KR100953917B1 - 항체의 Ｆｃ 영역에 특이적 결합능을 가지는 리포펩타이드 및 그를 포함하는 항원 인지형 지질 나노입자 - Google Patents
항체의 Ｆｃ 영역에 특이적 결합능을 가지는 리포펩타이드 및 그를 포함하는 항원 인지형 지질 나노입자 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 펩타이드(Fc-binding peptide, FcBP)를 포함하는 신규 리포펩타이드, 이를 포함하는 지질 나노입자, 상기 지질 나노입자에 항체가 비공유결합되어 있는 항원 인지형 지질 나노입자, 상기 항원 인지형 지질 나노입자 및 약물을 포함하는 의약 조성물 및 항원 특이적 약물전달체의 제조를 위한 상기 리포펩타이드, 상기 지질 나노입자 또는 상기 항원 인지형 지질 나노입자의 용도에 관한 것이다.
Fc 결합, 리포펩타이드, 항원 인지형 지질 나노입자
Description
본 발명은 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 펩타이드(Fc-binding peptide)를 포함하는 신규 리포펩타이드, 이를 포함하는 지질 나노입자, 상기 지질 나노입자에 항체가 비공유결합되어 있는 항원 인지형 지질 나노입자, 상기 항원 인지형 지질 나노입자 및 약물을 포함하는 의약 조성물 및 항원 특이적 약물전달체의 제조를 위한 상기 리포펩타이드, 상기 지질 나노입자 또는 상기 항원 인지형 지질 나노입자의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자는 지질 나노입자의 표면에 항체의 Fc 영역과 결합할 수 있는 리포펩타이드가 존재하므로 지질 나노입자의 표면에 항체를 비선택적으로 공유결합(random conjugation) 시켰던 기존의 항원 인지형 지질 나노입자와는 달리 지질 나노입자에 결합된 리포펩타이드를 통해 항원 인지능의 저하 없이 항체를 지질 나노입자의 표면에 결합시킬 수 있게 된다. 따라서, 본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자는 치료제, 진단제 등의 다양한 약물의 표적 세포로의 수송 효율을 현저히 증강시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 Fc 결합성 리포펩타이드를 포함하는 지질 나노입자는 리포펩타이드와 항체 사이의 비공유적이고 선택적인 결합을 통해 항체와 결합되므로, 비선택적 공유결합을 통해 항체와 지질 나노입자가 결합되어 있던 기존의 항원 인지형 지질 나노입자의 제조에 비해 반응 시간이 짧고, 단순 혼합을 통해 선택적인 반응이 유도되므로 공정이 간편하여 대량 생산시 경제성이 높다.
암, 자가면역질환, 신경계질환과 같은 난치성 질환을 치료하기 위해 수술, 방사선 요법, 또는 표적 질환 세포에 직접 또는 간접적으로 작용하는 화학의약이나 생물의약을 이용한 약물 치료법이 행해지고 있다.
그러나, 상기 약물들, 특히 항암제들은 주로 빠르게 증식하는 세포에 작용하는 약물로서, 전신의 혈류를 타고 온몸으로 퍼져서 암세포 이외의 빠르게 증식하는 정상세포, 예를 들면, 혈액을 생성하는 골수세포, 머리 및 수염을 빠르게 자라게 하는 모낭세포, 난자 및 정자를 생성하는 생식기 세포, 소화기 점막세포 등에 영향을 끼쳐 부작용을 나타내게 된다. 또한 기타 난치성 질환에 대한 약물들도 표적 질환 세포만을 표적화하는 능력의 부재로 여러 가지 부작용을 낳고 있다. 또한 단백질이나 핵산 등의 생물의약은 혈중에서 쉽게 분해되기에 원하는 표적 지역까지 본래의 상태로 도달할 수 없어 효력을 나타낼 수 없는 단점이 있다.
이러한 상기의 약물의 단점을 극복하기 위하여, 표적 조직의 세포 내부로 약 물을 효과적으로 전달하기 위한 약물 전달체로서 지질 나노입자에 대한 연구가 본격화되었다.
지질 나노입자 중 널리 연구되어온 리포좀은 생체막의 기본 구조인 인지질의 이중층(bilayer)으로 구성되어 있으며, 내부에는 친수성의 공간이 있고 외부로는 닫힌 이중의 지질막을 가지고 있는 미세 소포체를 가리킨다. 리포좀은 중앙의 친수성 공간에 수용성 분자(DNA 포함) 또는 약물을 내포할 수 있으며, 외부의 지질 이중막에는 지용성 약물을 붙이거나, 또는 양전하 또는 음전하 물질을 결합시킬 수 있다. 인지질은 양친매성(amphipathic) 물질로서, 음이온성 또는 양쪽성 이온의 극성 분자단과 탄화수소 16개 내외의 다양한 불포화도를 갖는 2개의 비극성 지용성 사슬을 가지고 있는 분자구조이기 때문에 인지질이 물에 분산되면 자발적으로 이중층을 형성한다.
이러한 지질 나노입자가 표적 질환 세포만을 표적화 한다면, 비표적 세포 또는 조직에 약물이 전달되어 일어나는 부작용을 최소화 할 수 있으며, 진단제를 봉입하여 표적 질환 세포 또는 조직의 비침투적 진단을 가능케 할 것이다. 따라서 비표적 세포에는 존재하지 않거나 발현량이 적으면서 표적 질환 세포 표면에는 과발현 되는 수용체를 표적화하는 약물전달체의 개발이 필요하다. 지질 나노입자를 통한 표적 세포의 표적화는 그의 유효량을 표적 세포에 선택적으로 전달하도록 지질 나노입자를 변형시켜 달성할 수 있다.
현재, 표적 세포에 특이적으로 과발현되는 분자들을 표적화하는 항체가 표면에 수식되어 있는 항원 인지형 지질 나노입자(antigen-recognizing lipid nanoparticle)에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다. 이러한 항원 인지형 지질 나노입자는 항원을 과발현하는 질환세포 또는 조직으로 다양한 치료제 또는 진단제를 선택적으로 보낼 수 있는 장점이 있다. 예를 들어, 종양 세포에 과발현되는 수용체인 HER2를 표적화하는 항-HER2 항체를 함유하는 리포좀을 제조하고 이에 독소루비신등의 항암제를 봉입하여 표적화 약물 전달체를 제조하는 방법 등이 이용되어 왔다(미국공개특허 제2006-0269542호).
기존의 항원 인지형 지질 나노입자는 공유적 접합 (covalent conjugation) 방법에 의해 주로 제조되어 왔다. 공유적 접합 방법은 지질과 각각의 항체 간에 공유결합을 형성시키는 것으로, 항원 인지형 지질 나노입자의 제조에 많은 시간이 소요되어 비효율적이다. 뿐만 아니라, 항체는 비선택적으로 지질 나노입자 표면에 공유결합하게 되기 때문에 항체의 Fc 영역 이나 항원을 인지하는 Fab 영역 모두에 지질과 반응 가능한 아미노산이 있는 경우 항체의 Fab 영역과 지질 간의 결합이 이루어질 수 있다. 그러나 항체의 Fab 영역이 지질 나노입자의 표면에 공유결합된 경우, 이 항체는 항원을 인지하지 못하게 되므로 소기의 목적한 기능을 발휘하지 못하게 되어 지질 나노입자에 결합된 항체 분자들의 개수와 항원 인지능 사이에는 차이가 생기는 현상이 문제점으로 제기되어 왔다.
본 발명은 지질 나노입자가 항체의 Fc 영역과 선택적으로 결합함으로써 항원을 효율적으로 인지할 수 있는 항원 인지형 지질 나노입자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
이를 위해, 본 발명은 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 지질이 결합된 신규 리포펩타이드 및 이를 포함하는 지질 나노입자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 항체의 Fc 결합성 리포펩타이드를 포함하는 지질 나노입자에 항체가 비공유결합되어 있는 항원 인지형 지질 나노입자 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 항원 특이적 약물전달체의 제조를 위한 상기 리포펩타이드, 상기 지질 나노입자 또는 상기 항원 인지형 지질 나노입자의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드(Fc-binding peptide, FcBP)와 지질이 공유결합되어 있는 항체의 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 제공한다.
항원을 인식하는 Fab 영역이 항체마다 그 구조가 다른 것과는 달리, 항체의 Fc 영역은 대부분의 항체에서 그 구조가 보존되어 있다. 따라서, 본 발명에서, 항 체의 Fc 영역 결합 펩타이드는 임의의 항체의 Fc 영역과 결합할 수 있는 펩타이드를 의미한다. 이러한 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드는 당업계에 공지되어 있다. 종래에 공지된 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드는 단백질 등의 생체 물질과 결합시켜 생체 물질의 체내 반감기를 증식시키고자 하는 용도, 또는 형광 물질과 결합시켜 항원을 형광 물질로 레이블링 하려는 용도 등으로 이용되어 왔다. 그러나, 이제까지 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드를 지질과 결합시켜 항체의 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 제조함으로써, 항원 인지형 지질 나노입자의 표적 지향성을 부여하기 위해 이용한 적은 없었다.
따라서, 본 발명에 있어서, 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드는 항체의 Fc 영역을 선택적으로 인식하고 이와 효율적으로 결합할 수 있는 펩타이드라면 어떠한 것이든 사용 가능하다.
항체의 Fc 영역을 선택적으로 인식하는 펩타이드들로서 DCAWHLGELVWCT (W.L. DeLano, M.H. Ultsch, A.M. de Vos, J.A. Wells, Convergent solutions to binding at a protein-protein interface, Science 287 (2000) 1279-1283.), HWRGWV, HYFKFD, HFRRHL (H. Yang, P.V. Gurge, R.G. Carbonell, Purification of human immunoglobulin G via Fc-specific small peptide ligand affinity chromatography, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 910-918.), 하기 구조식 1의 형태의 (RTY)4K2KG (G. Fassina, A Verdoliva, M.R. Odierna, M. Ruvo and G. Cassini, Protein A mimetic peptide ligand for affinity purification of antibodies, J. Mol. Recognit. 9 (1996) 564-569.) 등의 서열의 펩타이드들이 알려져 있다. 이들 Fc 영역 선택적 결합 펩타이드의 경우 혼합물에서 항체를 선택적으로 분리하는 용도로 사용되었다.
본 발명의 Fc 영역 선택적 결합 펩타이드는 예를 들어, 상기 공지의 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드중 하나인 하기 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 하기 구조식 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 분지형 펩타이드일 수 있다.
서열번호 1: DCAWHLGELVWCT
서열번호 2: CDCAWHLGELVWCT
서열번호 3: HWRGWV
서열번호 4: HYFKFD
서열번호 5: HFRRHL
[구조식 1]
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 두 개의 시스테인이 서로 이황화 결합을 형성하고 있어 U자 구조를 나타낸다. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또한 두번째 시스테인과 세번째 시스테인이 서로 이황화 결합을 형성하고 있어 U자 구조를 나타낸다.
상기 구조식 1의 분지형 펩타이드는 서열번호 6(GKKYTR)의 첫번째 리신(Lysine)이 서열번호 7(KYTR)의 첫번째 리신(Lysine)과 결합되어 있고, 서열번호 7(KYTR)의 첫번째 리신(Lysine)이 서열번호 8(YTR)의 첫번째 티로신(Tyrosine)과 결합되어 있고, 또한 서열번호 6(GKKYTR)의 두번째 리신(Lysine)이 서열번호 9(YTR)의 첫번째 티로신(Tyrosine)과 결합되어 있는 것으로서 오른쪽이 N 말단이다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 그들의 C 말단이 아미드화 되어 있을 수 있다. 아미드화는 C 말단의 카복실기의 음전하를 상쇄시키고 C 말단의 카복실기가 다른 펩타이드의 N 말단의 아민기와 결합하는 것을 방지하기 위해 수행될 수 있다.
본 발명의 리포펩타이드에 있어서, 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드와 지질은 공유결합되어 있다. 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드와 지질과의 공유결합의 방식은 특별히 제한되지 않는다. 다만, 본 발명의 리포펩타이드는 지질 나노입자의 형성을 위해 사용되는 것이므로 리포펩타이드가 지질의 헤드기의 말단에 공유결합되는 것이 바람직할 것이다.
한 구체예에서, 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드는 그의 설프하이드릴기(-SH) 또는 N 말단의 아민기(-NH2)를 통해 지질과 공유결합될 수 있다.
본 발명의 리포펩타이드의 제조를 위해 사용되는 지질 또한 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드와 공유결합할 수 있는 것이라면 어떠한 것이든 제한되지 아니한다.
리포펩타이드의 제조의 편의를 위해, Fc 영역 결합 펩타이드와의 공유결합이 용이한 기능기를 가지고 있는 지질을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 지질은 Fc 영역 결합 펩타이드의 설프하이드릴기(-SH) 또는 N 말단의 아민기(-NH2)와 결합할 수 있는 -COOH, -CHO, -NH2, -SH, -S-S-, -CONH2, -PO3H, -PO4H, -SO3H, -SO4H, -OH, -술포네이트, -니트레이트, -포스포네이트, -숙신이미딜기, -말레이미드기, 및 -알킬기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상이 기능기를 가지고 있거나, 이러한 기능기를 갖도록 변형된 것일 수 있다. 이러한 지질은 공지의 방법을 통해 합성하거나 시판되고 있는 것을 구입하여 사용할 수 있다.
Fc 영역 결합 펩타이드의 설프하이드릴기(-SH) 또는 N 말단의 아민기(-NH2)와 결합할 수 있는 지질의 기능기의 공유결합의 대표적 예를 하기 표 1에 기재하였다.
한편, 상기 지질은 탄소수 3 내지 24의 포화 또는 불포화 탄화수소를 포함하는 지질일 수 있다. 바람직하게는 탄소수 14 내지 20 의 포화 또는 불포화 탄화수소를 포함하는 지질이며 이는 지질 나노입자 제조에 일반적으로 사용되는 지질의 탄소수이다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 지질은 Fc 영역 결합 펩타이드의 설프하이드릴기(-SH) 또는 N 말단의 아민기(-NH2)와 결합할 수 있는 카복실기, 말레이마이드기, PDP(피리딜로 치환된 디티오기) 등과 같은 기능기를 갖도록 변형되어 있으며, 탄소수 3 내지 24의 포화 또는 불포화 탄화수소를 포함하는 공지의 지질일 수 있다. 따라서 지질의 친수성 부분에 Fc 영역 결합 펩타이드와 직접 공유 결합할 수 있는 상기의 기능기를 가진 지질이나 상기의 기능기를 링커(linker)를 사용하여 추가로 도입할 수 있는 지질이다.
