KR101664338B1 - 면역글로불린 Ｇ의 Ｆｃ 부위에 선택적으로 결합하는 신규 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)의 Fc 단편(fragment)에 특이적으로 결합하는 펩타이드로서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 11번 위치의 트립토판(trp)이 화학식 1로 표시되는 알라닌계 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 가짐으로써, IgG에 대한 결합력이 조절되어, IgG에 대한 우수한 결합력을 갖는 IgG 고정용 기판, 단분자막의 용도로 활용되거나, 우수한 정제 능력을 갖는 IgG 정제용 칼럼에 유용하게 이용될 수 있는, 면역글로불린 Ｇ의 Ｆｃ 부위에 선택적으로 결합하는 신규 펩타이드에 관한 것이다.

Description

면역글로불린 Ｇ의 Ｆｃ 부위에 선택적으로 결합하는 신규 펩타이드 {Novel peptides with specific binding to Fc domain of Immunoglobulin G}
본 발명은 면역글로불린 Ｇ의 Ｆｃ 부위에 선택적으로 결합하는 신규 펩타이드에 관한 것이다.
항원-항체 반응을 이용한 면역센서, 표적지향형 약물전달시스템(targeted drug delivery system), 단백질 칩, 진단 키트 등의 면역반응을 이용한 응용 분야에서 다양한 고체 물질(흡착지, 나노입자, 마이크로입자, 유리 및 금 등)의 표면 또는 다른 생체분자(펩타이드, 단백질, 핵산 및 리피드 등)에 항체를 고정하는 것은 필수 불가결한 과정이다. 따라서 항체의 항원결합부위가 표면에 잘 노출될 수 있도록 항체의 배향성(orientation)을 조절하여 그 고유한 결합 특성을 유지하면서 높은 재현성을 가지고 항체를 고정하는 기술은 칩 또는 센서의 검출 감도에 직접적으로 연결될 뿐 아니라, 약물 전달체의 생체적용을 위하여 필수불가결한 요소이다.
현재까지 고체기질 표면에 항체를 고정하는 방법은 주로 물리적 흡착 또는 선택성이 결여된 공유결합형성 반응에 의존하고 있다. 그러나 이러한 방법으로 항체를 고정하게 되면 입체적 장애(steric hindrance) 또는 무작위적 배향(random orientation) 등의 원인으로 항체 고유의 활성을 감소시키는 결과를 초래한다.
이에 대한 대안으로 단백질 A(Protein A)와 단백질 G(Protein G) 등과 같은 미생물 유래의 항체결합 단백질들(Antibodybinding proteins)이 사용되기도 한다. 상기 단백질들은 항원-항체 반응에 참여하지 않는 항체의 Fc 부위에 강하게 결합함으로써 항원의 접근성을 용이하게 한다. 또한, 상기 단백질들과 항체와의 결합에는 별도의 화학적 수식이 필요하지 않으므로 항체의 고유 기능을 해치지 않는 장점이 있다. 따라서 최근에는 유전공학적, 화학적 방법으로 항체결합 단백질을 변형시킴으로써 상기 문제를 극복하는 연구에 초점이 맞춰지고 있다. 그러나 상기 단백질들은 고비용성, 저안정성, 정제 과정에서의 오염물질 혼합가능성, 항체 활성 감소 및 선택성의 결여 등과 같은 단점을 가지고 있다.
상기 문제점을 극복할 수 있는 방법으로써 저분자 물질에 대한 연구가 이루어지고 있다. 지금까지 덴드리머(dendrimer), 철 이온 또는 캘릭스크라운(calixcrown) 유도체들을 이용한 방법들이 개발되었으나 상기 방법들은 항체에 대한 배향성 조절 및 선택성 없이 모든 종류의 단백질에 비슷한 정도의 결합을 나타내며 결합력이 강력하지 못하다는 단점이 있다.
한국등록특허 제738496호에는 자성 미세입자 및 배향성 고정화 리간드를 이용한 항체단백질 분리방법이 개시되어 있으나, 상기 문제점에 대한 대안을 제시하지 못하였다.
한국등록특허 제738496호
본 발명은 IgG에 대한 결합력을 용이하게 조절할 수 있는 신규 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 신규 펩타이드의 C-말단 또는 N-말단에 링커가 부착된 펩타이드 혼성체을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 펩타이드 혼성체가 부착된 기판, 상기 펩타이드 혼성체에 IgG가 결합된 단분자막, 이를 포함하는 면역 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 펩타이드 혼성체를 이용한 IgG 정제용 흡착 칼럼을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)의 Fc 단편(fragment)에 특이적으로 결합하는 펩타이드로서,
서열번호 1의 아미노산 서열에서 11번 위치의 트립토판(trp)이 하기 화학식 1로 표시되는 알라닌계 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는, 펩타이드:
[화학식 1]
Figure 112014051720093-pat00001
(식 중, R은 탄소수 6 내지 18의 1환 또는 2환의 아릴기이고, 방향족 환은 헤테로 원자를 포함할 수 있음).
2. 위 1에 있어서, 서열번호 2 내지 6으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는, 펩타이드.
3. 위 1에 있어서, 서열번호 2 또는 6 의 아미노산 서열을 갖는, 펩타이드.
4. 위 1에 있어서, 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는, 펩타이드.
