JP7467429B2 - 標的化部分－薬物グラフト化免疫細胞組成物および使用方法 - Google Patents

標的化部分－薬物グラフト化免疫細胞組成物および使用方法 Download PDF

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Description

[0001]本発明は、特定の癌細胞を標的とする癌療法、より具体的には、化学療法と免疫療法とを組み合わせる方法および組成物、例えば特定の癌細胞を標的として破壊するために、標的化部分－薬物複合体または標的化部分－薬物グラフト化免疫細胞（表面処理免疫細胞）を含む組成物に関する。本発明はまた、標的化部分－薬物複合体を免疫細胞膜上および／または細胞膜内に埋込むことにより、標的化部分－薬物グラフト化免疫細胞（表面処理免疫細胞）を調製するための方法ならびに、標的化部分－薬物グラフト化免疫細胞（表面処理免疫細胞）を使用する方法に関する。
[0002]有効な化学免疫療法は、化学療法剤が癌細胞死を誘導し、かつ、免疫調節を促進し、標的化学療法が、免疫細胞に対する有害作用を最小化し、そして、免疫エフェクター細胞が癌細胞に対する細胞溶解活性を維持することを必要とすると考えられている。
[0003]本発明は、標的癌化学免疫療法の開発のために、化学療法と免疫療法を組み合わせるための方法および組成物を特徴とする。この組合せアプローチにおいて、標的化部分－薬物複合体（例えば、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ））は、免疫細胞の表面に導入される。標的化部分－薬物複合体（例えばＡＤＣ）を免疫細胞表面上および／または表面内に埋込む方法は、ポリマー脂質鎖と細胞膜の脂質二重層との間の疎水性相互作用を利用し得る。脂質－コンジュゲート標的化部分－薬物複合体（例えば、疎水化標的化部分－薬物複合体）を、細胞膜の完全性を破壊することなく、脂質二重層中に取り込み、表面処理細胞に新しい機能を与えることができる。発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載の表面処理免疫細胞、例えば本明細書に記載する標的化部分－薬物複合体（例えばＡＤＣ）を特徴とする免疫細胞は、同時に、強力な化学療法剤を標的腫瘍に送達し、養子移入免疫細胞の腫瘍部位へのホーミングをその細胞毒性活性を損なうことなく増強することができることを見出した。これにより、癌と戦うための組合せ抗癌有効性を最終的に強化することができる。
[0004]標的化タンパク質またはペプチドを結合させることは、幹細胞上で試みられていたが、技術の目的は、再生のために特定のエリアに細胞を動員することであった。しかしながら、本発明では、細胞、例えば癌細胞を死滅させるために、標的化部分－薬物複合体を免疫細胞、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に結合させる。さらに、細胞を標的化し、標的細胞へと送達するために使用される実体が異なっている。例えば、特定の実施形態において、本発明は、標的化のために癌細胞マーカーを使用する。
[0005]本発明は、標的癌化学免疫療法の開発のために化学療法と免疫療法とを組み合わせる組成物を特徴とする。本明細書の組成物は、リン脂質－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを介して免疫細胞に結合される、標的化部分－薬物複合体を含む。例えば、標的化部分－薬物複合体は、リン脂質－ＰＥＧリンカーを介して免疫細胞の脂質二重層中に取り込み得る。いかなる理論または機構にも本発明を限定することを望むものではないが、本発明の表面処理免疫細胞（例えば、免疫細胞の表面上および／または表面内に取り込まれた標的化部分－薬物複合体）は、
（１）標的細胞、例えば癌細胞に向かう改変（表面処理）免疫細胞のホーミングを増強し、それにより、環境、例えば腫瘍環境中の免疫細胞の密度を上昇させ、そして、
（２）腫瘍増殖を阻止、および／または癌細胞を死滅させ得ると考えられている。これらの２つの事象は、癌細胞死を相乗的に引き起こし、免疫系を活性化することができ、後者は、転移性癌細胞および／または循環腫瘍細胞を死滅させることができる。本発明は、本明細書に記載する標的化部分－薬物複合体（またはＡＤＣ）、例えばＴ－ＤＭ１を特徴とするものに限定されない。現在市販されているものおよび開発中のものを含む任意の適当な抗体－薬物コンジュゲートまたは標的化部分－薬物複合体を、本明細書に記載の方法および組成物を用いて、免疫細胞（例えば、任意の免疫細胞）の表面上に取り込み得る。
[0006]端的には、本発明は、細胞、例えば癌細胞を標的とするための化学免疫療法組成物を特徴とする。特定の実施形態において、組成物は、目的の細胞上の標的に特異的であり、結合することができる標的化部分；標的化部分にコンジュゲートしており、標的化部分－薬物複合体を形成している、薬物；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結しており、リン脂質－ＰＥＧリンカーを形成しているリン脂質であって、リン脂質－ＰＥＧリンカーが標的化部分－薬物複合体に結合している、リン脂質；および標的化部分－薬物複合体がリン脂質－ＰＥＧリンカーを介して免疫細胞に疎水的に結合している、免疫細胞を含む。特定の実施形態において、標的化部分－薬物複合体は免疫細胞を目的の細胞へ差し向け、薬物は目的の細胞に対して細胞毒性作用を有する。