예를 들어, 상기 지질은 하기 화학식 1의 화합물을 사용할 수 있다.
[화학식 1]
상기 식에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 3 내지 24의 알킬, 또는 탄소수 3 내지 24의 알케닐을 나타내고,
X는 -R3-NH-CO-를 나타내며,
여기서 R3은 탄소수 1 내지 6의 알킬렌을 나타내고, n은 0 또는 1을 나타내며,
Y는 탄소수 1 내지 12의 알킬렌, -(OCH2CH2)p-, 또는 -R4-R5-를 나타내고,
여기서 p는 1 내지 100의 정수를 나타내며, R4 및 R5는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 알킬렌, 탄소수 3 내지 8의 사이클로알킬렌, 또는 탄소수 5 내지 12의 아릴렌을 타나내고,
Z는 -R6-NH-CO-R7- 또는 -R8-R9-를 나타내며,
여기서 R6 및 R7은 각각 독립적으로 단일결합, 탄소수 1 내지 6의 알킬렌 또는 -O-를 나타내고, R8 및 R9는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 알킬렌 또는 -O-를 나타내며 m은 0 또는 1을 나타내고,
Q는 -COOH, -SH, 숙신이미딜기, 말레이미딜기 또는 피리딜로 치환된 디티오기를 나타낸다.
상기 화학식 1의 화합물은 3-(N-숙신이미딜옥시클루타릴) 아미노프로필, 폴리에틸렌글리콜-카바밀 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(3-(N-succinimidyloxyglutaryl) aminopropyl, polyethyleneglycol-carbamyl distearoylphosphatidylethanolamine);
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌글리콜)2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)2000]);
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카복시(폴리에틸렌 글리콜)2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[carboxy(polyethylene glycol)2000]);
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[PDP(폴리에틸렌 글리콜)2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)2000]);
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포티오에탄올(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphothioethanol);
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[4-(p-말레이미도메틸)사이클로헥산-카복사미드(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidomethyl)cyclohexane-carboxamide]);
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[4-(p-말레이미도메틸)사이클로헥산-카복사미드](1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidomethyl)cyclohexane-carboxamide]);
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[4-(p-말레이미도페닐)뷰티라미드](1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide]);
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[4-(p-말레이미도페닐)뷰티라미드 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide]);
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트](1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[3-(2-pyridyldithio)propionate]);
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트](1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[3-(2-pyridyldithio)propionate]);
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(숙시닐)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(succinyl));
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(숙시닐)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(succinyl));
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(글루타릴)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Glutaryl));
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(글루타릴)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(glutaryl));
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(도데카노일)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(dodecanoyl)); 및
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(도데카노일)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(dodecanoyl))으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항체의 Fc 영역 결합성 리포펩타이드는 Fc 영역 결합성 펩타이드와 상기 지질을 용매의 존재하에 상온에서 1 ~ 10시간 동안 반응시켜 용이하게 제조할 수 있다. 상기 펩타이드와 지질의 첨가량은 특별히 제한되지 않으나, 1: 0.5~2 당량 비율로 첨가할 수 있다. 상기 용매는 특별히 제한되는 것은 아니나, 디메틸포름아믿와 같은 용매를 사용할 수 있다.
서열번호1의 펩타이드와 상기 지질의 아미드 결합을 위해서 EDC 및 NHS을 지질의 1.5 당량 정도의 양으로 첨가할 수 있다.
하기 실시예에서는 Fc 영역 결합성 펩타이드의 아민기 또는 설프하이드릴기와 지질의 카복시기, 말레이미드기, 또는 PDP기를 아미드 결합, 티오에테르 결합, 또는 이황화 결합을 통해 공유결합시켜 항체의 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 제조하는 방법에 대해 구체적으로 예시한다.
본 발명은 또한 상기 항체의 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 포함하는 지질 나노입자(lipid nanoparticle)를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 지질 나노입자는 이에 제한되는 것은 아니나, 리포좀(liposome), 미셀(micelle), 에멀젼(emulsion) 및 고형 지질 나노입자(solid lipid nanoparticle)로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있다.
지질을 이용하여 상기 제형을 갖는 지질 나노입자를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 제형을 갖는 지질 나노입자의 제조를 위해서는 본 발명의 리포펩타이드 이외에도 양하전 지질, 중성 지질 및 음하전 지질로부터 선택되는 보조 지질을 추가로 사용할 수 있다. 예를 들어, 양이온성 리포좀의 제조를 위해서는 양하전 지질 및 중성 지질을, 중성 리포좀의 제조를 위해서는 중성 지질을, 음이온성 리포좀의 제조를 위해서는 음하전 지질 및 중성 지질을 본 발명의 Fc 영역 선택 결합성 리포펩타이드와 유기 용매상에서 혼합하고 유기 용매를 모두 증발시킨 후 중성 pH의 완충용액으로 수화시켜 제조할 수 있다. 지질 나노입자의 제조를 위해 사용할 수 있는 양하전 지질, 중성 지질 및 음하전 지질은 당업계에 공지되어 있다.
예를 들어, 양하전 지질에는 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄프로판 (1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄프로판 (1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디스테로일-3-트리메틸암모늄프로판 (1,2-distearoyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로판 (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로판 (1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane), 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로판 (1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane), 1,2-스테아로일-3-디메틸암모늄-프로판 (1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane), 3'-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (3'-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)carbamoyl] cholesterol; DC-Chol), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (dimethyldioctadecylammonium bromide), 1,2-디라유로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), 1,2-팔미토일올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-palmitoyloleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine) 등이 포함된다.
중성 지질에는 L-a-포스파티딜콜린 (L-a-phosphatidylcholine), 1,2-프로피오노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-propionoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2- 부타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-butanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-펜타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-pentanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-카프로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-caproyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-heptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-카프리로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-capryloyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-노나노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-nonanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-카프릴-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-capryl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-언데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-undecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-lauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-트리데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-tridecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-펜타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-pentadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-heptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-노나데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-nonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-arachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-헤니에코사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-heniecosanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-베헤노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-behenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-트루시사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-trucisanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-리그노세로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-lignoceroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-미리스톨레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-myristoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-미리스텔라이도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-myristelaidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-팔미톨레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-palmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-팔미텔라이도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-palmitelaidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-페트로셀리노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-petroselinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-elaidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-linolenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-아이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-eicosenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-이루코일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-erucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-너보노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-nervonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), L-a-포스파티딜에탄올아민 (L-a-phosphatidylethanolamine), 1,2-디카프로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dicaproyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디카프릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dicapryl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디펜타데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디파이타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디팔미톨레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dielaidoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디리노에오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dilinoeoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-docosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 콜레스테롤(cholesterol) 등이 포함된다.
또한 음하전 지질에는 L-a-포스파티딜글리세롤 (L-a-phosphatidylglycerol), 1,2-디카프로일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dicaproyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디카프릴-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dicapryl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디파이타노일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dielaidoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-docosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), L-a-포스파티딜이노시톨 (L-a-phosphatidylinositol), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포이노시톨 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol), d-에리스로-스핑고실 포스포이노시톨 (d-erythro-sphingosyl phosphoinositol), L-α-포스파티딕산 (L-a-phosphatidic acid), 1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디테카노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디도데카노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-didodecanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디헥사테카노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디파이타노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디옥타데카노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디옥타데카디에노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dioctadecadienoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디이코사테트라에노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dieicosatetraenoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphate), L-a-포스파티딜세린 (L-a-phosphatidylserine), 1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디데카노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디도데카노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-didodecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디파이타노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디옥타데카노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디옥타데세노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-dioctadecenoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디옥타데카디에노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-dioctadecadienoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디이코사테트라에노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-dieicosatetraenoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 콜레스테릴 헤미숙시네이트 (cholesteryl hemisuccinate; CHEMS), 카디올리핀 (cardiolipin), 1',3'-비스[1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스포]-sn-글리세롤 (1',3'-bis[1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho]-sn-glycerol), 1',3'-비스[1,2-디옥타데세노일-sn-글리세로-3-포스포]-sn-글리세롤 (1',3'-bis[1,2-dioctadecenoyl-sn-glycero-3-phospho]-sn-glycerol) 등이 포함된다.
한 구체예에서, 상기 지질 나노입자는 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 미셀 또는 에멀젼 제형의 형성을 위해서는 본 발명의 리포펩타이드 및 보조 지질과 함께 계면활성제를 사용할 수 있다.
이러한 계면활성제는, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
예를 들어 비온성 계면활성제는 트윈 20 (Tween 20) 또는 트윈 80 (Tween 80)과 같은 폴리솔베이트계; 트리톤 X-100(Triton-X-100)와 같은 알킬페놀 폴리에틸렌옥사이드계; 폴리에틸렌글리콜 모노올레일 에테르(polyethylene glycol monooleyl ether), 에틸렌글리콜 모노도데실 에테르 (ethylene glycol monododecyl ether), 디에틸렌글리콜 모노헥실 에테르 (diethylene glycol monohexyl ether), 트리에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 (triethylene glycol monododecyl ether)와 같은 알킬(폴리)에틸렌 글리콜계; 플록사머계(Poloxamers); 옥틸 글루코사이드(octyl glucoside) 또는 사이클로헥실 베타 말토사이드 (cyclohexylmethyl β-D-maltoside)와 같은 알킬 폴리글루코사이드계; 라우릴에메틸아민옥사이드 (lauryldimethylamine-oxide) 또는 도데실 디메틸아민 산화물(dodecyl dimethylamine oxide)과 같은 알킬아민옥사이드계; 펜타에리스리틸 팔미테이트(pentaerythrityl palmitate) 또는 노나노일메틸글루카민 (N-nonanoyl-N-methylglucamine)를 포함한다.
양이온성 계면활성제는 4급 암모늄 이온을 포함하는 트리메틸헥사데실 암모늄 클로라이드(trimethylhexadecyl ammonium chloride), 도데실트리메틸 암모늄 클로라이드 (dodecyltrimethyl ammonium bromide), 세틸 브롬화 트리메틸암모늄염(cetyl trimethylammonium bromide), 또는 헥사데실 브롬화 암모늄염(hexadecyl trimethyl ammonium bromide)을 포함한다.
양쪽이온성 계면활성제는 도데실 베타인(dodecyl betaine)을 포함한다.
또한 음이온성 계면활성제는 디메틸팔미토일암모니오프로판 설포네이트(3-(N,Ndimethylpalmitylammonio) propane sulfonate)와 같은 설페이트, 설포네이트 또는 카르복실레이트 음이온을 포함하는 계면활성제 또는 라우로살코신 소듐염(N-lauroylsarcosine sodium salt) 등과 같은 지방산의 염을 포함한다.
하기 실시예에서는 본 발명의 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 이용하여 다양한 제형의 지질 나노입자를 제조하는 방법에 대해 구체적으로 설명한다. 표적 세포로 전달하고자 하는 치료제 또는 진단제와 같은 약물은 지질 나노입자의 제조시 제형 내로 봉입하거나 제형의 표면에 결합시킬 수 있다. 하기 실시예에서는 지질 나노입자의 제조시 형광 지질, 항암제, siRNA 등을 지질 나노입자에 도입하여 본 발명의 지질 나노입자의 항원 인지능과 약물전달능을 평가한다.
또한, 본 발명은 상기 지질 나노입자에 항체가 비공유결합되어 있는 항원 인지형 지질 나노입자를 제공한다. 본 발명의 지질 나노입자의 제조에 사용되는 리포펩타이드가 Fc 영역 특이적 결합능을 가지고 있다. 따라서, 별도의 결합 반응 없이도 지질 나노입자에 결합하는 항체의 Fc 영역이 지질 나노입자의 리포펩타이드에 비공유결합된다.
하기 실시예에서는, 항체가 선택적으로 비공유결합되어있는 본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자와 항체가 비선택적으로 공유결합되어 있는 종래의 항원 인지형 지질 나노입자에 비한 항원 인지능과 약물전달능을 평가하였다.
하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 기존의 항원 인지형 지질 나노입자는 항체를 화학적으로 변형하여 비선택적 공유 결합을 통해 지질에 결합하는 방법을 사용해왔으므로 항체 고유의 항원 인지 능력이 떨어지며 항체의 방향에 상관없이 무작위로 지질에 결합되어 또한 표적화 능력이 떨어진다. 이와 달리, 본 발명에서는 항체를 화학적으로 변형시키지 않음과 동시에 항체의 항원 인지 부위가 항원 인지형 지질 나노입자의 바깥쪽을 향하게 하여 항원 인지형 지질 나노입자의 표적화 능력을 증가시켰다.
또한, 기존의 항원 인지형 지질 나노입자의 제조시 지질과 항체의 공유결합으로 인해 공정이 복잡하고 시간이 많이 소요되었던 것과는 달리, 본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자는 지질 나노입자와 항체의 단순 혼합을 통해 제조될 수 있는 바, 제조가 간단하고 신속하다.
본 발명의 지질 나노입자에 포함되는 리포펩타이드는 임의의 항체의 Fc 영역과 결합할 수 있다. 본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자의 제조시에는 지질 나노입자에 항원 표적능을 부여하기 위해 약물 전달을 원하는 표적 세포의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하여 이를 지질 나노입자에 비공유결합시키게 된다.
본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자를 통해 약물을 전달받는 표적 세포는 치료 또는 진단이 요구되는 세포일 수 있다. 이러한 표적 세포는 예를 들어, 암 세포, 염증 세포 등일 수 있다. 하기 실시예에서는 버키트 림프종 세포주, 신경교종 세포주, 구강 편평세포암 세포주 등을 이용하여 본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자의 항원 인지능 및 약물 전달능을 평가한다.
