JP7360397B2 - グルカゴンペプチドの製造 - Google Patents

Description

本発明は、概して、工業的又は研究室スケールでのペプチド製造の分野に関する。本発明は、グルカゴンペプチドを効率的に合成し、そして精製する方法に関する。

ヒトグルカゴンはＧＣＧ遺伝子（ＨＧＮＣ：４１９１）の産物である。ペプチドは平均分子量３４８２．８０ｇ／ｍｏｌを有し、そして一文字コードで記述された２９アミノ酸の以下の配列：
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ （配列番号１）
からなる。

内分泌グルカゴンは、膵臓のアルファ細胞により産生され、そして中心的な異化ホルモンである。

グルカゴンは薬剤として、とりわけ重症低血糖の緊急処置として使用される。治療目的のためのグルカゴンは、ウシ及びブタの膵臓から最初に抽出され、そして精製された。今日では、グルカゴンは工業スケールで、大部分は組み換え技術により、そしてより最近では、化学的ペプチド合成によっても製造される。

化学的ペプチド合成は広範囲にわたって文献に記載されてきた。化学的ペプチド合成への２つの標準的なアプローチ、すなわち液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）及び固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）が区別され得る。さらに、ハイブリッドアプローチが利用され得、この場合、フラグメントが上記技術のうちの１つにより最初に合成され、次いで他方の技術を使用して接合される。溶液相ペプチド合成とも呼ばれるＬＰＰＳは、均一反応媒体中で起こる。連続するカップリングにより所望のペプチドが得られる。ＳＰＰＳでは、不溶性ポリマー樹脂に固定されているペプチドが、その配列を構成する保護されたアミノ酸の連続的付加により組み立てられる。最も一般的には、ペプチドはそのＣ末端アミノ酸を介して固定され、そして合成はＣ末端からＮ末端へ進む。

成長する鎖は不溶性支持体に結合されているので、過剰な試薬及び可溶性副生成物は単純な濾過により除去することができる。しかし、特に大きなペプチドの合成について、樹脂に結合した副生成物は、ペプチド鎖伸長の各サイクルの間に蓄積し得る。結果として、最終生成物の精製は非常に困難になり得る。

グルカゴンペプチドの精製は、それらの凝集する傾向に起因して特に厳しい。グルカゴンは酸性ｐＨで凝集する傾向があるということが知られている（例えば、非特許文献１）。本発明は、グルカゴンペプチドの製造及び精製のための方法を提供する。

その治療剤としての長い歴史にもかかわらず、グルカゴン製造及び精製に関する文献は限られている。

特許文献１は、天然供給源からグルカゴンを濃縮する方法を開示する。この方法は、フィード溶液及び約９～約１１のｐＨを有する移動相を使用した繰り返しサイズ排除クロマトグラフィーに依存する。グルカゴンは酸性溶液中でゲル及び小線維を形成する傾向があるので、酸性ｐＨでの精製工程を避けるよう教示される。

特許文献２は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるグルカゴン腫瘍壊死因子融合タンパク質の組み換え発現を報告する。融合タンパク質は切断され、そしてグルカゴンはＣ１８固定相を使用するＨＰＬＣにより精製される。精製に関する詳細は示されていない。

Ｙｏｓｈｉｄａ及びＴｅｒａｋｏｋａ（非特許文献２）は、ヒトインターフェロンガンマとの融合タンパク質としての組み換えグルカゴンの精製を教示する。グルカゴンは、融合タンパク質の可溶化及び切断により封入体から回収される。様々な精製プロトコルが開示される。Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ、続いてイオン交換ＤＥＡＥ－ＨＰＬＣを使用する２工程プロトコルは、不満足な収率を生じると報告される。改善されたプロトコルは、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー工程、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５カラムを使用した脱塩及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ－Ｓ１００カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーを含む。示差等電点沈殿（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）に依存する精製スキームが大規模製造には最も好ましかった。

Ｉｓｈｉｚａｋｉら（非特許文献３）は、大量の組み換えグルカゴンの精製を記載する。組み換え発現されたグルカゴン融合タンパク質を封入体から単離し、特異的プロテアーゼを用いて切断し、そして切断産物を、０．１トリフルオロ酢酸中の３２～４２％アセトニトリルの線形グラジエントを使用するＣ１８逆相ＨＰＬＣにより精製する。グルカゴンペプチド含有フラクションは約９０％の純度を有し、そしてその後１０ｍＭ ＴＲＩＳ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５、２０％アセトニトリル中０～０．１Ｍ ＮａＣｌの線形グラジエントを使用するイオン交換ＨＰＬＣにより精製する。最終生成物の純度は開示されていない。

Ｍｏｌｌｅｒｕｐら（非特許文献４）は、組み換えグルカゴンの製造のための別の方法を教示する。グルカゴンは出芽酵母（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において発現され、そして一連のクロマトグラフィー工程で精製される。

上の方法は、封入体からの可溶化及びプロテアーゼ切断後の組み換え発現されたグルカゴンの精製のための最適化された。このようなサンプルは化学的ペプチド合成から、特にＳＰＰＳから得られたものより複雑性が低いことに留意すべきである。

特許文献３は、カップリングが高温で行われるグルカゴンのＦｍｏｃ ＳＰＰＳを開示する。場合により、擬プロリン（ｐｓｅｕｏｐｒｏｌｉｎｅ）ジペプチドが使用される。

特許文献４は、ＳＰＰＳにより得られた粗製グルカゴン調製物の精製を記載する（実施例１～３を参照のこと）。粗製ペプチドは、３０％酢酸及び５％水性アセトニトリルに溶解され、濾過され、希釈され、そして３工程の手順により精製される。第一に、オクタデシルシラン結合シリカを固定相として、及び水性硫酸及び過塩素酸を含む移動相におけるアセトニトリルグラジエントを使用して逆相クロマトグラフィーを行う。第二の工程は、アンモニアを用いてｐＨを調整した後に塩析することを含む。次いで沈殿物を過塩素酸水溶液に再溶解する。第三の工程において、アニオン交換を行う。工程２の溶解された沈殿物をＣ１８固定相にロードし、アセトニトリル及び酢酸アンモニウム水溶液を含む移動相で洗浄し、そして塩酸を含む水溶液で溶出する。

この方法は、良好な収率及び９９．０％より高い純度を生じると言われる。しかし、そのようにして製造されたグルカゴンの不純物プロフィールは開示されていない。さらに、過塩素酸は危険なほど腐食性であり、爆発の可能性がある混合物を容易に形成し、そして広範な規制を受ける。したがって、プロセス及び生成物の安全性のために、過塩素酸の使用を避けることが望ましい。

ＵＳ ４，０３３，９４１ ＫＲ－Ｂ ０１４９９５５ 特許出願ＣＮ－Ａ １０３３３３２３９ 特許出願ＣＮ－Ａ １０３６９４３３８

Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１ （１９６９） ３７－４２ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ Ｓｈｉｏｎｏｇｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｎｏ ４５， １－１８， １９９８ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９２） ３６：４８３－４８６ Ｂｏｏｋ ｏｆ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ， ２１１ｔｈ ＡＣＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ， ＬＡ， Ｍａｒｃｈ， ２４－２８， １９９６

高度に純粋なグルカゴンの工業的製造を可能にする改善された方法の必要性がなお存在する。特に、ペプチド凝集を避けながらｄｅｓ－Ｔｈｒ５－、ｄｅｓ－Ｓｅｒ２、及びＧｌｕ２４－グルカゴンのような関連する物質の除去を可能にする、グルカゴン精製の経済的に実行可能な方法が必要とされる。

驚くべきことに、高度に純粋なグルカゴンの製造のための単純な方法が見いだされた。固定相として炭化水素結合シリカを使用し、そして第一の工程においてリン酸トリエチルアンモニウム及びアセトニトリルを含む第一の移動相を使用し、続いて酢酸水溶液及びアセトニトリルを含む第二の移動相を用いる第二の工程を使用する２つの連続したクロマトグラフィー工程を採用することが有利であることが見いだされた。驚くべきことに、両方の精製工程が、それらの精製パターンにおいて相補的であることが見いだされた。行われた実験において、再現性良く、高い収率並びに９９．０％より高い、そして９９．３％よりも高いプールされたフラクションの高い純度を再現性よく達成することができ、そして得られた生成物のゲル化は十分に制御された。

一般に、いくつかの略号及び定義は本発明全体を通して使用される：
Å オングストローム（０．１ｎｍ）
ＡＣＮ アセトニトリル
ＡｃＯＨ 酢酸
Ｂｏｃ ｔｅｒｔ．ブチルオキシカルボニル
ＤＢＵ ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン
ＤＥＰＢＴ ３－（ジエトキシ－ホスホリルオキシ）－３Ｈ－ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアジン－４－オン
ＤＩＣ ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
Ｄｍｂ ２，４－ジメトキシベンジル
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＴＥ １，４－ジチオエリトリオール（ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｉｏｌ）
ＤＴＴ １，４－ジチオトレイトール
ＥＤＴ １，２－エタンジチオール
Ｆｍｏｃ ９－フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＧＬＰ－１ グルカゴン様ペプチド１
ＧＬＰ グルカゴン様ペプチド
ＨＯＢｔ ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
本明細書において使用される用語ＨＰＬＣはＵＨＰＬＣを含む。
ＩＰＥ ジイソプロピルエーテル
ＬＣ－ＭＳ 液体クロマトグラフィー－質量分析
ＬＯＤ 検出限界
ＬＰＰＳ 液相ペプチド合成
ＭＴＢＥ メチルｔｅｒｔ．ブチルエーテル
ＭＴＴ ４－メチルトリチル
ＮＨ_４ＯＡｃ 酢酸アンモニウム
ＮＭＰ Ｎ－メチルピロリドン
ＯＭｐｅ ３－メチルペンタ－３－イルエステル
ＯｔＢｕ ｔｅｒｔ．ブチルエステル
ＯＮＳｕ Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＯＳｕとしても知られる）
Ｏｘｙｍａ シアノ－ヒドロキシイミノ－酢酸エチルエステル（ＯｘｙｍａＰｕｒｅ^（Ｒ）としても知られる）
Ｐｂｆ ２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル
ＲＰ－ＨＰＬＣ 逆相高速液体クロマトグラフィー
ＲＴ 室温
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＰＰＳ 固相ペプチド合成
ｔＢｕ ｔｅｒｔ．ブチル
ＴＢＴＵ （ベンゾトリアゾリル）テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＥＡＰ リン酸トリエチルアンモニウム
ＴＥＳ トリエチルシラン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＩＰＳ＝ＴＩＳ トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ トリチル
ＵＨＰＬＣ 超高パフォーマンス液体クロマトグラフィー

別の指示がなければ、液体混合物は、周囲温度での体積パーセンテージ及び体積比により定義される。

別の記述がなければ、ｐＨ値はそれぞれの水溶液を使用しようとする温度について示される。定義により、ｐＨ値は水溶液についてのみ、例えば移動相を調製する際に使用される水性成分についてのみ示すことができる。

本出願の文脈において使用される用語「約」は、いずれかの与えられた数値から１０％までの逸脱を示すために使用される。

本出願の文脈において使用される「組成物Ｃ」又は「組成物ＧＣ」のような表現は、「組成物（Ｃ）」又は「組成物（ＧＣ）」と同義と理解され得、すなわち、「Ｃ」及び「ＧＣ」は、参照記号と理解され得る。

本明細書で使用される用語「保護基」は、官能基の化学修飾により、その基をその後の工程段階における反応から遮断するため、例えば、アミノ酸側鎖の副反応を防止するために分子中に導入される基として最も広い意味で理解され得る。アミノ保護基の例はＢｏｃ及びＦｍｏｃ基であり、カルボン酸保護基の例は、メチルエステル、ベンジルエステル、又はｔｅｒｔ．ブチルエステルのような非反応性エステルである。

アミノ酸は、それらの正式名称（例示：アラニン）、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５に従う三文字コード（例えば、Ａｌａ）、又は一文字コード（例えば、Ａ）のいずれかにより交換可能に言及される。鏡像異性体形態が明示的に特定されていない限り、Ｌ－アミノ酸が一般的に言及される。しかし、本発明は、Ｄ－アミノ酸及び他の立体異性体を使用しても同様に実施することができるということに留意すべきである。

本明細書で使用される用語「ペプチド」及び「ポリペプチド」は交換可能に理解され得る。これはペプチド結合で連結されている２つ又はそれ以上のアミノ酸のポリマーを指す。アルファアミノ酸の場合、ペプチド結合は、１つのアミノ酸のアルファカルボキシル基と次のアミノ酸のアルファアミノ基との間のアミド結合であり得る。用語「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、分枝及び環状ペプチド、非天然アミノ酸を含むペプチド、同位体標識されたペプチド変形、並びにペプチド誘導体を含むことに留意すべきである。分枝ペプチドは、例えば、２つのペプチド鎖を、直接又は分子リンカーを介してアミノ酸側鎖を介して連結することから生じ得る。環状ペプチドは、例えば、末端又はアミノ酸側鎖における官能基間の分子内ジスルフィド結合形成から、又は分子内縮合反応から生じ得る。
ペプチド誘導体は、末端又はアミノ酸側鎖に、例えば、アシル化、アセチル化、アミド化、及び／又は別の方法で修飾された官能基を有するペプチドを含む。

別の指示がなければ、ペプチド配列は本明細書において、Ｎ－末端から始まり（左）、そしてＣ末端で終わる（右）ように示される。表１は様々な表記を説明し、これらは等価であり、そしてこの書面全体を通して交換可能に使用される。

ペプチド配列内の特定のアミノ酸は、本明細書においてアラビア数字で、場合により上付き文字で位置番号を示すことにより言及される。例として、ペプチドＧｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ａｌａ（配列番号６） （ＧＬＡＦＡとしても知られる）の位置３におけるアミノ酸Ａｌａ（Ａとしても知られる）は、Ａｌａ３又はＡｌａ^３又はＡ３又はＡ^３と言及される。これらの表記は交換可能に使用される。

以下の表記はアミノ酸誘導体のために使用される：アルファアミノ基（Ｎα）上の置換基は、アミノ酸記号の左に示され、そしてハイフンで隔てられており、アルファカルボキシ基における置換基は、アミノ酸記号の右に示され、そしてハイフンで隔てられており、側鎖における置換基は、アミノ酸記号のすぐ右に括弧内に示される。
Ｈｉｓの側鎖における置換基は、通常はイミダゾール環の位置１における窒素原子に位置する。置換基の位置は、しばしば明確には特定されていない。したがって、例えば、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨは特にＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（１－Ｔｒｔ）－ＯＨを含む。非修飾アルファ－アミノ酸については、アルファアミノ酸基（Ｎα）における置換基はプロトン（Ｈ－）であり、そしてアルファカルボキシ基における置換基はヒドロキシル（－ＯＨ）である。類似した表記が、ペプチドの一部である置換アミノ酸について使用される。

本明細書において使用される用語「アナログ」は、その配列が第一のペプチド配列から、３つまでのアミノ酸部分の置き換えにより誘導されたペプチド、及び／又は該第一のペプチド配列の３つまでのアミノ酸部分の欠失により誘導されたペプチド、及び／又は３つまでのアミノ酸部分の付加により誘導されたペプチドについて使用される。

本明細書で使用される用語「誘導体」は、化学反応により第一の化合物から得ることができる化合物を指す。結果として、誘導体は置換の存在又は不在により第一の化合物と異なり得る。例えば、ＳＰＰＳにおける使用のためのアミノ酸誘導体は、少なくともアミノ保護基の存在により、それらが誘導されたアミノ酸とは通常異なる。ペプチド誘導体としては、特に、ペプチドのアシル化、アミド化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）及び別の標識バージョンが挙げられる。

本明細書で使用される用語「グルカゴン様ペプチド」又はＧＬＰは、ＧＣＧ遺伝子から誘導された相同ペプチド（ＨＧＮＣ：４１９１）、エキセンディン及びそのアナログ、さらには上述のもののいずれかの誘導体を指す。

