练的技术人员将小心地且常规地最优化纯化步骤，包括样品储存的条件。为此目的，洗脱份可尤其被收集、沉淀、喷雾干燥、冷冻干燥、冷冻、冷藏、稀释、浓缩和/或与稳定缓冲液、碱、酸或其它物质混合。良好的做法是在稳定条件下处理敏感材料。例如，可能有利的是在低温下(例如在4℃至15℃的范围内)操作，以补偿其他不稳定的条件。作为另一实例，可能有利的是冷冻干燥胰高血糖素制剂，优选在选自6.6-7.9、优选7.0至7.8、且最优选7.0至7.5范围内的pH下。作为另一实例，可能有利的是在收集期间已稀释洗脱份和/或在洗脱期间调节温度和缓冲条件。已知胰高血糖素在低温、低浓度和略酸性pH下更稳定。
在本发明的优选实施例中，所有或一部分的色谱纯化步骤b)和/或c)和/或步骤a-iv)(如果存在)在选自4-28℃(例如15-28℃、4-20℃或4-10℃)范围内的温度下进行。同样，全部或一部分的任何任选的另外的纯化步骤(例如盐交换步骤d))可在选自4-28℃、优选4-20℃且最优选4-10℃范围内的温度下进行。
在特别优选的实施例中，本发明方法包含：
a)提供包含胰高血糖素和至少一种非所需组分的液体组合物C，任选地溶解于选自2.0至4.0范围内的pH的乙酸水溶液中；
b)对组合物C在pH约7下进行第一反相HPLC纯化，其中烃键合的二氧化硅被用作固定相，包含浓度为5至50mM的乙腈和水性三乙铵磷酸盐缓冲液的混合物被用作移动相，且通过将移动相内的乙腈浓度从3％(v/v)乙腈逐渐增加至50％(v/v)乙腈，同时收集含有洗脱份的胰高血糖素肽来实现洗脱；和
c)对步骤b)中获得的收集的含有胰高血糖素肽的洗脱份进行第二反相HPLC纯化，其中烃键合的二氧化硅被用作固定相，使用包含浓度为0.005-0.05％(v/v)的乙酸和乙腈的移动相，且通过将移动相内的乙腈浓度从3％逐渐增加至50％，同时收集含有经纯化胰高血糖素肽的洗脱份来实现洗脱；
d)任选地，对在步骤c)中获得的胰高血糖素肽进行离子交换步骤，其中乙酸根被氯离子置换
其中步骤b)和c)和(如果存在)步骤d)在选自4-25℃范围内的温度下进行；
其中优选地，步骤b)和c)中所用的固定相为C8键结二氧化硅或C18键结二氧化硅。
如以下实例中所示，本发明的方法使得能够制备极纯的胰高血糖素肽，且可常规地实现高于99.0％的纯度。尽管如此，可检测到痕量的若干缺失产物。
确切地说，这些是痕量的由26至28个连续氨基酸组成的肽，其与胰高血糖素肽的分子结构的不同之处在于其在胰高血糖素肽主链的一级序列(例如SEQ ID NO:1)中缺少至多三个氨基酸。换句话说，SEQ ID NO:1的胰高血糖素肽的缺失变异体可定义为长度为26至28个氨基酸部分的肽，在SEQ ID NO:1的全长上计算，其与SEQ ID NO:1共用至少89％同源性。
所属领域的技术人员将立即理解此类胰高血糖素缺失变异体可任选地(但非必须)在N端和/或C端氨基酸部分处截短。另外或替代地，非末端氨基酸部分也可缺失。如上文所提及，序列同源性可理解为通过本申请的申请日的版本的美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST(基本局部比对搜索工具)测定的序列同源性。这意味着每个氨基酸部分与其在待比较的序列中的对应物比对，避开了两者之间的缺失氨基酸部分，且在SEQ ID NO:1的全长上计算百分比同源性。
在进行的实验中，未在最终肽产物中以高于0.5％的相对丰度检测到肽污染物，其以通过RP-UHPLC在220nm处测量的相对峰面积形式测定(参见示例性图3)。这也反映了本发明的一个方面和优选实施例。相对峰面积测定为给定峰面积除以通过分析型RP-HPLC伴以220nm处的UV检测获得的色谱图中所有观察到的峰的面积总和的面积％。这可以使用任何适合于检测肽污染物的产物特异性RP-HPLC方案来进行。根据通过LC-MS测定的主峰纯度常规地评估分析方法的适合性。为了展示给定分析方案的适合性，常规地进行加标实验(spike experiment)，其中将待检测的污染人工添加至样品。
