KR101609840B1 - 항체의 Ｆｃ 부위 결합 펩타이드를 이용한 항체 정제용 흡착 칼럼 - Google Patents

항체의 Ｆｃ 부위 결합 펩타이드를 이용한 항체 정제용 흡착 칼럼 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항체의 Fc 부위 결합 펩타이드(Fc binding peptide, FcBP)를 이용한 항체 정제용 흡착 칼럼 및 상기 흡착 칼럼을 이용하여 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 새로운 아미노산 서열의 FcBP 또는 이에 링커(linker)연결된 혼성체를 개발하여 이를 이용하여 칼럼을 제작하였으며, 제작된 칼럼은 인간 IgG에 대한 결합능력이 우수하고 온화한 조건에서 항체를 용출시킬 수 있으며 95% 이상의 순도를 가진 항체 정제 효과를 보였고, 칼럼의 내구성 실험에서 100번 이상 사용하는 동안에도 항체 정제 효과가 저하되지 않는 것을 확인함으로써, 단백질 A 및 G와 같은 단백질 친화성 리간드의 고비용, 낮은 안정성 및 오염 가능성 등의 문제점을 해결할 수 있는 항체 정제용 흡착 칼럼에 관한 것이다.

Description

항체의 Ｆｃ 부위 결합 펩타이드를 이용한 항체 정제용 흡착 칼럼{Adsorbent columns using antibody Fc―binding peptide}
본 발명은 항체의 Fc 부위에 특이적으로 결합하는 펩타이드(Fc binding peptide, FcBP)를 이용한 항체 정제용 흡착 칼럼, 및 상기 흡착 칼럼을 이용하여 항체를 정제하는 방법에 관한 것이다.
질병의 치료 및 진단에 있어서, 항체의 사용이 증가하고 있으며, 임상시험을 마친 바이오 의약품의 약 20%가 항체 제제이다. 이에 항체의 생산 및 정제에 관련된 기술이 학문적 및 산업적 관심의 대상이 되고 있다(비특허문헌 1-5). 특히, 치료용적 항체의 제작에서 정제 등의 후속 과정이 전체 비용의 50 ~ 80 % 정도를 차지할 정도로 정제 단계가 비용 집약적이기 때문에 항체의 정제 기술을 개발하는데 많은 노력을 기울이고 있다(비특허문헌 5-6).
지난 20년에 걸쳐서, 항체 정제는 일반적으로 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 왔으며, 박테리아로부터 유래된 단백질 A 및 단백질 G와 같은 천연의 IgG-결합 단백질(natural IgG-binding protein)이 친화성 리간드로서 흔히 사용되고 있다(비특허문헌 7-10). 그러나, 단백질 리간드는 생산 비용이 높고, 안정성이 낮으며, 박테리아 성분으로 인한 오염 가능성이 크다는 문제점이 있다. 더욱이 결합 항체를 용출시키기 위해 가혹한 조건이 요구되므로 항체가 변성될 가능성이 크다는 단점이 있다(비특허문헌 7 및 11).
이에 합성 리간드가 단백질 리간드의 대안으로 개발되어 왔다(비특허문헌 7, 12 및 13). 새로운 리간드는 티올(thiol), 염료(dyes), 트리아진계(triazine-based) 화합물(compound), 및 천연 및/또는 비천연의 펩타이드를 포함한다(비특허문헌 7, 12 및 14). 이와 같이 항체 리간드가 개발되었음에도 불구하고, 박테리아 유래 단백질이 여전히 IgG 정제를 위한 친화성 리간드로 일반적으로 사용되고 있는데 이는 주로 상기 단백질이 IgG와 선택적이고 특이적으로 결합하여 정제의 효율이 높기 때문이다. 이러한 특이성 및 선택성은 단백질 A 및 단백질 G의 IgG에 대한 강한 결합 친화성(Kd = 10-5~ 10-8 M)과 관련이 있다. 이에 반하여 지금까지 보고된 대부분의 합성 리간드는 항체와의 결합 친화성이 Kd = 10-3~ 10-5 M 정도(비특허문헌 7)로 항체와의 선택적 특이적 결합력이 낮다는 문제점이 있다.
본 발명자들은 이전 발명에서 IgG Fc-결합 펩타이드가 인간 IgG에 대해 강한 결합 친화성(Kd = 85 nM)을 가지고 있다는 것을 밝혔다.
본 발명자들은 IgG와 높은 선택성 및 특이성을 가지고 결합하는 IgG Fc 도메인-결합 펩타이드(Fc domain-binding peptide, 이하 FcBP라 함)를 개발하였고(대한민국 특허출원 제 10-2008-0060863호), 이를 이용하여 표면 플라즈마 공명(surface plasmon resonance, SPR) 칩 위에 항체를 고정하는데 성공하였으며, 나아가 다른 고체상 표면(자서입자, 슬라이드 글라스 표면)에 항체를 고정하는데 이용하였다.
본 발명자들이 개발한 FcBP는 면역글로불린 G의 Fc 부위에 선택적이고 특이적으로 결합하는 저분자 펩타이드이다. 이런 FcBP는 무작위 DNA 서열을 포함하는 단일가닥 합성 DNA 라이브러리로부터 IgG의 Fc 단편을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 선별하여 제작될 수 있다. 이런 FcBP는 IgG의 항원결합부위가 아닌 Fc 부위를 결합하기 때문에 IgG의 항원 결합능에 영향을 미치지 않고 IgG에 강하게 결합하기 때문에 여러 종류의 고체상 표면에서 IgG에 배향성을 부여하여 고정시키는데 이용할 수 있다(대한민국 특허출원 제 10-2008-0060863호).
항체를 정제하기 위해서는 우선 항체와 선택적 특이적으로 결합을 하여 시료로부터 원하는 항체를 흡착, 분리하여야 하고 그리고는 다시 이 흡착된 항체를 변성 없이 분리 용출시켜야한다.
본 발명자들은, FcBP가 항체와의 결합력이 뛰어날 뿐만 아니라, 결합된 항체를 비교적 완화된 조건에서 항체의 변성 없이 분리 용출시킬 수 있는 것을 발견하고, FcBP를 이용한 항체 정제용 칼럼 및 이를 이용한 항체의 정제방법을 완성하였다.
다시 말하자면, 본 발명에서는 FcBP를 이용하여 칼럼을 제작하였으며, 제작된 칼럼은 인간 IgG에 대한 결합능력이 우수한 것을 확인하였다. 또한, 상기 칼럼은 온화한 조건에서 항체를 용출시킬 수 있고 95% 이상의 순도를 가진 항체 정제 효과를 보였으며, 칼럼의 내구성 실험에서 FcBP 칼럼은 100번 이상(자료는 30번 이상까지만 제시함) 사용하는 동안에도 효과가 저하되지 않는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
S.J. Demarest, S.M. Glaser, Current Opinion in Drug Discovery and Development 11 270 (2008) 675. S.J. Kim, Y. Park, H.J. Hong, Mol. Cells 20 (2005) 17. D. Michaeli, Semin. Oncol. 32 (2005) 82. B. Monzavi-Karbassi, T. Kieber-Emmons, Biotechniques 30 (2001) 170. A.C.A. Roque, C.R. Lowe, M.A. Taipa, Biotechnol. Prog. 20 (2004) 639. N. Tugcu, D.J. Roush, K.E. Goklen, Biotechnol. Bioeng. 99 (2008) 599. A.C.A. Roque, C.S.O. Silva, M.A. Taipa, J. Chromatogr. A 1160 (2007) 44. A.A. Shukla, B. Hubbard, T. Tressel, S. Guhan, D. Low, J. Chromatogr. B 848 (2007) 278 28. B. Akerstrom, T. Brodin, K. Reis, L. Bjorck, J. Immunol. 135 (1985) 2589. L. Bjorck, G. Kronvall, J. Immunol. 133 (1984) 969. G. Fassina, M. Ruvo, G. Palombo, A. Verdoliva, M. Marino, J. Biochem. Biophys. 282 Methods 49 (2001) 481. R. Li, V. Dowd, D.J. Stewart, S.J. Burton, C.R. Lowe, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 190. A. Verdoliva, D. Marasco, A. De Capua, A. Saporito, P. Bellofiore, V. Manfredi, R. Fattorusso, C. Pedone, M. Ruvo, ChemBioChem 6 (2005) 1307. D. Low, R. O'Leary, N.S. Pujar, J. Chromatogr. B 848 (2007) 48. Y. Jung, H.J. Kang, J.M. Lee, S.O. Jung, W.S. Yun, S.J. Chung, B.H. Chung, Anal. 288 Biochem. 374 (2008) 99. W.L. DeLano, M.H. Ultsch, A.M. De Vos, J.A. Wells, Science 287 (2000) 1279. K. Takatsu, T. Ishizaka, K. Ishizaka, J. Immunol. 114 (1975) 1838. J.C. Le, P.V. Bondarenko, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16 (2005) 307. N.G. Housden, S. Harrison, S.E. Roberts, J.A. Beckingham, M. Graille, E. Sutra, M.G. 293 Gore, Biochem. Soc. Trans. 31 (2003) 716. J. Yang, M. Jin, J. Chen, Y. Yang, P. Zheng, A. Zhang, Y. Song, H. Zhou, H. Chen, J. 295 Vet. Diagn. Invest. 19 (2007) 355.
본 발명의 목적은 항체의 Fc 부위와 결합하는 펩타이드(Fc binding peptide, FcBP)가 고정된 레진이 장착된 항체 정제용 흡착 칼럼을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 흡착 칼럼을 이용하여 항체를 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항체의 Fc 부위와 결합하는 펩타이드(Fc binding peptide, FcBP)가 고정된 레진이 장착된 항체 정제용 흡착 칼럼을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 FcBP가 고정된 레진이 장착된 흡착 칼럼에 항체를 포함하는 시료를 처리하여 상기 흡착 칼럼에 항체를 결합시키는 단계;
2) 세척하여 결합된 항체만 남기는 단계; 및
3) 세척된 흡착 칼럼으로부터 부착된 항체를 분리 용출시켜 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 정제 방법을 제공한다.
인간 IgG의 결합 친화성(binding affinity)과 유사한, 높은 친화성을 갖는 FcBP(Fc-binding peptide)는 항체에 대한 결합 능력이 높고, 온화한 pH에서 항체를 용출시키므로 불안정한 단백질인 항체를 정제할 수 있으며, 100 번의 재사용 후에도 초기 항체 정제 능력을 그대로 가지므로 항체 정제용 칼럼에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 친화성 칼럼에 결합한 허셉틴 및 pH 구배 완충용액으로의 용출을 보여주는 크로마토그램이다.
도 1a는 5가지 종류의 친화성 칼럼[FcBP 칼럼, FcBP-Ser(FcBP의 2개의 시스테인이 합성 동안 세린으로 치환됨) 칼럼, FcBP-Red(DTT에 의해 FcBP에서 이황화 결합을 감소시킴) 칼럼, 단백질 A 칼럼 및 단백질 G 칼럼]에서 각각 허셉틴에 대한 결합력을 보여주는 크로마토그램이다.
도 1b는 FcBP 칼럼과 단백질 칼럼의 허셉틴에 대한 결합력을 비교한 크로마토그램이다.
도 1c는 FcBP-red 칼럼과 단백질 칼럼의 허셉틴에 대한 결합력을 비교한 크로마토그램이다.
도 1d는 FcBP 칼럼, FcBP-Red 칼럼 및 FcBP-Ser 칼럼의 허셉틴에 대한 결합력을 비교한 크로마토그램이다.
도 2는 친화성 칼럼에 의한 돼지 IgG 정제의 크로마토그램이다.
도 3은 친화성 칼럼을 사용하여 정제된 돼지 IgG의 SDS-PAGE 분석을 수행한 결과를 보여주는 그림이다(IgG 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)는 각각 은 * 및 ◀로 표시함).
도 3의 (A)는 단백질 G 칼럼을 사용하여 정제한 단백질들을 확인한 그림이다(레인 1: 분자량 마커, 레인 2: 전체 돼지 혈청 단백질: 레인 3 - 5; 분획물 2 - 4; 레인 6 - 10: 분획물 20 - 24)이다.
도 3의 (B)는 단백질 A 칼럼을 사용하여 정제한 단백질들을 확인한 그림이다(레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 전체 돼지 항체 단백질; 레인 3 - 5: 분획물 2 - 4; 레인 6 - 10 분획물 19 - 23).
도 3의 (C)는 FcBP 칼럼을 사용하여 정제한 단백질들을 확인한 그림이다(레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 전체 돼지 항체 단백질; 레인 3 - 5: 분획물 2 - 4; 레인 6 - 10 분획물 19 - 23).
도 3의 (D)는 FcBP 칼럼에서 정제된 돼지 IgG 항체를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 보여주는 그림이다(레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 전체 돼지 혈청 단백질; 레인 3: 분획물 3; 레인 4: 분획물 21; 레인 5 - 7: 레인 2 - 4에 대한 항돼지 IgG 웨스턴 블랏).
도 4는 적용된 샘플의 양에 대하여 FcBP 칼럼으로부터 IgG의 회수량을 보여주는 크로마토그램이다.
도 5는 FcBP 칼럼의 재사용에 따른 IgG 정제의 재생력을 보여주는 크로마토그램이다.
도 6은 FcBP/돼지 IgG의 상호작용에 대한 SPR(surface plasmon resonance) 분석을 수행한 결과를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
항체를 정제하기 위해서는 항체가 칼럼(column)에 흡착되어 시료로부터 분리되어야 하며, 그리고 흡착된 항체가 변성 없이 용출되어야 한다.
본 발명은 항체의 Fc 부위와 결합하는 펩타이드(Fc binding peptide, FcBP)가 고정된 레진이 장착된 항체 정제용 흡착 칼럼을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 FcBP는 면역글로불린 G(Immunoglobulin G, IgG)의 Fc 부위(domain)에 결합하는 올리고펩타이드는 모두 사용가능하며, 7 내지 17개의 아미노산으로 구성된 올리고펩타이드인 것이 바람직하나 상기 아미노산의 갯수는 이에 한정되지 않는다.