이와 같이, 본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자는 표적 세포의 항원을 타겟팅하여 선택적으로 약물을 전달하는 약물전달체로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 항원 인지형 지질 나노입자 및 약물을 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자를 이용하여 표적 세포로 전달할 수 있는 약물은 치료제(therapeutic agent) 및 진단제(diagnostic agent)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 약물일 수 있다. 본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자는 치료제와 진단제를 동시에 전달할 수도 있다. 예를 들어, 리포좀의 중앙의 친수성 공간에 자성나노입자와 같은 진단제를, 외부의 지질 이중막에 지용성 약물이나 핵산과 같은 음전하 물질을 결합시킬 수 있다.
상기 치료제는 화학요법제, 단백질 의약 또는 핵산의약일 수 있다. 화학요법제는 임의의 질환에 대한 약리 효과를 나타내는 유기 화합물을 의미한다. 화학요법제는 대개 혈류를 통해 비선택적으로 세포에 전달되는 특성을 갖는데, 약물의 부작용을 감소시키기 위해 세포 또는 조직에 선택적인 치료가 요구되는 경우에는 본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 화학요법제의 대표적인 예로는 항암 화학요법제를 들 수 있다. 공지의 항암 화학요법제로는 예를 들어, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 발루비신(valubicin), 미토산트론(mitoxantrone), 커큐민(curcumin), 제피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 등이 있다.
본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자를 이용하여 표적세포에 전달할 수 있는 의약은 단백질 의약 또는 핵산의약일 수 있다. 예를 들어, 특정 수용체에 특이적으로 결합하여 신호 전달을 차단하거나 억제하는 펩타이드, 특정 유전자의 발현을 저해하는 siRNA 등이 이에 해당된다.
본 발명에 있어서, 핵산은 플라스미드 디옥시리보핵산(plasmid DNA), 리보핵산(RNA), 작은 간섭 리보핵산(siRNA), 안티센스 올리고핵산(antisense oligonucleotide), 마이크로 리보핵산 (microRNA), 잠금형 핵산 (locked nucleic acid), 핵산 앱타머(aptamer) 등을 포함한다.
한편, 상기 진단제는 표적 세포를 탐지해 내어 인식가능하게 할 수 있는 물질이면 어떠한 것이든 이용가능하다. 예를 들어, 상기 진단제는 MRI 등에서 사용하기 위한 자성나노입자나 공지의 조영제일 수 있다. 핵산 앱타머 또한 특정 항원에 대한 표적성을 가지므로 형광물질 등이 레이블링되어 있는 핵산 앱타머는 상기 진단제로 사용될 수 있을 것이다. 또한, 생체를 투과할 수 있는 근적외선(near infra-red) 계열의 형광물질; 또는 Calcium-47, Carbon-11, Carbon-14, Chromium-51, Cobalt-57, Cobalt-58, Erbium-169, Fluorine-18, Gallium-67, Gallium-68, Hydrogen-3, Indium-111, Iodine-123, Iodine-131, Technetium-99m와 같은 방사선의약품도 사용될 수 있다.
하기 실험예에서는 본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자 및 약물을 포함하는 의약 조성물이 표적 세포 내로 전달되는 효율에 대해 평가하였다. 모델 약물인 형광으로 표지된 지질 또는 형광으로 표지된 작은간섭리보핵산을 본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자에 도입함으로써 이들의 전달 효율을 형광 유세포 분석기(fluorescent-activated cell sorting, FACS)를 통하여 평가하였으며, 본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자에 의해 전달된 작은 간섭 리보핵산의 유전자 발현 억제 능력을 평가하기 위하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하였다. 그 결과, 본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자는 비표적화 지질 나노입자보다 약물의 표적 세포로의 전달 능력을 현저히 증가시켰고 또한 기존의 화학적 변형을 통한 공유결합 방식으로 제조한 항원 인지형 지질 나노입자보다도 세포로의 전달 능력을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하여 표적 유전자 발현 억제 능력도 증가됨을 확인하였다. 따라서 항원 인지형 지질 나노입자 및 약물을 포함하는 본 발명의 의약 조성물은 약물 전달 효율이 매우 우수하다.
그러므로 본 발명은 또한, 항체 Fc 영역 결합성 리포펩타이드, 상기 항체 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 포함하는 지질 나노입자 또는 상기 항체 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 포함하는 지질 나노입자에 항체가 비공유결합되어 있는 항원 인지형 지질 나노입자의 항원 특이적 약물전달체의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항체 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 함유하는 항원 특이적 약물전달체 제조용 조성물, 상기 항체 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 포함하는 지질 나노입자를 함유하는 항원 특이적 약물전달체 제조용 조성물 및 상기 항체 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 포함하는 지질 나노입자에 항체가 비공유결합되어 있는 항원 인지형 지질 나노입자를 함유하는 항원 특이적 약물전달체 제조용 조성물를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 항체 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 지질과 결합시켜 지질 나노입자를 제조하고, 상기 지질 나노입자에 항체를 비공유결합시켜 항원 인지형 지질 나노입자를 제조하는 것을 포함하는 항원 특이적 약물전달체의 제조 방법을 제공한다. 앞서 설명한 바와 같이 약물은 지질 나노입자의 제조시 또는 지질 나노입자나 항원 인지형 지질 나노입자의 제조 후 공지의 방법을 통해 지질 나노입자에 도입될 수 있다.
본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자는 지질 나노입자의 표면에 항체의 Fc 영역과 결합할 수 있는 리포펩타이드가 존재하므로 지질 나노입자의 표면에 결합시키고자 하는 항체를 지질 나노입자와 물리적으로 단순혼합시키면 항체의 Fc 영역과 리포펩타이드가 특이적으로 결합하게 된다. 따라서, 항체와 지질을 비선택적으로 공유결합(random conjugation)시켜 제조한 기존의 항원 인지형 지질 나노입자와는 달리 지질 나노입자에 결합된 리포펩타이드를 통해 항원 인지능의 저하 없이 항체를 지질 나노입자의 표면에 결합시킬 수 있게 된다. 따라서, 본 발명의 항원 인지형 지질 나노입자는 치료제, 진단제 등의 다양한 약물의 표적 세포로의 수송 효율을 현저히 증강시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 Fc 결합성 리포펩타이드를 포함하는 지질 나노입자는 리포펩타이드와 항체 사이의 비공유적이고 선택적인 결합을 통해 항체와 결합되므로, 비선택적 공유결합을 통해 항체와 지질 나노입자가 결합되어 있던 기존의 항원 인지형 지질 나노입자의 제조에 비해 반응 시간이 짧고, 단순 혼합을 통해 선택적인 반응이 유도되므로 공정이 간편하여 대량 생산시 경제성이 높다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단 지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<항체 결합을 위한 신규한 지질 결합체의 합성>
실시예 1. 항체 Fc 영역 결합 펩타이드와 폴리에틸렌 글리콜 지질의 아미드 결합을 통한 항체 Fc 영역 선택 결합성 리포펩타이드의 합성
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 11.46 mg(1.5 당량) 과 폴리에틸렌 글리콜 사슬의 분자량이 2000인 3-(N-succinimidyloxyglutaryl) aminopropyl, polyethyleneglycol-carbamyl distearoylphosphatidyl-ethanolamine(NOF corporation, Japan) 14.98 mg(1 당량)을 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 5 ml에 실온에서 12 시간 동안 질소 하 반응시킨 후, 진공으로 감압 농축하고 얻은 생성물을 클로로포름(chloroform)으로 재결정하여 미반응 펩타이드와 부산물을 제거시켰다.
실시예 2. 항체 Fc 영역 결합 펩타이드와 폴리에틸렌 글리콜 지질의 티오에테르 결합을 통한 항체 Fc 영역 선택 결합성 리포펩타이드의 합성
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 12.24 mg(1.5 당량) 과 폴리에틸렌 글리콜 사슬의 분자량이 2000인 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)2000](Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 Mal-PEG-DSPE라 함.) 14.71 mg(1 당량)을 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 5 ml에 실온에서 12 시간 동안 질소 하 반응시킨 후, 진공으로 감압 농축하고 얻은 생성물을 클로로포름(chloroform)으로 재결정하여 미반응 펩타이드와 부산물을 제거시켰다.
실시예 3. 항체 Fc 영역 결합 펩타이드와 폴리에틸렌 글리콜 지질의 아미드 결합을 통한 항체 Fc 영역 선택 결합성 리포펩타이드의 합성
폴리에틸렌 글리콜 사슬의 분자량이 2000인 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[carboxy(polyethylene glycol)2000](Avanti Polar Lipid Inc., USA) 14.25 mg(1 당량)과 EDC(1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide) 2.23 mg(1.5당량)을 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 5 ml에 실온에서 2 시간 동안 질소 하 반응시킨 후, 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 0.5 ml에 녹인 NHS(N-hydroxy-succinimide) 0.86 mg(1.5당량)을 천천히 적하시키고 실온에서 1 시간 동안 질소 하 반응시켰다. 반응 후, 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 0.5 ml에 녹인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 11.46 mg(1.5 당량)을 천천히 적하시켜 실온에서 8 시간 동안 질소 하 반응시켰다. 최종 반응 후, 진공으로 감압 농축하고 얻은 생성물을 클로로포름(chloroform)으로 재결정하여 미반응 펩타이드와 부산물을 제거시켰다.
실시예 4. 항체 Fc 영역 결합 펩타이드와 폴리에틸렌 글리콜 지질의 이황화 결합을 통한 항체 Fc 영역 선택 결합성 리포펩타이드의 합성
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 12.24 mg(1.5 당량) 과 폴리에틸렌 글리콜 사슬의 분자량이 2000인 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)2000](Avanti Polar Lipid Inc., USA) 14.94 mg(1 당량)을 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 5 ml에 실온에서 12 시간 동안 질소 하 반응시킨 후, 진공으로 감압 농축하고 얻은 생성물을 클로로포름(chloroform)으로 재결정하여 미반응 펩타이드와 부산물을 제거시켰다.
실시예 5. 항체 Fc 영역 결합 펩타이드와 지질의 아미드 결합을 통한 항체 Fc 영역 선택 결합성 리포펩타이드의 합성
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(succinyl)(Avanti Polar Lipid Inc., USA) 4.07 mg(1 당량)과 EDC(1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide) 2.23 mg(1.5당량)을 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 5 ml에 실온에서 2 시간 동안 질소 하 반응시킨 후, 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 0.5 ml에 녹인 NHS(N-hydroxy-succinimide) 0.86 mg(1.5당량)을 천천히 적하시키고 실온에서 1 시간 동안 질소 하 반응시켰다. 반응 후, 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 0.5 ml에 녹인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 11.46 mg(1.5 당량)을 천천히 적하시켜 실온에서 8 시간 동안 질소 하 반응시켰다. 최종 반응 후, 진공으로 감압 농축하고 얻은 생성물을 클로로포름(chloroform)으로 재결정하여 미반응 펩타이드와 부산물을 제거시켰다.
실시예 6. 항체 Fc 영역 결합 펩타이드와 지질의 아미드 결합을 통한 항체 Fc 영역 선택 결합성 리포펩타이드의 합성
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(glutaryl)(Avanti Polar Lipid Inc., USA) 4.14 mg(1 당량)과 EDC(1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide) 2.23 mg(1.5당량)을 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 5 ml에 실온에서 2 시간 동안 질소 하 반응시킨 후, 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 0.5 ml에 녹인 NHS(N-hydroxy-succinimide) 0.86 mg(1.5당량)을 천천히 적하시키고 실온에서 1 시간 동안 질소 하 반응시켰다. 반응 후, 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 0.5 ml에 녹인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 11.46 mg(1.5 당량)을 천천히 적하시켜 실온에서 8 시간 동안 질소 하 반응시켰다. 최종 반응 후, 진공으로 감압 농축하고 얻은 생성물을 클로로포름(chloroform)으로 재결정하여 미반응 펩타이드와 부산물을 제거시켰다.
실시예 7. 항체 Fc 영역 결합 펩타이드와 지질의 아미드 결합을 통한 항체 Fc 영역 선택 결합성 리포펩타이드의 합성
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(dodecanoyl)(Avanti Polar Lipid Inc., USA) 4.63 mg(1 당량)과 EDC(1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide) 2.23 mg(1.5당량)을 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 5 ml에 실온에서 2 시간 동안 질소 하 반응시킨 후, 디메틸포름아미 드(dimethylformamide) 0.5 ml에 녹인 NHS(N-hydroxy-succinimide) 0.86 mg(1.5당량)을 천천히 적하시키고 실온에서 1 시간 동안 질소 하 반응시켰다. 반응 후, 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 0.5 ml에 녹인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 11.46 mg(1.5 당량)을 천천히 적하시켜 실온에서 8 시간 동안 질소 하 반응시켰다. 최종 반응 후, 진공으로 감압 농축하고 얻은 생성물을 클로로포름(chloroform)으로 재결정하여 미반응 펩타이드와 부산물을 제거시켰다.
실시예 8. 항체 Fc 영역 결합 펩타이드와 지질의 티오에테르 결합을 통한 항체 Fc 영역 선택 결합성 리포펩타이드의 합성
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 12.24 mg(1.5 당량) 과 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidomethyl)cyclohexane-carboxamide(Avanti Polar Lipid Inc., USA) 4.67 mg(1 당량)을 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 5 ml에 실온에서 12 시간 동안 질소 하 반응시킨 후, 진공으로 감압 농축하고 얻은 생성물을 클로로포름(chloroform)으로 재결정하여 미반응 펩타이드와 부산물을 제거시켰다.
실시예 9. 항체 Fc 영역 결합 펩타이드와 지질의 티오에테르 결합을 통한 항체 Fc 영역 선택 결합성 리포펩타이드의 합성
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 12.24 mg(1.5 당량) 과 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p- maleimidophenyl)butyramide](Avanti Polar Lipid Inc., USA) 4.78 mg(1 당량)을 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 5 ml에 실온에서 12 시간 동안 질소 하 반응시킨 후, 진공으로 감압 농축하고 얻은 생성물을 클로로포름(chloroform)으로 재결정하여 미반응 펩타이드와 부산물을 제거시켰다.