用語「グルカゴン様ペプチド１アナログ」及び「ＧＬＰ－１アナログ」は、本明細書において交換可能に使用される。本明細書で使用される場合、それらはＧＬＰ－１受容体に結合することができるペプチドに関する。ＧＬＰ－１（７－３７）及びエキセンディン４（１－３９）の誘導体及びアナログ、例えばエキセナチド、リキシセナチド、セマグルチド及びリラグルチドは好ましいＧＬＰ－１アナログである。

本明細書で使用される表現「グルカゴン」及び「グルカゴンペプチド」は、配列番号１のペプチド（Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ）、又はその誘導体若しくはアナログを指すために交換可能に使用される。

特に好ましい実施態様において、グルカゴンペプチド（本発明の方法に従って製造されることを意図される）は配列番号１のペプチドである。

あるいは、本発明のグルカゴンペプチドはまた、３つまでのアミノ酸の付加、挿入、欠失及び／又は置換により配列番号１と異なるペプチドであり得る。これは、３つまでのアミノ酸位置が、問題のペプチドの配列番号１のペプチドとの配列アライメントに基づいて配列番号１とは異なるとみなされ得る－アミノ酸残基の付加、挿入、欠失、及び／又は置換に起因してそうなる－ということを意味する。ＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌＷのような典型的な配列アライメントツールは当業者に周知である。３つまでのアミノ酸の付加、挿入、欠失及び／又は置換を含むこのようなグルカゴンペプチドは、好ましくは粗製グルカゴンペプチド混合物中に含まれ、これは目的のグルカゴンペプチド（特に、配列番号１のグルカゴンペプチドも含む。しかし、当然のことながら、３つまでのアミノ酸の付加、挿入、欠失及び／又は置換を含むこのようなグルカゴンペプチドは、あるいは目的のグルカゴンペプチドでもあり得る。したがって、３つまでのアミノ酸の付加、挿入、欠失及び／又は置換を含むこのようなグルカゴンペプチドは、場合により製造（そして精製）しようとするグルカゴンペプチドでもあり得る。次いで、保持時間は異なる。当業者は適切に条件を適合させるだろう。

本明細書で使用される配列相同性は、当該分野で公知の配列相同性のいずれかの定義を指し得る。特に、配列相同性は、本出願の出願日のバージョンの国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ （Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）により決定された配列相同性として理解され得る。

好ましくは、グルカゴンペプチド（可溶性形態、すなわち樹脂から切断された）は、（本質的に）いずれの保護基も含まず、そしてアミノ酸側鎖において修飾を有していない。したがって、グルカゴンペプチドは、好ましくは完全に無保護のペプチドであり、これは好ましくはさらに修飾されない。

あるいは、グルカゴンペプチドのＮ末端は修飾され得る（例えば、アシル化、特にアセチル化）。あるいは又はさらに、Ｃ末端は修飾され得る（例えば、アミド化）。

あるいは又はさらに、１つ又はそれ以上のアミノ酸部分側鎖は、フルオロフォアに結合され得る。場合により、グルカゴンペプチドは放射標識されてもよく（例えば、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、９９ｍＴｃ又はランタニド元素（例えば、６４Ｇｄ）により）、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）により検出可能な１つ若しくはそれ以上の重同位体、例えば１３Ｃのようなスピン標識で標識されてもよい。

グルカゴンペプチドは、典型的に天然Ｌ－アミノ酸からなる。しかし、あるいは、ペプチドは、例えば、Ｄ－アミノ酸、ベータアミノ酸、メチル化アミノ酸（例えば、Ｎ－メチル化又はアルファ－メチル化アミノ酸）のような１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸を含んでいてもよく、又はそれらからなるものであってもよい。

当業者は、極性環境において、特に水性環境において、グルカゴンペプチドのペプチド鎖が、例えば、末端及び／又はアミノ酸側鎖のいくつかにおいて、プロトン又は他のカチオン及び／又はアニオンを結合することによって、プロトン又は他のカチオン及び／又はアニオンを放出することによって塩を形成し得るということがわかるだろう。

当業者には当然のことながら、本明細書で使用されるグルカゴンペプチドは、アニオン又はカチオンのような当該分野で公知のいずれかの対イオン、例えば塩化物イオン、酢酸イオン、炭酸イオン、炭酸水素イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、切断溶液のいずれかのイオン（例えば、ＴＦＡイオン、臭化物イオン、過塩素酸イオン、アンモニウムイオン）及び／又は保護基の残基のカチオン若しくはアニオンを場合により保有し得る。さらに、ペプチドは、痕跡量の１つ又はそれ以上のスカベンジャー、例えばトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、アニソール、チオアニソール又は１，２－エタンジチオールに場合により共有結合又は非共有結合で結合され得る。

本発明は、グルカゴンペプチドを効率的に合成及び精製する方法に関する。

特に、本発明の一局面は、
ａ） グルカゴンペプチド及び少なくとも１つの不要な成分を含む液体組成物Ｃを供給する工程；
ｂ） 組成物Ｃを、第一の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）精製にかける工程、［ここで、炭化水素結合シリカが固定相として使用され、リン酸トリエチルアンモニウム及びアセトニトリルを含む水性移動相が使用され、そして溶出は、グルカゴンペプチドを含有するフラクションを集める間、移動相内のアセトニトリル濃度を徐々に増加させることにより達成される］；並びに
ｃ） 工程ｂ）において得られたプールされたグルカゴンペプチド含有フラクションを、第二の逆相ＨＰＬＣ精製にかける工程、［ここで、炭化水素結合シリカが固定相として使用され、酢酸及びアセトニトリルを含む移動相が使用され、そして溶出は、精製されたグルカゴンペプチドを含有するフラクションを集める間、移動相内のアセトニトリル濃度を徐々に増加させることにより達成される］、
を含む、グルカゴンペプチドの製造方法に関する。

一実施態様において、本発明の方法は、
ｄ） アニオン交換を行う工程
をさらに含み、好ましくは、ここでアセテートはクロリドで置き換えられ、かつ／又はアニオン交換は、凍結乾燥、限外濾過、透析、固相抽出、逆相クロマトグラフィー若しくはイオン交換クロマトグラフィーにより達成される。

用語「グルカゴン及び少なくとも１つの不要な成分を含む液体組成物Ｃを供給すること」は、グルカゴン及び少なくとも１つの不要な成分を含有するいずれかの液体組成物を得ることとして最も広い意味で理解され得る。グルカゴンは、当該分野で公知のいずれかの手段により供給され得る。例として、バイオテクノロジー方法から、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）若しくは液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）から、又はそれらの組み合わせから得られ得る。液体組成物Ｃは、粗製グルカゴンペプチドを本質的に含み得、又は部分的に精製されたグルカゴンペプチドを含み得る。

本発明の好ましい実施態様において、工程ａ）は：
（ａ－ｉ） 固相に結合されたグルカゴンペプチドを供給する工程、［ここで、少なくともＧｌｕ、Ａｓｐ、及びＬｙｓの側鎖は保護基を有する］；及び
（ａ－ｉｉ） 固相からグルカゴンペプチドを切断し、そして好ましくは、グルカゴンペプチドから保護基を除去する工程
を含む。

本出願の目的のために、用語「未加工（ｒａｗ）」及び「粗製（ｃｒｕｄｅ）」は、グルカゴンのようなペプチドの調製物を指定するために交換可能に使用され、これらは本質的に、合成及び単離プロセスの直接生成物であり、そしてクロマトグラフィーのような特定の精製工程にまだかけられていない。化学合成により、通常は約４０～７０％の純度を有する粗製グルカゴン調製物が得られる。しかし、当然のことながら、液体組成物Ｃは、１００％未満の純度（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は９５％より高い純度）のいずれかの程度を特徴とし得、そして本発明の実施態様は、部分的に精製されたグルカゴン組成物に有利に適用され得る。

用語「工程ｂにおいて得られたプールされたグルカゴン含有フラクション」は、工程ｂにおいて得られた適切な純度のグルカゴン含有フラクションのプールに関すると理解され得る。さらなる加工のためにプールしようとする、すなわち合わせようとするフラクションの選択は、得られたフラクションのグルカゴン含有量及び純度の分析に基づき得る。

用語「不要な成分」は、不純物とみなされる化合物についての最も広い意味で本明細書において使用される。特に好ましい種類の不純物は、グルカゴンの合成及び貯蔵の間に形成され、そして例として、アミノ酸、ペプチド及びそれらの誘導体からなる群より選択され得る。特に、アミノ酸、ペプチド、及びそれらの誘導体からなる群より選択される不純物が包含され、これらは、ペプチド合成の間の未熟鎖終結、ペプチド合成の間の少なくとも１つのアミノ酸の脱落又は意図されない付加、保護基の不完全な除去、アミノ酸カップリング又はＦｍｏｃ脱保護工程の間に発生する副反応、分子内又は分子間縮合反応、固相からのペプチド切断の間の副反応、ラセミ化、いずれかの他の種類の異性体形成、脱アミド、（部分的）加水分解、及び凝集体形成のようなプロセスから生じ得る。グルカゴンが凝集体形成しやすいこと、及び低いｐＨ値がしばしばこのプロセスを促進すること、すなわち、低ｐＨ値が不安定化条件を表すこと（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ １２：４１１－４１９を参照のこと）は、当該分野で公周知である。上で概説したようなプロセスから生じたペプチド性混入物は、「関連物質」と呼ばれることもある。

特に好ましい実施態様において、不要な成分はペプチド性不純物である。本明細書で使用される表現「ペプチド性不純物」は、不要なペプチド性化合物を指し、そして特にＨＭＷ（高分子量）不純物、精製しようとするペプチドの誘導体、精製しようとするペプチドの切断型変異体、精製しようとするペプチドの欠失変異体、並びにこのような切断型及び欠失変異体の誘導体を含む。ペプチド性不純物は、ＲＰ－ＵＨＰＬＣを含む適切な分析用クロマトグラフィー方法により日常的に決定される。

一実施態様において、不要な成分は、精製しようと知るグルカゴンペプチドの共有結合又は非共有結合凝集体を含む。このような不要な成分は、生理学的に不活性であるか、又は未知の生理学的効果のものであり、そして５０００Ｄａよりも大きい分子量を有する。これらは本明細書において「高分子量（ＨＭＷ）不純物」と呼ばれる。別の実施態様において、不要な成分は精製しようとするペプチドの誘導体であり、例えば、アミノ酸ラセミ化、アミノ酸側鎖の酸化若しくは加水分解、及び／又はペプチド合成の間に形成された副生成物である。別の実施態様において、不要な成分は、精製しようとするペプチドの切断型変異体又はこのような切断型変異体の誘導体である。本明細書で使用される表現「切断型変異体」は、ペプチド配列のＮ末端及び／又はＣ末端において１つ又はそれ以上のアミノ酸を欠いている、所定のペプチドの連続したフラグメント、すなわちギャップのない配列を指す。別の好ましい実施態様において、不要な成分は、精製しようとするペプチドの欠失変異体又はこのような欠失変異体の誘導体を含む。本明細書で使用される表現「欠失変異体」は、それらの一次配列が単一又は複数のアミノ酸を欠いている点で異なる、精製しようとするペプチドの変異体を指すために使用される。「取り除かれた」アミノ酸は、元のペプチド配列内のいずれかの位置にあり得る。それ故、切断型変異体は、欠失変異体の特定の型とみなされ得る。

最も好ましい実施態様において、本発明に従う方法は、本質的に純粋なグルカゴン調製物を得るように、ペプチド性不純物の除去を可能にする。本発明の方法により、分析用クロマトグラフィーにより好ましくは２０５と２３０ｎｍとの間の波長でのＵＶ検出を用いて相対的ピーク面積に関して評価して、０．５％を超えるいずれの個々のペプチド性不純物も含有しない、本質的に純粋なグルカゴンペプチドが得られるということが示された。

いくつかの実施態様において、不要な成分は、Ｍｅｔ（Ｏ）^２７－グルカゴン、及び／又はＳｅｒ^２若しくはＴｈｒ^５を欠いたグルカゴン欠失変異体及び／又はＧｌｕ^２４－グルカゴンの少なくとも１つを含む。

一実施態様において、不要な成分は、ｄｅｓ－Ｔｈｒ^５－グルカゴン（配列番号２）、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^２－グルカゴン（配列番号３）、及び／又はＧｌｕ^２４グルカゴン（配列番号４）を含む。

本明細書に記載される本発明の実施態様は、合成後に得られる粗製調製物からグルカゴンを精製するために有利に使用され得る。本発明はグルカゴン合成の特定の方法にいかなるようにも限定されないが、好ましい実施態様は、化学合成されたグルカゴンペプチドの精製を含む。グルカゴンペプチドは、例えば、適切に保護されたアミノ酸及びジペプチド誘導体を使用するＦｍｏｃ固相ペプチド合成により合成され得る。

好ましくは、組成物Ｃは、以下の工程（ａ－ｉ）～（ａ－ｉｉｉ）：
（ａ－ｉ） グルカゴンペプチドの固相合成；
（ａ－ｉｉ） 固相からのグルカゴンペプチドの切断、及び好ましくはグルカゴンペプチドから保護基を除去すること；並びに
（ａ－ｉｉｉ） 切断溶液の成分からのグルカゴンペプチドの分離
を含む方法により製造されたグルカゴンペプチド又はその塩を含む。

その結果として、一実施態様において、本発明に従う方法の工程ａ）は、上の工程（ａ－ｉ）、（ａ－ｉｉ）、及び（ａ－ｉｉｉ）を行うことを含み得る。

用語「固相」、「樹脂」、「［樹脂］」、及び「支持体」は、本明細書において交換可能に使用される。これらは、ＳＰＰＳに使用可能ないずれかの構造、例えばビーズ様構造として最も広い意味で理解され得る。

ＳＰＰＳは、一般に固相支持体よりもゲル相で行われる。適切な樹脂は、ポリスチレン、ポリスチレン－ＰＥＧ複合材、ＰＥＧ、ＰＥＧＡ、架橋エトキシ化アクリレート（ＣＬＥＡＲ）、ポリアミド類、ポリジメチルアクリルアミド、又は所望の物理的及び化学的特性を有するいずれかの他の支持体に基づくものであり得る。日常的に使用される支持体の中で、１％ジビニルベンゼンを含むビーズ状ポリスチレンに基づく樹脂は、典型的には２００～４００メッシュ又は１００～２００メッシュのサイズ分布を有する。ポリスチレンベースの２－クロロトリチルクロリド（ＣＴＣ）樹脂、ジフェニルジアゾメタン（ＰＤＤＭ）樹脂、４－（２’，４’－ジメトキシフェニル－Ｆｍｏｃ－アミノメチル）－フェノキシメチル－ポリスチレン（Ｒｉｎｋ）樹脂、２－メトキシ－４－アルコキシベンジルアルコール（Ｓａｓｒｉｎ）樹脂、及び特に４－アルコキシベンジルアルコール（Ｗａｎｇ）樹脂は、本発明の方法とともに使用するために特に適しており、そしてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂａｃｈｅｍ及びＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅのような供給元から市販されている。しかし、ＳＰＰＳに適したいずれの他の樹脂も使用され得る。

Ｃ末端カルボキシル基を介した固定化の代替として、ペプチドはまた、（好ましくは末端）アミノ酸の側鎖を介して樹脂に結合されてもよい。さらなる代替としては、ペプチドはまた、Ｎ末端を介して樹脂に結合され、そしてＮ末端からＣ末端へと合成されてもよい（逆ペプチド合成）。

当業者には多様なＳＰＰＳ方法がわかるだろう。一般に、いずれの型のＳＰＰＳも本発明の状況において使用され得る。様々な型の装置をＳＰＰＳに使用することができる。バッチ式又は連続フローＳＰＰＳのいずれかのための手動、半自動化及び自動化合成機が利用可能である、いずれかの所定の装置について、樹脂は装置によって課される機械的要件を満たすように適切に選択され得る。