[0007]特定の実施形態において、リン脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンおよび１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは２ｋＤａ～１０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、４．５ｋＤａ～５．５ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、目的の細胞は乳癌細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンパ球、白血球および貪食細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンパ球、白血球および貪食細胞からなる群からの２以上の細胞の組合せである。いくつかの実施形態において、リンパ球は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態において、標的はＨＥＲ２である。いくつかの実施形態において、標的化部分は、抗体またはその断片である。いくつかの実施形態において、標的化部分は、抗ＨＥＲ２抗体である。いくつかの実施形態において、標的化部分は、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ペルツズマブ、ベバシズマブまたはリツキシマブである。いくつかの実施形態において、標的化部分は、抗ＣＤ５３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅｐ－ＣＡＭ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＭＳＬＮ抗体、抗ＣＤ３１９抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＦＧＦＲ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗Ｎｏｔｃｈ１抗体、抗ムチン抗体、抗ＭＣＰ－１抗体、抗ルイス－Ｙ抗原抗体、抗ＰＣＤＣ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗グリピカン３抗体、抗ＰＴＫ７抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗Ｂリンパ腫細胞抗体、抗ＤＲ５抗体、抗ＣＬＤＮ１９抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＨＥＲ１抗体、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ７０抗体である。いくつかの実施形態において、薬物はエムタンシン（ＤＭ１）である。
[0008]本発明はまた、治療を必要とする対象において腫瘍を治療するための方法を特徴とする。特定の実施形態において、方法は、治療上有効量の本発明による組成物を対象に投与することを含み、ここで、標的化部分は、腫瘍の細胞上の標的に特異的である。特定の実施形態において、薬物は腫瘍の細胞に対して細胞毒性作用を有する。
[0009]本明細書に記載する任意の特徴または特徴の組合せは、本発明の範囲内に含まれるが、ただし、任意のかかる組合せに含まれる特徴は、文脈、本明細書、および当技術分野の当業者の知識から明らかなように、相互に矛盾するものではない。本発明のさらなる利点および態様は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲において明らかである。
[0010]本発明の特徴および利点は、添付の図面に関連して示す以下の詳細な説明を考慮すれば明らかであろう：
[0011]図１Ａは、非改変ＮＫ細胞と、５０、１００または２００μｇのＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１を用いて生成したＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞との間の細胞生存率の比較を示す。データ＝平均±ＳＤである。 [0012]図１Ｂは、１０％血清を含有する培地中でインキュベートしたＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の表面上のＴ－ＤＭ１の表面滞留時間を示す。ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞を完全増殖培地中でインキュベートし、細胞の一部を各タイムポイントで４８時間まで採取した。ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の表面上のＴ－ＤＭ１の存在は、Ａｌｅｘａ ４８８－コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて検出した。プロットは、２回の独立した実験から選択される。 [0013]図１Ｃは、フローサイトメトリーにより決定したＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１－ＦＩＴＣ細胞の細胞膜上のＣＤ５６および２Ｂ４の利用可能性を示す。ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１－ＦＩＴＣ細胞を調製した後、ＡＰＣ－コンジュゲート抗ＣＤ５６抗体またはＡＰＣ－コンジュゲート抗２Ｂ４抗体を用いて、受容体利用可能性を検出した。全ての画像およびプロットは、２回の独立した実験の１回からのものである。 [0014]図２は、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞のＨＥＲ２－陽性癌細胞への結合を示す。癌細胞をＮＫ細胞、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞またはＴ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物と、１０：１のＥ：Ｔ比率で共インキュベートした。３０分後、非結合細胞を完全に洗浄し、残存ＮＫ細胞をフローサイトメトリーを用いて計数し、残存Ｅ：Ｔ比率を算出した。