실시예 10. 항체 Fc 영역 결합 펩타이드와 지질의 이황화 결합을 통한 항체 Fc 영역 선택 결합성 리포펩타이드의 합성
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 12.24 mg(1.5 당량) 과 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[3-(2-pyridyldithio)propionate](Avanti Polar Lipid Inc., USA) 4.56 mg(1 당량)을 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 5 ml에 실온에서 12 시간 동안 질소 하 반응시킨 후, 진공으로 감압 농축하고 얻은 생성물을 클로로포름(chloroform)으로 재결정하여 미반응 펩타이드와 부산물을 제거시켰다.
비교예 1. 폴리에틸렌 글리콜 잔기를 가지는 기존의 항체 공유결합용 지질
상기의 실시예 1 내지 4에서 제조한 폴리에틸렌 글리콜 잔기를 포함하는 신규한 리포펩타이드에 대한 비교예로서 기존의 항체 공유결합 용도로 당분야에서 일반적으로 사용되고 있는 폴리에틸렌 글리콜 잔기 포함 지질인 Mal-PEG-DSPE (Avanti Inc., 미국)를 클로로포름에 10 mg/ml 의 농도로 녹여서 사용하였다.
비교예 2. 폴리에틸렌 글리콜 잔기가 없는 기존의 항체 공유결합용 지질
상기의 실시예 5 내지 10에서 제조한 폴리에틸렌 글리콜 잔기가 없는 리포펩타이드에 대한 비교예로서 기존의 항체 공유 결합 용도로 당분야에서 일반적으로 사용되고 있는 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidomethyl)cyclohexane-carboxamide (Avanti Inc., 미국)를 클로로포름에 10 mg/ml 의 농도로 녹여서 사용하였다.
<지질 나노입자의 제조>
실시예 11. 실시예 1의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 형광 지질을 함유하는 음이온성 리포좀(anionic liposome)의 제조
실시예 1에서 제조한 리포펩타이드, 중성 지질인L-a-phosphatidylcholine(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'PC'라 함), 음하전 지질인 L-a-phosphatidylglycerol (Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'PG'라 함), 콜레스테롤(cholesterol, Sigma, USA)과 형광 지질인 N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'NBD-PE'라 함)을 각각 0.1:1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 질소 환경에서 모든 클로로포름이 증발될 때까지 낮은 속도로 회전 증발시켜 지질 박막 필름으로 제조하였다. 지질 다층형 소구체 (multilamella vesicle)를 제조하기 위하여 이 박막필름에 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 바이알을 37℃로 하여 밀봉 후 3 분간 교반(vortexing)하였다. 균일한 크기를 만들기 위해 이를 입자 균질화 제조기 (extruder, Northern Lipid Inc., Canada)를 사용하여 0.2 μm폴리카보네이트 막을 3 번 통과시켜 제조하였다. 수득된 리포펩타이드 함유 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 12. 실시예 2의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 형광 지질을 함유하는 음이온성 리포좀(anionic liposome)의 제조
실시예 2에서 제조한 리포펩타이드, PC, cholesteryl hemisuccinate (Sigma, USA, 이하 'CHEMS'라 함)와 형광 표지를 위한 NBD-PE를 각각 0.1:2:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 항체 결합을 위한 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 리포펩타이드 함유 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 13. 실시예 3의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 형광 지질을 함유하는 음이온성 리포좀(anionic liposome)의 제조
실시예 3에서 제조한 리포펩타이드, PC, Cardiolipin (Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'CA'라 함), 콜레스테롤과 형광 표지를 위한 NBD-PE를 각각 0.1:1:0.5:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 항체 결합을 위 한 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 리포펩타이드 함유 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 14. 실시예 5의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 형광 지질을 함유하는 중성 리포좀 (neutral liposome)의 제조
실시예 5에서 제조한 리포펩타이드, PC, 콜레스테롤과 형광 표지를 위한 NBD-PE를 각각 0.1:2:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 항체 결합을 위한 중성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 리포펩타이드 함유 중성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 15. 실시예 6의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 형광 지질을 함유하는 중성 리포좀 (neutral liposome)의 제조
실시예 6에서 제조한 리포펩타이드, L-alpha-Dioleoyl Phosphatidylethanolamine(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DOPE'라 함), 콜레스테롤과 형광 표지를 위한 NBD-PE를 각각 0.1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 항체 결합을 위한 중성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 리포펩타이드 함유 중성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 16. 실시예 7의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 형광 지질을 함유하는 중성 리포좀 (neutral liposome)의 제조
실시예 7에서 제조한 리포펩타이드, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DPPC'라 함), 콜레스테롤과 형광 표지를 위한 NBD-PE를 각각 0.1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 항체 결합을 위한 중성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 리포펩타이드 함유 중성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 17. 실시예 1의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 형광 지질을 함유하는 양이온성 리포좀 (cationic liposome)의 제조
실시예 1에서 제조한 리포펩타이드, 양하전 지질인 N-[1-(2,3- dioleyloxy)propyl]-N,N,N- trimethylammonium methyl sulfate(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DOTAP'이라 함), DOPE와 형광 표지를 위한 NBD-PE를 각각 0.1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 항체 결합을 위한 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 리포펩타이드 함유 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 18. 실시예 2의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 형광 지질을 함 유하는 양이온성 리포좀 (cationic liposome)의 제조
실시예 2에서 제조한 리포펩타이드, cholesteryl-3(beta)N-dimethyl aminoethyl(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DC-chol'이라 함), DOPE와 형광 표지를 위한 NBD-PE를 각각 0.1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 항체 결합을 위한 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 리포펩타이드 함유 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 19. 실시예 3의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 형광 지질을 함유하는 양이온성 리포좀 (cationic liposome)의 제조
실시예 3에서 제조한 리포펩타이드, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DOEPC'라 함), DOPE와 형광 표지를 위한 NBD-PE를 각각 0.1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 항체 결합을 위한 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 리포펩타이드 함유 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 20. 실시예 8의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 형광 지질을 함유하는 미셀 (micelle) 나노입자 제조
실시예 8에서 제조한 리포펩타이드, 계면활성제인 Tween 20, NBD-PE를 각각 0.1:1:0.025 μmole씩 취하여 유리 격막 바이알에 혼합한 다음 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 3분 동안 초음파 발생기를 사용하여 항체 결합을 위한 미셀을 제조하였다. 얻어진 리포펩타이드 함유 미셀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 21. 실시예 9의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 형광 지질을 함유하는 에멀젼(emulsion)의 제조
실시예 9에서 제조한 리포펩타이드, 계면활성제인 Tween 80, NBD-PE를 각각 0.1:1:0.025μmole씩 취하여 유리 격막 바이알에 혼합한 다음 스쿠알렌(squalene, Sigma, USA) 100 μl와 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 3분 동안 초음파 발생기를 사용하여 항체 결합을 위한 에멀젼을 제조하였다. 얻어진 리포펩타이드 함유 에멀젼은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 22. 실시예 10의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 형광 지질을 함유하는 고형 지질나노입자 (solid lipid nanoparticles)의 제조
실시예 10에서 제조한 리포펩타이드, 계면활성제인 Twenn 20, Tween 80, NBD-PE, 라우릭산(lauric acid, Sigma, USA)을 각각 0.1:10:10:0.025:100 μmole씩 취하여 유리 격막 바이알에 혼합한 다음 70 ℃에서 완전히 용융시킨 후 70 ℃의 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 5분 동안 초음파 발생기를 사용하여 고형 지질나노입자를 제조하였다. 얻어진 리포펩타이드 함유 고형지질나노입자는 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 23. 실시예 1의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 파클리탁셀이 함유된 음이온성 리포좀 (anionic liposome)의 제조
실시예 1에서 제조한 리포펩타이드, PC, PG, 콜레스테롤과 항암제인 파클리탁셀(paclitaxel, Sigma, USA)을 각각 0.1:1:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 리포펩타이드 함유 파클리탁셀 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 파클리탁셀 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 24. 실시예 2의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 도세탁셀이 함유된 음이온성 리포좀 (anionic liposome)의 제조
실시예 2에서 제조한 리포펩타이드, PC, PG, 콜레스테롤과 항암 의약인 도세탁셀(docetaxel, Sigma, USA)을 각각 0.1:1:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 리포펩타이드 함유 도세탁셀 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 도세탁셀 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 25. 실시예 3의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드 및 독소루비신이 함유된 음이온성 리포좀 (anionic liposome)의 제조
실시예 3에서 제조한 리포펩타이드, PC, PG, 콜레스테롤 을 각각 0.1:1:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 항체 결합을 위한 음이온성 리포좀을 제조하였다. 여기에 양전하로 하전 된 독소루비신(doxorubicin, Sigma, USA) 100 μg을 혼합하여 음이온성 리포좀 표면에 정전기적으로 결합시킨 다음, 리포좀에 함유되지 않고 남아있는 독소루비신은 PD-10 Column(GE healthcare, UK)을 사용하여 제거하였다. 얻어진 리포펩타이드 함유 독소루비신 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 26. 실시예 4의 항체 Fc 영역 선택결합성 리포펩타이드를 함유하는 양이온성 리포좀의 제조
실시예 4에서 제조한 리포펩타이드, DOTAP, DOPE를 각각 몰비 0.1:1:1의 비율로 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 3과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하고 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 3. 형광 지질을 함유하는 음이온성 리포좀의 제조
폴리에틸렌 글리콜 사슬의 분자량이 2000인 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 mPEG-DSPE라 함.), PC, PG, 콜레스테롤과 형광 표지를 위한 지질인 NBD-PE를 각각 0.1:1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 4. 형광 지질을 함유하는 중성 리포좀의 제조
PC, 콜레스테롤과 형광 표지를 위한 NBD-PE를 각각 1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 중성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 형광 지질 함유 중성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 5. 형광 지질을 함유하는 양이온성 리포좀의 제조
mPEG-DSPE, DOPE, 양하전 지질인 DOTAP와 형광 표지된 지질인NBD-PE를 각각 0.1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 형광 지질 함유 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 6. 파클리탁셀이 봉입된 음이온성 리포좀의 제조
mPEG-DSPE, PC, PG, 콜레스테롤과 파클리탁셀을 각각 0.1:1:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 파클리탁셀이 봉입된 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 파클리탁셀 함유 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 7. 도세탁셀이 봉입된 음이온성 리포좀의 제조
mPEG-DSPE, PC, PG, 콜레스테롤과 도세탁셀을 각각 0.1:1:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 도세탁셀이 봉입된 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 도세탁셀 함유 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 8. 독소루비신이 봉입된 음이온성 리포좀의 제조
mPEG-DSPE, PC, PG, 콜레스테롤을 각각 0.1:1:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 음이온성 리포좀을 제조하였다. 여기에 양전하로 하전 된 독소루비신(doxorubicin, Sigma, USA) 100 μg을 혼합하여 음이온성 리포좀 표면에 정전기적으로 결합시킨 다음, 리포좀에 함유되지 않고 남아있는 독소루비신은 PD-10 Column(GE healthcare, UK)을 사용하여 제거하였다. 얻어진 독소루비신 함유 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 9. 양이온성 리포좀의 제조
mPEG-DSPE, DOTAP, DOPE를 각각 몰비 0.1:1:1의 비율로 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 3과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하였으며, 얻어진 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 10. 비교예 1의 항체 공유결합용 지질 및 형광 지질을 함유한 음이온성 리포좀의 제조
당분야에서 일반적으로 사용되는 비교예 1의 항체 공유결합용 지질, PC, PG, 콜레스테롤과 형광 지질인 NBD-PE를 각각 0.1:1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 11. 비교예 2의 항체 공유결합용 지질 및 형광 지질을 함유한 중성 리포좀의 제조
당분야에서 일반적으로 사용되는 비교예 2의 항체 공유결합용 지질, PC, 콜레스테롤과 형광 지질인 NBD-PE를 각각 0.1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 중성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 중성 리포좀은 사용하기 전 까지 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 12. 비교예 1의 항체 공유결합용 지질 및 형광 지질을 함유한 양이온성 리포좀의 제조
당분야에서 일반적으로 사용되는 비교예 1의 항체 공유결합용 지질, DOTAP, DOPE와 형광 지질인 NBD-PE를 각각 0.1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 13. 비교예 1의 항체 공유결합용 지질 및 파클리탁셀이 봉입된 음이온성 리포좀의 제조
당분야에서 일반적으로 사용되는 비교예 1의 항체 공유결합용 지질, PC, PG, 콜레스테롤과 파클리탁셀을 각각 0.1:1:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 파클리탁셀이 봉입된 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 파클리탁셀 함유 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 14. 비교예 1의 항체 공유결합용 지질 및 도세탁셀이 함유된 음이온성 리포좀의 제조
당분야에서 일반적으로 사용되는 비교예 1의 항체 공유결합용 지질, PC, PG, 콜레스테롤과 도세탁셀을 각각 0.1:1:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 도세탁셀이 봉입된 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 도세탁셀 함유 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 15. 비교예 1의 항체 공유결합용 지질 및 독소루비신이 함유된 음이온성 리포좀의 제조
당분야에서 일반적으로 사용되는 비교예 1의 항체 공유결합용 지질, PC, PG, 콜레스테롤을 각각 0.1:1:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 음이온성 리포좀을 제조하였다. 여기에 양전하로 하전 된 독소루비신(doxorubicin, Sigma, USA) 100 μg을 혼합하여 음이온성 리포좀 표면에 정전기적으로 결합시킨 다음, 리포좀에 함유되지 않고 남아있는 독소루비신은 PD-10 Column(GE healthcare, UK)을 사용하여 제거하였다. 얻어진 독소루비신 함유 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
비교예 16. 비교예 1의 항체 공유결합용 지질을 함유하는 양이온성 리포좀의 제조
당분야에서 일반적으로 사용되는 비교예 1의 항체 공유결합용 지질, DOTAP, DOPE를 각각 몰비 0.1:1:1의 비율로 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 3과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
<항원 인지형 지질 나노입자의 제조>
실시예 27. 실시예 11의 음이온성 리포좀 표면에 CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 CXCR4 항원 인지형 리포좀의 제조
실시예 11에서 제조된 항체 Fc 영역 선택 결합성 리포펩타이드 및 형광 지질을 함유하는 음이온성 리포좀(anionic liposome) 10 μl 당 항-CXCR4 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 CXCR4 항체의 Fc 부분이 선택적으로 비공유적으로 선택 결합된 CXCR4 항원 인지형 음이온성 리포좀을 제조하였다.