所属领域的技术人员将立即理解，所有肽组分由于类似结构而具有相同或至少类似的反应因数，使得通过RP-HPLC在220nm处测量的相对峰面积与以相对于所有肽组分的求和质量的重量％(以％(w/w)指示)表示的给定肽的相对丰度充分相关。
因此，本发明的另一方面涉及包含获自根据本发明的任何实施例的方法的胰高血糖素肽的组合物GC，其特征在于所述组合物含有以分析型RP-HPLC伴以220nm处的UV检测中观察到的相对峰面积形式测定的纯度高于99.0％的胰高血糖素肽，且不含以分析型RP-HPLC伴以220nm处的UV检测中观察到的相对峰面积形式测定的大于0.5％的任何单一胰高血糖素衍生物、胰高血糖素截短变异体、胰高血糖素截短变异体的衍生物、胰高血糖素缺失变异体或胰高血糖素缺失变异体的衍生物。
优选地，组合物GC含有纯度高于99.1％、高于99.2％、高于99.3％、高于99.4％、高于99.5％、高于99.6％、高于99.7％、高于99.8％或高于99.9％的胰高血糖素，所述纯度以分析型RP-HPLC伴以220nm处的UV检测中观察到的相对峰面积形式测定。
根据优选实施例，组合物GC不含总浓度高于0.25％、0.20％、0.15％、0.1％、0.05％或0.01％的上述胰高血糖素缺失变异体，所述浓度以分析型RP-HPLC伴以220nm处的UV检测中观察到的相对峰面积形式测定。
本发明的另一方面涉及包含获自根据本发明的任何实施例的方法的胰高血糖素肽的组合物GC，其特征在于所述组合物含有以分析型RP-HPLC伴以220nm处的UV检测中观察到的相对峰面积形式测定的纯度高于99.0％的胰高血糖素肽，且不含以分析型RP-HPLC伴以220nm处的UV检测中观察到的相对峰面积形式测定的大于0.3％的任何单一胰高血糖素衍生物、胰高血糖素截短变异体、胰高血糖素截短变异体的衍生物、胰高血糖素缺失变异体或胰高血糖素缺失变异体的衍生物。
本发明的另一方面涉及包含获自根据本发明的任何实施例的方法的胰高血糖素肽的组合物GC，其特征在于所述组合物含有以分析型RP-HPLC伴以220nm处的UV检测中观察到的相对峰面积形式测定的纯度高于99.0％的胰高血糖素肽，且含有以分析型RP-HPLC伴以220nm处的UV检测中观察到的相对峰面积形式测定的可检测水平，但不大于0.5％的任何单一胰高血糖素衍生物、胰高血糖素截短变异体、胰高血糖素截短变异体的衍生物、胰高血糖素缺失变异体或胰高血糖素缺失变异体的衍生物。
因此，本发明的另一方面涉及包含获自根据本发明的任何实施例的方法的胰高血糖素肽的组合物GC，其特征在于参考肽组分的求和质量，所述组合物含有纯度高于99.0％的胰高血糖素肽，且参考所有肽组分的求和质量，不含大于0.5％(w/w)的任何单一胰高血糖素衍生物、胰高血糖素截短变异体、胰高血糖素截短变异体的衍生物、胰高血糖素缺失变异体或胰高血糖素缺失变异体的衍生物。
优选地，参考所有肽组分的求和质量，组合物GC含有纯度高于99.1％(w/w)、高于99.2％(w/w)、高于99.3％(w/w)、高于99.4％(w/w)、高于99.5％(w/w)、高于99.6％(w/w)、高于99.7％(w/w)、高于99.8％(w/w)或高于99.9％(w/w)的胰高血糖素。
根据优选实施例，参考所有肽组分的求和质量，组合物GC不含总浓度高于0.25％(w/w)、0.20％(w/w)、0.15％(w/w)、0.1％(w/w)、0.05％(w/w)或0.01％(w/w)的上述胰高血糖素缺失变异体。
本发明的另一方面涉及包含获自根据本发明的方法的胰高血糖素肽的组合物GC，其特征在于所述组合物含有纯度高于99.0％的胰高血糖素肽，且含有可检测水平，但不大于0.5％，优选不大于0.3％，尤其不大于0.2％，且任选地甚至不大于0.1％的Trp(O)25-胰高血糖素和/或Glu24-胰高血糖素、des-Ser2-胰高血糖素和/或des-Thr5-胰高血糖素。