癌細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸを用いて赤色に標識し、ＮＫ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ ＣＭＡＣを用いて青色に標識した。データは、平均±ＳＤを表す（ｎｓ、有意性なし；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ボンフェローニポストホックテストを用いた一元ＡＮＯＶＡによる）。 [0015]図３Ａは、Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物またはＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞のＳＫ－ＢＲ－３細胞との共インキュベートによって誘導された癌細胞死を示す。ＣＭＡＣ（青色）色素で標識した癌細胞を、非改変ＮＫ細胞、Ｔ－ＤＭ１、Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物またはＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞と、非結合ＮＫ細胞を除去せずに２４時間、インキュベートした。 [0016]図３Ｂは、Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物またはＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞をＣａｌｕ－３細胞と共インキュベートすることにより誘導された癌細胞死を示す。実験の詳細は上記図３Ａと同じである。 [0017]図３Ｃは、Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物またはＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞をＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と共インキュベートすることにより誘導された癌細胞死を示す。実験の詳細は上記図３Ａと同じである。 [0018]図３Ｄは、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の標的抗癌活性を示し、ここで、非結合ＮＫ細胞は、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞のＳＫ－ＢＲ－３細胞との共インキュベーション後に除去した。非結合ＮＫ細胞は、２時間のインキュベーション後に除去し、残存細胞混合物をさらに２４時間インキュベートした。癌細胞死を、ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８およびヨウ化プロピジウムのキットを用いてフローサイトメトリーにより測定した。データは平均±ＳＤを表す（ｎｓ、有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ボンフェローニポストホックテストを用いた二元ＡＮＯＶＡによる）。 [0019]図３Ｅは、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の標的抗癌活性を示し、ここで、非結合ＮＫ細胞は、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞のＳＫ－Ｃａｌｕ－３細胞との共インキュベーション後に除去した。 [0020]図３Ｆは、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の標的抗癌活性を示し、ここで、非結合ＮＫ細胞は、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞との共インキュベーション後に除去した。 [0021]図４Ａは、ＨＥＲ２－陽性Ｃａｌｕ－３癌の相対腫瘍体積変化を示す。腫瘍を雌ＮＯＤ ｓｃｉｄ Ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウスの左側腹部に接種した。腫瘍保有マウスは、全く処置を受けないか、０．２１ｍｇのＴ－ＤＭ１、１×１０７のＮＫ細胞、０．２１ｍｇのＴ－ＤＭ１＋１×１０７のＮＫ共処理物または１×１０７のＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の投与を、尾静脈注入により、１４日間毎週受けた。全ての剤は、２５０μＬのＰＢＳ中で新しく調製し、注入は１分間と予定された。データは、平均±ＳＤを表す（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ボンフェローニポストホックテストを用いた二元反復測定ＡＮＯＶＡ）。 [0022]図４Ｂは、ＨＥＲ２－陰性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌の相対腫瘍体積変化を示す。実験の詳細は上記図４Ａと同じである。 [0023]図４Ｃは、Ｃａｌｕ－３腫瘍保有ＮＳＧマウスにおけるＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の生体分布を示す（ｎ＝３）。動物は、全く処置を受けないか、１×１０７のＮＫ細胞、０．２１ｍｇのＴ－ＤＭ１＋１×１０７のＮＫ共処理物、または１×１０７のＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の投与を、尾静脈注入を介して受けた。全ての剤は、１分間の注入用に２５０μＬのＰＢＳ中で新しく調製した。腫瘍および他の生体器官を処置の２４時間後に回収した。単個細胞５０の浮遊液を回収した組織から調製し、ＡＰＣ－コンジュゲート抗ＣＤ５６抗体を適用してＮＫ細胞を検出した。フローサイトメーターを用いて、１×１０５の総細胞間のＮＫ細胞を計数した。データは、平均±ＳＤを表す（ｎｓ、有意性なし；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ボンフェローニポストホックテストを用いた二元ＡＮＯＶＡ）。