5. 하기 구조식 1 내지 3으로부터 선택되는 어느 하나의 구조를 갖는 펩타이드 혼성체:
[구조식 1]
H2N(CHnCH2O)2CH2CH2CO-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Xaa-Cys*-Thr-NH2
(식 중, n은 1 내지 30의 정수이고, Cys*는 이황화 결합이고, Xaa는 1-NAL, 2-NAL, hPhe, Phe 또는 BTA임)
[구조식 2]
Cap-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Xaa-Cys*-Thr-HNCH2CH2(OCH2CH2)nNH2
(Cap는 아세틸기 또는 숙시닐기이고, n은 1 내지 30의 정수이고, Cys*은 이황화 결합이고, Xaa는 1-NAL, 2-NAL, hPhe, Phe 또는 BTA임)
[구조식 3]
Cap-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Xaa-Cys*-Thr-HNCH2CH2(OCH2CH2)mYCH2CH2(OCH2CH2)nNH2
(Cap는 아세틸기 또는 숙시닐기이고, m 및 n은 서로 독립적으로 1 내지 30의 정수이고, Cys*는 이황화 결합이고; Xaa는 1-NAL, 2-NAL, hPhe, Phe, 또는 BTA이고, Y는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 탄소수 6 내지 18의 아릴렌기, 산소(-O-), 아민(-NH-), 유레아(-NHCONH-), 아미드(-CONH-) 또는 에스테르(-COO-)임).
6. 위 5에 있어서, 상기 구조식 1 내지 3 중 Xaa는 1-NAL 또는 BTA인, 펩티드 혼성체.
7. 위 5에 있어서, 상기 구조식 1 내지 3 중 Xaa는 2-NAL, hPhe 또는 Phe인, 펩티드 혼성체.
8. 일면에 청구항 5의 펩티드 혼성체가 부착된 IgG 고정용 기판.
9. 위 8에 있어서, 상기 펩티드 혼성체는 Xaa가 1-NAL 또는 BTA인, IgG 고정용 기판.
10. 위 8의 IgG 고정용 기판의 펩티드 혼성체에 IgG가 결합된 IgG 단분자막.
11. 위 10의 단분자막을 포함하는 면역 센서.
12. 위 5의 펩티드 혼성체가 부착된 레진을 구비한 IgG 정제용 흡착 칼럼.
13. 위 12에 있어서, 상기 펩티드 혼성체는 Xaa가 2-NAL, hPhe 또는 Phe인, IgG 정제용 흡착 칼럼.
본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열 중 특정 위치의 아미노산이 알라닌계 아미노산으로 치환됨으로써 IgG에 대한 결합력이 조절되어, IgG 고정이나 정제의 용도로써 유용하게 활용 가능하다.
본 발명의 IgG에 대한 결합력이 개선된 펩타이드는 IgG에 대한 결합력이 매우 우수하여, IgG 고정용 기판, 단분자막, 면역 센서의 용도로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 IgG에 대한 결합력이 감소된 펩타이드는 IgG에 대한 결합력은 우수하면서 온화한 pH 조건에서 IgG를 용출시킬 뿐만 아니라, 복수회의 반복 사용 후에도 우수한 정제 능력을 가져 IgG 정제용 칼럼에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 칼럼을 사용한 항체 정제 시험에서 얻은 세척분액과 전개분액에 대한 SDS PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 각 단계별 전개분액 E2와 E3에 대한 Bradford 발색 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 10 회 단위로 선별한 전개분액 E2에 대한 SDS PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 추가 시험에 대한 세척분액 및 전개분액에 대한 SDS PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Dynmic binding capacity를 측정하기 위해 실시한 크로마토그램이다.
도 6은 Ac-1-NAP-FcBP-BAE에 대한 SPR의 sensogram이다.
도 7은 Ac-BTA-FcBP-BAE에 대한 SPR의 sensogram이다.
도 8은 Ac-2-NAP-FcBP-BAE에 대한 SPR의 sensogram이다.
본 발명은 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)의 Fc 단편(fragment)에 특이적으로 결합하는 펩타이드로서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 11번 위치의 트립토판(trp)이 화학식 1로 표시되는 알라닌계 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 가짐으로써, IgG에 대한 결합력이 조절되어, IgG에 대한 우수한 결합력을 갖는 IgG 고정용 기판, 단분자막의 용도로 활용되거나, 우수한 정제 능력을 갖는 IgG 정제용 칼럼에 유용하게 이용될 수 있는, 면역글로불린 Ｇ의 Ｆｃ 부위에 선택적으로 결합하는 신규 펩타이드에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 신규 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 11번 위치의 트립토판(trp)이 하기 화학식 1로 표시되는 알라닌계 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는다:
[화학식 1]
Figure 112014051720093-pat00002
(식 중, R은 탄소수 6 내지 18의 1환 또는 2환의 아릴기이고, 방향족 환은 헤테로 원자를 포함할 수 있음).
상기 식 중, 헤테로 원자는 N, O, P, S 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
화학식 1로 표시되는 알라닌계 아미노산은 특별히 한정되지 않고, 천연 아미노산이나 비천연 아미노산일 수 있다. 예를 들면 L-페닐알라닌(Phe) 등의 천연 아미노산; L-1-나프틸알라닌(1-NAL), L-2-나프틸알라닌(2-NAL), L-호모페닐알라닌(hPhe), L-3-벤조티에닐알라닌(BTA) 등의 비천연 아미노산일 수 있다.
본 발명의 펩타이드가 서열번호 1의 아미노산 서열에서 11번 위치의 트립토판이 상기 예시한 알라닌계 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 경우, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 신규 펩타이드는 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; 이하 IgG)의 Fc 단편(fragment)에 특이적으로 결합하는 펩타이드(Fc binding protein; FcBP)로서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 11번 위치의 트립토판이 상기 화학식 1로 표시되는 알라닌계 아미노산으로 치환되어 IgG에 대한 결합력이 조절된다. 이는 상기 알라닌계 아미노산의 아릴기의 배향 및 형태가 IgG에 대한 결합 특성에 영향을 미치기 때문인 것으로 판단된다.
치환되는 알라닌계 아미노산의 종류에 따라 본 발명의 펩타이드의 IgG에 대한 결합력을 높이거나 낮출 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 11번 위치의 트립토판이 L-1-나프틸알라닌(1-NAL) 또는 L-3-벤조티에닐알라닌(BTA)으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 경우, IgG에 대한 결합력이 현저히 개선될 수 있다. 그러한 경우에 본 발명의 펩타이드는 IgG의 고정을 위한 용도로 특히 유용하게 사용될 수 있다.