本发明的另一方面涉及包含获自根据本发明的方法的胰高血糖素肽的组合物GC，其特征在于所述组合物含有纯度高于99.0％的胰高血糖素肽，且含有0.05-0.5％，优选0.05-0.3％，尤其0.05-0.2％，且任选地仅0.05-0.1％的Trp(O)25-胰高血糖素和/或Glu24-胰高血糖素、和/或des-Ser2-胰高血糖素、和/或des-Thr5-胰高血糖素。
本发明的一个方面涉及包含获自根据本发明的方法的胰高血糖素肽的组合物GC，其特征在于所述组合物含有纯度高于99.0％的胰高血糖素肽，且含有0.05-0.5％，优选0.05-0.3％，尤其0.05-0.2％，且任选地仅0.05-0.1％的Trp(O)25-胰高血糖素。
本发明的一个方面涉及包含获自根据本发明的方法的胰高血糖素肽的组合物GC，其特征在于所述组合物含有纯度高于99.0％的胰高血糖素肽，且含有0.05-0.5％，优选0.05-0.3％，尤其0.05-0.2％，且任选地仅0.05-0.1％的Glu24-胰高血糖素。
本发明的一个方面涉及包含获自根据本发明的方法的胰高血糖素肽的组合物GC，其特征在于所述组合物含有纯度高于99.0％的胰高血糖素肽，且含有0.05-0.5％，优选0.05-0.3％，尤其0.05-0.2％，且任选地仅0.05-0.1％的des-Ser2-胰高血糖素。
本发明的一个方面涉及包含获自根据本发明的方法的胰高血糖素肽的组合物GC，其特征在于所述组合物含有纯度高于99.0％的胰高血糖素肽，且含有0.05-0.5％，优选0.05-0.3％，尤其0.05-0.2％，且任选地仅0.05-0.1％的des-Thr5-胰高血糖素。
优选地，以上百分比测定为分析型RP-HPLC伴以220nm处的UV检测中观察到的相对峰面积。或者，以上百分比可参考所有肽组分的求和质量。
本发明的一个方面涉及包含获自根据本发明的方法的胰高血糖素肽的组合物GC，其特征在于所述组合物含有纯度高于99.0％的胰高血糖素肽，且含有可检测水平，但不大于0.5％，优选不大于0.3％，且尤其优选不大于0.2％的Glu24-胰高血糖素，和/或des-Ser2-胰高血糖素，和/或des-Thr5-胰高血糖素，其中所述浓度以分析型RP-HPLC伴以220nm处的UV检测中观察到的相对峰面积形式测定。
本发明的一个方面涉及包含获自根据本发明的方法的胰高血糖素肽的组合物GC，其特征在于所述组合物含有纯度高于99.3％的胰高血糖素肽，且含有可检测水平，但不大于0.5％，优选不大于0.3％，且尤其优选不大于0.2％的Glu24-胰高血糖素，和/或des-Ser2-胰高血糖素，和/或des-Thr5-胰高血糖素，其中所述浓度以分析型RP-HPLC伴以220nm处的UV检测中观察到的相对峰面积形式测定。
优选地，组合物GC中的所有胰高血糖素均获自根据本发明的方法。
以下图式和实例，包括进行的实验和获得的结果仅出于说明性目的提供且不应被理解为限制权利要求书的范围。
附图说明
图1展示在不使用(黑色)和使用(灰色)假脯氨酸二肽的情况下制备的粗胰高血糖素肽溶液的分析型RP-UHPLC迹线。相对于以min为单位的滞留时间，绘制以mAU为单位的220nm处的吸光度。基于与独立合成的参考化合物共洗脱和先前LC-MS分析，Des-Thr5-、des-Ser2-和Glu24-胰高血糖素在两种情况下均被鉴别为重要杂质。
图2展示粗胰高血糖素制剂(实线)和对应预纯化胰高血糖素制剂(点线)的分析型RP-UHPLC迹线。相对于以min为单位的滞留时间，绘制以mAU为单位的220nm处的吸光度。基于相对滞留时间和先前LC-MS分析，Des-Thr5-、des-Ser2-和Glu24-胰高血糖素在两种情况下均被鉴别为重要杂质。可以看出，在预纯化步骤中，这些杂质的去除不令人满意。