상기 FcBP는 정제하고자 하는 항체의 Fc 부위에 높은 선택성(selectivity)과 특이성(specificity)을 가지고 결합한다. 또한, 상기 FcBP는 항체의 항원결합부위가 아닌 Fc 부위를 결합하기 때문에, 항체의 항원 결합력에 영향을 미치지 않는다. 또한, 상기 FcBP는 항체의 친화성 리간드로서 통상 수지 등의 고체상에 고정될 수 있다.
상기 FcBP는 DCHKRSFWADNCT(서열번호: 1), DCRTQFRPNQTCT(서열번호: 2), DCQLCDFWRTRCT(서열번호: 3), DCFEDFNEQRTCT(서열번호: 4), DCLAKFLKGKDCT(서열번호: 5), DCWHRRTHKTFCT(서열번호: 6), DCRTIQTRSHWCT(서열번호: 7), DCIKLAQLHSVCT(서열번호: 8), DCWRHRNATEWCT(서열번호: 9), DCQNWIKDVHKCT(서열번호: 10), DCAWHLGELVWCT(서열번호: 11), DCAFHLGELVWCT(서열번호: 12), DCAYHLGELVWCT(서열번호: 13) 및 이들 아미노산 서열에서 한 개 또는 두 개의 아미노산이 첨가, 결실 또는 치환된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 올리고펩타이드인 것이 바람직하다. 상기 아미노산 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
FcBP 의 아미노산 서열
서열 번호 명칭 서열
1 DCHKRSFWADNCT
2 DCRTQFRPNQTCT
3 DCQLCDFWRTRCT
4 DCFEDFNEQRTCT
5 DCLAKFLKGKDCT
6 DCWHRRTHKTFCT
7 DCRTIQTRSHWCT
8 DCIKLAQLHSVCT
9 DCWRHRNATEWCT
10 DCQNWIKDVHKCT
11 FCBP-1 DCAWHLGELVWCT
12 FCBP-2 DCAFHLGELVWCT
13 FCBP-3 DCAYHLGELVWCT
14 FCBP-Ser DSAWHLGELVWST
상기 FcBP는 상기 아미노산 서열에서 두 개의 시스테인이 분자 내 이황화 결합을 하거나 하지 않은 올리고펩타이드가 모두 사용가능하며, 상기 아미노산 서열에서 두 개의 시스테인 잔기를 세린으로 치환시킨 FcBP-Ser은 DSAWHLGELVWST(서열번호: 14)인 올리고펩타이드도 사용가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 정제용 흡착 칼럼은 FcBP가 링커(linker)를 통해 레진에 연결될 수 있다.
상기 링커는 FcBP의 N-말단 또는 C-말단에 결합될 수 있고, C-말단에 결합되는 것이 바람직하다.
상기 링커(linker)는
1) (NH2(CH2CH2O)n(CH2)aC(O)-, [여기서 n은 1 ~ 30이고 a는 1 ~ 10이다.]);
2) (NH2(CH2CH2O)n(CH2)aY(CH2)bNH2, [여기서 n은 1 ~ 50이고, a는 1 ~ 10이며, b는 1 ~ 10이고, Y는 링커이며 알킬, 산소(-O-), 아민(-NH-), 유레아, 아미드, 에스테르 및 아릴로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나이다]; 및
3) (NH2(CH2CH2O)m(CH2)aY(CH2)b(CH2CH2O)n(CH2)cNH2-, [여기서 m 및 n은 각각 1 ~ 30이고, a, b, 및 c는 각각 2 ~ 10이며, Y는 링커이고 알킬, 산소(-O-), 아민(-NH-), 유레아, 아미드, 에스테르 및 아릴로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나이다])로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 적절한 알킬, 펩타이드 또는 유사체일 수 있다.
상기 링커는 말단의 아민(NH2)기가 말레이미드(maleimide), 아지드(azide) 및 알킨(alkyne)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 기능기로 치환될 수 있으며, 그 외 다른 적절한 기능기로 치환된 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
이런 올리고 펩타이드에 링커 및 적절한 반응기의 도입은 항체의 용해도를 개선하고 고체기판 사이에 충분한 공간을 제공한다.
상기 FcBP 유도체는 하기 구조들로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 구조를 갖는 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
1) 아미노-dPEG6-DCAWHLGELVWCT;
2) 아미노-dPEG6-DCAFHLGELVWCT;
3) 아미노-dPEG6-DCAYHLGELVWCT;
4) 아미노-dPEG6-DSAWHLGELVWST;
5) Ac-DCAWHLGELVWCT-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2;
6) Ac-DCAFHLGELVWCT-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2;
7) Ac-DCAYHLGELVWCT-NHCH2CH2O CH2CH2OCH2CH2NH2;
8) Ac-DSAWHLGELVWST-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2;
9) Ac-DCAWHLGELVWCT-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2;
10) Ac-DCAFHLGELVWCT-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2; 및
11) Ac-DCAYHLGELVWCT-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2.
본 발명에 있어서, 상기 레진은 아가로스, 세파로스, 셀룰로스, 덱스트란, 폴리아크릴 레이트 및 폴리스틸렌으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 세파로스인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 실시예에서는 1) Ac-DCAWHLGELVWCT-(C-말단 링커); 2) (N-말단 링커)-DCAWHLGELVWCT-CO2H (또는 CONH2); 3) Ac-DCAXHLGELVWCT-(C-말단 링커)(X = F 또는 Y); 4) (N-말단 링커)-DCAXHLGELVWCT-CO2H (또는 CONH2)(X = F 또는 Y); 5) Ac-DSAXHLGELVWST-(C-말단 링커); 및 6) (N-말단 링커)-DSAXHLGELVWST-CO2H (또는 CONH2) [본 실시예에서는 N-말단 링커로는 NH2(CH2CH2O)6CH2CH2CO-를 그리고 C-말단 링커로는 NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2 또는 NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCONH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2를 사용함]의 다양한 FcBP-링커 혼성체를 제조한 후, 이들을 각각 레진에 고정시킨 다음, 상기 레진을 칼럼에 장착하여 다양한 FcBP 친화성 흡착 칼럼을 제작하였다.
본 발명의 실시예에서는 본 발명에서 제작된 FcBP 친화성 흡착 칼럼의 IgG에 대한 결합력을 알아보기 위해, 상기 다양한 FcBP 친화성 흡착 칼럼을 이용하여 허셉틴에 대한 결합력을 측정한 결과, 매우 우수한 허셉틴에 대한 결합력을 나타내었다. 이런 결합력은 단백질 A 및 단백질 G를 이용한 흡착 칼럼과 유사한 수준임을 확인하였다(도 1a 및 도 1b 참조).
본 발명의 실시예에서는 FcBP의 이황화 결합이 IgG에 대한 결합력에 미치는 영향을 알아보기 위해, FcBP에 시스테인 잔기를 세린으로 치환한 FcBP-Ser, 및 FcBP의 이황화 결합을 감소시킨 FcBP-red를 각각 이용한 칼럼을 제작한 후 허셉틴에 대한 결합력을 측정한 결과, 상기 FcBP 친화성 흡착 칼럼에 비해 FcBP-Ser 및 FcBP-red의 IgG에 대한 결합력은 다소 낮아졌으나 여전히 우수한 허셉틴에 대한 결합력을 나타내었다(도 1a 및 도 1b 참조).
본 발명의 실시예에서는 본 발명에서 제작된 FcBP 친화성 흡착 칼럼에 흡착된 IgG가 온화한 조건에서 용출이 가능한지 알아보기 위해, FcBP 흡착 칼럼, 단백질 A 칼럼, 단백질 G 칼럼, FcBP-Ser 칼럼 및 FcBP-red 칼럼에 각각 흡착된 IgG를 pH 구배 완충용액을 이용하여 용출시킨 결과, FcBP 흡착 칼럼의 경우 단백질 A 또는 단백질 G에 비해 더 온화한 조건(pH 2.5 ~ 5.0)에서 IgG가 분리되는 것을 확인하였다(도 1c 및 도 1d 참조).
구체적으로, 본 발명에서 제작된 FcBP 흡착 칼럼은 항체 결합 후 해리속도가 빨라서 pH 2.5 ~ 5.0의 완충용액으로 항체의 용출이 가능하였다. FcBP의 아미노산 서열 중 두 개의 시스테인이 분자내 이황화 결합을 형성한 경우에는 pH 2.5 ~ 3.0의 완충용액으로 항체의 용출이 가능하였고, FcBP의 아미노산 서열 중 두 개의 시스테인이 분자내 이황화 결합이 제거된 경우에는 pH 3.0 ~ 5.0의 완충용액으로 항체의 용출이 가능한 것을 확인하였다. 이는 FcBP 리간드가 IgG를 정제하는데 사용할 때, 산에 의해 유도되는 IgG 활성의 손실을 극복할 수 있는 장점을 가지는 것을 알 수 있었다. 왜냐하면 용해 완충용액이 다른 칼럼의 실험에서 요구되는 것보다 더 높은 pH의 산성에서도 정제할 수 있기 때문이었다.
본 발명의 실시예에서는 본 발명에서 제작된 FcBP 친화성 흡착 칼럼의 돼지 IgG의 분리 능력을 확인하기 위해, 돼지 항체를 FcBP 친화성 칼럼에 흡착시킨 후 pH 구배 완충용액을 이용하여 용출 정도를 측정하였고 정제하여 얻은 분획물을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 이용하여 확인한 결과, FcBP 칼럼은 pH 2.5 ~ pH 5.0의 온화한 조건에서 IgG가 용출되는 것을 확인하였고, FcBP 칼럼의 정제된 양이 단백질 G 및 단백질 A의 정제한 양보다 많음을 확인하였다(도 3의 A 내지 D 참조).
본 발명의 실시예에서는 본 발명에서 제작된 FcBP 친화성 흡착 칼럼의 재사용에 따른 IgG의 회수량을 알아보기 위해, 돼지 혈청 단백질을 FcBP 친화성 칼럼에 적재하여 정제된 IgG의 회수량을 확인하였으며, 30회까지 반복하여 재사용하면서 IgG의 회수량을 확인한 결과, FcBP 칼럼은 적재한 단백질 총량이 늘어날수록 IgG 회수량이 감소하였고, 반복 횟수에 상관없이 재사용이 가능한 것을 확인하였다(도 4 내지 도 6 참조).
따라서, 본 발명의 FcBP 친화성 흡착 칼럼은 IgG에 대한 높은 결합력을 가지고, 흡착된 IgG를 온화한 조건(pH= 2.5 ~ 5.0)에서도 용출할 수 있으며, 100번의 재사용 후에도 초기 IgG 정제 능력을 유지할 수 있음을 확인함으로써, 단백질 A 및 단백질 G와 같은 단백질 친화성 리간드를 이용한 흡착 칼럼을 대체하는 항체 정제용 흡착 칼럼으로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 FcBP가 고정된 레진이 장착된 항체 정제용 흡착 칼럼을 이용한 항체의 정제 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은
1) 본 발명의 FcBP가 고정된 레진이 장착된 흡착 칼럼에 항체를 포함하는 시료를 처리하여 상기 흡착 칼럼에 항체를 결합시키는 단계;
2) 세척하여 결합된 항체만 남기는 단계; 및
3) 세척된 흡착 칼럼으로부터 부착된 항체를 분리 용출시켜 항체를 회수하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 항체는 IgG인 것을 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 항체의 결합은 pH 6.5 내지 pH 8.0에서 수행하는 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 2)의 세척은 pH 5.5 내지 pH 6.5의 완충용액을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 3)의 항체의 용출은 pH 구배 완충용액 또는 일정 pH 완충액을 이용하여 수행하는 것이 바람직하나 상기 방법에 한정되지 않는다. pH 구배 완충용액을 사용하는 경우, pH 2.5 내지 pH 5.0의 용출 완충용액을 사용하여 항체를 용출시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 FcBP를 이용하여 제작된 흡착 칼럼은 인간 IgG에 대한 결합능력이 우수하고, 단백질 A 및 G를 이용한 칼럼에 비교하여 보다 온화한 조건에서 항체를 용출시킬 수 있으며, 95% 이상의 순도를 가진 항체 정제 효과를 보였으며, 칼럼의 내구성 실험에서 100번 이상 재사용하는 동안에도 항체 정제 효과가 저하되지 않는 것을 확인함으로써, 항체 정제용 흡착 칼럼으로 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> N 말단에 링커가 도입된 FcBP 1의 제조
상기 [표 1]에서 나타난 FcBP들 중에서 FcBP-1, FcBP-2, FcBP-3, 그리고 FcBP-Ser의 고체상 합성 방법과 이들 펩티드의 N-말단에 아미노-dPEG6-산(Peptide International, 미국) 링커가 도입된 아미노-dPEG6-FcBP-1, 아미노-dPEG6-FcBP-2, 아미노-dPEG6-FcBP-3, 아미노-dPEG6-FcBP-Ser의 고체상 합성법을 나타내었다. 명세서에 언급된 다른 펩티드 및 그 유도체의 합성에도 실시예에 나타난 고체상 펩티드 합성방법을 사용하였다.
펩티드 합성에 사용된 시약은 DMF, DCM, DIPEA, 0.5 M 2-(1H-벤조티라졸(benzotriazole)-1-yl)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플로포포스페이트(hexafluorophosphate, HBTU) 함유 DMF, 0.5 M 하이드록시벤조티라졸(hydroxybenzotirazole, HOBt)) 함유 DMF, 20% 피페리딘 함유 DMF이며, 열거된 Fmoc 아미노산 블록 및 링커를 사용하여 C-말단 아미노산부터 고체상 펩티드 합성법에 따라 순차적으로 진행하였다.
<1-1> 아미노-dPEG 6 -FcBP-1
(i) 리간드 구조
환원: Amino-dPEG6-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-NH2
산화:
Figure 112012055681158-pat00001