그리고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 11번 위치의 트립토판이 L-2-나프틸알라닌(2-NAL), L-호모페닐알라닌(hPhe) 또는 L-페닐알라닌(Phe)으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 경우, IgG에 대한 결합력이 낮아진다. 그러한 경우에는 본 발명의 펩타이드는 IgG의 정제를 위한 용도로 특히 유용하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 IgG는 인간, 돼지, 토끼, 쥐, 염소 등의 포유류 유래 IgG를 의미하는 것으로, 바람직하게는 인간, 돼지 또는 토끼 유래 IgG일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드의 C-말단 또는 N-말단에 링커를 부가한 펩타이드 혼성체를 제공한다.
전술한 본 발명의 펩타이드는 IgG의 Fc 단편에 결합하므로, IgG를 기판, 레진 등에 고정시켜 항원 항체 반응을 이용하는 면역 센서 또는 IgG 정제용 컬럼을 제조하는 용도로 활용될 수 있다.
링커는 펩타이드를 기판, 레진 등에 용이하게 도입할 수 있도록 하고 용해도를 개선하는 역할을 하는 것으로, 펩타이드의 C-말단 또는 N-말단에 부가될 수 있고, 바람직하게는 C-말단에 부가될 수 있다.
본 발명에 따른 링커는 중량평균분자량이 60 내지 3,000인 PEG(폴리에틸렌글리콜) 또는 1,2-비스-(2-아미노에톡시)에탄(BAE)인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 펩타이드 혼성체는 하기 구조식 1 내지 3 중 어느 하나의 구조를 가질 수 있다:
[구조식 1]
H2N(CHnCH2O)2CH2CH2CO-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Xaa-Cys*-Thr-NH2
(식 중, n은 1 내지 30의 정수이고, Cys*는 이황화 결합이고, Xaa는 1-NAL, 2-NAL, hPhe, Phe 또는 BTA임)
[구조식 2]
Cap-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Xaa-Cys*-Thr-HNCH2CH2(OCH2CH2)nNH2
(Cap는 아세틸기 또는 숙시닐기이고, n은 1 내지 30의 정수이고, Cys*은 이황화 결합이고, Xaa는 1-NAL, 2-NAL, hPhe, Phe 또는 BTA임)
[구조식 3]
Cap-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Xaa-Cys*-Thr-HNCH2CH2(OCH2CH2)mYCH2CH2(OCH2CH2)nNH2
(Cap는 아세틸기 또는 숙시닐기이고, m 및 n은 서로 독립적으로 1 내지 30의 정수이고, Cys*는 이황화 결합이고; Xaa는 1-NAL, 2-NAL, hPhe, Phe, 또는 BTA이고, Y는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 탄소수 6 내지 18의 아릴렌기, 산소(-O-), 아민(-NH-), 유레아(-NHCONH-), 아미드(-CONH-) 또는 에스테르(-COO-)임).
상기 구조식 1 내지 3에서 C-말단 또는 N-말단의 아민(NH2)기가 말레이미드(maleimide), 아지드(azide) 및 알킨(alkyne)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 기능기로 치환될 수 있으며, 그 외 다른 적절한 기능기로 치환된 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 구조식 1 내지 3에서 Xaa는 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산으로, 서로 독립적으로 L-페닐알라닌(Phe) 등의 천연 아미노산 이거나, L-1-나프틸알라닌(1-NAL), L-2-나프틸알라닌(2-NAL), L-호모페닐알라닌(hPhe), L-3-벤조티에닐알라닌(BTA) 등의 비천연 아미노산일 수 있다.
상기 구조식 1 내지 3에서 Xaa가 1-NAL 또는 BTA인 경우, 펩타이드 혼성체의 IgG에 대한 결합력이 현저히 개선되어 IgG의 고정을 위한 용도로 특히 유용하게 사용될 수 있고, Xaa가 2-NAL, hPhe 또는 Phe인 경우, 펩타이드 혼성체의 IgG에 대한 결합력이 상대적으로 낮아져 IgG의 정제를 위한 용도로 특히 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 적어도 일면에 전술한 펩타이드 혼성체가 부착된 IgG 고정용 기판을 제공한다.
본 발명의 IgG 고정용 기판은 IgG의 Fc 단편에 결합하는 펩타이드 혼성체가 적어도 일면에 부착됨으로써, IgG를 그 표면에 부착시켜 고정할 수 있다.
기판은 CM-5 Au 센서 칩, 자성미세입자, 유리판, 금나노입자, PLGA 등 생분해성 유기고분자나노입자; 또는 각종 (미세)웰플레이트[(micro)well plate]; 등일 수 있다.
IgG 고정용 펩타이드 혼성체는 전술한 구조식 1 내지 3 중 하나 이상의 펩타이드 혼성체로서, 구조식 1 내지 3에서 Xaa가 L-1-나프틸알라닌(1-NAL) 또는 L-3-벤조티에닐알라닌(BTA)인 경우 IgG에 대한 결합력이 현저히 개선하므로 특히 바람직하다.
IgG 고정용 펩타이드 혼성체는 링커를 통해 기판에 부착되는 것으로서, 기판은 그 표면에 링커와 결합할 수 있는 반응기를 갖는다. 상기 반응기는 카르복시기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 전술한 IgG 고정용 기판의 IgG 고정용 펩타이드 혼성체에 IgG가 결합된 IgG 단분자막을 제공한다.
본 발명의 IgG 단분자막은 기판의 적어도 일면에 부착된 IgG 고정용 펩타이드 혼성체층 및 상기 펩타이드 혼성체층에 부착된 IgG 층을 포함한다.