[0024]用語
特に断らない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は、開示する発明が属する当技術分野の当業者が共通して理解するのと同じ意味を有する。単数用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない限り、複数形の参照対象を含む。同様に、語「または」は、文脈上明らかにそうでない限り、「および」を含むと意図される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、提示された定義されている要素に加えて、他の要素も存在し得ることを意味する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。言い換えれば、用語「含む」は、「主に含むが、それだけでなくてもよい」ことを意味する。さらに、語「含む」の変異形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、同様に同じ意味を有する。一観点において、本明細書に記載する組成物、方法およびその個々の構成要素に関連し、本発明に必須として本明細書に記載する技術は、特定されていない要素を、必須か否かに関わらず、なお受け入れる（「含む」）。
[0025]本明細書に開示する全ての実施形態は、文脈上明らかにそうでない限り、他の実施形態と組み合わせ得る。本開示の実施形態の実施および／または試験のための適当な方法および材料を下記に記載する。かかる方法および材料は単に例示のためであって、限定することを意図するものではない。本明細書に記載するものと類似している、または同等の他の方法および材料を使用してもよい。本明細書で言及する全ての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、全ての目的のために、参照によりその全体が組み込まれる。対立する場合は、用語の説明を含む本明細書が優先される。本明細書に記載するものと類似している、または同等の方法および材料を、本開示の技術の実施または試験に使用してもよいが、適当な方法および材料は下記に記載する。材料、方法および実施例は、単に例示のためであって、限定することを意図するものではない。本開示の種々の実施形態の概要を容易にするために、特定の用語について次の説明を示す：
[0026]抗体および抗体断片：本明細書の用語「抗体」は、最も広義の意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）および抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。「抗体」は、少なくとも軽鎖および重鎖イムノグロブリン可変領域を含み、抗原のエピトープに特異的に結合するペプチド（例えばポリペプチド）を指していてもよい。抗体は、コンジュゲートされていてもよい。抗体は、検出可能な標識、例えば酵素、ハプテン、またはフルオロフォアにより標識されていてもよい。「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体とは異なる分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
[0027]抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）：「抗体－薬物コンジュゲート」は、薬物、例えば細胞毒性化合物に化学的に連結したモノクローナル抗体を含む物質を指す。モノクローナル抗体は、特異的な標的、例えば特定の細胞種で見られるタンパク質または受容体に結合する。連結した薬物は標的細胞に入り、破壊し得る。ＡＤＣは典型的には、癌の処置のための標的療法として使用される。
[0028]有効量：本明細書で使用する用語「有効量」は、所望の効果を誘発するのに有効な化合物または組成物の投与量を指す。本明細書で使用するこの用語はまた、動物、哺乳類、またはヒトにおいて所望のインビボ効果をもたらすのに有効な量を指し得る。
[0029]モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体：用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、同一である、および／または同一のエピトープに結合するが、例えば天然に生じる変異を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の産生の間に生じた、可能性のあるバリアント抗体を除いては、かかるバリアントは、一般的に少量で存在する。用語「ポリクローナル抗体」は、典型的には、異なる決定因子（エピトープ）に対する異なる抗体を含む抗体調製物を指す。ポリクローナル抗体と対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、単一の決定因子または抗原に対するものである。したがって、修飾語句「モノクローナル」は抗体の特性が、実質的に均一な抗体集団から得られたものであることを示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとは解釈されない。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、免疫療法の主流の方式ならびに細胞毒性剤の標的送達のビヒクルとして確立されている。
[0030]特異的：本明細書で使用する語句「特異的結合」「特異的に結合する」または「～に特異的」は、標的とバイオマーカー特異的剤との間の結合のような、測定可能かつ再現性のある相互作用を指し、これは、生体分子を含む異質性の分子集団の存在下における標的の存在を決定付ける。例えば、ある標的に特異的に結合する結合性実体は、他の標的への結合より高い親和性、結合活性で、より容易に、および／またはより長期間、この標的に結合する抗体でもよい。