(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH 및 Fmoc-N-amido-dPEG6-acid
(iii) 아미노-dPEG 6 -FcBP-1의 제조
(a) 아미노산 도입
하기 과정에서 사용된 시약의 양은 0.25 mmole에 기초하였다. 0.5 g의 클리어 아미드 수지(Clear amide resin, 0.5 mmole/g, Peptide International, 미국)를 합성반응기에 넣고, 각각의 Fmoc-아미노산 블록 1 mmole의 무게를 달아 펩티드 아미노산 서열 순서대로 C-말단에서부터 N-말단까지 준비하였다. 클리어 아미드 수지로부터 Fmoc 보호를 제거하고, Fmoc-아미노산을 활성화하며, 클리어 아미드 수지에 활성화된 잔기를 부착하는 반응을 C-말단 아미노산부터 순차적으로 진행하였다. Fmoc의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF에서 수행하였고 잔기의 활성화 및 도입은 서열에 맞추어 준비한 아미노산을 2 ml 0.5 M HOBT 함유 DMF용액, 2 ml 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액 그리고 174 ul DIPEA와 5분간 혼합한 다음 수지가 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 혼합하였다. 도입 반응의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반응으로 확인되면 도입 반응을 1 회 더 반복하거나 20% Ac2O 함유 DMF 용액으로 캡핑을 실시하였다. 각 도입 반응과 Fmoc 제거 과정에서 다음 단계로 넘어가기 전에 DMF와 DCM으로 수지를 충분히 세척하였다. 이러한 과정은 FcBP-1의 펩티드 서열이 완성될 때까지 반복하였다. 합성이 끝난 후에, 보호기로 보호된 FcBP-1가 부착된 수지를 펩티드 반응기에서 건조하였고 중량을 측정하였다(H-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Trp(Boc)-His(Trt)-Leu-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-순수 아미드 레진은 1.20 g).
(b) 링커의 도입
<실시예 1>의 (a)과정에서 완성한 보호기로 보호된 FcBP-1가 부착된 수지에서 펩티드의 N-말단에 링커를 도입하는 과정을 실시하였다. 이때 사용한 링커는 아미노-dPEG6-acid를 사용하였다. 아미노-dPEG6-acid의 도입은 일반적인 고체상 펩티드 합성법에 따라 진행하였다. <실시예 1>의 a에서 완성한 펩티드가 부착된 수지 중에서 250 mg을 덜어내어 반응기에 넣고 DCM을 붓고 10 분 이상 정치하여 충분히 불렸다. 0.2 mmole의 Fmoc-amido-dPEG6-acid와 0.4 ml 0.5 M HOBT 함유 DMF용액, 0.4 ml 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액 그리고 34.8 ul DIPEA와 5 분간 혼합한 다음 수지가 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 혼합하였다. 도입 반응의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반응으로 확인되면 도입 반응을 1 회 더 반복하거나 20% Ac2O 함유 DMF 용액으로 캡핑을 실시하였다. 링커의 도입을 확인한 다음 20% 피페리딘(piperidine) 함유 DMF 용액(3 x 5 min)으로 처리하고 DMF와 DCM으로 수지를 충분히 세척한 다음 진공에서 건조하였다(1-Amino-3,6,9,12,15,18-hexaoxahenicosan-21-oyl-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Trp(Boc)-His(Trt)-Leu-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-순수 아미드 레진은 249 mg).
(c) 보호기의 제거와 수지의 분리
<실시예 1>의 (b)과정에서 준비한 펩티드가 부착된 수지 100 mg을 TFA, TIS, 물 및 EDT(94:1.0:2.5:2.5)의 혼합액 2 ml과 함께 실온에서 120분간 교반하여 수지에서 펩티드를 절단하였다. 절단 혼합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 에테르로 3회 더 세척하고 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% AcCN 함유 물에 녹인 다음 6시간 동안 교반한 다음 농축하였다. 농축액을 ACN:0.1 M 아세트산암모늄(ammonium acetate) 1:1 용액에 0.1 mg/ml 농도로 녹인 다음 공기에 노출된 상태로 24 시간 교반하였다. 이황화 결합(Disulfide) 형성 반응의 진행은 HPLC로 관측하였으며 더 이상 진행하지 않는 것으로 판단되면 반응액을 동결건조하여 펩티드 침전물을 얻었다(29mg).
(d) 정제
<실시예 1>의 (c)과정에서 동결건조하여 얻은 펩티드 침전물을 prep-LC 1차 정제조건에서 분리한 다음 prep-LC 2차 정제조건으로 추가 정제하고 동결 건조하였다. 얻어진 펩티드는 각각 98% 이상의 순도임을 분석용 HPLC로 확인하였으며, 합성한 펩티드의 분자량을 말디 토프 질량 분석기로 확인하였다(아미노-dPEG6-FcBP-1은 20 mg 얻었고 MW = 1865.08 및 M+1 1866.51이였다).
prep-LC 1차 정제조건
장비명 Schimazu, SCL-10Avp
칼럼 증류수, XBridge Prep C18 5um OBD 19x250 mm
이동상 A/B 0.1% TFA-30% AcCN / 70% AcCN 에서 0.1% TFA
구배 0 min → 50 min : B 0% → B 20%
유속 7 ml/min 검출파장 UV 230 nm
prep-LC 2차 정제조건
장비명 Schimazu, SCL-10Avp
칼럼 증류수, XBridge Prep C18 5um OBD 19x250 mm
이동상A/B 0.1% TFA-20% AcCN / 80% AcCN 에서 0.1% TFA
구배 0 min → 30 min : B 0% → B 100%
유속 17 ml/min 검출파장 UV 230 nm
<1-2> 아미노-dPEG 6 -FcBP-2
(i) 리간드 구조
환원: 아미노-dPEG6-Asp-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-NH2
산화:
Figure 112012055681158-pat00002