실시예 28. 실시예 12의 음이온성 리포좀 표면에 CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 CXCR4 항원 인지형 리포좀의 제조
실시예 12에서 제조된 음이온성 리포좀 10 μl 당 CXCR4 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 CXCR4 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 음이온성 리포좀을 제조하였다.
실시예 29. 실시예 13의 음이온성 리포좀 표면에 CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 CXCR4 항원 인지형 리포좀의 제조
실시예 13에서 제조된 음이온성 리포좀 10 μl 당 CXCR4 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 CXCR4 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 음이온성 리포좀을 제조하였다.
실시예 30. 실시예 14의 중성 리포좀 표면에 EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 EGFR 항원 인지형 리포좀의 제조
실시예 14의 중성 리포좀 10 μl 당 EGFR 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 EGFR항체가 표면에 비공유적으로 결합된 중성 리포좀을 제조하였다.
실시예 31. 실시예 15의 중성 리포좀 표면에 EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 EGFR 항원 인지형 리포좀의 제조
실시예 15의 중성 리포좀 10 μl 당 EGFR 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 EGFR항체가 표면에 비공유적으로 결합된 중성 리포좀을 제조하였다.
실시예 32. 실시예 16의 중성 리포좀 표면에 EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 EGFR 항원 인지형 리포좀의 제조
실시예 16의 중성 리포좀 10 μl 당 EGFR 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 EGFR항체가 표면에 비공유적으로 결합된 중성 리포좀을 제조하였다.
실시예 33. 실시예 17의 양이온성 리포좀 표면에 HER2 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 HER2 항원 인지형 리포좀의 제조
실시예 17의 양이온성 리포좀 10 μl 당 HER2 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 HER2 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 양이온성 리포좀을 제조하였다.
실시예 34. 실시예 18의 양이온성 리포좀 표면에 HER2 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 HER2 항원 인지형 리포좀의 제조
실시예 18의 양이온성 리포좀 10 μl 당 HER2 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 HER2 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 양이온성 리포좀을 제조하였다.
실시예 35. 실시예 19의 양이온성 리포좀 표면에 HER2 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 HER2 항원 인지형 리포좀의 제조
실시예 19의 양이온성 리포좀 10 μl 당 HER2 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 HER2 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 양이온성 리포좀을 제조하였다.
실시예 36. 실시예 20의 미셀 표면에 EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 EGFR 항원 인지형 미셀의 제조
실시예 20의 미셀 10 μl 당 EGFR 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 EGFR 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 미셀을 제조하였다.
실시예 37. 실시예 21의 에멀젼 표면에 EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 EGFR 항원 인지형 에멀젼의 제조
실시예 21의 에멀젼 10 μl 당 EGFR 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 EGFR 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 에멀젼을 제조하였다.
실시예 38. 실시예 22의 고형지질나노입자 표면에 EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 EGFR 항원 인지형 고형 지질 나노입자의 제조
실시예 22에서 제조된 고형지질나노입자 10 μl 당 EGFR 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 EGFR 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 고형지질나노입자를 제조하였다.
실시예 39. 실시예 26의 양이온성 리포좀 표면에 Iba1 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 Iba1 항원 인지형 리포좀의 제조
실시예 26의 양이온성 리포좀 10 μl 당 Iba1 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 Iba1 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 양이온성 리포좀을 제조하였다.
실시예 40. 실시예 23의 파클리탁셀 함유 리포좀 표면에 HER2 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 HER2 항원 인지형 파클리탁셀 리포좀의 제조
실시예 23의 파클리탁셀 함유 음이온성 리포좀 10 μl 당 HER2 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 HER2 항체가 표면에 비공유적으로 결합한 HER2 항원 인지형 파클리탁셀 리포좀을 제조하였다.
실시예 41. 실시예 24의 도세탁셀 함유 리포좀 표면에 EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 EGFR 항원 인지형 도세탁셀 리포좀의 제조
실시예 24의 도세탁셀 함유 음이온성 리포좀 10 μl 당 EGFR 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여, EGFR 항체가 표면에 비공유적으로 결합한 EGFR항원 인지형 도세탁셀 음이온성 리포좀을 제조하였다.
실시예 42. 실시예 25의 독소루비신 함유 리포좀에 CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 CXCR4 항원 인지형 독소루비신 리포좀의 제조
실시예 25의 독소루비신 함유 리포좀 10 μl 당 CXCR4 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여, CXCR4 항체가 표면에 비공유적으 로 결합한 CXCR4 항원 인지형 독소루비신 리포좀을 제조하였다.
실시예 43. 실시예 26의 양이온성 리포좀 표면에 EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 EGFR 항원 인지형 양이온성 리포좀의 제조
실시예 26의 양이온성 리포좀 10 μl 당 EGFR 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여, EGFR 항체가 표면에 비공유적으로 결합한 EGFR 항원 인지형 및 리보핵산 탑재 양이온성 리포좀을 제조하였다.
실시예 44. 실시예 26의 양이온성 리포좀 표면에 CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 CXCR4 항원 인지형 양이온성 리포좀의 제조
실시예 26의 양이온성 리포좀 10 μl 당 CXCR4 항체 5 μg을 에펜도르프 튜브에 섞고 상온에서 30 분 동안 혼합하여 CXCR4 항체가 표면에 비공유적으로 결합한 CXCR4 항원 인지형 양이온성 리포좀을 제조하였다.
비교예 17. 비교예 10의 음이온성 리포좀 표면에 CXCR4 항체가 비선택적으로 공유결합된 리포좀의 제조
기존의 공유결합을 이용한 항체의 나노입자 표면 수식을 위하여 2-iminothiolane(Traut's reagent, Thermo Fisher Scientific Inc., USA)을 pH 8.0의 인산완충용액에 20 μM 농도가 되도록 용해시키고, 이 용액 16.6 μl와 5 μg의 CXCR4 항체를 혼합하여 1 시간동안 상온에서 반응시켜 티올기가 수식된 항체를 제 조하였다. 이후 비교예 10의 음이온성 리포좀 10 μl 당 티올기가 수식된 항체 5 μg을 첨가하고 4 시간동안 37 ℃에서 반응시켜 CXCR4 항체가 표면에 공유결합된 리포좀을 제조하였다.
비교예 18. 비교예 11의 중성 리포좀 표면에 EGFR 항체가 비선택적으로 공유결합된 리포좀의 제조
리포좀 표면에 EGFR 항체를 기존의 공유결합으로 수식하기 위하여, 2-iminothiolane을 pH 8.0의 인산완충용액 에 20 μM 농도가 되도록 용해시키고, 이 용액 16.6 μl와 5 μg의 EGFR 항체를 혼합하여 1 시간동안 상온에서 반응시켜 티올기가 수식된 항체를 제조하였다. 이후 비교예 11의 중성 리포좀 10 μl 당 티올기가 수식된 항체 5 μg을 첨가하고 4 시간동안 37 ℃에서 반응시켜 EGFR 항체가 표면에 공유결합 형태로 연결된 리포좀을 제조하였다.
비교예 19. 비교예 12의 양이온성 리포좀 표면에 HER2 항체가 비선택적으로 공유결합된 리포좀의 제조
리포좀 표면에 HER2 항체를 기존의 공유결합으로 수식하기 위하여, 2-iminothiolane을 pH 8.0의 인산완충용액에 20 μM 농도가 되도록 용해시키고, 이 용액 16.6 μl와 5 μg의 항-HER2 항체를 혼합하여 1 시간동안 상온에서 반응시켜 티올기가 수식된 항체를 제조하였다. 이후 비교예 12의 양이온성 리포좀 10 μl 당 티올기가 수식된 항체 5 μg을 첨가하고 4 시간동안 37 ℃에서 반응시켜 HER2 항체 가 공유결합으로 표면 수식된 리포좀을 제조하였다.
비교예 20. 비교예 16의 양이온성 리포좀 표면에 Iba1 항체가 비선택적으로 공유결합된 리포좀의 제조
리포좀 표면에 Iba1 항체를 기존의 공유결합으로 수식하기 위하여, 2-iminothiolane을 pH 8.0의 인산완충용액에 20 μM 농도가 되도록 용해시키고, 이 용액 16.6 μl와 5 μg의 항-Iba1 항체를 혼합하여 1 시간동안 상온에서 반응시켜 티올기가 수식된 항체를 제조하였다. 이후 비교예 16의 양이온성 리포좀 10 μl 당 티올기가 수식된 항체 5 μg을 첨가하고 4 시간동안 37 ℃에서 반응시켜 Iba1 항체가 공유결합으로 표면 수식된 리포좀을 제조하였다.
비교예 21. 비교예 13의 파클리탁셀 음이온성 리포좀 표면에 HER2 항체가 비선택적으로 공유결합된 파클리탁셀 리포좀의 제조
항암제인 파클리탁셀을 함유하는 리포좀 표면에 HER2 항체를 기존의 공유결합으로 수식하기 위하여 2-iminothiolane을 pH 8.0의 인산완충용액에 20 μM 농도가 되도록 용해시키고, 이 용액 16.6 μl와 5 μg의 항-HER2 항체를 혼합하여 1 시간동안 상온에서 반응시켜 티올기가 수식된 항체를 제조하였다. 이후 비교예 13의 파클리탁셀이 봉입된 음이온성 리포좀 10 μl 당 티올기가 수식된 항체 5 μg을 첨가하고 4 시간동안 37 ℃에서 반응시켜 HER2 항체가 공유결합으로 표면 수식된 파클리탁셀 리포좀을 제조하였다.
비교예 22. 비교예 14의 도세탁셀 음이온성 리포좀 표면에 EGFR 항체가 비선택적으로 공유결합된 도세탁셀 리포좀의 제조
항암제인 도세탁셀을 함유하는 리포좀 표면에 EGFR 항체를 기존의 공유결합으로 수식하기 위하여 2-iminothiolane을 pH 8.0의 인산완충용액에 20 μM 농도가 되도록 용해시키고, 이 용액 16.6 μl와 5 μg의 항-EGFR 항체를 혼합하여 1 시간동안 상온에서 반응시켜 티올기가 수식된 항체를 제조하였다. 이후 비교예 14의 도세탁셀이 봉입된 음이온성 리포좀 10 μl 당 티올기가 수식된 항체 5 μg을 첨가하고 4 시간동안 37 ℃에서 반응시켜 EGFR 항체가 공유결합으로 표면 수식된 도세탁셀 리포좀을 제조하였다.
비교예 23. 비교예 15의 독소루비신 음이온성 리포좀 표면에 CXCR4 항체가 비선택적으로 공유결합된 독소루비신 리포좀의 제조
독소루비신을 함유하는 리포좀 표면에 CXCR4 항체를 기존의 공유결합으로 수식하기 위하여 2-iminothiolane을 pH 8.0의 인산완충용액에 20 μM 농도가 되도록 용해시키고, 이 용액 16.6 μl와 5 μg의 CXCR4 항체를 혼합하여 1 시간동안 상온에서 반응시켜 티올기가 수식된 항체를 제조하였다. 이후 비교예 15의 독소루비신이 봉입된 음이온성 리포좀 10 μl 당 티올기가 수식된 항체 5 μg을 첨가하고 4 시간동안 37 ℃에서 반응시켜 CXCR4항체가 공유결합으로 표면 수식된 독소루비신 리포좀을 제조하였다.
비교예 24. 비교예 16의 양이온성 리포좀 표면에 EGFR 항체가 비선택적으로 공유결합된 EGFR 항원 인지형 리포좀의 제조
EGFR 항체를 기존의 공유결합으로 양이온성 리포좀 표면에 수식하기 위하여 2-iminothiolane을 pH 8.0의 인산완충용액에 20 μM 농도가 되도록 용해시키고, 이 용액 16.6 μl와 5 μg의 항-EGFR 항체를 혼합하여 1 시간동안 상온에서 반응시켜 티올기가 수식된 항체를 제조하였다. 이후 비교예 16의 양이온성 리포좀 10 μl 당 티올기가 수식된 항체 5 μg을 첨가하고 4 시간동안 37 ℃에서 반응시켜 EGFR 항체가 공유결합으로 표면 수식된 양이온성 리포좀을 제조하였다.
비교예 25. 비교예 16의 양이온성 리포좀 표면에 CXCR4 항체가 비선택적으로 공유결합된 CXCR4 항원 인지형 리포좀의 제조
CXCR4 항체를 기존의 공유결합으로 양이온성 리포좀 표면에 수식하기 위하여 2-iminothiolane을 pH 8.0의 인산완충용액에 20 μM 농도가 되도록 용해시키고, 이 용액 16.6 μl와 5 μg의 CXCR4 항체를 혼합하여 1 시간동안 상온에서 반응시켜 티올기가 수식된 항체를 제조하였다. 이후 비교예 16의 양이온성 리포좀 10 μl 당 티올기가 수식된 항체 5 μg을 첨가하고 4 시간동안 37 ℃에서 반응시켜 CXCR4 항체가 공유결합으로 표면 수식된 양이온성 리포좀을 제조하였다.
[실험예]
세포 배양
사람의 백혈병 세포인 Ramos 및 U937 세포주, 신경교종인 U87 세포주, 비인두표피암 조직에서 유래된 KB 세포주, 세포자궁경부암 상피 세포인 HeLa 세포주, 사람의 유방암 세포주인 MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-453 및 SK-BR-3, 미세 신경교세포인 MG5 세포주는 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하여 사용하였다. HeLa, Ramos, U937 및 MDA-MB-231 세포주는 RPMI(Gibco, USA), U87, MCF7, MDA-MB-453 및 MG5 세포주는 DMEM(Dulbecco's modified eagles medium, Gibco, USA), KB 및 SK-BR-3 세포주는 MEM(Minimum Essential Medium, Gibco, USA)에 10% 우태아 혈청 w/v (HyClone laboratories Inc, USA)와 100 unit/ml 페니실린 또는 100㎍/ml 스트렙토마이신을 포함하여 배양하였다.