또한, 본 발명은 전술한 IgG 단분자막을 포함하는 면역 센서를 제공한다.
면역 센서는 IgG와 이에 특이적으로 결합하는 항원 간의 항원-항체 반응을 검출하는데 사용될 수 있다.
항원-항체 반응의 검출은 SPR, 효소면역분석, 형광탐침을 이용한 형광분석법에 의해 수행될 수 있다. 상기 항원에 특이적으로 결합하는 IgG-발색효소 컨쥬케이트를 결합시키고 세척한 후 상기 발색효소에 의해 발색 반응하는 기질을 가한 후 상기 발색을 측정함으로써 수행될 수 있다.
상기 발색효소는 HRP(HorseradishPeroxidase), GUS(β-Glucuronidase), AP(alkaline phophatase), β-Gal(β-Galactosidase) 및 루시퍼레이즈(luciferase)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이제 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 항원에 특이적으로 결합하는 IgG-형광탐침 컨쥬케이트를 결합시키고 세척한 후 상기 형광을 측정함으로써 수행될 수 있다. 상기 형광탐침은 6-FAM, 플루로레세인(Fluorescein), Cy3, Cy5 및 로다민(Rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 면역 센서를 이용한 항원-항체 반응의 검출은 기판의 종류에 따라 달라질 수도 있다. 예를 들어, 상기 기판이 CM-5 Au 센서 칩인 경우 상기 면역 센서에 항원을 일정한 속도로 주입하면서 표면 플라즈몬 공명법에 의해 항원-항체 결합 정도를 측정할 수 있다. 또한, 상기 기판이 자성미세입자인 경우 상기 자성미세입자 자체를 완충 용액에서 끓인 후, PAGE 방법으로 측정할 수 있다. 아울러, 상기 기판이 유리판인 경우 형광 표지된 IgG를 펩타이드에 처리함으로써 형광을 측정하여 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 IgG 정제용 펩타이드 혼성체가 부착된 레진을 구비한 IgG 정제용 흡착 칼럼을 제공한다.
본 발명에 따른 레진은 아가로스, 세파로스, 셀룰로스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트 및 폴리스티렌으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 세파로스인 것이 더욱 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 IgG 정제용 흡착 칼럼은 IgG를 정제하는 데에 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 흡착 칼럼에 IgG를 포함하는 시료를 처리하여 IgG를 결합시키고, 상기 흡착 칼럼을 세척하여 시료 중 IgG만 남긴 다음, 세척된 흡착 칼럼으로부터 IgG만을 분리 용출시켜 회수함으로써 IgG를 정제할 수 있다.
IgG의 흡착 칼럼에의 결합은 pH 6.5 내지 pH 8.0에서 수행되는 것이 바람직하고, 상기 세척은 pH 5.5 내지 pH 6.5의 완충 용액을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 IgG의 용출은 pH 구배 완충 용액 또는 용출액을 이용하여 수행하는 것이 바람직하나 이제 제한되는 것은 아니다. pH 구배 완충 용액을 사용하는 경우, pH 2.5 내지 pH 5.0의 용출 완충 용액을 사용하여 항체를 용출시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 IgG 정제용 펩타이드 혼성체는 전술한 구조식 1 내지 3 중 하나 이상의 펩타이드 혼성체로서, 구조식 1 내지 3에서 Xaa가 L-2-나프틸알라닌(2-NAL), L-호모페닐알라닌(hPhe) 또는 L-페닐알라닌(Phe) 인 경우 IgG에 대한 결합력이 상대적으로 낮아 IgG의 용출이 용이하다는 점에서 특히 바람직하다.
상기와 같은 본 발명의 IgG 정제용 흡착 칼럼은 IgG에 대한 높은 결합력을 가지고, 흡착된 IgG를 온화한 조건(pH 2.5 ~ 5.0)에서도 용출할 수 있으며, 100번의 재사용 후에도 초기 IgG 정제 능력을 유지할 수 있음을 확인함으로써, 단백질 A 및 단백질 G 혹은 PEG6-FcBP 이용한 흡착 칼럼을 대체하는 IgG 항체 정제용 흡착 칼럼으로 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1. 펩타이드 혼성체의 제조
서열번호 명칭 서열
2 1-NAP-FcBP Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-1-NAL-Cys-Thr
3 2-NAP-FcBP Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-2-NAL-Cys-Thr
4 hPhe-FcBP Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-hPhe-Cys-Thr
5 Phe-FcBP Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Phe-Cys-Thr
6 BTA-FcBP Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-BTA-Cys-Thr
상기 표 1에서 펩타이드, 그리고 이들 펩타이드의 N-말단은 아세틸화 또는 숙시닐화되고, C-말단에 1,8-diamino-3,6-dioxaoctane 링커가 도입된, 하기 표 2에 기재된 펩타이드 혼성체를 고체상 합성법으로 합성하였다.
구분 구조식
1 Ac-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Phe-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2
2 Suc-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Phe-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2
3 Ac-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-hPhe-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2
4 Suc-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-hPhe-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2
5 Ac-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-1-NAL-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2
6 Suc-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-1-NAL-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2
7 Ac-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-2-NAL-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2
8 Suc-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-2-NAL-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2
9 Ac-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-BTA-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2
10 Suc-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-BTA-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2
Cys*는 이황화 결합
명세서에 언급된 다른 펩타이드 및 그 유도체의 합성에도 실시예에 나타난 고체상 펩타이드 합성방법을 사용하여 조달하였다.
펩타이드 합성에 사용된 시약은 DMF, DCM, DIPEA, 0.5 M 2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate(HBTU) 함유 DMF, 0.5 M hydroxybenzotirazole(HOBt) 함유 DMF, 20% 피페리딘 함유 DMF이며, 열거된 Fmoc 아미노산 블록 및 링커를 사용하여 C-말단 아미노산부터 고체상 펩타이드 합성법에 따라 순차적으로 진행하였다.