(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Phe-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH 및 Fmoc-N-amido-dPEG6-acid
(iii) 아미노-dPEG 6 -FcBP-2의 제조
(a) 아미노산 도입
상기 <실시예 1-1>의 아미노-dPEG6-FcBP-1의 제조에 따른 아미노산 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과, H-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Phe-His(Trt)-Leu-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-순수 아미드 레진 1.22 g으로 측정되었다.
(b) 링커의 도입
상기 <실시예 1-1>의 아미노-dPEG6-FcBP-1의 제조에 따른 링커의 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과, 1-아미노-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤니코산(hexaoxahenicosan)-21-oyl-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Trp(Boc)-His(Trt)-Leu-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-순수 아미드 레진 251 mg을 얻었다.
(c) 보호기의 제거와 수지의 분리
상기 <실시예 1-1>의 아미노-dPEG6-FcBP-1의 제조에 따른 보호기의 제거와 수지를 분리한 동일한 방법으로 수행한 결과, 31 mg을 얻었다.
(d) 정제
상기 <실시예 1-1>의 아미노-dPEG6-FcBP-1의 제조에 따라 정제한 동일한 방법으로 수행한 결과, 아미노-dPEG6-FcBP-2는 23 mg 얻었고, MW = 1826.04 및 M+1 1827.21로 확인되었다.
<1-3> 아미노-dPEG 6 -FcBP-3
(i) 리간드 구조
환원: 아미노-dPEG6-Asp-Cys-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-NH2
산화:
Figure 112012055681158-pat00003