当業者は、樹脂負荷がＳＰＰＳ、特に工業的ＳＰＰＳにおける有効性に影響を及ぼし得るということを十分に認識する。これは特に、グルカゴンペプチドのような長い凝集しやすいペプチド配列を扱う場合に影響を有し得る：一方で、プロセス有効性は、樹脂負荷を増加させるにつれて増加する。他方で、樹脂負荷を減らすことにより樹脂上沈殿を減らすことが必要不可欠である。そのようにして繊細なバランスが満たされ得、そして最適な樹脂負荷が、いずれかの所定のＳＰＰＳプロトコルについて慣用の実験により確立され得る。樹脂負荷は、様々な置換度が市販されている樹脂を使用することにより、又は第一のアミノ酸と比較して、少ないモルの第二のアミノ酸をカップリングして、その後未反応の第一のアミノ酸をアセチル化する、すなわち、ブロッキングすることのいずれかにより変化し得る。同様に、第一のアミノ酸は、樹脂に対して少ないモルでカップリングされ得、続いてブロッキング工程にかけられる。

本発明の好ましい実施態様において、約０．２ｍｍｏｌ／ｇ～約０．９ｍｍｏｌ／ｇの範囲の樹脂負荷、例えば、約０．２ｍｍｏｌ／ｇ、０．３ｍｍｏｌ／ｇ、０．４ｍｍｏｌ／ｇ、０．５ｍｏｌ／ｇ、０．６ｍｍｏｌ／ｇ、０．７ｍｍｏｌ／ｇ、０．８ｍｍｏｌ／ｇ、又は０．９ｍｍｏｌ／ｇの樹脂負荷が使用される。この状況において、ＳＰＰＳの間に、使用される様々な溶媒中での樹脂の膨潤及び縮小が、樹脂体積のかなりの変動をもたらし得、それ故樹脂上のペプチド濃度の変動ももたらし得るということがわかるだろう。

本発明の好ましい実施態様において、Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳが行われる。当業者は、Ｆｍｏｃ合成プロトコルに基づくＳＰＰＳ法を十分認識する。樹脂へのアミノ酸付加の各サイクルは、典型的にはＦｍｏｃ切断、すなわち樹脂結合ペプチド鎖からのＦｍｏｃ保護基の除去から開始する。これは、ペプチド樹脂を、樹脂を膨潤させて試薬を溶解させることのできる溶媒中の塩基とともにインキュベートすることにより達成される。この目的のためによく知られている塩基は、例えばピペリジン及び４－メチルピペリジンのような第二級アミン類を含む。適切な溶媒は、例えば、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、トルエン、及びそれらの混合物を含む。反応は、一般的に周囲温度で、例えば１５～３０℃の温度範囲内で行われる。通常は、塩基に不安定でかつ酸に安定なＦｍｏｃは、ＤＭＦ中５～５０％、好ましくは２０％（体積／体積）ピペリジンを用いた短時間の処理（２～１５分間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５分間）により分離される。必要な場合、この処理は繰り返され、かつ／又はわずかに延長される（７～３０分間、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０分間）。鎖の切断が困難な大きなペプチドの合成については、Ｆｍｏｃ切断の期間さらには繰り返し回数を徐々に増加し得る。例えば、切断時間は、１５～７５分、例えば１５、３０、４５、６０、又は７５分であり得、そして切断は８回まで、例えば２、３、４、５、６、７、又は８回繰り返される。さらに、温度は例えば３０℃と４５℃との間の温度まで増加され得る。これらの条件下で、大部分の場合に完全な脱ブロックが達成される。さらに又はあるいは、Ｆｍｏｃ切断に使用される試薬は変更され得る。

試薬の僅かな変化でも切断をかなり加速し得るということが見いだされた、例えばＤＭＦ中１～５％ＤＢＵ、ＤＭＦ中２０％ピペリジン及び１～５％ＤＢＵ、ＮＭＰ中２０％ピペリジン、又はＤＭＦ中２０％ピペリジン４５℃。さらに、切断反応の加速は、加熱／マイクロ波処理により達成され得る。

他方で、ペプチドの性質は、より穏やかな処理の使用を有利にし得る。特定の穏やかな切断条件は、例えば、０．１Ｍ ＨＯＢｔ及びＤＭＦ中２０％ピペリジン、ＤＭＦ中５０％モルホリン、ＮＭＰ中５０％ＤＭＳＯ中２％ＨＯＢｔ及び２％ヘキサメチレンイミン及び２５％Ｎ－メチルピロリジンである。当業者は、合成の各工程においてＦｍｏｃ切断条件を日常的に最適化し、そして制御するだろう。

好ましい実施態様において、Ｆｍｏｃ保護基は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中５～５０％（体積／体積）ピペリジン又は４－メチルピペリジン、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）中５～５０％（体積／体積）ピペリジン又は４－メチルピペリジン、ＤＭＦ中１～５％（体積／体積）ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）、及びＤＭＦ中５０％（体積／体積）モルホリンからなる群より選択される混合物を使用して、固相に結合された伸長するペプチド鎖から切断される。

切断試薬は、典型的にはＦｍｏｃ除去の後に注意深く洗い流される。ＤＭＦ及び場合によりＩＰＡは、中性ｐＨになるまで洗浄に使用される。完全な塩基除去を確実にするため、少量のＨＯＢｔを後の洗浄サイクルで加えることが有利かもしれない。

アミノ酸誘導体のペプチド樹脂へのカップリング、すなわち伸長工程は、ＳＰＰＳサイクルの中心的工程のうちの１つである。

Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳのための適切な保護されたアミノ酸誘導体、例えば、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｍｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｍｔｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｍｔｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（１－Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ （Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（１－Ｔｒｔ）－ＯＨと呼ばれることもある）、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ （Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（１－Ｂｏｃ）－ＯＨと呼ばれることもある）、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、及びＦｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨは、様々な供給源から市販されている。非天然アミノ酸誘導体、例えばＡｉｂ（α－アミノイソ酪酸）、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、又はＯｒｎ（オルニチン）のグルカゴン様ペプチドの合成における使用も同様に本発明の方法に包含されるということに留意のこと。
好ましい実施態様において、アミノ酸誘導体Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、及びＦｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨが使用される。別の好ましい実施態様において、アミノ酸誘導体Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、及びＦｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨが使用される。

カップリング反応の速度及び収率は、溶媒の選択、立体障害、及び活性化されたカルボン酸の反応性のような様々なパラメーターにより影響を受け得る。溶媒は、前駆ペプチド－樹脂の膨潤を決定するだけではないかもしれず、それ故、反応性部位のアクセス性に影響を及ぼし得る；また、これはカップリング反応の動力学に直接影響を及ぼし得る。適切な溶媒は、樹脂を膨潤させ、そして試薬を溶解することができ、そして例えば、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、トルエン、及びそれらの混合物を含む。立体障害は、アミノ酸側鎖及びそれらの保護基の性質により決定される。活性化カルボン酸の反応性は、アシル化速度、さらにはラセミ化のような副反応の程度を決定する。選択された合成ストラテジーに依存して、擬プロリンジペプチド誘導体、ジ－又はトリペプチド誘導体、又は分枝ジペプチド誘導体のようなペプチド誘導体が、単一のアミノ酸誘導体の代わりに使用され得る。

本発明の特定の実施態様において、アミノ酸活性化は溶媒としてのＤＭＦ中で行われ、すなわち、アミノ酸又はペプチド誘導体、カップリング試薬及び場合により添加剤又は塩基がＤＭＦに溶解され、そして混合される。ＤＩＣは、添加剤としてＯｘｙｍａＰｕｒｅ^（Ｒ）又はＨＯＢｔのいずれかと組み合わせてカップリング試薬として使用され得る。別の方法では、塩基、好ましくはＤＩＰＥＡの存在下でＴＢＴＵ又はＤＥＰＢＴを使用して、Ｆｍｏｃアミノ酸を活性ＯＢｔ又はＯＤｈｂｔエステルに変換し得る。

本明細書で使用される用語「カップリング試薬混合物」は、カップリング試薬及び場合により添加剤又は塩基を含む組成物に関する。本発明とともに使用するための好ましいカップリング試薬混合物は、ＴＢＴＵ及びＤＩＰＥＡ、ＤＩＣ及びＯｘｙｍａ、ＤＥＰＢＴ及びＤＩＰＥＡ、又はＤＩＣ及びＨＯＢｔを含む。

選択されたアミノ酸誘導体は、樹脂に添加する前に１～３０分間、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、…、２８、２９、又は３０分間、上記の試薬とともにインキュベートすることにより予め活性化される。カップリング反応は、１～７４時間（ｈ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、…、７１、７２、７３、又は７４ｈ継続される。アミノ酸誘導体は、樹脂結合アミン基の量に対して０．４～３モル比で、例えば０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、又は３．０のモル比で使用され得る。完全なカップリングを達成するために、活性化剤又は塩基の第二の部分を、しばらくの時間の後、例えば１０、２０、３０、４０、又は６０分後に反応混合物に加えることが有利かもしれない。予備活性化（ｐｒｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）及びカップリング工程は、一般には室温で行われるが、他の温度でも行われ得る。アミノ基の完全に近い変換を達成するために１つ又はそれ以上の再カップリング工程を行うことが有利かもしれない。

本発明の他の実施態様において、アミノ酸活性化は、場合によりＤＭＦとともに、ＮＭＰ、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、トルエン、及びそれらの混合物からなる溶媒中で行われる。

本発明の一実施態様において、工程ａ）は、適切に保護されたアミノ酸誘導体又はジペプチド誘導体を使用して、グルカゴンペプチドのＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成を行うことを含み、ここで該保護されたアミノ酸誘導体又はジペプチド誘導体は：
（Ａ） ベンゾトリアゾリル）テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）；
（Ｂ） ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びシアノ－ヒドロキシイミノ－酢酸エチルエステル（Ｏｘｙｍａ）；
（Ｃ） ３－（ジエトキシ－ホスホリルオキシ）－３Ｈ－ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアジン－４－オン（ＤＥＰＢＴ）及びＤＩＰＥＡ；並びに
（Ｄ） ＤＩＣ及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）
からなる群より独立して各工程について選択される試薬を含む１つ又はそれ以上のカップリング試薬を用いて活性化される。

本発明の一実施態様において、工程ａ）は、適切に保護されたアミノ酸誘導体又はジペプチド誘導体を使用して、グルカゴンペプチドのＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成を行うことを含み、ここで該保護されたアミノ酸誘導体又はジペプチド誘導体は：
（Ａ） ベンゾトリアゾリル）テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）；
（Ｂ） ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びシアノ－ヒドロキシイミノ－酢酸エチルエステル（Ｏｘｙｍａ）；
（Ｃ） ３－（ジエトキシ－ホスホリルオキシ）－３Ｈ－ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアジン－４－オン（ＤＥＰＢＴ）及びＤＩＰＥＡ；並びに
（Ｄ） ＤＩＣ及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）
からなる群より各工程について独立して選択される１つ又はそれ以上のカップリング試薬を用いて活性化される。

Ｈｉｓ誘導体のカップリングは、好ましくはラセミ化を避けるように行われる。この副反応は、３つの異なるアプローチにより低減され得る：１）イミダゾール環のＮ３のブロッキング、２）Ｂｏｃ又はＴｏｓのような電子吸引基によるイミダゾール環のＮ１のブロッキング、及び３）Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（１－Ｔｒｔ）－ＯＨを使用した場合のカプリング条件の最適化。したがって、Ｎ末端Ｈｉｓを導入するために、ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ又はＤＥＰＢＴ／ＤＩＰＥＡのいずれかと組み合わせてＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（１－Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（１－Ｔｒｔ）－ＯＨ、又はＢｏｃ－Ｈｉｓ（１－Ｂｏｃ）－ＯＨ、最も好ましくはＢｏｃ－Ｈｉｓ（１－Ｂｏｃ）－ＯＨを使用することが推奨される。

したがって、好ましい実施態様において、Ｎ末端ヒスチジン部分は、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、及びＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨからなる群より選択されるアミノ酸誘導体、並びにＤＥＰＢＴ及びＤＩＰＥＡ又はＤＩＣ及びＯｘｙｍａを含むカップリング試薬混合物を使用して、固相に結合されたグルカゴンペプチドに導入される。

驚くべきことに、少なくとも２つのＦｍｏｃ擬プロリンジペプチドの使用が、ペプチド凝集を有利に抑制し、それ故、非効率的な合成に起因する副生成物の形成が抑制されるということが見いだされた。好ましくは、２つの擬プロリンジペプチドは、配列番号１のペプチドの、（Ｇｌｙ^４－Ｔｈｒ^５及びＰｈｅ^６－Ｔｈｒ^７）、（Ｇｌｙ^４－Ｔｈｒ^５及びＴｈｒ^７－Ｓｅｒ^８）、（Ｇｌｙ^４－Ｔｈｒ^５及びＴｙｒ^１０－Ｓｅｒ^１１）、（Ｇｌｙ^４－Ｔｈｒ^５及びＡｓｐ^１５－Ｓｅｒ^１６）、（Ｐｈｅ^６－Ｔｈｒ^７及びＴｙｒ^１０－Ｓｅｒ^１１）、（Ｐｈｅ^６－Ｔｈｒ^７及びＡｓｐ^１５－Ｓｅｒ^１６）、（Ｔｈｒ^７－Ｓｅｒ^８及びＴｙｒ^１０－Ｓｅｒ^１１）、（Ｔｈｒ^７－Ｓｅｒ^８及びＡｓｐ^１５－Ｓｅｒ^１６）、並びに（Ｔｙｒ^１０－Ｓｅｒ^１１及びＡｓｐ^１５－Ｓｅｒ^１６）からなる群より選択される２つの位置に対応するか、又は２つの位置と同一の位置に導入される。

したがって、本発明の一局面において、工程ａ） －すなわち、グルカゴンペプチド及び少なくとも１つの不要な成分を含む液体組成物Ｃを供給する工程－ は：
（ａ－ｉ） 固相に結合されたグルカゴンペプチドを供給すること、［ここで、少なくともＧｌｕ、Ａｓｐ、及びＬｙｓの側鎖は保護基を有し、そして固相に結合されたグルカゴンペプチドは２つの擬プロリンジペプチドを含み、好ましくはここで２つの擬プロリンジペプチドは：配列番号１のペプチドのＧｌｙ^４－Ｔｈｒ^５及びＰｈｅ^６－Ｔｈｒ^７、Ｇｌｙ^４－Ｔｈｒ^５及びＴｈｒ^７－Ｓｅｒ^８、Ｇｌｙ^４－Ｔｈｒ^５及びＴｙｒ^１０－Ｓｅｒ^１１、Ｇｌｙ^４－Ｔｈｒ^５及びＡｓｐ^１５－Ｓｅｒ^１６、Ｐｈｅ^６－Ｔｈｒ^７及びＴｙｒ^１０－Ｓｅｒ^１１、Ｐｈｅ^６－Ｔｈｒ^７及びＡｓｐ^１５－Ｓｅｒ^１６、Ｔｈｒ^７－Ｓｅｒ^８及びＴｙｒ^１０－Ｓｅｒ^１１、Ｔｈｒ^７－Ｓｅｒ^８及びＡｓｐ^１５－Ｓｅｒ^１６、又はＴｙｒ^１０－Ｓｅｒ^１１及びＡｓｐ^１５－Ｓｅｒ^１６からなる群より選択される位置に対応するか又はそれらと同一の位置に導入される］；及び
（ａ－ｉｉ） 固相からグルカゴンペプチドを切断し、そして好ましくはグルカゴンペプチドから保護基を除去すること
を含む。

本発明の文脈において使用される擬プロリンジペプチドは、保護基とみなされ得る。したがって好ましくは、このような保護基はまた、本発明の方法の工程（ａ－ｉｉ）において除去される。

本明細書で使用される用語「擬プロリンジペプチド」は、一時的なプロリン模倣物を指し、これは、例えばＳｅｒ及びＴｈｒを含有するジペプチドからオキサゾリジン形成により、及びＣｙｓ含有ジペプチドからチアゾリジン形成により容易に得られる。当業者は、このような擬プロリンジペプチドを十分に認識する。これらのジペプチドは、ＳＰＰＳの間の樹脂上凝集を軽減するための１つの可能な選択肢である。２，２－ジメチルオキサゾリジン類は、ＴＦＡにより円滑に切断され、したがってＦｍｏｃ－ＳＰＰＳに特に適している。これらは本明細書において（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）と略される。