N-말단 아미노기의 캡핑의 경우, 아세틸로 캡핑하는 경우에는 20% Acetic anhydride 함유 DMF를, 숙신닐로 캡핑하는 경우에는 1.0 M succinic anhydride 함유 DMF를 펩타이드 레진에 처리하여 달성하였다.
보호기 및 레진으로부터의 펩타이드를 절단하는 것은 TFA 절단 용액을 사용하여 진행하였고, 이황결합 반응은 5%-DMSO-20%-ACN in 0.01M potassium phosphate buffer(pH 7.5)에서 펩타이드 농도를 0.1 mg/ml 이하로 유지하는 조건에서 수행하였다. 수득물의 분석 및 반응 진행의 관찰은 분석용 HPLC로 수행하였고, 합성이 완료된 펩타이드의 정제는 prep-HPLC를 사용하여 95% 이상의 순도로 펩타이드 혼성체를 확보하였다.
하기에, 상기 표 2에 기재된 구조식의 펩타이드 혼성체 중, Ac-1-NAL-FcBP-BAE, Ac-2-NAL-FcBP-BAE, Ac-BTA-FcBP-BAE, Ac-hPhe-FcBP-BAE 및 Ac-Phe-FcBP-BAE의 구체적인 합성 방법을 설명한다.
1-1. Ac -1- NAL - FcBP - BAE 의 제조
(i) Ac -1- NAL - FcBP - BAE 의 구조
Figure 112014051720093-pat00003

( ii ) 사용된 Fmoc 아미노산 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-1-NAL-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH
( iii ) 제조 과정
(a) 아미노산 도입
하기 과정에서 사용된 시약의 양은 0.25 mmole에 기초하였다. 0.5 g의 O-bis-(aminoethyl)ethylene glycol trityl resin (0.5 mmole/g, Novabiochem, 미국)를 합성 반응기에 넣고, 각각의 Fmoc-아미노산 블록 1 mmole의 무게를 달아 펩타이드 아미노산 서열 순서대로 C-말단에서부터 N-말단까지 준비하였다.
Fmoc-아미노산을 활성화하여 O-bis-(aminoethyl)ethylene glycol trityl resin에 활성화된 잔기를 부착하는 반응을 C-말단 아미노산부터 순차적으로 진행하였다.
Fmoc의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF에서 수행하였고 잔기의 활성화 및 도입은 서열에 맞추어 준비한 아미노산을 2 ml 0.5 M HOBT 함유 DMF용액, 2 ml 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액, 그리고 174 ul DIPEA와 5분간 혼합한 다음 수지가 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 혼합하였다.
도입 반응의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반응으로 확인되면 도입 반응을 1회 더 반복하거나 20% Ac2O 함유 DMF 용액으로 캡핑을 실시하였다. 각 도입 반응과 Fmoc 제거 과정에서 다음 단계로 넘어가기 전에 DMF와 DCM으로 수지를 충분히 세척하였다. 이러한 과정은 목표한 펩타이드 서열이 완성될 때까지 반복하여 진행하였다.
(b) 캡핑 그룹의 도입.
아미노산 도입이 모두 끝난 다음에 N-말단에 Acetyl을 도입하기 위하여 20% Ac2O in DMF 용액(3x10mlx10min)으로 30 분간 처리하였다. 합성이 끝난 후에, 보호기로 보호된 펩타이드가 부착된 수지를 건조하고 중량을 측정하였다.
(Ac-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Trp(Boc)-His(Trt)-Leu-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-1-NAL-Cys(Trt)-Thr(tBu)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH-Trityl resin, 1.30 g)
(c) 보호기의 제거와 수지의 분리
상기 (b) 과정에서 준비한 펩타이드가 부착된 수지 100 mg을 TFA, TIS, 물 그리고 EDT(94:1.0:2.5:2.5)의 혼합액 2 ml과 함께 실온에서 120분간 교반하여 수지에서 펩타이드를 절단하였다. 절단 혼합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩타이드를 침전시켰다. 침전된 펩타이드를 에테르로 3회 더 세척하고 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% AcCN 함유 물에 녹인 다음 6시간 동안 교반한 다음 농축하였다.
농축액을 5%-DMSO-20%-ACN in 0.01M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 용액에 0.1 mg/ml 농도로 녹인 다음 공기 노출된 상태로 24 시간 교반하였다. 이황화 결합 형성 반응의 진행은 HPLC로 관측하였으며, 더 이상 진행하지 않는 것으로 판단되면 반응액을 동결건조하여 펩타이드 침전물을 얻었다. (31mg)
(d) 정제
상기 (c) 과정에서 동결건조하여 얻은 펩타이드 침전물을 하기 표 3에 기재된 prep-LC 1차 정제 조건에서 분리한 다음 하기 표 4에 기재된 prep-LC 2차 정제 조건으로 추가 정제하고 동결 건조하였다. 얻어진 펩타이드는 각각 98% 이상의 순도임을 분석용 HPLC로 확인하였으며, 합성한 펩타이드의 분자량을 LC/MS 질량 분석기로 확인하였다.