图3展示预纯化胰高血糖素制剂(黑色)、在如实例3中所述的第一(TEAP)纯化维度之后获自收集含有纯化胰高血糖素的洗脱份的中间胰高血糖素制剂(灰色)和在如实例3中所述的第二(乙酸)纯化维度之后获自收集含有胰高血糖素的洗脱份的高纯度胰高血糖素制剂(星号)的分析型RP-HPLC迹线。可以看出，两个维度关于去除相关物质彼此互补且产生极佳的产物纯度。
实例：
实例1：胰高血糖素的全化学合成
使用Fmoc保护的氨基酸衍生物和任选地两种假脯氨酸二肽衍生物在Wang树脂上合成根据SEQ ID NO:1的胰高血糖素肽。对于每个链伸长循环，偶合试剂混合物包含TBTU加上DIPEA、DIC加上Oxyma或DEPBT加上DIPEA。在合成之后，通过与浓TFA一起在清除剂存在下在惰性气体下孵育，将肽链从树脂裂解且去除保护基。将碘化铵添加至裂解混合物且随后通过添加抗坏血酸还原形成的碘。通过过滤分离树脂和裂解溶液，且使用二异丙醚(IPE)作为反溶剂从裂解溶液沉淀粗肽。干燥的肽沉淀物再溶解于乙酸水溶液中且经脱羧，以产生具有约40至80％胰高血糖素含量的粗肽溶液。
通过UHPLC分析在不使用(黑色线)和使用(灰色线)假脯氨酸二肽的情况下制备的粗胰高血糖素肽溶液(参见图1)。基于相对滞留时间、加标实验和先前LC-MS分析，Des-Thr5-、des-Ser2-和Glu24-胰高血糖素在两种情况下均被鉴别为重要杂质。此外，观察到具有可能对应于Glu3-胰高血糖素的RRT 1.042的杂质。这些相关物质的浓度在下表2中以总峰面积的面积百分比给出。
表2
数据展现在SPPS期间使用两个假脯氨酸二肽建构嵌段允许在出人意料的程度上改善固相肽合成的直接产物，即固相结合的胰高血糖素肽。所得固相结合的胰高血糖素肽的特征总体上在于非所需物质的显著减少(粗胰高血糖素的纯度为56.21％vs 82.43％)，且尤其在于des-Thr5-、des-Ser2-和Glu24-胰高血糖素的减少。
实例2：预纯化
尤其当根据实例1制备的材料的胰高血糖素含量低于80％时，推荐进行预纯化步骤。制备缓冲液A(0.1％TFA水溶液)和缓冲液B(含0.1％TFA的60％乙腈水溶液)。将如同实例1制备的粗肽溶液负载于经缓冲液A预平衡的反相色谱柱(C18二氧化硅)上，所述柱用1.2柱体积(CV)的缓冲液A冲洗且用20％至100％缓冲液B的线性梯度洗脱，同时用UV检测器在220nm处监测肽洗脱。收集含有胰高血糖素的洗脱份，以得到预纯化的胰高血糖素制剂。此制剂可经冻干。如此获得的总体产物纯度为(纯度：94.27％)。
图2展示纯粗胰高血糖素制剂(实线)和预纯化胰高血糖素制剂(点线)的分析型RP-UHPLC迹线。可以看出，尽管制剂的总体纯度增加，但des-Ser2-和Glu3-胰高血糖素的相对含量根本不降低，且des-Thr5-和Glu24-胰高血糖素的含量不令人满意地高。因此，开发强力纯化方案的挑战之一是不管其相似性，将这些杂质与所需胰高血糖素序列分离。
实例3：二维RP-HPLC纯化
使用C18键结二氧化硅对如同实例2获得的胰高血糖素制剂进行二维纯化。相同柱用于两个纯化步骤，且通过根据UV吸收来监测肽洗脱。
将预纯化胰高血糖素制剂(纯度：95.48％)负载于反相色谱柱(C18二氧化硅，10μm孔径为的粒子)，且如下表3中所指示地洗脱肽。收集含有纯化胰高血糖素的洗脱份，以得到中间胰高血糖素制剂。
表3：参数TEAP纯化维度
如下表4中所指示地在反相色谱柱(C18二氧化硅，10μm孔径为的粒子)上进一步纯化中间胰高血糖素制剂。
表4
在第二纯化维度之后收集的洗脱份的纯度为99.42％，如通过分析型RP-UHPLC所评估，两个步骤之后的总产率为57.3％。检测不到浓度高于0.5％的单一非所需组分。起始物质和在第一和第二次HPLC之后收集的洗脱份的分析型RP-UHPLC迹线的比较展现两个纯化维度出人意料的互补性：每个纯化维度去除不同的非所需组分，使得两个步骤的组合产生极佳的产物纯度(参见图3)。表5详述特定的主要杂质的去除。
表5
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序列表