特に好ましい実施態様において、少なくとも２つの擬プロリンジペプチド誘導体が使用され、これらは、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、及びＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨからなる群より選択される。したがって、本明細書に開示される方法の工程ａ）は、Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳを行うことを含み得る。

本明細書で使用される用語「配列番号１のペプチドの（Ｇｌｙ^４－Ｔｈｒ^５及びＰｈｅ^６－Ｔｈｒ^７）、［…］、並びに（Ｔｙｒ^１０－Ｓｅｒ^１１及びＡｓｐ^１５－Ｓｅｒ^１６）からなる群より選択される２つの位置に対応する位置」は、グルカゴンペプチドの一次配列内の２つの位置を指し、これらの位置は、配列番号１のペプチドとの該グルカゴンペプチドの配列アライメントに基づいて、配列番号１のペプチドの２つの選択された位置に対して相同とみなされる。典型的には、このようなアライメントにおいて互いの先端に示される位置は、相同であるとみなされ、すなわち、互いに対応する。ＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌＷのような典型的な配列アライメントツールは当業者に周知である。

したがって、擬プロリン部分の導入は、固相結合グルカゴンペプチドの供給をもたらし、これは関連不純物の減少したパーセンテージを特徴とする。したがって、一局面において、本出願は、少なくとも２つの擬プロリンジペプチドを含む固相結合グルカゴンペプチドを提供し、ここでＮ末端Ｈｉｓ部分の側鎖はＢｏｃ保護基又はＴｒｔ保護基で、特に１－Ｂｏｃ保護基又は１－Ｔｒｔ保護基で保護されている。したがって別の局面において、本出願は、少なくとも２つの擬プロリンジペプチド及びＮ末端Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）部分を含む固相結合グルカゴンペプチドを提供する。したがって別の局面において、本出願は、少なくとも２つの擬プロリンジペプチド及びＮ末端Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（１－Ｔｒｔ）部分を含む固相結合グルカゴンペプチドを提供する。好ましい実施態様において、該固相結合グルカゴンペプチドは、Ｇｌｕ^２４－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^２－グルカゴン及びｄｅｓ－Ｔｈｒ^５－グルカゴンの低い含有量をさらに特徴とする。別の好ましい実施態様において、該固相結合グルカゴンペプチドは、０．７０％未満の相対含有量のｄｅｓ－Ｓｅｒ^２－グルカゴン、又は０．５０％未満の相対含有量のｄｅｓ－Ｔｈｒ^５－グルカゴン、又は０．７０％未満の相対含有量のＧｌｕ^２４－グルカゴンを特徴とする。

別の好ましい実施態様において、該固相結合グルカゴンペプチドは、０．７０％未満の相対含有量のｄｅｓ－Ｓｅｒ^２－グルカゴン、及び０．５０％未満の相対含有量のｄｅｓ－Ｔｈｒ^５－グルカゴン、及び０．７０％未満の相対含有量のＧｌｕ^２４－グルカゴンを特徴とする。別の好ましい実施態様において、該固相結合グルカゴンペプチドは、いずれの単一の欠失変異体についても２．０％未満の相対含有量を特徴とし、これは目的のグルカゴンペプチドと単一のアミノ酸だけ異なるものである。別の好ましい実施態様において、該固相結合グルカゴンペプチドは、ｄｅｓ－Ｈｉｓ^１－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^２－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｇｌｎ^３－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｇｌｙ^４－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｈｒ^５－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｐｈｅ^６－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｈｒ^７－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^８－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｓｐ^９－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｙｒ^１０－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^１１－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｌｙｓ^１２－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｙｒ^１３－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｌｅｕ^１４－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｓｐ^１５－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^１６－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｒｇ^１７－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｒｇ^１８－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｌａ^１９－グルカゴン、及びｄｅｓ－Ｇｌｎ^２０－グルカゴンの各々について２．０％未満の相対含有量を特徴とする。別の好ましい実施態様において、該固相結合グルカゴンペプチドは、ｄｅｓ－Ｈｉｓ^１－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^２－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｇｌｎ^３－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｇｌｙ^４－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｈｒ^５－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｐｈｅ^６－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｈｒ^７－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^８－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｓｐ^９－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｙｒ^１０－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^１１－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｌｙｓ^１２－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｙｒ^１３－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｌｅｕ^１４－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｓｐ^１５－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^１６－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｒｇ^１７－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｒｇ^１８－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｌａ^１９－グルカゴン、及びｄｅｓ－Ｇｌｎ^２０－グルカゴンの各々について１．０％未満の相対含有量を特徴とする。別の好ましい実施態様において、該固相結合グルカゴンペプチドは、ｄｅｓ－Ｈｉｓ^１－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^２－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｇｌｎ^３－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｇｌｙ^４－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｈｒ^５－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｐｈｅ^６－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｈｒ^７－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^８－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｓｐ^９－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｙｒ^１０－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^１１－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｌｙｓ^１２－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｙｒ^１３－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｌｅｕ^１４－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｓｐ^１５－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^１６－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｒｇ^１７－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｒｇ^１８－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｌａ^１９－グルカゴン、及びｄｅｓ－Ｇｌｎ^２０－グルカゴンのうちすくなくとも２つについて１．０％未満の相対含有量を特徴とする。

別の好ましい実施態様において、上記固相結合グルカゴンペプチドは、ｄｅｓ－Ｈｉｓ^１－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^２－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｇｌｎ^３－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｇｌｙ^４－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｈｒ^５－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｐｈｅ^６－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｈｒ^７－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^８－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｓｐ^９－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｙｒ^１０－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^１１－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｌｙｓ^１２－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｔｙｒ^１３－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｌｅｕ^１４－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｓｐ^１５－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^１６－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｒｇ^１７－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｒｇ^１８－グルカゴン、ｄｅｓ－Ａｌａ^１９－グルカゴン、及びｄｅｓ－Ｇｌｎ^２０－グルカゴンのうち少なくとも４つについて２．０％未満の相対含有量を特徴とする。

固相結合グルカゴンにおける該不純物の相対含有量は、好ましくは対応する粗製ペプチドの分析用ＵＨＰＬＣにおいて相対的ピーク面積（不純物のピーク面積を、観察された全てのピークの総ピーク面積で割ったもの）を測定することにより決定される。

ＳＰＰＳを行う場合、未反応のアミンをその後の合成工程におけるペプチド結合形成からブロックするため、すなわち合成しようとする配列の欠失変異体の形成を避けるために、キャッピングが行われ得る。これは、大過剰の高度に反応性で嵩高くない（ｕｎｈｉｎｄｅｒｅｄ）酸誘導体、例えば酢酸無水物または塩化ベンゾイル、及び塩基、例えばピリジン、コリジン、またはＤＩＰＥＡを、場合によりＯｘｙｍａＰｕｒｅ^（Ｒ）またはＨＯＢｔのような添加剤の存在下で用いてペプチド樹脂を短時間処理することにより達成され得る。とりわけ、以下のキャッピング組成物が使用され得る：ＤＣＭ中１～１５当量Ｎ－アセチルイミダゾール；ＤＭＦ ２，５～２５体積中の酢酸無水物／ピリジン（１：１）［すなわち、（１：１：５）体積／体積／体積～（１：１：５０）体積／体積／体積］；ＤＭＦ １～１０体積中の酢酸無水物／ＤＩＰＥＡ（１：１）［すなわち、（１：１：２）体積／体積／体積～（１：１：２０）体積／体積／体積］；ＤＣＭ中１～１５当量酢酸無水物及びトリエチルアミン；ＮＭＰ／ＤＣＭ（１：１）中１～５当量Ｎ－（２－クロロベンジルオキシカルボニル）－スクシンイミド及びＤＩＰＥＡ；並びにＮＭＰ中１～１０当量ＤＩＰＥＡとともに１～１５当量（Ｂｏｃ）_２Ｏ。キャッピングにより、典型的には切断型配列が得られ、これは一般的には最終ペプチドとはかなり異なり、そして容易に分離することができる。好ましくは、手順通りの二重カップリングの後にキャッピングを行う。キャッピング工程の終わりに、試薬を典型的にはろ別し、そして樹脂を例えばＤＭＦ及び場合によりＩＰＡで注意深く洗浄した後、次の脱保護工程に進める。

場合により、ＳＰＰＳ反応の進行は、有効なＦｍｏｃ除去、カップリング、及び／又はキャッピング工程を確実にするために、インプロセス制御を使用してモニタリングされ得る。一方でＦｍｏｃ測定を行い、他方で遊離アミンを測定することにより、相補的な情報が生じ得る。総合すれば、これらの方法は、ＳＰＰＳプロセスの各工程の効率的なモニタリングを可能にし得る。本発明の状況で使用可能な一般的なモニタリング法のいくつかを以下に例示する。

場合により、樹脂結合ペプチドから切断されたＦｍｏｃの量は、例えば光度定量により、またはＨＰＬＣ分析を適用することにより容易に定量され得る。

樹脂から流出されたＦｍｏｃ切断試薬を集めて、その中のＦｍｏｃ濃度を、例えば３０１ｎｍでの吸光度を測定することにより決定し得る。切断されたＦｍｏｃの量に基づいて、樹脂負荷、すなわち樹脂上のＦｍｏｃペプチドの元の量が計算され得る。さらに、Ｆｍｏｃ除去の完全性を評価するために、Ｆｍｏｃが脱保護されたと推定される樹脂の少量サンプルを、この処理により除去された残留Ｆｍｏｃの量を決定するために、追加の厳しいＦｍｏｃ切断プロトコルにかけ得る。別の方法では、樹脂サンプルからのペプチドの小スケール試験切断を、Ｆｍｏｃ除去の完全性を評価するためにおこなってもよい。得られたペプチドは、標準的グラジエントを使用する分析用ＲＰ－ＨＰＬＣにより分析され得、この場合、Ｆｍｏｃ保護及び遊離ペプチド配列は、通常十分に分離される。さらに又はあるいは、ペプチドサンプルは、質量分光法により、例えばＬＣ－ＭＳ又はＭＡＬＤＩ－ＭＳにより分析され得る。薄層クロマトグラフィーも同様に、微量のＦｍｏｃペプチドの検出を可能にし得る。

樹脂上の遊離アミンの量は、比色Ｋａｉｓｅｒ法（すなわち、ニンヒドリン）、ＴＮＢＳ、クロラニル、及びブロモフェノールブルー試験を含む様々なアッセイにより評価され得る。これは当業者に周知である。

ＳＰＰＳによるグルカゴンペプチドの合成が完了したとき、それはなお樹脂に結合されている。したがって、固相に結合しており、少なくとも部分的に側鎖が保護されている。グルカゴンペプチドを得るために、樹脂から切断されることが必要である。したがって、本発明の一局面は、グルカゴンペプチドの製造のための方法を提供することであり、該方法は、上記の固相結合グルカゴンペプチドを固相から切断すること、及び好ましくは、グルカゴンペプチドから保護基を除去することを含む。これは、例えば、固相からのグルカゴンペプチドの切断の工程（ｉｉ）又は工程（ａ－ｉｉ）に代表される。

最も好ましくは、この工程の間に、側鎖保護基の大部分又は全てもグルカゴンペプチドから付随して切断され、すなわち、ペプチドは脱保護される。

したがって、好ましくは、例えば工程（ａ－ｉｉ）における脱保護及び樹脂からの切断は、ＴＦＡ及び１つ又はそれ以上のスカベンジャーを含む切断組成物とのインキュベーションに付随して行われる。

本出願の文脈において、用語「スカベンジャー」は、ＳＰＰＳ後の樹脂からのペプチドの切断の間、及び／又は保護基の除去の間の副反応を抑制するために反応混合物に添加される化合物を指すために使用される。切断組成物において使用される典型的なスカベンジャーは、「チオールスカベンジャー」（例えば、ＥＤＴ、ＤＴＥ、ＤＴＴ、及びベータ－メルカプトエタノール）及び「シランスカベンジャー」（例えば、ＴＥＳ及びＴＩＰＳ）である。さらなる一般的に使用されるスカベンジャーは、エチルメチルスルフィド、チオアニソール、アニソール、ｍ－若しくはｐ－クレゾール、２－Ｍｅ－インドール、Ａｃ－Ｔｒｐ－ＯＭｅ、又はトリプタミンを含む。当業者は、使用可能な多様なスカベンジャーを十分知っている。

樹脂からペプチドを切断するため、及び好ましくはグルカゴンペプチドから保護基を除去するために、この目的に適したいずれかの組成物が使用され得る。好ましくは、切断及び脱保護は、５０％（体積／体積）より多いＴＦＡ、より好ましくは７５％（体積／体積）より多いＴＦＡ、特に少なくとも８０％（体積／体積）又は少なくとも９０％（体積／体積）ものＴＦＡを含む組成物を用いて行われる。組成物はまた、１つ又はそれ以上のスカベンジャーを含んでいてもよい。組成物は水を含んでいてもよい。好ましくは、組成物は、ＴＦＡ、水及び１つ又はそれ以上のスカベンジャーを含む。特に有利なスカベンジャーは、ＥＤＴのようなチオールスカベンジャー及び／又は例えば、ＴＩＰＳのようなシランスカベンジャーである。切断組成物は、少なくとも８０％のＴＦＡ、好ましくは少なくとも９０％のＴＦＡ、及びＥＤＴを含み得る。切断組成物は、少なくとも８０％のＴＦＡ、好ましくは少なくとも９０％のＴＦＡ、水、及びＥＤＴを含み得る。切断組成物は、少なくとも８０％のＴＦＡ、好ましくは少なくとも９０％のＴＦＡ、水、及びＴＩＰＳを含み得る。切断組成物は、少なくとも８０％のＴＦＡ、好ましくは少なくとも９０％のＴＦＡ、水、ＴＩＰＳ及びＥＤＴを含み得る。例示的に、本発明の状況における使用のための組成物は、ＴＦＡ／水／ＴＩＰＳ（９０：５：５）体積／体積／体積、ＴＦＡ／水／ＴＩＰＳ（９５：２：３）体積／体積／体積、ＴＦＡ／水／フェノール（９０：５：５）体積／体積／体積、ＴＦＡ／ｍ－クレゾール（９５：５）体積／体積、ＴＦＡ／ｍ－クレゾール（９２：８）体積／体積、ＴＦＡ／水／ＥＤＴ（９０：５：５）体積／体積／体積、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＴＥ／水（８８／２／５／５）体積／体積／質量／質量；ＴＦＡ／水／ＤＴＥ（９０／４／６）体積／体積／質量；ＴＦＡ／水／ＥＤＴ／ＴＩＰＳ（９０：５：２．５：２．５）体積／体積／体積／体積、ＴＦＡ／水／ＥＤＴ／ＴＩＰＳ（９０：４：３：３）体積／体積／体積／体積、ＴＦＡ／水／ＥＤＴ（９２：４：４）体積／体積／体積、ＴＦＡ／水／ＥＤＴ（８５：５：１０）体積／体積／体積、ＴＦＡ／チオアニソール／アニソール／ＥＤＴ（９０：５：３：２）体積／体積／体積／体積、及びＴＦＡ／チオアニソール／水／フェノール／ＥＤＴ（８２．５：５：５：５：２．５）体積／体積／体積／体積／体積からなる群より選択され得る。

当業者は、目的のグルカゴンペプチドのアミノ酸組成に依存して本発明の状況における使用のための組成物を日常的に最適化し、そしてとりわけ、ＤＴＥ、ＥＤＴ、ＴＥＳ、ＴＩＰＳ、２－メルカプトエタノール、ジメチルスルフィド、エチルメチルスルフィド、ｍ－若しくはｐ－クレゾール、２－Ｍｅ－インドール、Ａｃ－Ｔｒｐ－ＯＭｅ、フェノール、又はトリプタミンのような１つ又はそれ以上のスカベンジャーの任意の使用を想定するだろう。