실험예 1. CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 리포좀의 Ramos 세포 표면 CXCR4 항원 인지능 측정: FACS 분석
CXCR4를 과발현하는 것으로 알려진 Ramos 세포주를 실험 전날 6 웰 플레이트에 웰 당 3×105 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 3의 형광지질 함유 음이온성 리포좀, 비교예 17의 기존의 공유결합으로 CXCR4항체가 표면수식된 형광 음이온성 리포좀, 실시예 27의 CXCR4항체가 비공유적으로 표면에 결합된 CXCR4 항원 인지형 형광 음이온성 리포좀을 각각 첨가한 후 37 ℃의 CO₂배양기에서 30분간 동안 배양하였다. 배양된 세포 를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 비교예 3, 17 및 실시예 27에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR (BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 CXCR4 항원 인지능을 분석하였고, 이를 도1에 나타내었다.
도1A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도1B는 비교예 3의 음이온성 리포좀, 도1C는 비교예 17의 기존의 공유결합으로 CXCR4항체가 표면수식된 음이온성 리포좀, 도1D는 실시예 27의 비공유적으로 CXCR4 항체가 표면 결합된 음이온성 리포좀을 처리한 세포군으로 도1B는 3.97 %, 도1C는 59.53 %의 세포를 리포좀이 인지하여 결합한 반면, 본 발명의 실시예 27의 CXCR4 항원 인지형 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 96.53 % 를 나타내어 비교예 3의 음이온성 리포좀 처리군에 비하여 세포 표면의 항원 인지능이 현저히 증가되었고 기존의 방법대로 제조한 비교예 17의 CXCR4 항체가 공유결합된 음이온성 리포좀보다 Ramos 세포 결합 비율이 37% 정도 증가되었음을 알 수 있다.
실험예 2. CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 리포좀의 U937 세포 표면 CXCR4 항원 인지능 측정: FACS 분석
CXCR4를 세포 표면에 과발현하는 것으로 알려진 U937 세포주를 실험 전날 6 웰 플레이트에 웰 당 3×105 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 3의 형광지질 함유 음이온성 리포좀, 비교예 17의 기존의 공유결합으로 CXCR4항체가 표면수식된 형광 음이온성 리포좀, 실시예 28의 CXCR4 항체가 비공유적으로 표면 결합된 음이온성 리포좀을 각각 첨가한 후 37 ℃의 CO₂배양기에서 30분간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 비교예 3, 17 및 실시예 28에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 CXCR4 항원 인지능을 분석하였고, 이를 도2에 나타내었다.
도2A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도2B는 비교예 3의 음이온성 리포좀, 도2C는 비교예 17의 CXCR4 항체가 공유결합으로 연결된 음이온성 리포좀, 도2D는 실시예 28의 CXCR4 항체가 비공유적으로 표면 결합된 항원 인지형 음이온성 리포좀을 처리한 세포군으로 도2B는 4.36 %, 도2C는 50.33 % 의 세포가 형광으로 표지된 반면, 본 발명의 실시예 28의 CXCR4 항체가 비공유적으로 결합된 음이온성 리포좀 처리군의 경우 86.30 %의 세포가 형광으로 표지되어 비교예 3, 17의 음이온성 리포좀 처리군 각각에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가되었음을 알 수 있다.
실험예 3. CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 리포좀의 HeLa 세포 주 표면 CXCR4 항원 인지능 측정: FACS 분석
CXCR4를 과발현하는 것으로 알려진 HeLa 세포주를 실험 전날 6 웰 플레이트에 웰 당 3×105 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 3의 형광 음이온성 리포좀, 비교예 17의 CXCR4 항체가 공유결합으로 수식된 형광 음이온성 리포좀, 실시예 29의 CXCR4 항체가 비공유적으로 결합된 형광 음이온성 리포좀을 각각 첨가한 후 37 ℃의 CO₂배양기에서 30분간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 비교예 3, 17 및 실시예 29에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 CXCR4 항원 인지능을 분석하였고, 이를 도3에 나타내었다.
도3A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도3B는 비교예 3의 형광 음이온성 리포좀, 도3C는 비교예 17의 CXCR4가 공유결합으로 연결된 형광 음이온성 리포좀, 도3D는 실시예 29의 CXCR4가 비공유적으로 결합된 형광 음이온성 리포좀을 처리한 세포군으로 도3B는 1.55 %, 도3C는 72.45 % 전달 된 반면, 본 발명의 실시예 29의 CXCR4가 비공유적으로 결합된 형광 음이온성 리포좀 처리군의 경우 99.48 % 를 나타내어 비교예 3 및 17의 음이온성 리포좀 처리군에 비하여 HeLa 세포주 표면의 CXCR4 항원 인지능이 증가되었음을 알 수 있다.
실험예 4. EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 리포좀의 U87세포 표면 EGFR 항원 인지능 측정 : FACS 분석
EGFR을 과발현하는 것으로 알려진 U87 세포주를 실험 전날 6 웰 플레이트에 웰 당 3×105 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 4의 형광 지질 함유 중성 리포좀, 비교예 18의 EGFR 항체가 공유결합으로 표면 수식된 형광 지질 함유 중성 리포좀, 실시예 30의 EGFR 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 형광 지질 함유 중성 리포좀을 각각 첨가한 후 37 ℃의 CO₂배양기에서 30분간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충 용액으로 2번 세척하였다. 비교예 4, 18 및 실시예 30에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 표지된 중성 리포좀이 부착된 세포들은 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 EGFR 항원 인지능을 분석하였고, 이를 도4에 나타내었다.
도4A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도4B는 비교예 4의 형광 지질인 NBD-PE 함유 중성 리포좀, 도4C는 비교예 18의 EGFR 항체가 표면에 공유결합으로 수식된 NBD-PE 함유 중성 리포좀, 도4D는 실시예 30의 EGFR 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀을 처리한 세포군으로 도4B는 10.00 %, 도4C는 42.45 % 의 세포가 형광 리포좀에 의해 인지된 반면, 본 발명의 실시예 30의 EGFR 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 중성 리포좀의 경우 97.38 %가 형광으로 표지화 되어 비교예 4 및 기존의 공유결합 방식으로 항체가 표면 수식된 비교예 18에 비하여서도 목적하는 세포 표면의 EGFR 항원을 인지하는 효율이 크게 증가한 것을 알 수 있다.
실험예 5. EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 리포좀의 KB 세포 표면 EGFR 항원 인지능 측정 :FACS 분석
EGFR을 과발현한다고 알려진 KB 세포주를 실험 전날 6 웰 플레이트에 웰 당 3×105 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 4의 NBD-PE 형광 지질 함유 중성 리포좀, 비교예 18의 EGFR 항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀, 실시예 31의 EGFR 항체가 비공유적으로 표면에 결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀을 각각 첨가한 후 37 ℃의 CO₂배양기에서 30분간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 비교예 4, 18 및 실시예 31에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 표지된 중성 리포좀이 부착된 세포들은 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 EGFR 항원 인지능을 분석하였고, 이를 도5에 나타내었다.
도5A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도5B는 비교예 4의 NBD-PE 중성 리포좀, 도5C는 비교예 18의 EGFR 항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀, 도5D는 실시예 31의 EGFR 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀을 각각 처리한 세포군으로 도5B는 12.48 %, 도5C는 67.85 %의 세포가 형광으로 표지화 된 반면, 본 발명의 실시예 31의 EGFR 항체가 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀의 경우 99.03 % 의 형광 표지율을 나타내어 비교예 4 및 비교예 18의 기존 방식으로 항체를 공유결합시킨 리포좀에 비하여 세포 표면의 EGFR 항원을 인지하는 효율이 현저히 증가되었음을 알 수 있다.
실험예 6. EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 리포좀의 MDA-MB-231 세포 표면 EGFR 항원 인지능 측정 :FACS 분석
EGFR을 과발현한다고 알려진 MDA-MB-231 세포주를 실험 전날 6 웰 플레이트에 웰 당 3×105 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 4의 NBD-PE 형광 지질 함유 중성 리포좀, 비교예 18의 EGFR 항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀, 실시예 32의 EGFR 항체가 비공유적으로 표면에 결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀을 각각 첨가한 후 37 ℃의 CO₂배양기에서 30분간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 비교예 4, 18 및 실시예 32에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 표지된 중성 리포좀이 부착된 세포들은 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 EGFR 항원 인지능을 분석하였고, 이를 도6에 나타내었다.
도6A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도6B는 비교예 4의 NBD-PE 중성 리포좀, 도6C는 비교예 18의 EGFR 항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀, 도6D는 실시예 32의 EGFR 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀을 각각 처리한 세포군으로 도6B는 3.55 %, 도6C는 70.49 % 세포가 형광으로 표지화 된 반면, 본 발명의 실시예 32의 EGFR 항체가 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀의 경우 92.02 % 의 형광 표지율을 나타내어 비교예 4 및 비교예 18의 기존 방식으로 항체를 공유결합시킨 리포좀에 비하여 세포 표면의 EGFR 항원을 인지하는 효율이 현저히 증가되었음을 알 수 있다.
실험예 7. HER2 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 리포좀의 MCF-7 세포 표면 HER2 항원 인지능 측정 : FACS 분석
HER2를 과발현한다고 알려진 MCF7 세포주를 실험 전날 6 웰 플레이트에 웰 당 3×105 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 5의 NBD-PE 형광 지질 함유 양이온성 리포좀, 비교예 19의 HER2항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀, 실시예 33의 HER2 항 체가 비공유적으로 표면에 결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀을 각각 첨가한 후 37 ℃의 CO₂배양기에서 30분간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 비교예 5, 19 및 실시예 33에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 표지된 중성 리포좀이 부착된 세포들은 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 HER2 항원 인지능을 분석하였고, 이를 도7에 나타내었다.
도7A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도7B는 비교예 5의 NBD-PE 양이온성 리포좀, 도7C는 비교예 19의 HER2 항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀, 도7D는 실시예 33의 HER2 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀을 각각 처리한 세포군으로 도7B는 27.75 %, 도7C는 79.62%의 세포가 형광으로 표지화 된 반면, 본 발명의 실시예 33의 HER2항체가 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀의 경우 90.57% 의 형광 표지율을 나타내어 비교예 5 및 비교예 19의 기존 방법으로 항체를 표면에 공유 결합시킨 리포좀에 비하여 세포 표면의 HER2 항원을 인지하는 효율이 현저히 증가되었음을 알 수 있다.
실험예 8. HER2 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 리포좀의 MDA-MB-453 세포 표면 HER2 항원 인지능 측정: FACS 분석
HER2를 과발현하는 것으로 알려진 MDA-MB-453 세포주를 실험 전날 6 웰 플레 이트에 웰 당 3×105 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 5의 NBD-PE 형광 지질 함유 양이온성 리포좀, 비교예 19의 HER2항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀, 실시예 34의 HER2 항체가 비공유적으로 표면에 결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀을 각각 첨가한 후 37 ℃의 CO₂배양기에서 30분간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 비교예 5, 19 및 실시예 34에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 표지된 중성 리포좀이 부착된 세포들은 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 HER2 항원 인지능을 분석하였고, 이를 도8에 나타내었다.
도8A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도8B는 비교예 5의 NBD-PE 양이온성 리포좀, 도8C는 비교예 19의 HER2 항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀, 도8D는 실시예 34의 HER2 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀을 각각 처리한 세포군으로 도8B는 34.61%, 도8C는 70.49%의 세포가 형광으로 표지화 된 반면, 도8D에서 본 발명의 실시예 34의 HER2항체가 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀의 경우 95.20% 의 형광 표지율을 나타내어 비교예 5 및 비교예 19의 기존 방법으로 항체를 표면에 공유 결합시킨 리포좀에 비하여 비공유적으로 HER2 항체가 결합된 리포좀 나노입자의 경우 세포 표면의 HER2 항원을 인지하는 효율이 현저히 증가되었음을 알 수 있다.
실험예 9. HER2 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 리포좀의 SK-BR-3 세포 표면 HER2 항원 인지능 측정 : FACS 분석
HER2를 과발현하는 것으로 알려진 SK-BR-3 세포주를 실험 전날 6 웰 플레이트에 웰 당 3×105 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 5의 NBD-PE 형광 지질 함유 양이온성 리포좀, 비교예 19의 HER2항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀, 실시예 35의 HER2 항체가 비공유적으로 표면에 결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀을 각각 첨가한 후 37 ℃의 CO₂배양기에서 30분간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 비교예 5, 19 및 실시예 35에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 표지된 중성 리포좀이 부착된 세포들은 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 HER2 항원 인지능을 분석하였고, 이를 도9에 나타내었다.
도9A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도9B는 비교예 5의 NBD-PE 양이온성 리포좀, 도9C는 비교예 19의 HER2 항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀, 도9D는 실시예 35의 HER2 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀을 각각 처리한 세포군으로 도9B는 14.70%, 도9C는 61.14%의 세포가 형광으로 표지화 된 반면, 도9D에서 본 발명의 실시예 35의 HER2항체가 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀의 경우 98.53%의 높은 형광 표지율을 나타내어 비교예 5 및 비교예 19의 기존 방법으로 항체를 표면에 공유 결합시킨 리포좀에 비하여 비공유적으로 HER2 항체가 결합된 실시예 35의 양이온성 리포좀 나노입자의 경우 세포 표면의 HER2 항원을 인지하는 효율이 현저히 증가되었음을 알 수 있다.
실험예 10. EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 미셀의 U87 세포 표면 EGFR 항원 인지능 측정 : FACS 분석
EGFR을 과발현한다고 알려진 U87 세포주를 실험 전날 6 웰 플레이트에 웰 당 3×105 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 4의 NBD-PE 형광 지질 함유 중성 리포좀, 비교예 18의 EGFR 항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀, 실시예 36의 EGFR 항체가 비공유적으로 표면에 결합된 NBD-PE 함유 미셀을 각각 첨가한 후 37 ℃의 CO₂배양기에서 30분간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 비교예 4, 18 및 실시예 36에서 사용된 나노입자 제형은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 EGFR 항원 인지능을 분석하였고, 이를 도10에 나타내었다.