(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Tyr-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH 및 Fmoc-N-amido-dPEG6-acid
(iii) 아미노-dPEG 6 -FcBP-3의 제조
(a) 아미노산 도입
상기 <실시예 1-1>의 아미노-dPEG6-FcBP-1의 제조에 따른 아미노산 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과, H-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Tyr(tBu)-His(Trt)-Leu-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-순수 아미드 레진 1.17 g으로 측정되었다.
(b) 링커의 도입
상기 <실시예 1-1>의 아미노-dPEG6-FcBP-1의 제조에 따른 링커의 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과, 1-아미노-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤니코산-21-oyl-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Tyr(tBu)-His(Trt)-Leu-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc) Cys(Trt)-Thr(tBu)-순수 아미드 레진 246 mg을 얻었다.
(c) 보호기의 제거와 수지의 분리
상기 <실시예 1-1>의 아미노-dPEG6-FcBP-1의 제조에 따른 보호기의 제거와 수지를 분리한 동일한 방법으로 수행한 결과, 29 mg을 얻었다.
(d) 정제
상기 <실시예 1-1>의 아미노-dPEG6-FcBP-1의 제조에 따라 정제한 동일한 방법으로 수행한 결과, 아미노-dPEG6-FcBP-3은 22 mg 얻었고, MW = 1842.04 및 M+1 1843.36로 확인되었다.
<1-4> 아미노-dPEG 6 -FcBP-Ser
(i) 리간드 구조
아미노-dPEG6-Asp-Ser-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Ser-Thr-NH2
(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH 및 Fmoc-N-amido-dPEG6-acid
(iii) 아미노-dPEG 6 -FcBP-Ser의 제조
(a) 아미노산 도입
상기 <실시예 1-1>의 아미노-dPEG6-FcBP-1의 제조에 따른 아미노산 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과,H-Asp(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Trp(Boc)-His(Trt)-Ple-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-순수 아미드 레진 1.23 g으로 측정되었다.
(b) 링커의 도입
상기 <실시예 1-1>의 아미노-dPEG6-FcBP-1의 제조에 따른 링커의 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과, 1-아미노-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤니코산-21-oyl-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Trp(Boc)-His(Trt)-Ple-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-순수 아미드 레진 247 mg을 얻었다.
(c) 보호기의 제거와 수지의 분리
<실시예 1>의 (b)과정에서 준비한 펩티드가 부착된 수지 100 mg을 TFA, TIS, 물 그리고 EDT(94:1.0:2.5:2.5)의 혼합액 2 ml과 함께 실온에서 120분간 교반하여 수지에서 펩티드를 절단하였다. 절단 혼합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 에테르로 3회 더 세척하고 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% AcCN 함유 물에 녹인 다음 6시간 동안 교반한 다음 반응액을 동결건조하여 펩티드 침전물을 얻었다(33 mg).
(d) 정제
상기 <실시예 1-1>의 아미노-dPEG6-FcBP-1의 제조에 따라 정제한 동일한 방법으로 수행한 결과, 아미노-dPEG6-FcBP-Ser는 23 mg 얻었고, MW = 1834.96 및 M+1 1836.11으로 확인되었다.
<실시예 2> C-말단에 링커가 도입된 FcBP의 제조
상기 [표 1]에서 나타난 FcBP 들 중에서 FcBP-1, FcBP-2, FcBP-3 및 FcBP-Ser의 고체상 합성 방법과 이들 펩티드의 N-말단은 아세틸화(Acetylation)시키고 C-말단에 1,8-diamino-3,6-디옥사옥탄(dioxaoctane) 링커가 도입된 Ac-(FcBP-1)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2, Ac-(FcBP-2)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2, Ac-(FcBP-3)- NHCH2CH2O CH2CH2OCH2CH2NH2 및 Ac-(FcBP-Ser)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2의 고체상 합성법을 나타낸다. 명세서에 언급된 다른 펩티드 및 그 유도체의 합성에도 실시예에 나타난 고체상 펩티드 합성방법을 사용하여 조달하였다.
펩티드 합성에 사용된 시약은 DMF, DCM, DIPEA, 0.5 M 2-(1H-벤조트리아졸(benzotriazole)-1-yl)-1,1,3,3-테트라메틸우료늄(tetramethyluronium) 헥사플루로로인산염(hexafluorophosphate, HBTU) 함유 DMF, 0.5 M hydroxybenzotirazole(HOBt) 함유 DMF, 20% 피페리딘 함유 DMF이며, 열거된 Fmoc 아미노산 블록 및 링커를 사용하여 C-말단 아미노산부터 고체상 펩티드 합성법에 따라 순차적으로 진행하였다.
<2-1> Ac-(FcBP-1)-NHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2
(i) 리간드 구조
환원:
Figure 112012055681158-pat00004
산화:
Figure 112012055681158-pat00005

(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH 및 Ac2O
(iii) Ac-(FcBP-1)-NHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2 의 제조
(a) 아미노산 도입
하기 과정에서 사용된 시약의 양은 0.25 mmole을 기초하였다. 0.5 g의 O-bis-(아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 레진 (0.5 mmole/g, Novabiochem, 미국)를 합성반응기에 넣고, 각각의 Fmoc-아미노산 블록 1 mmole의 무게를 달아 펩티드 아미노산 서열 순서대로 C-말단에서부터 N-말단까지 준비하였다. Fmoc-아미노산을 활성화하여O-bis-(아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 레진에 활성화된 잔기를 부착하는 반응을 C-말단 아미노산부터 순차적으로 진행하였다. Fmoc의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF에서 수행하였고 잔기의 활성화 및 도입은 서열에 맞추어 준비한 아미노산을 2 ml 0.5 M HOBT 함유 DMF용액, 2 ml 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액 그리고 174 ul DIPEA와 5분간 혼합한 다음 수지가 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 혼합하였다. 도입 반응의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반응으로 확인되면 도입 반응을 1 회 더 반복하거나 20% Ac2O 함유 DMF 용액으로 캡핑을 실시하였다. 각 도입 반응과 Fmoc 제거 과정에서 다음 단계로 넘어가기 전에 DMF와 DCM으로 수지를 충분히 세척하였다. 이러한 과정은 FcBP-1의 펩티드 서열이 완성될 때까지 반복하였다. 아미노산 도입이 모두 끝난 다음에 N-말단에 아세틸을 도입하기 위하여 20% Ac2O in DMF 용액(3x10mlx10min)으로 처리하였다. 합성이 끝난 후에, 보호기로 보호된 Ac-FcBP-1가 부착된 수지를 펩티드 반응기에서 건조하였고 중량을 측정하였다(Ac-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Trp(Boc)-His(Trt)-Leu-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH-트리틸 레진, 1.30 g).
(b) 보호기의 제거와 수지의 분리
상기 <실시예 2-1>의 (a)과정에서 준비한 펩티드가 부착된 수지 100 mg을 TFA, TIS, 물 그리고 EDT(94:1.0:2.5:2.5)의 혼합액 2 ml과 함께 실온에서 120분간 교반하여 수지에서 펩티드를 절단하였다. 절단 혼합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 에테르로 3회 더 세척하고 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% AcCN 함유 물에 녹인 다음 6시간 동안 교반한 다음 농축하였다.
농축액을 ACN:0.1 M 아세트산 암모늄 1:1 용액에 0.1 mg/ml 농도로 녹인 다음 공기에 노출된 상태로 24 시간 교반하였다. 이황화 결합 형성 반응의 진행은 HPLC로 관측하였으며 더 이상 진행하지 않는 것으로 판단되면 반응액을 동결 건조하여 펩티드 침전물을 얻었다(31 mg).
(c) 정제
상기 <실시예 2-1>의 (b)과정에서 동결건조하여 얻은 펩티드 침전물을 prep-LC 1차 정제조건에서 분리한 다음 prep-LC 2차 정제조건으로 추가 정제하고 동결 건조하였다. 얻어진 펩티드는 각각 98% 이상의 순도임을 분석용 HPLC로 확인하였으며, 합성한 펩티드의 분자량을 말디 토프 질량 분석기로 확인하였다(Ac-(FcBP-1)- NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2는 24 mg 얻었고 MW = 1702.91 및 M+1 1704.01으로 확인되었다.).
prep-LC 1차 정제조건
장비명 Schimazu, SCL-10Avp
칼럼 증류수, XBridge Prep C18 5um OBD 19x250 mm
이동상 A/B 0.1% TFA-30% AcCN / 0.1% TFA in 70% AcCN
구배 0 min → 50 min : B 0% → B 20%
유속 17 ml/min 검출파장 UV 230 nm
rep-LC 2차 정제조건
장비명 Schimazu, SCL-10Avp
칼럼 증류수, XBridge Prep C18 5um OBD 19x250 mm
이동상A/B 0.1% TFA-20% AcCN / 0.1% TFA in 80% AcCN
구배 0 min → 30 min : B 0% → B 100%
유속 17 ml/min 검출파장 UV 230 nm
<2-2> Ac-(FcBP-2)-NHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2
(i) 리간드 구조
환원:
Figure 112012055681158-pat00006
산화:
Figure 112012055681158-pat00007

(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Phe-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH 및 Ac2O
(iii) Ac-(FcBP-2)-NHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2 의 제조
(a) 아미노산 도입
상기 <실시예2-1>에 Ac-(FcBP-1)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2의 제조에서 아미노산 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과, kAc-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Phe-His(Trt)-Leu-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH-트리틸 레진 1.28 g으로 측정되었다.
(b) 보호기의 제거와 수지의 분리
상기 <실시예2-1>에 Ac-(FcBP-1)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2의 제조에서 보호기의 제거와 수지의 분리와 동일한 방법으로 수행한 결과, 29 mg을 얻었다.
(c) 정제
상기 <실시예2-1>에 Ac-(FcBP-1)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2의 제조에서 정제와 동일한 방법으로 수행한 결과, Ac-(FcBP-2)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2는 23 mg 얻었고 MW = 1663.87 및 M+1 1665.07으로 확인되었다.
<2-3> Ac-(FcBP-3)-NHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2
(i) 리간드 구조
산화:
Figure 112012055681158-pat00008
환원:
Figure 112012055681158-pat00009

(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Tyr-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH 및 Ac2O
(iii) Ac-(FcBP-3)-NHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2 의 제조
(a) 아미노산 도입
상기 <실시예2-1>에 Ac-(FcBP-1)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2의 제조에서 아미노산 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과, Ac-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Tyr(tBu)-His(Trt)-Leu-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH-트리틸 레진 1.33 g으로 측정되었다.
(b) 보호기의 제거와 수지의 분리
상기 <실시예2-1>에 Ac-(FcBP-1)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2의 제조에서 보호기의 제거와 수지의 분리와 동일한 방법으로 수행한 결과, 29 mg을 얻었다.
(c) 정제
상기 <실시예2-1>에 Ac-(FcBP-1)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2의 제조에서 정제와 동일한 방법으로 수행한 결과, Ac-(FcBP-3)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2는 22 mg 얻었고 MW = 1679.87 및 M+1 1680.78으로 확인되었다.
<2-4> Ac -( FcBP -S er )- NHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2
(i) 리간드 구조
Figure 112012055681158-pat00010