グルカゴンペプチドを樹脂から切断し、そして好ましくはグルカゴンペプチドから保護基を除去する工程、例えば工程（ａ－ｉｉ）は、この目的のために適したいずれかの条件で行われ得る。切断は好ましくは、洗浄した樹脂を切断組成物とともに約１～４時間かつ／又は０～３２℃の温度でインキュベートすることにより（好ましくは不活性ガス下で）行われる。例として、切断は、洗浄した樹脂を切断組成物とともに１時間まで、１．５時間まで、２時間まで、２．５時間まで、３時間まで、３．５時間まで、若しくは４時間まで、又は４時間より長く、約０～４℃、４～１０℃、１０～１５℃、１５～２５℃、又は２５～３５℃の温度でインキュベートすることにより（好ましくは不活性ガス下で）行われ得る。例として、切断は、洗浄した樹脂を切断組成物とともに１時間まで、１．５時間まで、２時間まで、２．５時間まで、３時間まで、３．５時間まで、若しくは４時間まで、又は４時間より長く、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、又は３２℃の温度でインキュベートすることにより（好ましくは不活性ガス下で）行われ得る。

ヨウ化物塩（例えば、ヨウ化アンモニウム）、ジメチルスルフィド、１，４－ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリメチルシリルブロミド、及びアスコルビン酸からなる群より選択される１つ又はそれ以上薬剤を、樹脂を含む懸濁液に加えることが推奨され得る。これは、例えばペプチド樹脂及び切断組成物のインキュベーションの開始時に、又はペプチド樹脂を切断組成物とともに一定時間インキュベートした後に行われ得る。いずれの理論にも拘束されることを望まないが、これはメチオニン側鎖のＳ－メチルチオエーテル基の酸化を回避し、かつ／又は戻すと考えられている。

次いで、例えば工程（ａ－ｉｉ）において、樹脂からペプチドを切断し、そして好ましくは、グルカゴンペプチドから保護基を除去することにより得られた溶液Ｓから、通常は濾過により樹脂を分離する。この溶液Ｓは、グルカゴンペプチド及び切断に使用された試薬（例えば、ＴＦＡ、水、スカベンジャー、還元剤、及びペプチドから切断された保護基の残基）を含む。

場合により、濾過の後に、例えば濃ＴＦＡ又は濃ＴＦＡとスカベンジャーとを用いて樹脂をリンスする。場合により、さらなるリンス溶液も、溶液Ｓの一部を形成し得、すなわち、それらは樹脂からペプチドの切断後に直接得られた溶液とともにプールされ得る。

当業者には当然のことながら、溶液Ｓからグルカゴンペプチドを単離し、それにより粗製ペプチド（典型的にはＴＦＡ塩として存在する）を得ることが望ましい。これは、好ましくは貧溶媒（ａｎｔｉ－ｓｏｌｖｅｎｔ）を用いるグルカゴンペプチドの沈殿により行われる。好ましい貧溶媒は、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル（ＩＰＥ）、メチルｔｅｒｔ．ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、及びＩＰＥとアセトニトリルとの混合物を含む。好ましい実施態様において、ＩＰＥが使用される。好ましくは、溶液Ｓ対貧溶媒の体積比は、１：５～１：１５の範囲、例えば１：５、１：８、１：１０、１：１２、又は１：１５である。換言すると：溶液Ｓの１体積は、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５体積に相当する量の貧溶媒と混合され得る。

溶液Ｓからグルカゴンペプチドを沈殿させる工程（工程（ａ－ｉｉｉ））は、この目的のために適したいずれかの温度及びいずれかの時間間隔で行われ得る。例として、グルカゴンペプチドの沈殿（工程（ａ－ｉｉｉ））は、約－５℃～１０℃の範囲、好ましくは約０℃～１０℃の範囲の温度で行われる。適切な温度範囲は、約－５～０℃、－２．５～２．５℃、０～５℃、２．５～７．５℃、又は５～１０℃であり得る。例として、沈殿は約３０～３６０分、例えば約３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３３０、又は３６０分の時間間隔の間行われる。樹脂からのペプチドの切断、及び好ましくはグルカゴンペプチドからの保護基の除去により得られた（例えば工程（ａ－ｉｉ）において）溶液Ｓ及び貧溶媒は、当該分野で公知のいずれかの方法によりいずれかの順序で混合され得る。例えば、貧溶媒は溶液Ｓに加えられ得る。これは、それを一度に加えることにより、又はそれを滴下することにより、かつ／又はゆっくりと流すことにより達成され得る。あるいは、溶液Ｓが貧溶媒に加えられてもよい。これは、それを一度に加えることにより、又はそれを滴下することにより、かつ／又はゆっくりと流すことにより達成され得る。当業者は、このような沈殿工程を行う方法を十分に分かっている。

次いでグルカゴンペプチドを含む沈殿物が貧溶媒中の懸濁液として形成され、ここでこの懸濁液は、切断組成物の試薬（例えば、ＴＦＡ、水、及びスカベンジャー）、さらにはペプチドから切断された保護基の残基をさらに含む。

次いで、グルカゴンペプチドを含む（又は本質的にグルカゴンペプチドからなる）沈殿物を、当該分野においてこのような目的のために知られているいずれかの手段により粗製懸濁液から単離し得る。

濾過は、例えば、デッドエンド濾過又はクロスフロー濾過のような当該分野で公知のいずれの濾過方法であってもよい。本明細書で使用される用語「クロスフロー（ｃｒｏｓｓ－ｆｌｏｗ）濾過」、「クロスフロー（ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ）濾過」、「タンジェンシャルフロー濾過」又は「タンジェンシャル濾過」は、交換可能に理解され得る。フィルターは、例えば、プラスチック（例えば、ナイロン、ポリスチレン）、金属、合金、ガラス、セラミック、セロファン、セルロース、又は複合材料のような、当該分野で濾過の状況において知られるいずれの材料製のものでもよい。フィルターの表面は、中性でも、正に荷電していても負に荷電していてもよい。

遠心分離は、懸濁された沈殿物の沈降が加速されるいずれかの手段としてもっとも広い意味で理解され得る。例として、１００ ｘ ｇまで、少なくとも１００ ｘ ｇ、少なくとも１，０００ ｘ ｇ、少なくとも２，５００ ｘ ｇ、少なくとも５，０００ ｘ ｇ、少なくとも７，５００ ｘ ｇ、少なくとも１０，０００ ｘ ｇ、少なくとも１５，０００ ｘ ｇ、少なくとも２５，０００ ｘ ｇ、又は少なくとも少なくとも５０，０００ ｘ ｇの遠心力が使用され得る。遠心分離を用いて、粗製グルカゴンペプチドを含む（又は（本質的に）粗製グルカゴンペプチドからなる）ケーキが形成される。場合により、ケーキを貧溶媒に再懸濁してもよく、この貧溶媒は上で言及した貧溶媒と同じでも異なるものであってもよい。場合により、遠心分離及びペレットの貧溶媒中の再懸濁は、繰り返し数回行われ得、これにより粗製グルカゴンペプチドの純度をさらに増加し得る。

粗製ペプチド沈殿物は、乾燥状態でグルカゴンペプチドを少なくとも３０％（質量／質量）、好ましくは少なくとも４０％（質量／質量）、より好ましくは少なくとも５０％（質量／質量）、より好ましくは少なくとも６０％（質量／質量）、より好ましくは少なくとも７０％（質量／質量）、なおより好ましくは少なくとも８０％（質量／質量）、なおより好ましくは少なくとも９０％（質量／質量）、特に少なくとも９５％（質量／質量）又は１００％（質量／質量）含み得る。典型的には、粗製ペプチド沈殿物は、乾燥状態でグルカゴンペプチドを４０～７０％（質量／質量）含む。

好ましくは、本発明の方法により得られた粗製ペプチドは、組成物Ｃを得るために１つ又はそれ以上の予備加工工程によりさらなる精製にかけられ得る。

一般的に言えば、樹脂からのいずれかのペプチドのＴＦＡ切断は、カルバメート及びＴＦＡエステルのような副生成物の形成を生じ得る。したがって、粗製ペプチドを脱炭酸反応及び／又はエステル加水分解にかけることは有利であり得る。これは、例として、粗製ペプチドに、例えば少なくとも７．２、少なくとも８．０、少なくとも８．５、少なくとも９、少なくとも９．５、少なくとも１０、少なくとも１０．５、少なくとも１１、又は少なくとも１１．５の高ｐＨ処理を施すことにより達成され得る。あるいは又はさらに、脱炭酸反応は、例えば、６．０～７．０のｐＨ、５．５～６．５のｐＨ、５．０～６．０のｐＨ、４．０～５．０のｐＨ、３．０～４．０のｐＨ、又はｐＨ若しくは２．０～３．０のような穏やかな酸条件で行われ得る。場合により、該処理は、例えば、２５～７０℃、例えば２５、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、又は７０℃の温度での熱処理を伴い得る。処理時間は、２分と１２０分との間で変化し得る、例えば２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、又は１２０分。

特定の場合に依存して、ＴＦＡ切断の生成物を、以下の工程の１つ又はそれ以上を含むプロトコルにかけることは有利であり得る：ｐＨ２．０～３．０、５５℃で約３０分インキュベーション；ｐＨ７～７，５、４０℃で約４０分インキュベーション；４５℃、ｐＨ２．０～４．０で約６０分インキュベーション；５０℃、ｐＨ２．０～４．０で約９０分インキュベーション；３０℃ｐＨ５．４～６．６で約７０分インキュベーション；４５℃、ｐＨ６．６～７．４で約９０分インキュベーション；アルカリｐＨ（例えば、少なくとも１０．２のｐＨ）、４５～２５℃で１０分インキュベーション；ｐＨ１０．４、３５℃で１０分インキュベーション；３０～４０℃、ｐＨ．１１．０で２分インキュベーション、２５℃、ｐＨ１１．８で５分インキュベーション。脱炭酸及び／又はＴＦＡエステル切断のために、希釈した酸、例えば塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、又は希釈した塩基、例えばＮａＯＨ水溶液、アンモニア、ホスフェート、ＴＥＡＰ中に粗製ペプチド沈殿物を溶解することは有利であり得る。当業者は、適切な条件を日常的に選択するだろう。この段落の教示は、グルカゴン様ペプチド並びにそれらのアナログ及び誘導体の製造に、例えばＧＬＰ－１アナログ及びＧＬＰ－２アナログの製造に同様に適用可能であることに留意すべきである。

したがって、本発明の実施態様において、工程ａ）、すなわち、グルカゴンペプチド及び少なくとも１つの不要な成分を含む液体組成物Ｃを供給する工程は、グルカゴンペプチドを脱炭酸及び／又はエステル加水分解反応にかけることを含む。

本発明の別の実施態様において、工程ａ）は、グルカゴンペプチドを含むサンプルを、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）精製にかけることを含み、ここで炭化水素結合シリカが固定相として使用され、トリフルオロ酢酸及びアセトニトリルを含む水性移動相が使用され、そして溶出は、グルカゴンペプチドを含有するフラクションを集める間、移動相内のアセトニトリル濃度を徐々に増加させることにより達成される。

このような予備精製工程は、好ましくは０．１％（体積／体積）ＴＦＡ水溶液を含む緩衝液Ａ及び０．１％ＴＦＡ水溶液中の６０％（体積／体積）アセトニトリルを含む緩衝液Ｂを使用したＲＰ－ＨＰＬＣを含み得る。一実施態様において、溶出はアセトニトリル濃度１２％（体積／体積）から６０％（体積／体積）へのグラジエントにより達成される。一実施態様において、Ｃ１８固定相が使用される。一実施態様において、移動相は０．５～０．２％ＴＦＡを含み、そして溶出は１２％（体積／体積）アセトニトリルから６０％（体積／体積）アセトニトリルの線形グラジエントにより達成される。

工程ａ）において場合により使用され得る精製及び分離のためのさらなる手段は、例えば、１つ若しくはそれ以上の電気泳動法（例えば、ゲル電気泳動又はキャピラリー（ＣＥ）電気泳動）、１つ若しくはそれ以上のさらなる沈殿ベースの方法（例えば、塩溶（ｓａｌｔｉｎｇ ｉｎ）又は塩析）、１つ若しくはそれ以上の透析（ｄｉａｌｙｔｉｃａｌ）方法（透析）、及び／又は１つ若しくはそれ以上のクロマトグラフィー法（例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、フラッシュクロマトグラフィー（ｆｌａｓｈ）、ラピッドレフルイド（Ｒａｐｉｄ Ｒｅｆｌｕｉｄ）液体クロマトグラフィー（ＲＲＬＣ）、高速分離液体クロマトグラフィー（ＲＳＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＦＬＣ）、逆相ＵＦＬＣ（ＲＰ－ＵＦＬＣ）、超高パフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）又は逆相ＵＰＬＣ（ＲＰ－ＵＰＬＣ）、向流クロマトグラフィー、連続クロマトグラフィー）を含む。

本発明の一実施態様において、工程ａ）は：
（ａ－ｉ） 適切に保護されたアミノ酸誘導体又はジペプチド誘導体を使用してグルカゴンペプチドのＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成を行うことにより、少なくともＧｌｕ、Ａｓｐ、及びＬｙｓの側鎖は保護基を有する、固相に結合されたグルカゴンペプチドを供給する工程、
［ここで該保護されたアミノ酸誘導体又はジペプチド誘導体は：
（Ａ） （ベンゾトリアゾリル）テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）；
（Ｂ） ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びシアノ－ヒドロキシイミノ－酢酸エチルエステル（Ｏｘｙｍａ）；
（Ｃ） ３－（ジエトキシ－ホスホリルオキシ）－３Ｈ－ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアジン－４－オン（ＤＥＰＢＴ）及びＤＩＰＥＡ；並びに
（Ｄ） ＤＩＣ及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）
からなる群より独立して各工程について選択される試薬を含む１つ又はそれ以上のカップリング試薬混合物を用いて活性化され、
さらにここで、Ｎ末端ヒスチジン部分は、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、及びＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨからなる群より選択されるアミノ酸誘導体を使用して、固相に結合されたグルカゴンペプチド中に導入され、
場合により、さらにここで少なくとも２つの擬プロリンジペプチドが使用される］；
ａ－ｉｉ） 少なくとも５０％ＴＦＡ及び１つ若しくはそれ以上のスカベンジャーを含む切断組成物を用いてインキュベーションすることにより、［かつ／又はここで、ヨウ化物塩、硫化ジメチル、１，４－ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、臭化トリメチルシリル、及びアスコルビン酸からなる群より選択される１つ若しくはそれ以上の薬剤が、切断後のペプチド溶液に添加される］、固相からグルカゴンペプチドを切断する（そしてグルカゴンペプチドから保護基を除去する）工程；並びに
ａ－ｉｉｉ） ペプチドを得られた溶液から沈殿により単離する工程
を含む。

本発明の別の実施態様において、工程ａ）は、上記工程ａ－ｉ）～ａ－ｉｉｉ）そしてさらに、工程ａ－ｉｉｉ）において得られたペプチド沈殿物を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）精製にかける工程ａ－ｉｖ）を含み、ここで炭化水素結合シリカが固定相として使用され、トリフルオロ酢酸及びアセトニトリルを含む水性移動相が使用され、そして溶出は、グルカゴンペプチドを含有するフラクションを集める間に、移動相内のアセトニトリル濃度を徐々に増加させることにより達成される。一実施態様において、工程ａ－ｉｖ）は、０．１％（体積／体積）ＴＦＡ水溶液を含む緩衝液Ａ及び０．１％（体積／体積）ＴＦＡ水溶液中６０％アセトニトリルを含む緩衝液Ｂを使用するＲＰ－ＨＰＬＣ精製を含む。