Ac-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-1-NAL-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2 (Cys* 이황화 결합 위치, MW = 1712.77), 24 mg, Purity; 95%up (HPLC), LC/MS: 1713.8 (M+1) 857.6 (M/2 + 1)
prep-LC 1차 정제조건
장비명 Waters 2525 pump, Waters 2487 UV detector
컬럼 Waters, XBridge Prep C18 5um OBD 19x250 mm
이동상A/B 0.1% TFA-20% AcCN / 0.1% TFA in 80% AcCN
구배 0 min → 30 min : B 0% → B 100%
유속 17 ml/min 검출파장 UV 230 nm
prep-LC 2차 정제조건
장비명 Waters 2525 pump, Waters 2487 UV detector
컬럼 Waters, XBridge Prep C18 5um OBD 19x250 mm
이동상 A/B 0.1% TFA-30% AcCN / 0.1% TFA in 70% AcCN
구배 0 min → 20 min : B 0% → B 20%
유속 15 ml/min 검출파장 UV 280 nm
1-2. Ac -2- NAL - FcBP - BAE 의 제조
(i) Ac -2- NAL - FcBP - BAE 의 구조
Figure 112014051720093-pat00004

( ii ) 사용된 Fmoc 아미노산 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-2-NAL-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH
( iii ) 제조 방법
상기 제조예 1-1과 동일한 방법으로, Ac-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-2-NAL-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2(Cys* 이황결합 위치, MW = 1712.77) 19 mg을 확보하였다. Purity: 95%up (HPLC), LC/MS: 1713.7 (M+1) 857.6 (M/2 + 1)
1-3. Ac - BTA - FcBP - BAE 의 제조
(i) Ac - BTA - FcBP - BAE 의 구조
Figure 112014051720093-pat00005
( ii ) 사용된 Fmoc 아미노산 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-BTA-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH
( iii ) 제조 방법
상기 제조예 1-1과 동일한 방법으로, Ac-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-BTA-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2 (Cys* 이황결합 위치, MW = 1718.73), 21 mg을 확보하였다. Purity: 95%up (HPLC), LC/MS: 1719.6 (M+1) 860.6 (M/2 + 1)
1-4. Ac - hPhe - FcBP - BAE 의 제조
(i) Ac - hPhe - FcBP - BAE 의 구조
Figure 112014051720093-pat00006
( ii ) 사용된 Fmoc 아미노산 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-hPhe-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH
( iii ) 제조 방법
상기 제조예 1-1과 동일한 방법으로, Ac-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-hPhe-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2 (Cys* 이황결합 위치, MW = 1676.77), 23 mg을 확보하였다. Purity: 95%up (HPLC), LC/MS: 1677.8 (M+1) 839.6 (M/2 + 1))
1-5. Ac - Phe - FcBP - BAE 의 제조
(i) Ac - Phe - FcBP - BAE 의 구조
Figure 112014051720093-pat00007

( ii ) 사용된 Fmoc 아미노산 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Phe-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH
( iii ) 제조 방법
상기 제조예 1-1과 동일한 방법으로, Ac-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Phe-Cys*-Thr-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2 (Cys* 이황결합 위치, MW = 1662.75), 18 mg을 확보하였다. Purity: 95%up (HPLC), LC/MS: 1663.7 (M+1) 832.5 (M/2 + 1)
실시예 2. 항체 친화성 레진 및 칼럼 제작
실시예 1 에서 제조된 각각의 펩타이드 혼성체를 이용한 친화성 레진을 제조사의 프로토콜에 따라 제작하였다.
구체적으로, 1 mL의 NHS-activated SepharoseTM 4 Fast Flow(GE 헬스케어, Uppsala, Sweden)를 5 mg 펩타이드 리간드 혼성체가 포함된 0.2 M NaHCO3(pH 8.5; 10 mL) 용액과 함께 4 ?에서 하루 동안 반응시켰다. 펩타이드 용액을 제거한 후에, 비드(bead)를 블로킹 완충 용액 (blocking buffer 150 mM NaCl)을 포함하는 0.5 M 에탄올아민(ethanolamine, pH 8.5)으로 한 시간 동안 처리하여 활성형 에스테르(NHS ester)를 불활성화하였다. 그런 다음, 증류수로 세척한 후 비드(bead)를 4℃에 보관하였다. 레진에 고정된 펩타이드의 양은 대략 2.5 ± 0.5 mg/mL 습식 레진이었으며, 이는 회복된 펩타이드의 차감에 의해 계산되었다.
상기 과정에서 제작된 항체 친화성 레진을 가지고 칼럼을 제작하여 내구성 시험과 Dynamic binding capacity를 측정하는데 사용할 수 있도록 준비하였다.
실험예 1. 칼럼을 사용한 IgG 항체 정제 시험
상기 실시예 2을 통하여 제작한 IgG 항체 정제용 레진을 사용하여 100 ㎕ 용량의 간이 칼럼을 제작하여 IgG 항체 정제 효능을 시험하였다. 사용한 항체는 인간 유래 IgG를 사용하였고, 칼럼 세척은 PBS로, 전개용액은 Glycine HCl 완충액 (pH 2.5)을 사용하였으며, 항체 적재, PBS 세척, Gly-HCl 완충액 전개의 단계로 진행하였다. 세척분액과 전개분액에 대하여 SDS PAGE 방법으로 분석하여 정제 효능을 확인하였다(도 1).
도 1을 참조하면, 세척분액에서는 용출되는 항체가 없었으며, 전개분액에서만 항체가 용출되는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 칼럼 내구성 시험
상기 실시예 2를 통하여 제작한 IgG 항체 정제용 레진을 사용하여 1 ml 용량의 칼럼을 제작하여 칼럼 내구성 시험하였다. 사용한 항체는 인간 유래 IgG를 사용하였고, 칼럼 세척은 PBS로, 전개용액은 Glycine HCl 완충액 (pH 2.5)을 사용하였으며, 항체 적재, PBS 세척, Gly-HCl 완충액 전개, PBS 세척의 단계를 100회 이상 반복하여 실시하였다. 각 단계별 항체는 1 mg 적재하였고, 2 ml x 5 PBS로 세척하고, 2 ml x 5 Gly-HCl 완충액으로 전개하고, 추가로 10 ml의 Gly-HCl 완충액과 10 ml PBS로 세척하는 과정으로 초기화 시키는 과정을 반복하여 실시하였다.
1 차 단계에서 세척분액(W)과 전개분액(E)에 대하여 Bradford로 정량하였으며, 세척분액에서는 단백질이 검출되지 않았으며, 전개분액의 두 번째 분액과 세 번째 분액에서 단백질이 검출되었으며 대부분의 단백질이 두 번째 분액에서 검출되었다(표 5).