도10A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도10B는 비교예 4의 NBD-PE 중성 리포좀, 도10C는 비교예 18의 EGFR 항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀, 도10D는 실시예 36의 EGFR 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 미셀 나노입자를 각각 처리한 세포군으로 도10B는 0.52%, 도10C는 46.22%의 세포가 형광으로 표지화 된 반면, 도10D에서 본 발명의 실시예 35의 EGFR항체가 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀의 경우 79.85%의 높은 형광 표지율을 나타내어 비교예 4 및 비교예 18의 기존 방법으로 항체를 표면에 공유 결합시킨 리포좀에 비하여 비공유적으로 EGFR항체가 결합된 실시예 36의 미셀 나노입자의 경우 세포 표면의 EGFR항원을 인지하는 효율이 현저히 증가되었음을 알 수 있다.
실험예 11. EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 에멀젼의 KB 세포주 표면 EGFR 항원 인지능 측정: FACS 분석
EGFR을 과발현한다고 알려진 KB 세포주를 실험 전날 6 웰 플레이트에 웰 당 3×105 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 4의 NBD-PE 형광 지질 함유 중성 리포좀, 비교예 18의 EGFR 항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀, 실시예 37의 EGFR 항체가 비공유적으로 표면에 결합된 NBD-PE 함유 에멀젼을 각각 첨가한 후 37 ℃의 CO₂배양기에서 30분간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세 척하였다. 비교예 4, 18 및 실시예 37에서 사용된 제형은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 EGFR 항원 인지능을 분석하였고, 이를 도11에 나타내었다.
도11A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도11B는 비교예 4의 NBD-PE 중성 리포좀, 도11C는 비교예 18의 EGFR 항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀, 도11D는 실시예 37의 EGFR 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 에멀젼을 각각 처리한 세포군으로 도11B는 8.36%, 도11C는 53.75%의 세포가 형광으로 표지화 된 반면, 도11D에서 본 발명의 실시예 37의 EGFR항체가 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 양이온성 리포좀의 경우 94.73%의 높은 형광 표지율을 나타내어 비교예 4 및 비교예 18의 기존 방법으로 항체를 표면에 공유 결합시킨 리포좀에 비하여 비공유적으로 EGFR항체가 결합된 실시예 37의 에멀젼의 경우 세포 표면의 EGFR항원을 인지하는 효율이 현저히 증가되었음을 알 수 있다.
실험예 12. EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 고형지질나노입자의 MDA-MB-231 세포 표면 EGFR 항원 인지능 측정 : FACS 분석
EGFR을 과발현하는 것으로 알려진 MDA-MB-231 세포주를 실험 전날 6 웰 플레이트에 웰 당 3×105 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 4의 NBD-PE 형광 지질 함유 중성 리포좀, 비교예 18의 EGFR 항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀, 실시예 38의 EGFR 항체가 비공유적으로 표면에 결합된 NBD-PE 함유 고형 지질 나노입자 (solid lipid nanoparticles)을 각각 첨가한 후 37 ℃의 CO₂배양기에서 30분간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 비교예 4, 18 및 실시예 38에서 사용된 제형은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 EGFR 항원 인지능을 분석하였고, 이를 도12에 나타내었다.
도12A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도12B는 비교예 4의 NBD-PE 중성 리포좀, 도12C는 비교예 18의 EGFR 항체가 표면에 공유결합된 NBD-PE 함유 중성 리포좀, 도12D는 실시예 38의 EGFR 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 고형 지질 나노입자를 각각 처리한 세포군으로 도12B는 25.19%, 도12C는 55.33%의 세포가 형광으로 표지화 된 반면, 도12D에서 본 발명의 실시예 37의 EGFR항체가 비공유적으로 결합된 NBD-PE 함유 고형 지질 나노입자의 경우 93.03%의 높은 형광 표지율을 나타내어 비교예 4 및 비교예 18의 기존 방법으로 항체를 표면에 공유 결합시킨 리포좀에 비하여 비공유적으로 EGFR항체가 표면에 결합된 실시예 38의 고형 지질 나노입자의 경우 세포 표면의 EGFR항원을 인지하는 효율이 현저히 증가되었음을 알 수 있다.
실험예 13. Iba1 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 리포좀의 MG5 세포 표면 Iba1 항원 인지능 측정 : FACS 분석
Iba1을 과발현하는 것으로 알려진 MG5 세포주를 실험 전날 6 웰 플레이트에 웰 당 3×105 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 9의 양이온성 리포좀, 비교예 20의 Iba1 항체가 표면에 공유결합된 양이온성 리포좀, 실시예 39의 Iba1 항체가 비공유적으로 표면에 결합된 양이온성 리포좀과, 혈청이 포함되지 않은 배지 50 μl씩을 넣고 형광 마커로 표지된 이중나선 리보핵산 물질인 Block-iT (Invitrogen, 미국) 20 pmole 씩을 각각 첨가하였다. 이후 37 ℃의 CO₂배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 이후 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 리포좀에 의하여 형광 표지된 이중나선 리보핵산이 전달된 세포들을 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 전달 효율을 분석하였고, 이를 도13에 나타내었다.
도13A의 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도13B는 비교예 9의 양이온성 리포좀과 형광 이중나선 리보핵산의 복합체, 도13C는 비교예 20의 Iba1 항체가 표면에 공유결합된 양이온성 리포좀과 형광 이중나선 리보핵산의 복합체 처리군, 도13D는 실시예 39의 Iba1 항체가 비공유적으로 표면에 결합된 양이온성 리포좀과 형광 이중나선 리보핵산의 복합체를 각각 처리한 세포군으로 도13B는 60.73 %, 도13C는 80.31 % 전달 된 반면, 본 발명의 실시예 39 의 Iba1 항체가 비공유적으로 표면에 결합된 양이온성 리포좀과 형광 이중나선 리보핵산의 복합체 처리군의 경우 97.61 %의 세포가 형광으로 표지화 되어서 비교예 9 및 20의 양이온성 리포좀에 비하여 세포 내 이중 나선 리보핵산 전달 효율이 증가되었음을 알 수 있다.
실험예 14. HER2 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 파클리탁셀 리포좀의 항암 효능 평가 :MTT 분석
본 발명의 HER2 항체가 비공유적으로 결합된 파클리탁셀 리포좀의 표적세포 내 항암제 전달 효율에 관한 평가를 하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다. HER2를 과발현하는 것으로 알려진 MCF-7 세포에 비교예 6의 파클리탁셀이 봉입된 음이온성 리포좀과 비교예 21의 HER2항체가 비선택적으로 공유결합된 파클리탁셀 음이온성 리포좀, 실시예 40의 HER2항체의 Fc 부분이 선택적으로 비공유 결합된 파클리탁셀 음이온성 리포좀을 각각 처리하고 세포 내로 전달된 항암제에 의한 암세포의 생존율을 평가하였다. 항암 효능은 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 시약에 의한 방법으로 세포 생존율을 측정하여 평가하였다.
세포를 웰 당 2×104 세포가 되도록 48 웰(well)에 분주 (seeding)하고 12시간 배양한 후 비교예 6의 파클리탁셀이 봉입된 음이온성 리포좀, 비교예 21의 HER2항체가 표면에 공유결합된 파클리탁셀 음이온성 리포좀, 실시예 40의 HER2항체가 표면에 비공유적으로 결합된 파클리탁셀 음이온성 리포좀 10 μl를 각각 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 MTT 용액(Sigma, USA)을 배지의 10%가 되도록 가하고, 4시간 더 배양한 다음 상층액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더 (ELISA reader, Sunrise-Basic TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 570 nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다. 도14는 상기의 파클리탁셀이 봉입된 리포좀 제형들의 항암 효능을 평가한 결과로 비교예 6의 파클리탁셀 함유 음이온성 리포좀이나 비교예 21의 HER2 항체가 표면에 공유결합된 파클리탁셀 리포좀 보다 실시예 40의 HER2 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 파클리탁셀 리포좀 조성이 더 증강된 암세포 사멸효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 이러한 도14의 항암 효능 결과로부터 실시예 40의 HER2 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 파클리탁셀 리포좀의 경우 HER2 항원을 세포 표면에 발현하는 MCF 세포주에 보다 효과적으로 결합하여 파클리탁셀을 암세포내로 전달하여 증강된 항암 효능을 나타내는 것을 추론할 수 있다.
실험예 15. EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 도세탁셀 리포좀의 항암 효능 평가 : MTT 분석
본 발명의 EGFR 항체가 비공유적으로 결합된 도세탁셀 리포좀의 표적세포 내 항암제 전달 효율에 관한 평가를 하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다. EGFR을 과발현한다고 알려진 U87 세포에 도세탁셀이 봉입된 비교예 7의 음이 온성 리포좀과 도세탁셀이 봉입된 비교예 22의 EGFR 항체가 비선택적으로 공유결합된 음이온성 리포좀, 도세탁셀이 봉입된 실시예 41의 EGFR 항체의 Fc 부분이 선택적으로 비공유 결합된 음이온성 리포좀 조성을 처리하고 암세포의 사멸 정도를 평가하였다. 항암 효능은 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 시약에 의한 방법으로 평가하였다.
세포를 웰 당 2×104 세포가 되도록 48 웰(well)에 분주 (seeding)하고 12시간 배양한 후 비교예 7의 리포좀, 비교예 22의 리포좀, 실시예 41의 리포좀 10 μl를 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 각각 MTT 용액(Sigma, USA)을 배지의 10%가 되도록 가하고, 4시간 더 배양한 다음 상층액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더 (ELISA reader, Sunrise-Basic TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 570 nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다. 도15는 상기의 도세탁셀이 봉입된 조성들의 항암 효능 평가 실험을 수행한 결과로 비교예 7의 도세탁셀 함유 음이온성 리포좀이나 비교예 22의 EGFR 항체가 공유적으로 수식된 음이온성 도세탁셀 리포좀 보다 실시예 41의 EGFR 항체가 비공유적으로 결합된 음이온성 도세탁셀 리포좀 조성이 더 증가된 항암 효능을 나타낸다는 것을 보여준다. 따라서, 실시예 41의 EGFR항체가 표면에 비공유적으로 결합된 파클리탁셀 리포좀의 경우 EGFR 항원을 세포 표면에 과발현하는 MCF 세포주에 보다 효과적으로 결합하여 파클리탁셀을 암세포내로 전달하여 증강된 항암 효능을 나타내는 것으로 생각된다.
실험예 16. CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 독소루비신 리포좀의 항암 효능 평가 : MTT 분석
본 발명의 CXCR4 항체가 비공유적으로 결합된 독소루비신 리포좀의 표적세포 내 항암제 전달 효율에 관한 평가를 하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다. CXCR4 항원을 표면에 과발현하는 것으로 알려진 Ramos 세포에 독소루비신이 봉입된 비교예 8의 음이온성 리포좀과 독소루비신이 봉입된 비교예 23의 CXCR4 항체가 표면에 공유결합된 음이온성 리포좀, 독소루비신이 봉입된 실시예 42의 CXCR4 항체의 Fc 부분이 표면에 비공유적으로 결합된 음이온성 리포좀 조성을 처리하고 항암 효능을 평가하였다. 암세포의 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 시약에 의한 방법으로 평가하였다.
세포를 웰 당 2×104 세포가 되도록 48 웰(well)에 분주 (seeding)하고 12시간 배양한 후 비교예 8의 리포좀, 비교예 23의 리포좀, 실시예 42의 리포좀 10 μl를 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 각각 MTT 용액(Sigma, USA)을 배지의 10%가 되도록 가하고, 4시간 더 배양한 다음 상층액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더 (ELISA reader, Sunrise-Basic TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 570 nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다. 도16은 상기의 독소루비신이 봉입된 리포좀 조성들의 항암 효능 평가 실험을 수행한 결과로 비교예 8의 독소루비신 리포좀이나 비교예 23의 CXCR4 항체가 표면에 공유결합된 독소루비신 리포좀 보다 실시예 42의 CXCR4 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 리포좀 조성이 더 증가된 암세포 사멸능을 나타낸다는 것을 보여준다. 따라서 도16으로부터 CXCR4 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 독소루비신 리포좀의 경우 CXCR4 항원을 세포 표면에 과발현하는 Ramos 세포주에 보다 효과적으로 결합하여 독소루비신의 세포 내 전달능력이 향상된 것을 알 수 있다.
실험예 17. EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 양하전 리포좀의 작은간섭 리보핵산 전달 효능 평가: 역전사 효소 중합 반응에 의한 mRNA 분석
EGFR을 세포 표면에 과발현하는 것으로 알려진 U87 세포주를 실험 전날 12 웰 플레이트에 웰 당 세포를 2×105 씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 에펜도르프 튜브에 서바이빈 유전자 발현을 선택적으로 억제하는 siRNA (siSurvivin) 20 pmole 씩과 비교예 9의 항체가 수식되지 않은 양이온성 리포좀 10 μl, 비교예 24의 EGFR항체가 비선택적으로 공유 결합된 양이온성 리포좀 10 μl, 실시예 43의 EGFR항체의 Fc 부분이 선택적으로 비공유 결합된 양이온성 리포좀을 각각 첨가하였다. 서바이빈 (survivin) 유전자(Gene bank accession number: NM_001168)의 발현 억제를 유도하기 위한 siRNA는 삼천리제약 (Samchully Pharmaceuticals, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 미디어에 포함된 siRNA의 최종 농도는 50 nM이 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하고 이렇게 제조된 리포좀과 작은간섭 리보핵산의 복합체를 각각 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포내에 존재하는 전체 리보핵산 (RNA)을 분리하였으며, 이 RNA는 AccuPowerRT PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA로 역전사 하였다. 중합효소연쇄반응은 95℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성화시킨 후, 95℃/1분; 57℃/1분; 및 72℃/1분을 한 사이클로 하여 최종 30회 반복한 다음, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키는 조건으로 수행하였다. 서바이빈(survivin)에 특이적인 프라이머의 서열은 5'-GGACCACCGCATCTCTACAT-3'(정방향), 5'-CTTTCTCCGCAGTTTCCTCA-3'(역방향)이며 중합효소연쇄반응 생성물의 크기는 347 염기쌍이었다. 서바이빈(survivin) 유전자 발현의 정도는 1 % 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 서바이빈 특이적인 연쇄반응 생성물의 밴드 밀도를 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 증폭하여 나타나는 밴드 밀도로 보정하여 정량적인 발현의 변화를 측정하였다.