一実施態様において、溶出は、１２％（体積／体積）から６０％（体積／体積）までのアセトニトリル濃度のグラジエントにより達成される。一実施態様において、Ｃ１８固定相は工程ａ－ｉｖ）において使用される。いくつかの実施態様において、上記移動相は、例えば、１２０Å細孔径及び１５～３０マイクロメートル粒径を有するＣ８固定相とともに使用される。いくつかの代替の実施態様において、上記移動相は、例えば細孔径１２０Å及び粒径１５～３０マイクロメートルを有するＣ１８固定相とともに使用される。

より好ましくは、組成物Ｃ中に含有されるグルカゴンの総量は上記方法により得られる。

本発明の好ましい実施態様において、精製方法の工程ａ）は、乾燥した粗製グルカゴンペプチド沈殿物を得ること、そして該乾燥沈殿物を溶解して、グルカゴン及び少なくとも１つの不要な成分を含む液体組成物Ｃを得ることを含む。例えば、液体組成物Ｃは、希釈酢酸中に約２と約４との間のｐＨで粗製グルカゴンペプチドを含み得る。

本発明の文脈において、用語「精製された」は、特定の精製工程、例えば分取様クロマトグラフィーにかけられたペプチドを指定するために使用される。このような組成物は、高度に又は部分的に精製され得る。

別の指示がなければ、ペプチド純度は、本明細書において「ＨＰＬＣ純度」として、すなわち、分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）において２０５と２３０ｎｍとの間の波長で、すなわちペプチド結合の吸収極大でＵＶ検出を用いて観察された相対ピーク面積として示される。換言すると、この値は、２０５と２３０ｎｍとの間の波長でのＵＶ検出を用いた分析用ＲＰ－ＨＰＬＣにより得られたクロマトグラムにおいて観察された全てのピークの面積の合計で所定のピーク面積を割った面積％として決定される。この測定は分野において一般的な行為であり、当業者は、生成物に特定のＲＰ－ＨＰＬＣプロトコルを日常的に考案し、そして米国薬局方に示される確立されたガイドラインに従って定量を行うだろう。ペプチド性混入物の検出のためのＲＰ－ＨＰＬＣプロトコルの適性は、ＬＣ－ＭＳによりピーク純度を決定することにより日常的に評価される。

それらの類似した構造に起因して、全てのペプチド性成分は同じ吸収を有するという仮定の下に、ＲＰ－ＨＰＬＣ純度は質量パーセンテージ［％（質量／質量）］として表される純度の代理として使用され得る。

同様に、ペプチドの相対含有量（求められる成分でも不要な成分でも）は、分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）において２０５と２３０ｎｍとの間の波長で、すなわちペプチド結合の吸収極大でのＵＶ検出を用いて観察された相対的ピーク面積として決定され得る。換言すると、この値は、２０５と２３０ｎｍとの間の波長でのＵＶ検出を用いて、上記の適切なプロトコルを使用した分析用ＲＰ－ＨＰＬＣにより得られたクロマトグラムにおいて観察された全てのピークの面積の合計で所定のピーク面積を割った面積％として決定される。

当業者は、クロマトグラフィー精製のためのサンプルを準備する方法を十分に認識する。例えば、乾燥した粗製グルカゴン調製物は、必要に応じて温度及びｐＨを調整しながら穏やかに撹拌することにより水相に溶解され得る。さらなる例として、サンプルは、不活性ガス下に維持されても、又は超音波処理にかけられてもよく、脱炭酸反応にかけられてもよく、ＴＦＡエステル加水分解にかけられても、かつ／又は濾過若しくは遠心分離により非液体成分から分離されてもよい。サンプル濃度は、とりわけ乾燥、凍結乾燥、溶媒の部分的エバポレーション、若しくは限外濾過により、かつ／又は場合によって、サンプルローディング緩衝液中にペプチド調製物を溶解若しくは希釈することにより調整され得る。

逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）は周知であり、そしてペプチドの精製及びペプチドサンプルの分析のために、すなわち製造だけでなく分析の目的にも広く使用されている。この技術は、サンプルの様々な成分と疎水性固定相との間の疎水性会合に基づき、この会合は、移動相中に含まれる化学物質、例えば溶媒により破壊される。サンプルの成分の分別溶出は、通常は移動相内の化学物質、例えば溶媒の濃度を徐々に増加させることにより達成される。

実施の観点から、このグラジエントは、通常は移動相を構成する第一及び第二の溶出緩衝液の比率を変えることにより得られる：
第一の緩衝液（慣例により緩衝液Ａと呼ばれる）は、適切な水性緩衝液中に少量の溶媒を含み、一方第二の緩衝液（慣例により緩衝液Ｂと呼ばれる）は、上記水性緩衝液中に多量の溶媒を含む。それ故、移動相中の緩衝液Ｂの比率を増加させることにより、より疎水性の成分が固定相から溶出され得る。

本明細書で使用される用語ＨＰＬＣは、超高パフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ、ＵＰＬＣとも指定される）も含む。１つの好ましい実施態様において、ＨＰＬＣはＵＨＰＬＣである。より好ましくは、ＵＨＰＬＣは逆相ＵＨＰＬＣであり、したがってＲＰ－ＵＨＰＬＣとも指定される。したがって、特に好ましい実施態様において、ＨＰＬＣはＲＰ－ＵＨＰＬＣである。

本出願の文脈において、表現「炭化水素結合シリカ」は、それらの表面において炭化水素部分と化学的に結合された多孔性シリカ粒子又はシリカゲルから製造された固体クロマトグラフィー相を指す。化学結合の種類さらには結合した炭化水素部分の化学的性質は変わり得るということが理解される。例えば、本出願とともに使用するための固定相は、４～１８個、好ましくは８～１８個の炭素原子の化学的に結合された炭化水素部分を有する多孔性シリカ粒子から製造されたものであり得る。このような炭化水素部分は、好ましくは線状アルキル鎖である。炭化水素結合シリカの好ましい種類は、４（Ｃ４）、６（Ｃ６）、８（Ｃ８）、１０（Ｃ１０）、１２（Ｃ１２）、１４（Ｃ１４）、１６（Ｃ１６）、又は１８（Ｃ１８）個の炭素原子を有する炭化水素部分を有する。特に好ましい種類の炭化水素結合シリカは、４（Ｃ４）、８（Ｃ８）、１２（Ｃ１２）又は１８（Ｃ１８）個の炭素原子の非分岐アルキル鎖、すなわち、ブチル、オクチル、ドデシル、又はオクタデシル部分を有する。Ｃ８結合シリカ、特にｎ－オクチル結合シリカ、及び／又はＣ１８結合シリカ、特にｎ－オクタデシル結合シリカは、本発明に従う方法の工程ｂ）、ｃ）、及び場合によりｄ）における使用のためになおより好ましい固定相である。工程ｂ）及びｃ）において使用される固定相は、工程の各々において同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、固定相は同じである。特に好ましくは、Ｃ１８結合シリカは、工程ｂ）及び／若しくは工程ｃ）において固定相として使用され、かつ／又はここで同じ固定相が工程ｂ）及びｃ）において使用され、好ましくはここで同一のカラムが工程ｂ）及びｃ）に使用される。工程ｂ）及びｃ）において単一の固定相（すなわち、単一のカラム）を使用するこの選択肢は、特に費用効率の良い手順を可能にする。

本出願の文脈において、表現「Ｃ８結合シリカ」は、それらの表面に化学的に結合されたＣ８炭化水素部分、好ましくは線状オクチル、すなわちｎ－オクチル部分を有する多孔性シリカ粒子又はシリカゲルから製造された固定クロマトグラフィー相を指定するために使用される。さらに、表現「Ｃ１２結合シリカ」は、それらの表面に化学的に結合されたＣ１２炭化水素部分、好ましくは線状ドデシル、すなわちｎ－ドデシル部分を有する多孔性シリカ粒子又はシリカゲルから製造された固定クロマトグラフィー相を指定するために使用される。同様に、用語「Ｃ１８結合シリカ」又は「ＯＤＳ」は、本明細書において、それらの表面に化学的に結合されたＣ１８炭化水素部分、好ましくは線状オクタデシル、すなわちｎ－オクタデシル部分を有する多孔性シリカ粒子又はシリカゲルから製造された固定クロマトグラフィー相を指すために交換可能に使用される。

広範囲の炭化水素結合シリカ材料が市販されている。本発明において使用することのできる固定相の例は、それぞれ、Ｄａｉｓｏにより製造されるＤａｉｓｏｇｅｌ^ＴＭ Ｃ１８ ＯＤＳ、Ｄａｉｓｏ ＯＤＳ－Ｂｉｏ、Ｄａｉｓｏ－ＯＤＳ－Ａ－ＨＧ Ｃ１８、Ｄａｉｓｏｇｅｌ^ＴＭ Ｃ８－Ｂｉｏ、ＹＭＣ ＯＤＳ－Ａ、ＹＭＣ Ｔｒｉａｒｔ Ｃ８－Ｌ、Ｌｕｎａ Ｃ８、Ｌｕｎａ Ｃ１８、Ｋｒｏｍａｓｉｌ^ＴＭ Ｃ１８、及びＫｒｏｍａｓｉｌ^ＴＭ Ｃ８、ＹＭＣ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、及びＡｋｚｏＮｏｂｅｌである。

シリカ粒子は、直径２～２００マイクロメートル、好ましくは２．５～２０マイクロメートル、好ましくは５～１５マイクロメートル、そして最も好ましくは１０マイクロメートルのものであり得、そして５０～１０００Å、好ましくは８０～４００Å、好ましくは１００～３００Å、最も好ましくは（約）１００Åの細孔径を有し得る。

不純物を除去するために実行の間に適切な溶液で固定相を洗い流すことは良い慣行であり、これら不純物はなおカラムに結合しており、そしてその後のペプチドバッチの品質を低下させ得る。さまざまなこのような清浄プロトコルがこの目的のために記載されており、これらとしては、ＮａＯＨ又はギ酸の水溶液を用いたフラッシングが挙げられる（例えば、ＷＯ ２００４／０８９５０４を参照のこと）。本発明者らは、カラムローディングの前にアセトニトリルを含むＴＦＡの水溶液で固定相をリンスすることが、凝集を低減するという点で精製されたグルカゴンペプチドの品質のために有益であるということを見出した。水溶液中にＴＦＡ、及びアセトニトリルを２０％より多く、例えば３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％（体積／体積）含む混合物が特に適している。ＴＦＡの濃度は好ましくは、０．０５％（体積／体積）～１．０％（体積／体積）の範囲から選択される。例えば、この混合物は、５０％より多くのＡＣＮ及び０．０５～１．０％ＴＦＡを含み得る。

例の混合物としては、限定されないが、以下が挙げられる：水中１％（体積／体積）ＴＦＡ及び２５％ＡＣＮ；水中１％（体積／体積）ＴＦＡ及び３０％ＡＣＮ；水中１％（体積／体積）ＴＦＡ及び５０％ＡＣＮ；水中１％（体積／体積）ＴＦＡ及び７０％ＡＣＮ；水中１％（体積／体積）ＴＦＡ及び９０％ＡＣＮ；水中０．５％（体積／体積）ＴＦＡ及び２５％ＡＣＮ；水中０．５％（体積／体積）ＴＦＡ及び４０％ＡＣＮ；水中０．５％（体積／体積）ＴＦＡ及び５０％ＡＣＮ；水中０．５％（体積／体積）ＴＦＡ及び６０％ＡＣＮ；水中０．５％（体積／体積）ＴＦＡ及び７０％ＡＣＮ；水中０．５％（体積／体積）ＴＦＡ及び８０％ＡＣＮ；水中０．１％（体積／体積）ＴＦＡ及び２５％ＡＣＮ；水中０．１％（体積／体積）ＴＦＡ及び４０％ＡＣＮ；水中０．１％（体積／体積）ＴＦＡ及び５０％ＡＣＮ；水中０．１％（体積／体積）ＴＦＡ及び６０％ＡＣＮ；水中０．１％（体積／体積）ＴＦＡ及び７０％ＡＣＮ；水中０．１％（体積／体積）ＴＦＡ及び８０％ＡＣＮ；水中０．１％（体積／体積）ＴＦＡ及び９０％ＡＣＮ；水中０．０５％（体積／体積）ＴＦＡ及び４０％ＡＣＮ；水中０．０５％（体積／体積）ＴＦＡ及び５０％ＡＣＮ；水中０．０５％（体積／体積）ＴＦＡ及び６０％ＡＣＮ；水中０．０５％（体積／体積）ＴＦＡ及び７０％ＡＣＮ；水中０．０５％（体積／体積）ＴＦＡ及び８０％ＡＣＮ。したがって、本発明に従う方法は、液体組成物Ｃをロードする前に、かつ／又は工程ｂ）において得られたプールされたグルカゴンペプチド含有フラクションをロードする前に、ＴＦＡ及びアセトニトリルを含む水溶液で固定相をリンスする工程を含み得る。

本発明のこの局面は、他のペプチドの精製に、特にグルカゴン様ペプチドの精製に、例えばエキセナチド、リキシセナチド、リラグルチド、セマグルチド、テデュグルチドなどのようなＧＬＰ－１及びＧＬＰ－２のアナログ及び誘導体に、同様に適用可能である。

したがって、本発明の一局面は、クロマトグラフィー固定相を再生するための方法に関し、ここで該クロマトグラフィー固定相は、ペプチド含有サンプルのクロマトグラフィー精製の後に、トリフルオロ酢酸、水、及びアセトニトリルを含む再生溶液と接触される。

本発明の別の局面は、上記方法を使用して再生されたクロマトグラフィー固定相を使用して精製されたペプチドに関する。

本発明のＲＰ－ＨＰＬＣ工程において使用される移動相は、一般的に溶媒として水性成分及びアセトニトリルを含む。有機モディファイアのようなさらなる成分が存在していてもよい。溶出は、通常、溶媒としてのアセトニトリルの濃度を徐々に増加させることにより達成される。

いずれの理論にも縛られることは望まないが、溶媒は、組成物Ｃの成分の固定相への会合と競合すると考えられている。直線速度を維持するために、当業者は、カラム直径に依存して、そして使用される装置及び固定相の仕様を考慮に入れて、移動相の流量を調整するだろう。

本発明に従う方法の工程ｂ）、すなわち、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製スキームの第一の次元（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）は、６．５と７．５との間のｐＨ値で、例えば、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、又は７．５のｐＨ値で、好ましくは６．７と７．２との間のｐＨ値で行われる。ｐＨ値は、移動相の水性成分中の濃リン酸及びトリメチルアミン（ＴＥＡ）の使用により、工程が実行される温度で調整される。好ましくは、ホスフェートアニオンは、５～５０ｍＭの濃度で、例えば約１０、２０、３０、４０、又は５０ｍＭの濃度で存在する。いずれの型のアセトニトリルグラジエントも、固定相からのグルカゴンの溶出に使用され得、グラジエントプロフィールは、この工程において達成可能な精製に影響を及ぼすということが理解される。

好ましい実施態様において、工程ｂ）における溶出は、アセトニトリル含有量を２～４％（体積／体積）アセトニトリルから３０～５０％（体積／体積）アセトニトリルに増加させるグラジエントにより達成される。

別の好ましい実施態様において、工程ｃ）における溶出は、アセトニトリル含有量を２～４％（体積／体積）アセトニトリルから４０～６０％（体積／体積）アセトニトリルに増加させるグラジエントにより達成される。

より好ましい実施態様において、工程ｂ）における溶出は、アセトニトリル含有量を２～４％（体積／体積）アセトニトリルから３０～５０％（体積／体積）アセトニトリルに増加させるグラジエントにより達成され、そして工程ｃ）における溶出は、アセトニトリル含有量を２～４％（体積／体積）アセトニトリルから４０～６０％（体積／体積）アセトニトリルに増加させるグラジエントにより達成される。

したがって、これは当業者により特定の実験設定に日常的に適合されるだろう。好ましい実施態様において、グルカゴンペプチドは、工程ｂ）において３～２０％アセトニトリルから４０～５０％（体積／体積）アセトニトリルへのグラジエントにより、例えば３～４０％（体積／体積）アセトニトリルから、又は７～４３％（体積／体積）アセトニトリルからのグラジエントにより溶出される。線形グラジエントが特に好ましい。