각 단계의 전개분액 중에서 두 번째 분액에 대해서 Bradford 시험을 실시하여 100회 이상 반복 사용하여도 항체가 전개과정에서 용출되어, 갈색의 시약이 푸른색으로 변화한 것을 확인할 수 있었다(표 5, 도 2).
10 회 단위로 선별한 전개분액에 대하여 SDS PAGE로 분석하여 Bradford 시험에서 확인된 단백질이 시험 과정에서 적재한 항체라는 것을 확인하였다(도 3).
반복 시험이 종료된 후에 실시한 추가시험에서 세척분액과 전개분액을 SDS-PAGE로 분석하여 항체정제 효능을 유지하고 있는 것을 확인하였고(도 4), 두 번째 전개분액으로 실시한 Bradford 시험을 통해 추가 시험에서 단백질 검출량이 유지되고 있는 것을 확인할 수 있었다(표 6).
분액 W1 W2 W3 W4 E1 E2 E3 E4 E5
Au at 595 nm 0.01 0.01 0.01 0.01 0.00 0.36 0.02 0.01 0.00
W = 세척분액, E = 전개분액
시행회수 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Au 0.40 0.31 0.37 0.43 0.40 0.40 0.34 0.39 0.40 0.43 0.39 0.48
시행회수 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Au 0.49 0.41 0.42 0.45 0.43 0.43 0.35 0.48 0.76 0.41 0.49 0.42
시행회수 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
Au 0.39 0.38 0.40 0.40 0.33 0.37 0.36 0.39 0.44 0.33 0.36 0.46
시행회수 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
Au 0.47 0.36 0.42 0.33 0.35 0.39 0.41 0.46 0.45 0.49 0.46 0.45
시행회수 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
Au 0.50 0.35 0.48 0.36 0.47 0.46 0.32 0.39 0.75 0.34 0.36 0.45
시행회수 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72
Au 0.30 0.27 0.38 0.63 0.35 0.36 0.41 0.31 0.43 0.41 0.43 0.49
시행회수 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84
Au 0.26 0.29 0.34 0.44 0.35 0.37 0.42 0.36 0.47 0.34 0.40 0.47
시행회수 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96
Au 0.30 0.37 0.44 0.48 0.39 0.43 0.43 0.43 0.44 0.24 0.19 0.34
시행회수 97 98 99 100 추가
시행		 Auave = 0.41±0.1
Au 0.19 0.61 0.89 0.50 0.46
실험예 3. Dynamic binding capacity
상기 실시예 2을 통하여 제작한 IgG 항체 정제용 레진을 사용하여 칼럼을 제작하여 칼럼의 정제효능을 Dynamic binding capacity (DBC)를 측정하여 확인하였다.
측정 조건,
C0 = 3.0 mg/ml; IgG concentraton (항체 농도, mg/ml)
Vc = 3.46 ml; geometric total volune (칼럼 부피, ml)
V0 = 5.0 ml; bed volume (ml)
V10 % = 60 ml; threshold volume (ml)
Flow rate = 100 cm/h (residence time: 5.4 min) 이었으며,
[수학식 1]
Figure 112014051720093-pat00008
상기 수학식 1에 따라, 47.7 mg/ml의 DBC 값을 확인할 수 있었다(도 5).
실험예 4. SPR 덱스트란 칩 위에 배향성이 고정된 IgG 고정용 펩타이드 혼성체의 항체 결합
4-1. IgG 고정용 펩타이드 혼성체의 배향성 고정화
표면에 카르복시기를 갖는 기판 표면에 실시예 1에서 수득한 펩타이드 혼성체 및 대조물질로 PEG6-FcBP를 고정하였다. 덱스트란 CM-5 Au 센서 칩(Biacore AB, 스웨덴) 위에 0.2 M EDC와 0.05 M NHS를 혼합한 PBS 완충 용액을 7 ul/min의 속도로 흘려주어 센서 칩 표면의 카르복시기를 활성화시켰다. 이어서 100 uM의 펩타이드 혼성체를 포함하는 PBS 완충액을 동일한 속도로 30 분간 흘려주었다. 상기 펩타이드 혼성체들의 아민기가 NHS 에스터로 활성화된 칩 표면의 카르복시기와 결합하였다. 마지막으로 상기 펩타이드 혼성체들과 반응하지 않은 표면을 pH 8.5, 1 M 에탄올아민(ethanolamine) 용액을 처리하여 불활성화시켰다.
4-2. 항체 결합력의 측정
상기 방법으로 펩타이드 혼성체로 표면 처리된 칩과 항체와의 결합력을 시험하였다. 시험에 사용한 항체는 허셉틴을 PBS 용액에 녹여 사용하였으며, 해리 용액은 20 mM NaOH를 사용하였다. 허셉틴 농도별로 결합시키고 해리시키는 과정을 통해 결합 상수를 Biacore T100 기기를 이용하여 표면 플라즈몬 공명법(SPR)으로 측정하였다.
표 7에 기재된 펩티드 혼성체에 대하여 항체 결합력을 측정하였고, 측정 결과는 하기 표 8에 나타내었다(도 6 ~ 도 8).