<110> 巴赫姆控股股份公司
<120> 制备胰高血糖素肽
<130> BAC71521PC
<150> EP18154113.7
<151> 2018-01-30
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类胰高血糖素的杂质- des-Thr5-胰高血糖素
<400> 2
His Ser Gln Gly Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg
1 5 10 15
Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类胰高血糖素的杂质- des-Ser2-胰高血糖素
<400> 3
His Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg
1 5 10 15
Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人类胰高血糖素的杂质- Glu24-胰高血糖素
<400> 4
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Glu Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 指示命名法的示例性肽
<400> 5
Gly Leu Ala Phe
1
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 指示氨基酸部分位置的命名法的示例性肽
<400> 6
Gly Leu Ala Phe Ala
1 5
Claims (14)
1.一种制备胰高血糖素肽的方法，所述胰高血糖素肽是SEQ ID NO:1的肽，所述方法包括：
a)提供包含所述胰高血糖素肽和至少一种非所需组分的液体组合物C；
b)对所述组合物C进行第一反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，其中C8-C18烃键合的二氧化硅被用作固定相，使用具有6.5至7.5的pH值的包含磷酸三乙铵和乙腈的水性移动相，且通过逐渐增加所述移动相内的所述乙腈浓度，同时收集含有所述胰高血糖素肽的洗脱份来实现洗脱；和
c)对步骤b)中获得的、收集的含有所述胰高血糖素肽的洗脱份进行第二反相HPLC纯化，其中C8-C18烃键合的二氧化硅被用作固定相，使用具有2至4的pH值的包含乙酸和乙腈的水性移动相，且通过逐渐增加所述移动相内的所述乙腈浓度，同时收集含有纯化的胰高血糖素肽的洗脱份来实现洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)的所述移动相中所述乙酸的浓度为0.5至5％(v/v)，和/或其中步骤b)中的洗脱是通过将所述乙腈含量从2至4％(v/v)乙腈增加至30至50％(v/v)乙腈的梯度来实现，和/或其中步骤c)中的洗脱是通过将所述乙腈含量从2至4％(v/v)乙腈增加至40至60％(v/v)乙腈的梯度来实现。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中C18键合的二氧化硅被用作步骤b)和/或步骤c)中的固定相，和/或其中相同固定相用于步骤b)和c)中。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，进一步包括在装载液体组合物C之前和/或在装载步骤b)中获得的收集的含有胰高血糖素肽的洗脱份之前，用包含TFA和乙腈的水溶液冲洗所述固定相的步骤。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：
d)进行阴离子交换。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中步骤a)包括：