より好ましい実施態様において、工程ｂ）における溶出は３～４０％（体積／体積）アセトニトリルのグラジエントにより達成され、かつ／又はここで工程ｃ）における溶出は、３～５０％（体積／体積）アセトニトリルのグラジエントにより達成される。

本発明に従う方法の工程ｃ）、すなわち、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製スキームの第二の次元は、約２～４範囲から選択されるｐＨ値で優先的に、優先的に約２～３、例えば約２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、又は３．０のｐＨ値で行われる。ｐＨ値は、移動相の水性成分中の０．５～５％（体積／体積）酢酸の存在により決定され得る。好ましい実施態様において、工程ｃ）において使用される移動相内の酢酸濃度は、０．５～５％（体積／体積）の範囲、好ましくは１～３％（体積／体積）の範囲、例えば１、２、又は３％（体積／体積）から選択される。いずれの型のアセトニトリルグラジエントも固定相からのグルカゴンの溶出に使用され得、そしてグラジエントプロフィールは、この工程において達成可能な精製に影響を及ぼすということが理解される。好ましい実施態様において、工程ｃ）におけるグラジエントは３から５０％（体積／体積）アセトニトリルである。３から５０％（体積／体積）アセトニトリルの線形グラジエントが特に好ましい。例えば、３から５０％アセトニトリルの線形グラジエントが使用され得る。

好ましい実施態様において、方法はアニオン交換を行う工程ｄ）をさらに含み、好ましくはここでアセテートはクロリドで置き換えられ、かつ／又はここでアニオン交換は、凍結乾燥、限外濾過、透析、固相抽出、逆相クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーにより達成される。

工程ｄ）は、ペプチド製造の分野において公知のいずれかのアニオン交換方法によって行われ得る。

当業者は、本発明の方法を適切な読み出し技術と日常的に組み合わせるだろう。例えば、クロマトグラフィー工程は、２０５～２３０ｎｍ若しくは２８０ｎｍの波長で溶出液のＵＶを吸光度を追跡することにより、かつ／又は溶出液の伝導度を追跡することによりモニタリングされ得る。さらに、クロマトグラフィーは、質量分析、サイズ排除ＵＨＰＬＣ、イオン交換ＵＨＬＰＣ、及び／若しくは逆相ＵＨＰＬＣ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、並びに／又は細胞ベースの機能的アッセイによりオンライン又はオフラインの分析と組み合わせられ得る。

ペプチドの品質の劣化を避けるために、当業者は、注意深くかつ日常的にサンプル貯蔵を含めて精製工程の条件を最適化するだろう。この目的のために、とりわけフラクションは、プールされ、沈殿し、噴霧乾燥され、凍結乾燥され、凍結され、冷蔵され、希釈され、濃縮され、かつ／又は安定化緩衝液、塩基、酸、若しくは他の物質と混合され得る。感受性の物質を安定化条件下で扱うことは優れた実践である。例えば、例えば、その他の不安定化条件を補うために低温で、例えば４℃～１５℃の範囲で作業をすることは有利かもしれない。さらなる例として、グルカゴン調製物を、好ましくは６．６～７．９の範囲から選択されるｐＨで、好ましくは７．０～７．８、そして最も好ましくは７．０～７．５の範囲から選択されるｐＨで凍結乾燥することは有利かもしれない。別の例として、集める間にすでにフラクションを希釈すること並びに／又は溶出の間に温度及び緩衝液条件を調整することが有利かもしれない。グルカゴンは低温、低濃度、及びわずかに酸性のｐＨでより安定であることが知られている。

本発明の好ましい実施態様において、クロマトグラフィー精製工程ｂ）及び／若しくはｃ）並びに／又は存在する場合工程ａ－ｉｖ）の全て又は一部は、４～２８℃、例えば１５～２８℃、４～２０℃、又は４～１０℃の範囲から選択される温度で行われる。同様に、いずれかの任意のさらなる精製工程、例えば塩交換工程ｄ）の全て又は一部は、４～２８℃、好ましくは４～２０℃、そして最も好ましくは４～１０℃の範囲から選択される温度で行われ得る。

特に好ましい実施態様において、本発明の方法は：
ａ） 場合により２．０～４．０の範囲から選択されるｐＨの酢酸水溶液中に溶解された、グルカゴン及び少なくとも１つの不要な成分を含む液体組成物Ｃを供給する工程；
ｂ） 組成物Ｃを、約７のｐＨで第一の逆相ＨＰＬＣ精製にかける工程、［ここで、炭化水素結合シリカが固定相として使用され、アセトニトリル及び５～５０ｍＭの濃度のリン酸トリエチルアンモニウム緩衝液を含む混合物が移動相として使用され、そして溶出は、グルカゴンペプチド含有フラクションを集める間、移動相内のアセトニトリル濃度を３％から５０％（体積／体積）アセトニトリルまで徐々に増加させることにより達成される］；並びに
ｃ） 工程ｂ）において得られたプールされたグルカゴンペプチド含有フラクションを、第二の逆相ＨＰＬＣ精製にかける工程、［ここで、炭化水素結合シリカが固定相として使用され、０．００５～０．０５％（体積／体積）の濃度の酢酸及びアセトニトリルを含む移動相が使用され、そして溶出は、精製されたグルカゴンペプチドを含有するフラクションを集める間、移動相内のアセトニトリル濃度を３％から５０％に徐々に増加させることにより達成される］；
ｄ） 場合により、工程ｃ）で得られたグルカゴンペプチドをイオン交換工程にかける工程、［ここで、アセテートがクロリドで置き換えられる］
を含み、ここで工程ｂ）及びｃ）並びに、存在する場合は工程ｄ）は、４～２５℃の範囲から選択される温度で行われ；
ここで好ましくは工程ｂ）及びｃ）において使用される固定相はＣ８結合シリカ又はＣ１８結合シリカである］
を含む。

以下の例に示されるように、本発明の方法は、非常に純粋なグルカゴンペプチドの製造を可能にし、そして９９．０％より高い純度を日常的に達成することができる。それにもかかわらず、いくつかの欠失生成物の痕跡が検出され得る。

これらは、特に２６～２８の連続したアミノ酸からなるペプチドの痕跡であり、これらは、それがグルカゴンペプチド骨格の一次配列（例えば配列番号１）から３つまでのアミノ酸を欠いているという点でグルカゴンペプチドの分子構造とは異なる。換言すると、配列番号１のグルカゴンペプチドの欠失変異体は、２６～２８アミノ酸部分の長さのペプチドとして定義され、これは配列番号１の長さ全体にわたって計算して、配列番号１に対して少なくとも８９％の相同性を共有する。

当業者は、このようなグルカゴン欠失変異体が、必ずではないが場合により、Ｎ末端及び／又はＣ末端アミノ酸部分で切断されていてもよいということを即座に理解するだろう。さらに又はあるいは、非末端アミノ酸部分も欠失し得る。上述のように、配列相同性は、本出願の出願日のバージョンのアメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ （Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）により決定された配列相同性として理解され得る。そのため、各アミノ酸部分は、中間の欠失したアミノ酸部分を割愛して、比較しようとする配列中の対応するものと整列され、そして相同パーセンテージが配列番号１の全長にわたって計算される。

行われた実験において、ＲＰ－ＵＨＰＬＣにより２２０ｎｍで測定された相対ピーク面積として決定して（例示する図３を参照のこと）、相対存在量０．５％より多いペプチド性混入物は最終ペプチド生成物において検出されなかった。これはまた、本発明の局面及び好ましい実施態様を反映する。相対ピーク面積を、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣにより２２０ｎｍでのＵＶ検出を用いて得られたクロマトグラムにおいて観察された全てのピークの面積の合計で所定のピーク面積を割った面積％として決定した。これは、ペプチド性混入物の検出に適したいずれかの生成物特異的ＲＰ－ＨＰＬＣプロトコルを使用して行われ得る。分析方法の適性は、ＬＣ－ＭＳにより決定される第一ピーク純度の観点から日常的に評価される。所定の分析用プロトコルの適性を実証するために、スパイク実験が日常的に行われ、ここで検出しようとする混入物がサンプルに人為的に添加される。

それらの類似した構造に起因して、全てのペプチド性成分は、同じか又は少なくとも同等の応答係数を有し、その結果、ＲＰ－ＨＰＬＣにより２２０ｎｍで測定された相対ピーク面積は、全てのペプチド成分の合計質量と比較した質量パーセントで表される所定のペプチドの相対存在量（％（質量／質量）で示される）と十分に相関するということを当業者は即座に理解するだろう。

したがって、本発明のさらなる局面は、本発明のいずれかの実施態様に従う方法から得ることができるグルカゴンペプチドを含む組成物ＧＣに関し、該組成物は、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで２２０ｎｍでのＵＶ検出を用いて観察された相対ピーク面積として決定して９９．０％より高い純度でグルカゴンペプチドを含有し、そして分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで２２０ｎｍでのＵＶ検出を用いて観察された相対ピーク面積として決定して０．５％より多いいずれの単一のグルカゴン誘導体、グルカゴン切断型変異体、グルカゴン切断型変異体の誘導体、グルカゴン欠失変異体も、グルカゴン欠失変異体の誘導体も含有しないことを特徴とする。

好ましくは、組成物ＧＣは、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで２２０ｎｍでのＵＶ検出を用いて観察された相対ピーク面積として決定して、９９．１％より高い、９９．２％より高い、９９．３％より高い、９９．４％より高い、９９．５％より高い、９９．６％より高い、９９．７％より高い、９９．８％より高い、又は９９．９％より高い純度でグルカゴンを含有する。

好ましい実施態様によれば、組成物ＧＣは、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで２２０ｎｍでのＵＶ検出を用いて観察された相対ピーク面積として決定して、０．２５％、０．２０％、０．１５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％よりも多い総濃度の上述のグルカゴン欠失変異体を含有しない。

本発明のさらなる局面は、本発明のいずれかの実施態様に従う方法から得ることができるグルカゴンペプチドを含む組成物ＧＣに関し、該組成物は、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで２２０ｎｍでのＵＶ検出を用いて観察された相対ピーク面積として決定して、９９．０％より高い純度でグルカゴンペプチドを含有し、そして分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで２２０ｎｍでのＵＶ検出を用いて観察された相対ピーク面積として決定して、０．３％より多くのいずれの単一のグルカゴン誘導体、グルカゴン切断型変異体、グルカゴン切断型変異体の誘導体、グルカゴン欠失変異体、又はグルカゴン欠失変異体の誘導体も含有しないことを特徴とする。

本発明のさらなる局面は、本発明のいずれかの実施態様に従う方法から得ることができるグルカゴンペプチドを含む組成物ＧＣに関し、該組成物は、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで２２０ｎｍでのＵＶ検出を用いて観察された相対ピーク面積として決定して、９９．０％より高い純度でグルカゴンペプチドを含有し、そして分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで２２０ｎｍでのＵＶ検出を用いて観察された相対ピーク面積として決定して、検出可能なレベルを含有するが、０．５％より多くのいずれの単一のグルカゴン誘導体、グルカゴン切断型変異体、グルカゴン切断型変異体の誘導体、グルカゴン欠失変異体、又はグルカゴン欠失変異体の誘導体も含有しないことを特徴とする。

したがって、本発明のさらなる局面は、本発明のいずれかの実施態様に従う方法から得ることができるグルカゴンペプチドを含む組成物ＧＣに関し、該組成物は、全てのペプチド成分の合計質量を参照して９９．０％（質量／質量）より高い純度でグルカゴンペプチドを含有し、そして全てのペプチド成分の合計質量を参照して０．５％（質量／質量）より多くのいずれの単一のグルカゴン誘導体、グルカゴン切断型変異体、グルカゴン切断型変異体の誘導体、グルカゴン欠失変異体、又はグルカゴン欠失変異体の誘導体も含まないことを特徴とする。

好ましくは、組成物ＧＣは、全てのペプチド成分の合計質量を参照して、９９．１％（質量／質量）より高い、９９．２％（質量／質量）より高い、９９．３％（質量／質量）より高い、９９．４％（質量／質量）より高い、９９．５％（質量／質量）より高い、９９．６％（質量／質量）より高い、９９．７％（質量／質量）より高い、９９．８％（質量／質量）より高い、又は９９．９％（質量／質量）より高い純度でグルカゴンを含有する。

好ましい実施態様によれば、組成物ＧＣは、全てのペプチド成分の合計質量を参照して、０．２５％（質量／質量）、０．２０％（質量／質量）、０．１５％（質量／質量）、０．１％（質量／質量）、０．０５％（質量／質量）、又は０．０１％（質量／質量）より多い総濃度で上述のグルカゴン欠失変異体を含有しない。

本発明のさらなる局面は、本発明に従う方法から得ることができるグルカゴンペプチドを含む組成物ＧＣに関し、該組成物は９９．０％より高い純度でグルカゴンペプチドを含有し、そして検出可能なレベルであるが、０．５％以下、好ましくは０．３％以下、特に０．２％以下、そして場合により０．１％以下のＴｒｐ（Ｏ）^２５－グルカゴン及び／又はＧｌｕ^２４－グルカゴン、ｄｅｓ－Ｓｅｒ^２－グルカゴン及び／又はｄｅｓ－Ｔｈｒ^５－グルカゴンを含有することを特徴とする。

本発明のさらなる局面は、本発明に従う方法から得られたグルカゴンペプチドを含む組成物ＧＣに関し、該組成物は、９９．０％より高い純度でグルカゴンペプチドを含有し、かつＴｒｐ（Ｏ）^２５－グルカゴン及び／又はＧｌｕ^２４－グルカゴン、及び／又はｄｅｓ－Ｓｅｒ^２－グルカゴン、及び／又はｄｅｓ－Ｔｈｒ^５－グルカゴンを、０．０５～０．５％、好ましくは０．０５～０．３％、特に０．０５～０．２％含有し、そして場合により０．０５～０．１％しか含有しないことを特徴とする。

本発明の一局面は、本発明に従う方法から得られたグルカゴンペプチドを含む組成物ＧＣに関し、該組成物は、９９．０％より高い純度でグルカゴンペプチドを含有し、かつＴｒｐ（Ｏ）^２５－グルカゴンを、０．０５～０．５％、好ましくは０．０５～０．３％、特に０．０５～０．２％含有し、そして場合により０．０５～０．１％しか含有しないことを特徴とする。

本発明の一局面は、本発明に従う方法から得られたグルカゴンペプチドを含む組成物ＧＣに関し、該組成物は、９９．０％より高い純度でグルカゴンペプチドを含有し、かつＧｌｕ^２４－グルカゴンを、０．０５～０．５％、好ましくは０．０５～０．３％、特に０．０５～０．２％含有し、そして場合により０．０５～０．１％しか含有しないことを特徴とする。

本発明の一局面は、本発明に従う方法から得られたグルカゴンペプチドを含む組成物ＧＣに関し、該組成物は、９９．０％より高い純度でグルカゴンペプチドを含有し、かつｄｅｓ－Ｓｅｒ^２－グルカゴンを、０．０５～０．５％、好ましくは０．０５～０．３％、特に０．０５～０．２％含有し、そして場合により０．０５～０．１％しか含有しないことを特徴とする。

本発明の一局面は、本発明に従う方法から得られたグルカゴンペプチドを含む組成物ＧＣに関し、該組成物は、９９．０％より高い純度でグルカゴンペプチドを含有し、かつｄｅｓ－Ｔｈｒ^５－グルカゴンを、０．０５～０．５％、好ましくは０．０５～０．３％、特に０．０５～０．２％含有し、そして場合により０．０５～０．１％しか含有しないことを特徴とする。

好ましくは、上記のパーセンテージは、２２０ｎｍでのＵＶ検出を用いる分析用ＲＰ－ＨＰＬＣにおいて観察された相対ピーク面積として決定される。あるいは、上記パーセンテージは、全てのペプチド成分の合計質量を参照し得る。