(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH 및 Ac2O
( iii ) Ac -( FcBP -S er )- NHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2 의 제조
(a) 아미노산 도입
상기 <실시예2-1>에 Ac-(FcBP-1)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2의 제조에서 아미노산 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과, Ac-Asp(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Trp(Boc)-His(Trt)-Leu-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH-트리틸 레진 1.21 g으로 측정되었다.
(b) 보호기의 제거와 수지의 분리
상기 <실시예 1>의 a 과정에서 준비한 펩티드가 부착된 수지 100 mg을 TFA, TIS, 물 그리고 EDT(94:1.0:2.5:2.5)의 혼합액 2 ml과 함께 실온에서 120분간 교반하여 수지에서 펩티드를 절단하였다. 절단 혼합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 에테르로 3회 더 세척하고 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% AcCN 함유 물에 녹인 다음 6시간 동안 교반한 다음 반응액을 동결건조하여 펩티드 침전물을 얻었다(33 mg).
(c) 정제
상기 <실시예2-1>에 Ac-(FcBP-1)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2의 제조에서 정제와 동일한 방법으로 수행한 결과, Ac-(FcBP-Ser)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2은 MW = 1672.79 및 M+1 1674.31으로 확인되었다.
<2-5> Ac-(FcBP-1)-NHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NHCONHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2
(i) 리간드 구조
환원:
Figure 112012055681158-pat00011
산화:
Figure 112012055681158-pat00012

(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2, Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH 및 Ac2O
(iii) Ac-(FcBP-1)-NHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NHCONHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2 의 제조
하기 과정에서 사용된 시약의 양은 0.25 mmole을 기초로 하였다. 0.5 g의 O-bis-(아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 레진(0.5 mmole/g, Novabiochem, 미국)를 합성반응기에 넣고 DCM으로 불린 후, 카르보닐디이미다졸(243 mg, 1.5 mmole, Aldrich) 을 4 ml DMF에 녹인 용액으로 4시간 처리하여 활성화시켰다. DCM으로 레진을 세척한 후 과량의 O-bis-(아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 레진(1.48 g, 10 mmole) DMF (5 mL)용액으로 1 시간 처리한 후 DCM으로 세척하였다. 그런 다음 <실시예 2-1>의 방법에 의하여 아미노산 도입, 보호기 제거 및 정제 과정을 거쳐 리간드를 합성하였다.
(a) 정제
상기 <실시예 2-1>에 Ac-(FcBP-1)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2의 제조에서 정제와 동일한 방법으로 수행한 결과, Ac-(FcBP-1)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2 MW = 1877.15 및 M+1 1878.16으로 확인되었다.
<2-6> Ac-(FcBP-2)-NHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NHCONHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2
(i) 리간드의 구조
환원:
Figure 112012055681158-pat00013
산화:
Figure 112012055681158-pat00014

(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2, Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Phe-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH 및 Ac2O
(iii) Ac-(FcBP-2)-NHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NHCONHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2 의 제조
하기 과정에서 사용된 시약의 양은 0.25 mmole을 기초하였다. 0.5 g의 O-bis-(아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 레진(0.5 mmole/g, Novabiochem, 미국)를 합성반응기에 넣고 DCM으로 불린 후, 카보닐디이미다졸(243 mg, 1.5 mmole, Aldrich) 을 4 ml DMF에 녹인 용액으로 4시간 처리하여 활성화시켰다. DCM으로 레진을 세척한 후 과량의 O-bis-아미노에틸)에틸렌 글리콜(1.48 g, 10 mmole) DMF (5 mL)용액으로 1 시간 처리한 후 DCM으로 세척하였다. 그런 다음 <실시예 2-1>의 방법에 의하여 아미노산 도입, 보호기 제거 및 정제 과정을 거쳐 리간드를 합성하였다.
(a) 정제
상기 <실시예 2-1>에 Ac-(FcBP-1)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2의 제조에서 정제와 동일한 방법으로 수행한 결과, Ac-(FcBP-2)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2는 MW = 1838.11 및 M+1 1839.12으로 확인되었다.
<2-7> Ac-(FcBP-3)-NHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NHCONHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2
(i) 리간드 구조
환원:
Figure 112012055681158-pat00015
산화:
Figure 112012055681158-pat00016

(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2, Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Tyr-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH 및 Ac2O
( iii ) Ac -( FcBP -S er )- NHCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NHCONH CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 NH 2 의 제조
하기 과정에서 사용된 시약의 양은 0.25 mmole를 기초하였다. 0.5 g의 O-bis-(아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 레진(0.5 mmole/g, Novabiochem, 미국)를 합성반응기에 넣고 DCM으로 불린 후, 카보닐디이미다졸(carbonyldiimidazole)(243 mg, 1.5 mmole, Aldrich)을 4 ml DMF에 녹인 용액으로 4시간 처리하여 활성화시켰다. DCM으로 레진을 세척한 후 과량의 O-bis-아미노에틸)에틸렌 글리콜(1.48 g, 10 mmole) DMF (5 mL)용액으로 1 시간 처리한 후 DCM으로 세척하였다. 그런 다음 <실시예 2-1>의 방법에 의하여 아미노산 도입, 보호기 제거 및 정제 과정을 거쳐 리간드를 합성하였다.
(a) 정제
상기 <실시예 2-1>에 Ac-(FcBP-1)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2의 제조에서 정제와 동일한 방법으로 수행한 결과, Ac-(FcBP-2)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2 는 MW = 1854.11 및 M+1 1855.11으로 확인되었다.
<실시예 3> FcBP 친화성 레진의 제작
상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>에서 제조한 각각의 FcBP-링커 혼성체를 이용한 친화성 레진을 제조사의 프로토콜에 따라 제작하였다. 구체적으로, 5 mL의 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)(Sigma-Aldrich, USA])-activated SepharoseTM 4 Fast Flow(GE 헬스케어, Uppsala, Sweden)를 30 mg FcBP가 포함된 0.2 M NaHCO3(pH 8.5; 10 mL)과 함께 4 ℃에서 하루 동안 반응시켰다. 펩타이드 용액을 제거한 후에, 비드(bead)를 블로킹 완충용액(blocking buffer)(150 mM NaCl)을 포함하는 0.5 M 에탄올아민(ethanolamine, pH 8.5)으로 세척한 후 상기 동일한 완충용액으로 한 시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 증류수로 세척한 후 비드(bead)를 4 ℃에 보관하였다. 레진에 고정된 펩타이드의 양은 대략 2.5 ± 0.5 mg/mL 습식 레진이었으며, 이는 회복된 펩타이드의 차감에 의해 계산되었다. 펩타이드는 몰 흡광 계수 펩타이드는 몰 흡광 계수(ε = 12,863 M-1cm-1 (FCBP-1), 5930 M-1cm-1 (FCBP-2) 및 7210 M-1cm-1 (FCBP-3))를 이용하여 UV-VIS 분광 광도계(spectrophotometer)에서 280 nm 흡광도를 측정하여 정량하였다. 상기 계수는 실험으로 결정되었다.
<실시예 4> FcBP 친화성 칼럼의 제작
상기 <실시예 3>에서 제작된 각각의 FcBP 친화성 레진을 이용하여 칼럼을 제작하였다.
한편, FcBP는 내부에 이황화 결합을 가지고 있는 FcBP(비특허문헌 16)로서, 상기 이황화 결합이 IgG 결합에 필수적인지 아닌지를 조사하기 위하여, 추가적으로 하기 두 개의 펩타이드 칼럼을 제작하였다. FcBP-Ser 칼럼은 FcBP의 아미노산 서열에서 두 개의 시스테인 잔기를 세린(serine)으로 치환시킨 다음, 변형된 펩타이드를 칼럼에 적재하여 제작하였다. 또다른 하나인 FcBP-Red 칼럼은 FcBP 칼럼을 사용하기 전에 이황화 결합을 감소시키기 위해 50 mM의 DTT로 처리하여 제작하였다(비특허문헌 17).
<실험예 1> FcBP 친화성 칼럼의 IgG에 대한 정제능력 분석
상기 제작된 FcBP 칼럼, FcBP-Ser 칼럼, FcBP-Red 칼럼, 단백질 A 칼럼 및 단백질 G 칼럼의 IgG에 대한 결합 친화성을 비교분석하기 위해, 허셉틴(Herceptin, Roche)에 대한 결합력을 측정하였다.
이때, 사용된 FcBP 칼럼은 NH2(CH2CH2O)6CH2CH2CO-DCAWHLGELVWCT-NH2 [NH2(CH2CH2O)6CH2CH2CO-AspCys*AlaTrpHisLeuGlyGluLeuValTrpCys*Thr-NH2](상기 이황화-결합된 시스테인은 특수기호 (*)로 표시하였음)를 사용하였고, FcBP-Ser 칼럼은 NH2(CH2CH2O)6CH2CH2CO-DSAWHLGELVWST-NH2 [NH2(CH2CH2O)6CH2CH2CO-AspSerAlaTrpHisLeuGlyGluLeuValTrpSerThr-NH2]를 사용하였다.
상기 허셉틴은 인간 IgG1 타입의 치료용 항체로서 알려져 있기 때문에 IgG의 모델로 선택하였다.
IgG에 대한 결합 친화성은 다음과 같이 측정하였다. 흡착 칼럼을 이용한 IgG 정제 능력을 측정하기 위하여, 칼럼을 ACTA FPLC(GE Healthcare)에 부착한 후 허셉틴 정제 실험을 수행하였다. 100 mM 인산염(phosphate) 완충용액(pH 8.0)으로 평형화시킨 후, 상기의 완충용액 5 mL에 36.5 mg 및 20 mg의 허셉틴을 각각 용해시켜 항체 시료를 제조한 다음, 칼럼에 흡착시켰다. 항체를 pH 구배 완충용액로 pH 8.0에서 pH 2.0으로 순차적으로 녹여서 분리하였고, 인산염 및 구연산(citrate)(pH 2.0 및 50 mM) 완충용액의 비를 조절하여 완성하였다. 용출액은 l mL씩 분취하였으며, UV 흡광도 254 nm에서 관찰하면서 UV 흡광도를 보이는 분획을 취한 다음 바로 붕산계 완충용액(1 M 및 pH 8.5)으로 중화시킨 후, SDS-PAGE로 단백질을 분석하였다. 단백질 양은 브레드포드 분석(Bradford assay)으로 측정하였다.
그 결과, 각각의 친화성 칼럼에 허셉틴을 대량으로 적재하였을 때(36.5 ㎎), FcBP 칼럼이 단백질 A 및 단백질 G 칼럼에 비하여 눈에 띄게 높은 결합력을 나타내었다(도 1a). 단백질 A 칼럼은 용출 완충용액이 pH 2.3일 때 결합된 항체가 최대로 용출되기 시작되었고, 단백질 G 및 FcBP 칼럼은 pH 2.1에서 결합 항체가 최대로 용출되기 시작하였다. FcBP의 결합은 단백질 A/허셉틴 결합보다 단백질 G/허셉틴 결합과 더 유사함을 확인하였다(도 1b 참조).
한편, FcBP 칼럼 중에서, 상기 실시예 <2-3> 및 <2-4>에서 제작된 혼성체를 이용한 칼럼은 각각 항체 결합 후 해리속도가 빨라서 pH 3.0 ~ 4.0의 완충용액으로 항체의 용출이 가능하였다. 또한, 상기 실시예 <2-1> 및 <2-4>에서 제작된 2개의 시스테인이 분자 내에 이황화 결합을 한 FcBP를 포함하는 혼성체를 이용한 칼럼은 각각 pH 2.5 ~ 3.0의 완충용액으로 항체의 용출이 가능한 반면에, 2개의 시스테인이 분자내 이황화 결합이 없는 FcBP를 포함하는 혼성체를 이용한 칼럼은 pH 3.0 ~ 5.0의 완충용액으로 항체의 용출이 가능하였다.
하기 표 2에서 보는 바와 같이, FcBP 칼럼의 결합력이 단백질 A 칼럼 및 G 칼럼에 비해 인간 IgG에 대한 결합력이 우수하였다. 이는 FcBP가 인간 IgG에서 단백질 G (Kd = 20 nM) 보다 더 낮은 결합 친화성(Kd = 85 nM)을 가졌음에도 불구하고(Y. Jung, H.J. Kang, J.M. Lee, S.O. Jung, W.S. Yun, S.J. Chung, B.H. Chung, Anal.288 Biochem. 374 (2008) 99), 레진 표면에서 FcBP의 높은 분자 밀도를 보여주며, 이는 단백질 친화성 리간드와 비교해서 FcBP의 작은 분자량, 레진에서 단백질 G의 낮은 밀도뿐만 아니라 IgG의 결합 효율성의 증가에 기인할 수 있는 것이다. 친화성 칼럼에서 회수율을 비교하였을 때 최대 결합력보다 낮은 허셉틴의 양(20 ㎎)을 적용하였다. 하기 표 2에서 주어진 바와 같이 FcBP 칼럼은 단백질 칼럼보다 더 높은 회수율을 나타내었다. 게다가 FcBP-Red 칼럼도 단백질 A 칼럼 및 G 칼럼에 비해 회수율이 높았다.
FcBP의 IgG 회수율