(a-i)提供与固相结合的胰高血糖素肽，其中至少Glu、Asp和Lys的侧链带有保护基；和
(a-ii)将所述胰高血糖素肽从所述固相裂解且从所述胰高血糖素肽去除所述保护基。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述与固相结合的胰高血糖素肽包含两个假脯氨酸二肽，其选自由以下组成的群组：
Fmoc-Gly-Thr(Psi(Me,Me)pro)-OH、
Fmoc-Phe-Thr(Psi(Me,Me)pro)-OH、
Fmoc-Thr(tBu)-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OH、
Fmoc-Tyr(tBu)-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OH和
Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OH。
8.根据权利要求6所述的方法，其中使用选自由以下组成的群组的氨基酸衍生物将N端组氨酸部分引入至与所述固相结合的所述胰高血糖素肽中：Boc-His(Boc)-OH、Boc-His(Trt)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH，和包含DEPBT加上DIPEA或DIC加上Oxyma的偶合试剂混合物。
9.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中步骤a)包括对包含胰高血糖素肽的样品进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，其中C8-C18烃键合的二氧化硅被用作固定相，使用包含三氟乙酸和乙腈的水性移动相，且通过逐渐增加所述移动相内的所述乙腈浓度，同时收集含有所述胰高血糖素肽的洗脱份来实现洗脱。
10.根据权利要求6所述的方法，其中如下地实现从所述固相裂解所述胰高血糖素肽和从所述胰高血糖素肽去除所述保护基的步骤：通过与包含至少50％TFA和一种或多种清除剂的裂解组合物一起孵育，和/或其中将选自由以下组成的群组的一种或多种试剂添加至包含所述固相的悬浮液：碘化盐、二甲硫、1,4-二硫苏糖醇、三甲基溴硅烷和抗坏血酸。
11.根据权利要求10的方法，其中所述碘化盐是碘化铵。
12.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中C18键合的二氧化硅被用作步骤b)和/或步骤c)中的固定相，和/或其中相同固定相用于步骤b)和c)中，其中相同柱用于步骤b)和c)。
13.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其进一步包含以下步骤：
d)进行阴离子交换，其中乙酸根至少部分被氯离子置换。
14.一种组合物GC，其包含从根据权利要求1至2中任一项所述的方法获得的如SEQ IDNO:1所示的胰高血糖素肽，其特征在于所述组合物含有纯度高于99.3％的胰高血糖素肽，且含有可检测水平，但不超过0.5％的如SEQ ID NO:4所示的Glu24-胰高血糖素和/或如SEQID NO:3所示的des-Ser2-胰高血糖素和/或如SEQ ID NO:2所示的des-Thr5-胰高血糖素，其中des-Ser2-胰高血糖素和des-Thr5-胰高血糖素的总浓度不超过0.15％，其中所述浓度以分析型RP-HPLC伴以220nm处的UV检测中观察到的相对峰面积的形式确定。
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|---|---|---|---|
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