本発明の一局面は、本発明に従う方法から得られたグルカゴンペプチドを含む組成物ＧＣに関し、該組成物は、９９．０％より高い純度でグルカゴンペプチドを含有し、かつ検出可能なレベルであるが、０．５％以下、好ましくは０．３％、そして特に好ましくは０．２％以下のＧｌｕ２４－グルカゴン、及び／又はｄｅｓ－Ｓｅｒ２－グルカゴン、及び／又はｄｅｓ－Ｔｈｒ５－グルカゴンを含有することを特徴とし、ここで該濃度は、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで２２０ｎｍでのＵＶ検出を用いて観察された相対ピーク面積として決定される。

本発明の一局面は、本発明に従う方法から得られたグルカゴンペプチドを含む組成物ＧＣに関し、該組成物は、９９．３％より高い純度でグルカゴンペプチドを含有し、かつ検出可能なレベルであるが、０．５％以下、好ましくは０．３％以下、そして特に好ましくは０．２％以下の、Ｇｌｕ２４－グルカゴン、及び／又はｄｅｓ－Ｓｅｒ２－グルカゴン、及び／又はｄｅｓ－Ｔｈｒ５－グルカゴンを含有することを特徴とし、ここで上記濃度は、２２０ｎｍでのＵＶ検出を用いる分析用ＲＰ－ＨＰＬＣにおいて観察された相対ピーク面積として決定される。

好ましくは、組成物ＧＣ中の全てのグルカゴンは、本発明に従う方法から得られる。

行われた実験及び達成された結果を含めて以下の図面及び実施例は、説明の目的のみのために提供されるものであり、特許請求の範囲を限定するとは解釈されるべきではない。

図１は擬プロリンジペプチドを使用せずに（黒色）及び使用して（灰色）製造された粗製グルカゴンペプチド溶液の分析用ＲＰ－ＵＨＰＬＣトレースを示す。２２０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）を保持時間（分）に対してプロットする。Ｄｅｓ－Ｔｈｒ５－、ｄｅｓ－Ｓｅｒ２－、及びＧｌｕ２４－グルカゴンを、独立して合成された参照化合物との共溶出及び以前のＬＣ－ＭＳ分析に基づいて両方の場合に重大な不純物と同定した。 図２は、粗製グルカゴン調製物（実線）及び対応する予備精製されたグルカゴン調製物（点線）の分析用ＲＰ－ＵＨＰＬＣトレースを示す。２２０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）を保持時間（分）に対してプロットする。Ｄｅｓ－Ｔｈｒ５－、ｄｅｓ－Ｓｅｒ２－、及びＧｌｕ２４－グルカゴンを、相対保持時間及び以前のＬＣ－ＭＳ分析に基づいて、両方の場合に重大な不純物として同定した。これらの不純物の除去は、予備精製工程において十分でないということがわかる。 図３は、予備精製されたグルカゴン調製物（黒色）、実施例３において記載されるように第一の（ＴＥＡＰ）精製次元の後に精製されたグルカゴン含有フラクションをプールすることから得られた中間グルカゴン調製物（灰色）、及び実施例３において記載されるように第二の（酢酸）精製次元の後にグルカゴン含有フラクションをプールすることから得られた高度に純粋なグルカゴン調製物（アスタリスク）の分析用ＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す。両方の次元が、関連物質の除去に関して互いに相補的であり、そして優れた生成物純度を生じるということがわかる。

実施例
実施例１：グルカゴンの完全化学合成
配列番号１に従うグルカゴンペプチドを、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸誘導体及び場合により２つの擬プロリンジペプチド誘導体を使用してＷａｎｇ樹脂で合成した。各鎖伸長サイクルについて、カップリング試薬混合物は、ＴＢＴＵ及びＤＩＰＥＡ、ＤＩＣ及びＯｘｙｍａ、又はＤＥＰＢＴ及びＤＩＰＥＡを含んでいた。合成後に、ペプチド鎖を樹脂から切断し、そして濃ＴＦＡを用いてスカベンジャーの存在下で不活性ガス下でインキュベートすることにより脱保護した。ヨウ化アンモニウムを切断混合物に加え、そして形成されたヨウ化物をその後アスコルビン酸を加えることにより還元した。樹脂及び切断溶液を濾過により分離し、そして粗製ペプチドを、ジイソプロピルエーテル（ＩＰＥ）を貧溶媒として使用して切断溶液から沈殿させた。乾燥したペプチド沈殿物を酢酸水溶液に再溶解し、そして脱炭酸しておよそ４０～８０％のグルカゴン含有量を有する粗製ペプチド溶液を得た。

擬プロリンジペプチドを使用せずに（黒色線）及び使用して（灰色線）製造された粗製グルカゴンペプチド溶液を、ＵＨＰＬＣにより分析した（図１を参照のこと１）。相対保持時間、スパイク実験、及び以前のＬＣ－ＭＳ分析に基づいて、Ｄｅｓ－Ｔｈｒ５－、ｄｅｓ－Ｓｅｒ２－、及びＧｌｕ２４－グルカゴンを両方の場合に重大な不純物と同定した。さらに、Ｇｌｕ３－グルカゴンに対応する可能性のあるＲＲＴ １．０４２を有する不純物が観察された。これらの関連物質の濃度を、以下の表２において総ピーク面積の面積パーセントとして示す。

データは、ＳＰＰＳの間の２つの擬プロリンジペプチドビルディングブロックの使用が、固相ペプチド合成の直接生成物、すなわち固相結合グルカゴンペプチドを驚くべき程度まで改善することを可能にするということを実証する。得られた固相結合グルカゴンペプチドは、概して不要な物質のかなりの減少（粗製グルカゴンの純度は、５６．２１対８２．４３パーセント）、そして特にｄｅｓ－Ｔｈｒ５－、ｄｅｓ－Ｓｅｒ２－、及びＧｌｕ２４－グルカゴンの減少を特徴とする。

実施例２：予備精製
特に実施例１に従って製造された材料のグルカゴン含有量が８０％未満である場合、予備精製工程を行うことが推奨される。緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ水溶液）及び緩衝液Ｂ（６０％アセトニトリル水溶液中０．１％ＴＦＡ）を準備した。実施例１のように製造された粗製ペプチド溶液を、緩衝液Ａで予め平衡化した逆相クロマトグラフィーカラム（Ｃ１８シリカ）にロードし、カラムに１．２カラム体積（ＣＶ）の緩衝液Ａを流し、そして２２０ｎｍでのＵＶ検出器を用いてペプチド溶出をモニタリングしながら２０％～１００％緩衝液Ｂの線形グラジエントを用いて溶出した。グルカゴン含有フラクションをプールして、予備精製されたグルカゴン調製物を得た。この調製物を凍結乾燥してもよい。このようにして得られた生成物の全体純度は（純度：９４．２７％）であった。

図２は、純粋な粗製グルカゴン調製物（実線）及び予備精製されたグルカゴン調製物（点線）の分析用ＲＰ－ＵＨＰＬＣトレースを示す。調製物の全体の純度が増加しながら、ｄｅｓ－Ｓｅｒ２－、及びＧｌｕ３－グルカゴンの相対含有量は全く減少せず、そしてｄｅｓ－Ｔｈｒ５－及びＧｌｕ２４－グルカゴンにおける含有量は不満足に高かったということが分かる。したがって、強力な精製プロトコルを開発する際の課題の一つは、それらの類似性にもかかわらず所望のグルカゴンからこれらの不純物を分離することである。

実施例３：２次元ＲＰ－ＨＰＬＣ精製
実施例２のように得られたグルカゴン調製物を、Ｃ１８結合シリカを使用した２次元精製にかけた。同じカラムを両方の精製工程に使用し、そしてペプチド溶出を以下のＵＶ吸収でモニタリングした。

予備精製したグルカゴン調製物（純度：９５．４８％）を、逆相クロマトグラフィーカラム（Ｃ１８シリカ、細孔径１００Åを有する１０μｍ粒子）にロードし、そしてペプチドを以下の表３に示されるように溶出した。精製されたグルカゴンを含有するフラクションをプールし、中間グルカゴン調製物を得た。

中間グルカゴン調製物を、以下の表４に示されるように逆相クロマトグラフィーカラム（Ｃ１８シリカ、細孔径１００Åを有する１０μｍ粒子）でさらに精製した。

第二の精製次元後のプールされたフラクションの純度は、分析用ＲＰ－ＵＨＰＬＣにより評価して９９．４２％であり、両方の工程の後の全体収率は５７．３％であった。単一の不要な成分は０．５％より高い濃度で検出できなかった。出発物質と第一及び第二のＨＰＬＣパスの後のプールされたフラクションとの分析用ＲＰ－ＵＨＰＬＣトレースの比較は、両方の精製次元の驚くべき相補性を実証した：各精製次元は、異なる不要な成分を除去し、その結果両方の工程の組み合わせが、優れた生成物純度を生じた（図３を参照のこと）。表５は、特定の主要な不純物の除去を詳述する。

配列表
配列番号１ ヒトグルカゴン
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ
配列番号２ ヒトｄｅｓ－Ｔｈｒ５－グルカゴン
ＨＳＱＧＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ
配列番号３ ヒトｄｅｓ－Ｓｅｒ２－グルカゴン
ＨＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ
配列番号４ ヒトＧｌｕ２４－グルカゴン
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＥＷＬＭＮＴ

Claims (15)

1. グルカゴンペプチドの製造方法であって：
   ａ） グルカゴンペプチド及び少なくとも１つの不要な成分を含む液体組成物Ｃを供給する工程；
   ｂ） 組成物Ｃを、第一の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）精製にかける工程、［ここで、炭化水素結合シリカが固定相として使用され、リン酸トリエチルアンモニウム及びアセトニトリルを含む６．５～７．５のｐＨの水性移動相が使用され、そして溶出は、グルカゴンペプチド含有フラクションを集める間、移動相内のアセトニトリル濃度を徐々に増加させることにより達成される］；並びに
   ｃ） 工程ｂ）において得られたプールされたグルカゴンペプチド含有フラクションを、第二の逆相ＨＰＬＣ精製にかける工程、［ここで、炭化水素結合シリカが固定相として使用され、酢酸及びアセトニトリルを含む移動相が使用され、工程ｃ）の移動相における酢酸の濃度は０．５と５％（体積／体積）との間であり、そして溶出は、精製されたグルカゴンペプチド含有フラクションを集める間、移動相内のアセトニトリル濃度を徐々に増加させることにより達成される］、
   を含む、上記方法。
2. 工程ｂ）における溶出は、アセトニトリル含有量を２～４％（体積／体積）アセトニトリルから３０～５０％（体積／体積）アセトニトリルまで増加させるグラジエントにより達成され、かつ／又は工程ｃ）における溶出は、アセトニトリル含有量を２～４％（体積／体積）アセトニトリルから４０～６０％（体積／体積）アセトニトリルまで増加させるグラジエントにより達成される、請求項１に記載の方法。
3. Ｃ１８結合シリカは工程ｂ）及び／若しくは工程ｃ）において固定相として使用され、かつ／又は同じ固定相が工程ｂ）及びｃ）において使用される、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
4. 液体組成物Ｃをロードする前に、かつ／又は工程ｂ）において得られたプールされたグルカゴンペプチド含有フラクションをロードする前に、ＴＦＡ及びアセトニトリルを含む水溶液で固定相をリンスする工程をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方
   法。
5. ｄ） アニオン交換を行う工程
   をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 工程ａ）は：
   （ａ－ｉ） 固相に結合されたグルカゴンペプチドを供給すること、［ここで、少なくともＧｌｕ、Ａｓｐ、及びＬｙｓの側鎖は保護基を有する］；及び
   （ａ－ｉｉ） 固相からグルカゴンペプチドを切断し、そしてグルカゴンペプチドから保護基を除去すること
   を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 固相に結合されたグルカゴンペプチドは２つの擬プロリンジペプチドを含む、請求項６に記載の方法。
8. 工程（ａ－ｉ）は、適切に保護されたアミノ酸誘導体又はジペプチド誘導体を使用してグルカゴンペプチドのＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成を行うことを含み、ここで該保護されたアミノ酸誘導体又はジペプチド誘導体は：
   （Ａ） （ベンゾトリアゾリル）テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）；
   （Ｂ） ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びシアノ－ヒドロキシイミノ－酢酸エチルエステル（Ｏｘｙｍａ）；
   （Ｃ） ３－（ジエトキシ－ホスホリルオキシ）－３Ｈ－ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアジン－４－オン（ＤＥＰＢＴ）及びＤＩＰＥＡ；並びに
   （Ｄ） ＤＩＣ及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）
   からなる群より独立して各工程について選択される試薬を含む１つ又はそれ以上のカップリング試薬混合物を用いて活性化される、請求項６～７のいずれか１項に記載の方法。
9. Ｎ末端ヒスチジン部分が、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、及びＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨからなる群より選択されるアミノ酸誘導体、並びにＤＥＰＢＴ及びＤＩＰＥＡ又はＤＩＣ及びＯｘｙｍａを含むカップリング試薬混合物を使用して、固相に結合されたグルカゴンペプチドに導入される、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
10. グルカゴンペプチドは配列番号１のペプチドである、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 工程ａ）は、グルカゴンペプチドを含むサンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）精製にかけることを含み、ここで炭化水素結合シリカは固定相として使用され、トリフルオロ酢酸及びアセトニトリルを含む水性移動相が使用され、そして溶出は、グルカゴンペプチドを含有するフラクションを集める間、移動相内のアセトニトリル濃度を徐々に増加させることにより達成される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 固相からグルカゴンペプチドを切断し、そしてグルカゴンペプチドから保護基を除去する工程は、少なくとも５０％ＴＦＡ及び１つ若しくはそれ以上のスカベンジャーを含む切断組成物を用いたインキュベーションにより達成され、かつ／又はヨウ化アンモニウムのようなヨウ化物塩、硫化ジメチル、１，４－ジチオトレイトール、臭化トリメチルシリル、及びアスコルビン酸からなる群より選択される１つ若しくはそれ以上の薬剤が、固相を含む懸濁液に添加される、請求項６～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 同じカラムが工程ｂ）及びｃ）に使用される、請求項３に記載の方法。
14. ｄ） アニオン交換を行う工程
    をさらに含み、ここでアセテートはクロリドで少なくとも部分的に置き換えられ、かつ／又はアニオン交換は、凍結乾燥、限外濾過、透析、固相抽出、逆相クロマトグラフィー若しくはイオン交換クロマトグラフィーにより達成される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
15. 固相に結合されたグルカゴンペプチドは、配列番号１のペプチドのＧｌｙ ⁴ －Ｔｈｒ ⁵ 及びＰｈｅ ⁶ －Ｔｈｒ ⁷ 、Ｇｌｙ ⁴ －Ｔｈｒ ⁵ 及びＴｈｒ ⁷ －Ｓｅｒ ⁸ 、Ｇｌｙ ⁴ －Ｔｈｒ ⁵ 及びＴｙｒ ¹⁰ －Ｓｅｒ ¹¹ 、Ｇｌｙ ⁴ －Ｔｈｒ ⁵ 及びＡｓｐ ¹⁵ －Ｓｅｒ ¹⁶ 、Ｐｈｅ ⁶ －Ｔｈｒ ⁷ 及びＴｙｒ ¹⁰ －Ｓｅｒ ¹¹ 、Ｐｈｅ ⁶ －Ｔｈｒ ⁷ 及びＡｓｐ ¹⁵ －Ｓｅｒ ¹⁶ 、Ｔｈｒ ⁷ －Ｓｅｒ ⁸ 及びＴｙｒ ¹⁰ －Ｓｅｒ ¹¹ 、Ｔｈｒ ⁷ －Ｓｅｒ ⁸ 及びＡｓｐ ¹⁵ －Ｓｅｒ ¹⁶ 、又はＴｙｒ ¹⁰ －Ｓｅｒ ¹¹ 及びＡｓｐ ¹⁵ －Ｓｅｒ ¹⁶ からなる群より選択される位置に対応するか又はそれらと同一の位置に導入される、２つの擬プロリンジペプチドを含む、請求項６に記載の方法。

Images