리간드
(㎎/μmole)a 		최대 IgG 결합
(㎎/μmole)		 IgG 회수율c
적용한 양
(㎎/μmole)		 용출된 양
(㎎/μmole)b 		회수율(%)
실시예 <1-1> 3/1.61 26.6/0.18 20.0/0.14 18.2/0.12 91.1
실시예 <1-2> 2.5/1.37 24.3/0.16 20.0/0.14 17.9/0.12 86.4
실시예 <1-3> 2.6/1.41 25.2/0.17 20.0/0.14 17.7/0.12 85.4
실시예 <1-4> 2.5/1.36 8.1/0.05 20.0/0.14 7.8/0.05 37.6
실시예 <2-1> 2.2/1.29 23.6/0.16 20.0/0.14 17.9/0.12 86.4
실시예 <2-2> 2.1/1.26 22.3/0.15 20.0/0.14 17.7/0.12 85.4
실시예 <2-3> 2.1/1.25 22.5/0.15 20.0/0.14 17.6/0.12 84.9
실시예 <2-4> 2.0/1.20 7.9/0.05 20.0/0.14 7.2/0.05 34.7
실시예 <2-5> 2.9/1.54 24.1/0.16 20.0/0.14 18.0/0.12 86.9
실시예 <2-6> 2.7/1.47 23.2/0.16 20.0/0.14 17.8/0.12 85.9
실시예 <2-7> 2.8/1.51 22.1/0.15 20.0/0.14 17.7/0.12 85.4
FcBP-red 3/1.61 19.2/0.13 20.0/0.14 16.1/0.11 81.0
단백질 A 2/0.12 22.4/0.15 20.0/0.14 15.4/0.10 77.0
단백질 G 6/0.14 24.8/0.17 20.0/0.14 16.7/0.11 82.9
a각각의 리간드를 1 ㎖ 습식 레진에 고정시켰다. 단백질 G 및 단백질 A의 분자량은 각각 17,000 Da 및 42,000 Da이다(GE Healthcare). b허셉틴의 최대 초과량(36.5 ㎎)을 칼럼에 적용하였다. C허셉틴의 분자량은 148,000 Da이다(비특허문헌 18).
<실험예 2> FcBP에서 이황화 결합의 IgG 결합에 대한 영향 분석
상기 <실험예 1>에서 분석한 허섭틴에 대한 친화도를 이용하여 FcBP에서 이황화 결합의 IgG 결합에 미치는 영향을 분석하였다.
그 결과, FcBP-Red는 이황화 결합이 없음에도 불구하고 IgG에 대한 상당한 결합력이 있었다. FcBP-red 칼럼은 단백질 A 또는 FcBP 칼럼을 사용했을 때 나타나는 결과 보다 높은 pH에서 항체가 용출되기 시작하였고, 단백질 A 또는 단백질 G보다 더 순조롭게 IgG가 분리되었다(도 1c). 한편, FcBP에서 시스테인 잔기가 세린으로 치환되면 결합력이 감소하였으며, 이에 시스테인 잔기는 FcBP가 IgG 결합을 하는데 필수적인 것을 확인하였다(도 1d).
<실험예 3> FcBP 칼럼의 돼지 혈청 유래 IgG의 정제능 분석
미생물에 감염된 돼지가 생산한 항체는 해당 미생물에 의한 질병의 진단에 상업적으로 널리 사용될 수 있기 때문에(J. Yang, M. Jin, J. Chen, Y. Yang, P. Zheng, A. Zhang, Y. Song, H. Zhou, H. Chen, J. Vet. Diagn. Invest. 19 (2007) 355), 돼지 혈청으로부터 분리된 IgG을 사용하여 정제 수준을 분석하였다.
돼지의 혈청으로부터 얻은 IgG 정제하기 위하여 돼지 혈청을 6배의 100 mM 인산염 완충용액(pH 8.0)에 희석하였고, 상기 완충용액이 평형이 되게 칼럼에 직접 주입하였다. 주입하는 양은 2 ~ 5 mL 사이로 다양하게 하였고, 전체 혈청 단백질 양의 10 ~ 50 mg을 포함하였다. 친화성 칼럼에 내린 다음에 pH 구배 완충용액으로 용출·정제하였다. 정제된 IgG는 웨스턴 블랏으로 확인하였다. FcBP 칼럼의 안정성을 측정하기 위해, 전체 혈청 단백질의 40 mg을 포함하는 100개의 샘플(sample)을 순차적으로 정제하였다. IgG의 순도를 확인하기 위하여, SDS-PAGE를 수행하였고 상기의 결과를 멀티 게이지(Multi Guage, LAS-3000 소프트웨어 푸지 필름)로 평가하였다.
그 결과, FcBP 칼럼 및 단백질 G 칼럼의 용출 크로마토그램(elution chromatograms)은 인간 IgG를 정제할 때와 유사하였고, FcBP 및 단백질 A 칼럼의 용출 크로마토그램도 유사한 모양을 나타내었다(도 2).
돼지 IgG 항체를 상기 3가지 칼럼으로 정제하였고 SDS-PAGE 분석 및 브레드포드 분석으로 정량화한 결과 순도 및 회수율이 모두 매우 유사하였다. SDS-PAGE 분석의 도면을 확인한 결과 정제된 IgG는 친화성 칼럼의 종류에 상관없이 95% 이상의 순도로 정제되었다. FcBP 칼럼으로 정제한 것은 돼지 IgG 항체를 사용하여 웨스턴 블랏으로 시각화하였다(도 3).
또한, FcBP 칼럼으로부터 돼지 IgG의 회수량을 측정하였다. 총 혈청 단백질의 10 내지 50 ㎎은 FcBP 칼럼에 적재할 때 용출 크로마토그램(chromatogram)과 유사하였다(도 4). 그러나 적재한 단백질의 총량이 늘어날수록 IgG 회수율은 감소하였으나(표 3), 칼럼에서 항체의 용출시간은 그대로 유지되었다(도 4). 1차 정제에서 결합하지 않고 흘러나온 샘플은 다시 동일 칼럼에 적용하여 추가로 IgG를 다시 정제할 수 있었다.
FcBP 흡착 칼럼의 재사용에 따른 IgG의 회수량을 확인함으로써 흡착칼럼의 내구성을 실험하였다. FcBP 친화성 칼럼을 5, 10, 15, 20, 25 및 30회를 반복하여 항체정제에 사용한 후 그 결과를 분석하였다. 그 결과, FcBP 칼럼에 돼지 혈청 샘플을 사용하여 30번을 사용하는 동안에도 전체 분리 능력이 유지되는 것으로 나타났다(도 5). 상기 실험을 그 이후 100회 이상 반복되었으며, 비슷한 효과를 관찰하였다.
적재한 단백질 총량에 따른 FcBP 흡착 칼럼의 회수율
적재한 단백질 총량(㎎) 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0
IgG 분리량(㎎) 3.0 5.2 7.4 9.0 10.0
회수률(%) 30.0 26.0 24.7 22.5 20.0
<실험예 4> FcBP의 돼지 IgG에 대한 결합 친화성 분석
FcBP와 돼지 IgG의 결합 친화성을 확인하기 위하여, 표면 플라즈마 공명(Surface Plasma Resonance, SPR) 분석으로 돼지의 IgG에서 FcBP 결합 해리 상수를 측정하였다.
SPR 칩 표면에 돼지 IgG를 코팅한 후, 50, 100, 200 및 400 nM의 다양한 농도의 FcBP 용액을 처리하여 해리 상수(dissociation constant)를 측정하였다. 돼지의 IgG는 비아코어(Biacore AB, Uppsala, Sweden)에서 공급하고 있는 덱스트란 기질(dextran matrix)이 결합되어있는 CM5 센서 칩(sensor chip, CM-5 Au) 상에서 진행되었으며, 제조자의 프로토콜에 따라 실험을 진행하였고 SPR 분석은 비아코어 X(Biacore X)를 사용하여 진행하였다.
카르복시메틸화 덱스트란 표면에 200 mM 1-에틸-3-3-디메틸아미노 프로필카르보디이미드(1-ethyl-3-3-dimethyl아미노 propylcarbodiimide, EDC)(Sigma-Aldrich, USA) 및 50 mM NHS의 혼합수용액을 7 ㎕/min의 유속으로 7분 동안 주입하였다. FcBP-아세테이트완충액(FcBP 25 ㎍/ 아세테이트 완충액 1 ml (pH 4.5, 10 mM))을 상기 활성화된 SPR칩에 주입한 후, 1 M 에탈올아민 염산염(ethanolamine hydrochloride, pH 8.5) 수용액으로 7분 동안 처리하여 잔존하는 NHS 에스테르를 불활성화 시킴으로써 FcBP 칩을 제작하였다. 돼지에서 유래한 IgG를 50, 100, 200, 400 및 800 nM의 농도로 25 ℃에서 30 ㎕/min의 유속으로 칩 표면에 주입하였고, 각각의 분석 사이클 마지막에서 칩의 표면을 20 mM NaOH로 1분간 세척함으로써 칩표면을 재생시켰다. 상기의 보정(background) 자료를 뺀 후에, 결합 상수는 칩 제조자로부터 제공된 비아이밸류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어를 사용하여 랭뮤어(Langmuir)(1:1) 모델에서 측정한 결과 해리 상수(Kd)가 79 ±2 nM임을 밝혀내었다. 흥미롭게도 결과의 해리 상수의 값은 토끼의 IgG(Kd = 305 nM)보다 인간 IgG(Kd = 85 nM)의 FcBP 결합과 더 유사하였다(도 6).
<실험예 5> FcBP 흡착칼럼을 이용한 간편한 항체정제 방법
상기 방법으로 제조된 FcBP 흡착 레진을 내경 1 cm 및 길이 10 mL 칼럼에 충진하여 흡착칼럼을 제작하였다.
흡착칼럼을 0.1 M, pH 8.0 인산완충액(50 mL)으로 씻어 주었고 인산완충액으로 희석한 항체용액(또는 혈청)을 0.5 ml/min의 속도로 칼럼에 흘려주어 항체를 흡착시켰다(상기 조건에서 항체배양액의 경우 최대 44 mg의 항체가 1 ml의 레진에 흡착된다.). 샘플의 적용이 끝난 후, pH 6.0 MES 완충액(100 ml)으로 칼럼을 씻어주었다. 그런 다음 pH 3.0 구연산 완충액이나, pH 2.5 글리신 완충액으로 항체를 용출하였다. 이때 용출되는 항체 분액은 바로 pH 8.0 1. 0 M Tris 완충액으로 중화하여 변성을 방지하였다. 정제된 항체분액은 SDS PAGE방법과 Bradford 시험법으로 확인 정량한 후, 그 자체로 혹은 적절한 완충액으로 투석한 후 동결건조하여 보관 하였다. 상기 사용된 완충액은 필요에 따라 유사한 pH를 가진 다른 완충액으로 변경하여도 동일한 정제효과를 얻을 수 있었다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Adsorbent columns using antibody Fc-binding peptide <130> 12p-06-11 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP-DCHKRSFWADNCT <400> 1 Asp Cys His Lys Arg Ser Phe Trp Ala Asp Asn Cys Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP-DCRTQFRPNQTCT <400> 2 Asp Cys Arg Thr Gln Phe Arg Pro Asn Gln Thr Cys Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP-DCQLCDFWRTRCT <400> 3 Asp Cys Gln Leu Cys Asp Phe Trp Arg Thr Arg Cys Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP-DCFEDFNEQRTCT <400> 4 Asp Cys Phe Glu Asp Phe Asn Glu Gln Arg Thr Cys Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP-DCLAKFLKGKDCT <400> 5 Asp Cys Leu Ala Lys Phe Leu Lys Gly Lys Asp Cys Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP-DCWHRRTHKTFCT <400> 6 Asp Cys Trp His Arg Arg Thr His Lys Thr Phe Cys Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP-DCRTIQTRSHWCT <400> 7 Asp Cys Arg Thr Ile Gln Thr Arg Ser His Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP-DCIKLAQLHSVCT <400> 8 Asp Cys Ile Lys Leu Ala Gln Leu His Ser Val Cys Thr 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP-DCWRHRNATEWCT <400> 9 Asp Cys Trp Arg His Arg Asn Ala Thr Glu Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP-DCQNWIKDVHKCT <400> 10 Asp Cys Gln Asn Trp Ile Lys Asp Val His Lys Cys Thr 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP-1 <400> 11 Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP-2 <400> 12 Asp Cys Ala Phe His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP-3 <400> 13 Asp Cys Ala Tyr His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcBP-Ser <400> 14 Asp Ser Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Ser Thr 1 5 10