도17은 각각의 조성을 처리한 경우 U87 세포내에서 타겟 유전자인 서바이빈의 전사체 발현을 밴드의 밀도로 비교한 것이다. 대조군은 서바이빈 특이적인 작은간섭 리보핵산이 세포 내로 전달되지 않아 서바이빈 유전자의 발현에 변화가 없었고, 비교예 9의 항체가 존재하지 않는 양이온성 리포좀과 리보핵산의 복합체 처리군, 비교예 24의 EGFR항체가 표면에 공유적으로 결합한 양이온성 리포좀과 서바이 빈 특이적 작은간섭 리보핵산의 복합체 처리군에 비하여 실시예 43의 EGFR항체가 표면에 비공유적으로 결합한 양이온성 리포좀과 서바이빈 특이적 작은간섭 리보핵산의 복합체 처리군의 경우 세포 내에서 서바이빈 유전자 발현이 현저히 억제되었다. 실시예 43에서 서바이빈 유전자의 mRNA 수준의 발현 억제능이 가장 증가한 것은 리포좀 표면에 Fc 부분이 선택적으로 비공유 결합된 CXCR4 항체가 세포 내로 서바이빈 특이적인 작은간섭 리보핵산을 전달하는 효율이 증가한 결과 나타나는 현상으로 해석된다.
실험예 18. CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 양하전 리포좀의 작은간섭 리보핵산 전달 효능 평가: 역전사 효소 중합 반응에 의한 mRNA 분석
CXCR4를 표면에 과발현하는 것으로 알려진 HeLa 세포주를 실험 전날 12 웰 플레이트에 웰 당 세포를 2×105 씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 에펜도르프 튜브에 서바이빈 유전자 발현 억제를 위한 siRNA 20 pmole 씩과 비교예 9의 양이온성 리포좀 10 μl, 비교예 25의 CXCR4 항체가 표면에 공유결합된 양이온성 리포좀 10 μl, 실시예 44의 CXCR4 항체가 표면에 비공유적으로 결합된 양이온성 리포좀을 각각 첨가하였다. 미디어에 포함된 siRNA의 최종 농도는 50 nM이 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하고 이렇게 제조된 리포좀과 작은간섭 리보핵산의 복합체를 각각 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂세포배양 기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포내에 존재하는 전체 리보핵산 (RNA)을 분리하였으며, 이 RNA는 AccuPowerRT PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA로 역전사 하였다. 중합효소연쇄반응은 95℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성화시킨 후, 95℃/1분; 57℃/1분; 및 72℃/1분을 한 사이클로 하여 최종 30회 반복한 다음, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키는 조건으로 수행하였다. 서바이빈(survivin)에 특이적인 프라이머의 서열은 5'-GGACCACCGCATCTCTACAT-3'(정방향), 5'-CTTTCTCCGCAGTTTCCTCA-3'(역방향)이며 중합효소연쇄반응 생성물의 크기는 347 염기쌍이었다. 서바이빈(survivin) 유전자 발현의 정도는 1 % 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 서바이빈 특이적인 연쇄반응 생성물의 밴드 밀도를 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 증폭하여 나타나는 밴드 밀도로 보정하여 정량적인 발현의 변화를 측정하였다.
도18은 각각의 조성을 처리한 경우 HeLa 세포내에서 타겟 유전자인 서바이빈의 전사체 발현을 밴드의 밀도로 비교한 것이다. 대조군은 서바이빈 특이적인 작은간섭 리보핵산이 세포 내로 전달되지 않아 서바이빈 유전자의 발현에 변화가 없었고, 비교예 9의 항체가 존재하지 않는 양이온성 리포좀과 리보핵산의 복합체 처리군, 비교예 25의 CXCR4항체가 표면에 공유적으로 결합한 양이온성 리포좀과 서바이빈 특이적 작은간섭 리보핵산의 복합체 처리군에 비하여 실시예 44의 CXCR4항체가 표면에 비공유적으로 결합한 양이온성 리포좀과 서바이빈 특이적 작은간섭 리보핵산의 복합체 처리군의 경우 세포 내에서 서바이빈 유전자 발현이 현저히 억제되었 다. 실시예 44에서 서바이빈 유전자의 mRNA 수준의 발현 억제능이 가장 증가한 것은 리포좀 표면에 Fc 부분이 비공유적으로 결합된 CXCR4 항체가 세포 내로 서바이빈 특이적인 작은간섭 리보핵산을 전달하는 효율이 증가한 결과 나타나는 현상으로 해석된다.
도 1은 사람의 백혈병 세포주인 Ramos 에서 CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 형광 지질 함유 리포좀의 Ramos 세포 표면 CXCR4 항원 인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 2는 사람의 백혈병 세포주인 U937 에서 CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 형광 지질 함유 리포좀의 U937 세포 표면 CXCR4 항원 인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 3은 사람의 자궁경부암 상피 세포주인 HeLa에서 CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 형광 지질 함유 리포좀의 HeLa 세포주 표면 CXCR4 항원 인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 4는 사람의 신경교종 세포주인 U87 에서 EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 형광 지질 함유 리포좀의 U87세포 표면 EGFR 항원 인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 5는 사람의 비인두 표피암 조직에서 유래된 세포주인 KB 에서 EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 형광 지질 함유 리포좀의 KB 세포 표면 EGFR 항원 인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 6은 사람의 유방암 세포주인 MDA-MB-231 에서 EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 형광 지질 함유 리포좀의 MDA-MB-231 세포 표면 EGFR 항원 인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 7은 사람의 유방암 세포주인 MCF7 에서 EGFR항체의 Fc 부분이 비공유적으 로 선택 결합된 형광 지질 함유 리포좀의 MCF7 세포 표면 EGFR 항원 인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 8은 사람의 유방암 세포주인 MDA-MB-453 에서 HER2항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 형광 지질 함유 리포좀의 MDA-MB-453 세포 표면 HER2 항원 인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 9는 사람의 유방암 세포주인 SK-BR-3 에서 HER2항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 형광 지질 함유 리포좀의 SK-BR-3 세포 표면 HER2 항원 인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 10은 사람의 신경교종 세포주인 U87 에서 EGFR항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 형광 지질 함유 미셀의 U87 세포 표면 EGFR 항원 인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 11은 사람의 비인두 표피암 조직에서 유래된 세포주인 KB 에서 EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 형광 지질 함유 에멀젼의 전달 효율 정도를 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 12는 사람의 유방암 세포주인 MDA-MB-231 에서 EGFR항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 고형 지질 나노입자의 MDA-MB-231 세포주 표면 EGFR 항원 인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 13은 사람의 미세 신경교세포 세포주인 MG5 에서 Iba1 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 리포좀와 형광 마커로 표지된 이중 나선 리보핵산의 복합체의 MG5 세포 표면 Iba1 항원 인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분 석한 결과이다.
도 14는 HER2 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 파클리탁셀 함유 리포좀에 의한 암세포 사멸 효능을 MTT (tetrazolium 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide) 염색법을 사용하여 MCF 세포주에서 확인한 결과이다.
도 15는 EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 도세탁셀 함유 리포좀에 의한 암세포 사멸 효능을 MTT 염색법을 사용하여 U87 세포주에서 확인한 결과이다.
도 16은 CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 독소루비신 함유 리포좀에 의한 암세포 사멸 효능을 MTT 염색법을 사용하여 Ramos 세포주에서 확인할 결과이다.
도 17은 EGFR 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 양하전 리포좀을 이용하여 서바이빈 발현 억제 siRNA에 의해 매개된 서바이빈 전사체 발현 억제 효능을 U87 세포주에서 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 18은 CXCR4 항체의 Fc 부분이 비공유적으로 선택 결합된 양하전 리포좀을 이용하여 서바이빈 발현 억제 siRNA에 의해 매개된 서바이빈 전사체 발현 억제 효능을 HeLa 세포주에서 역전사 중합효소 연쇄반응으로 확인한 결과를 보여준다.
<110> Korea University Industrial & Academic Collaboration Foundation
<120> Lipopeptides with specific affinity to Fc region of antibodies
and antigen-recognizing lipid nanoparticles comprising the same
<160> 5
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region binding protein
<400> 1
Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region binding protein
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1 5 10
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<220>
<223> Fc region binding protein
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<212> PRT
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<220>
<223> Fc region binding protein
<400> 5
His Phe Arg Arg His Leu
1 5
Claims (23)
- 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드(Fc-binding peptide)와 지질이 공유결합되어 있는 항체의 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 포함하는 지질 나노입자(lipid nanoparticle)에 항체가 비공유결합되어 있는 항원 인지형 지질 나노입자.
- 제1항에 있어서,상기 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드가 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 하기 구조식 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 분지형 펩타이드인 항원 인지형 지질 나노입자.서열번호 1: DCAWHLGELVWCT서열번호 2: CDCAWHLGELVWCT서열번호 3: HWRGWV서열번호 4: HYFKFD서열번호 5: HFRRHL[구조식 1]
- 제1항에 있어서,항체의 Fc 영역 결합 펩타이드의 설프하이드릴기(-SH) 또는 N 말단의 아민기(-NH2)에 지질이 공유결합되어 있는 항원 인지형 지질 나노입자.
- 제1항에 있어서,상기 지질이 -COOH, -CHO, -NH2, -SH, -S-S-, -CONH2, -PO3H, -PO4H, -SO3H, -SO4H, -OH, -술포네이트, -니트레이트, -포스포네이트, -숙신이미딜기, -말레이미드기, 및 -알킬기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 기능기를 가지는 항원 인지형 지질 나노입자.
- 제1항에 있어서,상기 지질이 하기 화학식 1의 화합물인 항원 인지형 지질 나노입자:[화학식 1]
상기 식에서,R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 3 내지 24의 알킬, 또는 탄소수 3 내지 24의 알케닐을 나타내고,X는 -R3-NH-CO-를 나타내며,여기서 R3은 탄소수 1 내지 6의 알킬렌을 나타내고, n은 0 또는 1을 나타내며,Y는 탄소수 1 내지 12의 알킬렌, -(OCH2CH2)p-, 또는 -R4-R5-를 나타내고,여기서 p는 1 내지 100의 정수를 나타내며, R4 및 R5는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 알킬렌, 탄소수 3 내지 8의 사이클로알킬렌, 또는 탄소수 5 내지 12의 아릴렌을 타나내고,Z는 -R6-NH-CO-R7- 또는 -R8-R9-를 나타내며,여기서 R6 및 R7은 각각 독립적으로 단일결합, 탄소수 1 내지 6의 알킬렌 또는 -O-를 나타내고, R8 및 R9는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 알킬렌 또는 -O-를 나타내며 m은 0 또는 1을 나타내고,Q는 -COOH, -SH, 숙신이미딜기, 말레이미딜기 또는 피리딜로 치환된 디티오기를 나타낸다. - 제1항에 있어서,상기 지질 나노입자가 리포좀(liposome), 미셀(micelle), 에멀젼(emulsion) 및 고형 지질 나노입자(solid lipid nanoparticle)로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가진 것인 항원 인지형 지질 나노입자.
- 제1항에 있어서,상기 지질 나노입자가 양하전 지질, 중성 지질 및 음하전 지질로부터 선택되는 보조 지질을 추가로 포함하는 것인 항원 인지형 지질 나노입자.
- 제1항에 있어서,상기 지질 나노입자가 계면활성제를 추가로 포함하는 것인 항원 인지형 지질 나노입자.
- 제8항에 있어서,상기 계면활성제는 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽이온성(zwitterionic) 계면활성제 및 비이온성 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 항원 인지형 지질 나노입자.
- 제1항에 있어서,상기 항체의 Fc 영역이 지질 나노입자의 리포펩타이드에 비공유결합되어 있는 것인 항원 인지형 지질 나노입자.
- 제1항에 있어서,상기 항체가 표적 세포의 항원에 결합하는 것인 항원 인지형 지질 나노입자.
- 제11항에 있어서,상기 표적 세포가 치료 또는 진단이 요구되는 세포인 항원 인지형 지질 나노입자.
- 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드(Fc-binding peptide)와 지질이 공유결합되어 있는 항체의 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 포함하는 지질 나노입자(lipid nanoparticle)에 항체가 비공유결합되어 있는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항원 인지형 지질 나노입자; 및치료제(therapeutic agent) 및 진단제(diagnostic agent)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 약물을 포함하는 의약 조성물.
- 제13항에 있어서,상기 치료제가 화학요법제, 단백질 의약 또는 핵산의약인 의약 조성물.
- 제14항에 있어서,상기 화학요법제가 항암 화학요법제인 의약 조성물.
- 제15항에 있어서,상기 항암 화학요법제가 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 발루비신(valubicin), 미토산트론(mitoxantrone), 커큐민(curcumin), 제피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 빈블라스틴(vinblastine) 및 빈크리스틴(vincristine)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 의약 조성물.
- 제14항에 있어서,상기 핵산은 플라스미드 디옥시리보핵산(plasmid DNA), 리보핵산(RNA), 작은 간섭 리보핵산(siRNA), 안티센스 올리고핵산(antisense oligonucleotide), 마이크로 리보핵산 (microRNA), 잠금형 핵산 (locked nucleic acid), 및 핵산 앱타머(aptamer)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 의약 조성물.
- 제13항에 있어서,상기 진단제가 근적외선(near infra-red) 계열의 형광물질, 방사성의약품(radiopharmaceuticals) 또는 조영제(contrast agent)인 의약 조성물.
- 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드(Fc-binding peptide)와 지질이 공유결합되어 있는 항체의 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 함유하는 항원 특이적 약물전달체 제조용 조성물.
- 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드(Fc-binding peptide)와 지질이 공유결합되어 있는 항체의 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 포함하는 지질 나노입자를 함유하는 항원 특이적 약물전달체 제조용 조성물.
- 항체의 Fc 영역 결합 펩타이드(Fc-binding peptide)와 지질이 공유결합되어 있는 항체의 Fc 영역 결합성 리포펩타이드를 포함하는 지질 나노입자에 항체가 비공유결합되어 있는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항원 인지형 지질 나노입자를 함유하는 항원 특이적 약물전달체 제조용 조성물.
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