펩티드 혼성체 구조식
PEG6-FcBP H2N(CH2CH2O)5CH2CH2CO-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys*-Thr-NH2
Ac-1-NAP-FcBP-BAE Ac-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-1-NAP-Cys-Thr-HNCH2CH2(OCH2CH2)nNH2
Ac-2-NAP-FcBP-BAE Ac-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-2-NAP-Cys-Thr-HNCH2CH2(OCH2CH2)nNH2
Ac-Phe-FcBP-BAE Ac-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Phe-Cys-Thr-HNCH2CH2(OCH2CH2)nNH2
Ac-BTA-FcBP-BAE Ac-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-1-NAP-Cys-Thr-HNCH2CH2(OCH2CH2)nNH2
펩티드 혼성체 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(M)
PEG6-FcBP 4.72E+5 1.93E-3 4.08E-9
Ac-1-NAP-FcBP-BAE 5.39E+5 1.27E-4 2.36E-10
Ac-2-NAP-FcBP-BAE 2.46E+6 6.98E-2 2.84E-8
Ac-Phe-FcBP-BAE 1.04E+6 2.98E-3 2.87E-9
Ac-BTA-FcBP-BAE 5.62E+5 1.03E-4 2.31E-10
PEG6-FcBP에 비하여 결합력이 높아진 서열번호 2 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 혼성체 Ac-1-NAP-FcBP-BAE와 Ac-BTA-FcBP-BAE는 배향성이 조절된 IgG 단분자막 제조의 용도로 사용되는 것이 특히 바람직하며, 항체 결합력이 PEG6-FcBP에 비하여 낮추어진 서열번호 3 내지 5의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 혼성체 Ac-2-NAP-FcBP-BAE, Ac-hPhe-FcBP-BAE 및 Ac-Phe-FcBP-BAE는 IgG 항체 정제용 레진 제조의 용도로 사용하는 것이 특히 바람직하다.
보다 구체적으로, Ac-1-NAP-FcBP-BAE와 Ac-BTA-FcBP-BAE는 ka는 기준 물질인 PEG6-FcBP과 비교하여 15 ~ 20% 정도 상승하여 결합력은 다소 증가하였지만, kd 는 각각 1/15과 1/19로 뚜렷하게 낮아져서, IgG가 접합하는 정도는 큰 차이가 없지만 칩에 접합한 IgG와 펩타이드 혼성체 간의 결합력이 매우 강하여 안정성이 개선된 항체 단백질 칩을 제조하는데 적합하다.
한편, Ac-2-NAP-FcBP-BAE는 ka는 5.2 배, kd는 36 배 가량 증가하여 결합력도 증가하여 항체를 잘 붙들어 주지만 매우 완화된 용출조건을 사용할 수 있어서 IgG 항체 정제용 레진 제조에 적합하다.
<110> DONGGUK UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION FOUNDATION NANOHELIX <120> Novel peptides with specific binding to Fc domain of Immunoglobulin G <130> P2014-274 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding Peptide <400> 1 Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xaa is 1-NAL <400> 2 Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Xaa Cys Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xaa is 2-NAL <400> 3 Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Xaa Cys Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xaa is hPhe <400> 4 Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Xaa Cys Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xaa is Phe <400> 5 Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Xaa Cys Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xaa is BTA <400> 6 Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Xaa Cys Thr 1 5 10

Claims (13)

  1. 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)의 Fc 단편(fragment)에 특이적으로 결합하는 펩타이드로서,
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 11번 위치의 트립토판(trp)이 하기 화학식 1로 표시되는 알라닌계 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는, 펩타이드:
    [화학식 1]
    Figure 112014051720093-pat00009

    (식 중, R은 탄소수 6 내지 18의 1환 또는 2환의 아릴기이고, 방향족 환은 헤테로 원자를 포함할 수 있음).
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 2 내지 6으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는, 펩타이드.
  3. 청구항 1에 있어서, 서열번호 2 또는 6 의 아미노산 서열을 갖는, 펩타이드.
  4. 청구항 1에 있어서, 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는, 펩타이드.
  5. 하기 구조식 1 내지 3으로부터 선택되는 어느 하나의 구조를 갖는 펩타이드 혼성체:
    [구조식 1]
    H2N(CHnCH2O)2CH2CH2CO-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Xaa-Cys*-Thr-NH2
    (식 중, n은 1 내지 30의 정수이고, Cys*는 이황화 결합이고, Xaa는 1-NAL, 2-NAL, hPhe, Phe 또는 BTA임)
    [구조식 2]
    Cap-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Xaa-Cys*-Thr-HNCH2CH2(OCH2CH2)nNH2
    (Cap는 아세틸기 또는 숙시닐기이고, n은 1 내지 30의 정수이고, Cys*은 이황화 결합이고, Xaa는 1-NAL, 2-NAL, hPhe, Phe 또는 BTA임)
    [구조식 3]
    Cap-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Xaa-Cys*-Thr-HNCH2CH2(OCH2CH2)mYCH2CH2(OCH2CH2)nNH2
    (Cap는 아세틸기 또는 숙시닐기이고, m 및 n은 서로 독립적으로 1 내지 30의 정수이고, Cys*는 이황화 결합이고; Xaa는 1-NAL, 2-NAL, hPhe, Phe, 또는 BTA이고, Y는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 탄소수 6 내지 18의 아릴렌기, 산소(-O-), 아민(-NH-), 유레아(-NHCONH-), 아미드(-CONH-) 또는 에스테르(-COO-)임).
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 구조식 1 내지 3 중 Xaa는 1-NAL 또는 BTA인, 펩티드 혼성체.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 구조식 1 내지 3 중 Xaa는 2-NAL, hPhe 또는 Phe인, 펩티드 혼성체.
  8. 일면에 청구항 5의 펩티드 혼성체가 부착된 IgG 고정용 기판.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 펩티드 혼성체는 Xaa가 1-NAL 또는 BTA인, IgG 고정용 기판.
  10. 청구항 8의 IgG 고정용 기판의 펩티드 혼성체에 IgG가 결합된 IgG 단분자막.
  11. 청구항 10의 단분자막을 포함하는 면역 센서.
  12. 청구항 5의 펩티드 혼성체가 부착된 레진을 구비한 IgG 정제용 흡착 칼럼.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 펩티드 혼성체는 Xaa가 2-NAL, hPhe 또는 Phe인, IgG 정제용 흡착 칼럼.
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