Claims (14)

  1. 항체의 Fc 부위와 결합하는 서열번호 11 내지 13 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드(Fc binding peptide, FcBP)가 고정된 레진이 장착된 항체 정제용 흡착 칼럼.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 면역글로불린 G(Immunoglobulin G , IgG)의 Fc 부위(domain)에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 정제용 흡착 칼럼.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 레진은 서열번호 1 내지 10, 또는 서열번호 14 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 하나 이상 더 고정시키는 것을 특징으로 하는 항체 정제용 흡착 칼럼.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 펩타이드 N-말단 또는 C-말단에 링커(linker)가 결합된 혼성체인 것을 특징으로 하는 항체 정제용 흡착 칼럼.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 5항에 있어서, 상기 혼성체는 하기 구조들로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 항체 정제용 흡착 칼럼:
    1) 아미노-dPEG6-DCAWHLGELVWCT;
    2) 아미노-dPEG6-DCAFHLGELVWCT;
    3) 아미노-dPEG6-DCAYHLGELVWCT;
    4) Ac-DCAWHLGELVWCT-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2;
    5) Ac-DCAFHLGELVWCT-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2;
    6) Ac-DCAYHLGELVWCT-NHCH2CH2O CH2CH2OCH2CH2NH2;
    7) Ac-DCAWHLGELVWCT-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2;
    8) Ac-DCAFHLGELVWCT-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2; 및
    9) Ac-DCAYHLGELVWCT-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCONHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 레진은 아가로스, 세파로스, 셀룰로스, 덱스트란, 폴리아크릴 레이트 및 폴리스틸렌으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 정제용 흡착 칼럼.
  10. 1) 제 1항의 흡착 칼럼에 항체를 포함하는 시료를 처리하여 상기 흡착 칼럼에 항체를 결합시키는 단계;
    2) 세척하여 결합된 항체만 남기는 단계; 및
    3) 세척된 흡착 칼럼으로부터 부착된 항체를 분리 용출시켜 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 정제 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 단계 1)의 항체의 결합은 pH 6.5 내지 pH 8.0에서 수행하는 것을 특징으로 하는 항체의 정제 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 단계 2)의 세척하여 결합된 항체만 남긴 단백질의 세척은 pH 5.5 내지 pH 6.5의 완충용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 항체의 정제 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 단계 3)의 항체의 용출은 pH 구배 완충용액 또는 일정 pH 완충액을 이용하는 것을 특징으로 하는 항체의 정제 방법.
  14. 제 10항에 있어서, 상기 단계 3)의 항체의 용출은 pH 2.5 내지 pH 5.0에서 용출되는 것을 특징으로 하는 항체의 정제 방법.
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