[0031]対象：本明細書で使用する用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図している。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば非哺乳類（例えばニワトリ、両生類、爬虫類）および哺乳類、例えば非ヒト霊長類、家畜化したおよび／または農業的に有用な動物（例えばヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ等）および齧歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット等）を含む。
[0032]標的化部分：用語「標的化部分」は、改変細胞（例えば免疫細胞）を特定の部位または関連部位へ結合または標的化または指向させるのに作用する任意の化学的実体を指し、例えば、標的化部分は、免疫細胞を標的、例えば標的細胞の表面上のバイオマーカーに結合させる抗体またはその断片でもよい。標的化部分は例えば、改変細胞を特異的なタンパク質または酵素、または、特定の細胞部位、または特定の細胞種に差し向けるのに使用し得る。標的化部分は、改変細胞の蓄積を選択的に増強する補助に使用し得る。適当な標的化部分としては、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、ステロイド、多糖、ホルモン、補助因子、核酸、抗体、キメラ抗原受容体および薬物が挙げられるが、これらに限定されない。
[0033]処置：本明細書で使用する用語「処置する」または「処置」または「処置すること」は、治療的な処置または予防的または防止的な対策の両方を指し、ここで、目的は、疾患の進行を防止または遅延させること、例えば、心臓障害の進行を遅延させること、または、病状、疾患または障害、例えば不十分なもしくは望まない機能を特徴とする任意の障害のうち、少なくとも１つの有害作用または症候の進行を低減させることである。処置は一般的に、この用語が本明細書で定義されるように、１つまたは複数の症候または臨床マーカーが低減する場合に「有効」である。あるいは、処置は、疾患の進行が低減または停止する場合に「有効」である。すなわち、「処置」は、疾患の症候の改善またはマーカーの低下を含むだけではなく、処置が行われない場合に予期される症候の進行または悪化の休止または遅延化も含む。有益な、または所望の臨床結果としては、検出可能であっても検出不能であっても、１つまたは複数の症候の軽減、疾患の程度の低下、安定した（例えば悪化していない）疾患の状態、疾患進行の遅延または遅延化、疾患状態の改善または緩和および緩解（部分的であっても全体的であっても）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けない場合に予期される生存と比較して、生存を延長することを意味し得る。処置を必要とする人には、病状について既に診断されている人ならびに、遺伝的な易罹患性または他の要因、例えば体重、食事および健康によって病状を発症する可能性が高い人が含まれる。
[0034]表面処理免疫細胞
本発明は、標的癌化学免疫療法の開発のために、化学療法と免疫療法とを組み合わせる組成物を特徴とする。本明細書の組成物は、標的化部分－薬物複合体（例えば抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ））を含み、これは、リン脂質－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを介して免疫細胞に結合されている。例えば、標的化部分－薬物複合体（例えばＡＤＣ）は、リン脂質－ＰＥＧリンカーを免疫細胞の脂質二重層中に取り込むことにより、免疫細胞に結合していてもよい。
[0035]以前に議論されたように、本発明は、本明細書に記載する標的化部分－薬物複合体（例えばＡＤＣ）、例えばＴ－ＤＭ１を特徴とするものに限定されない。現在市販されているものおよび開発中のものを含む任意の適当な標的化部分－薬物複合体が、本明細書に記載の方法および組成物を用いて免疫細胞（例えば任意の免疫細胞）の表面上に取り込まれ得る。
[0036]いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。しかし、本発明はＮＫ細胞に限定されない。いくつかの実施形態において、免疫細胞はリンパ球、例えばＴ細胞（例えば、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞等）、Ｂ細胞等である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は白血球である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は貪食細胞、例えば好中球、マクロファージ、単球、マスト細胞等である。本発明は上述の細胞に限定されない。
[0037]標的化部分－薬物複合体は、特定の細胞マーカーまたは癌細胞に特異的な標的化部分（または結合部分）を含む。標的化部分は、例えば、抗体または抗体断片であってもよい。しかしながら、本発明は、抗体またはその断片に限定されない。標的化部分は、標的に特異的に結合することができる任意の化学的実体を含み得る。適当な標的化部分としては、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、ステロイド、多糖、ホルモン、補助因子、核酸、抗体、キメラ抗原受容体および薬物が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、標的は、標的化部分に特異的に結合することができる任意のリガンドでもよい。
[0038]一例として、特定の実施形態において、標的化部分は抗ＨＥＲ２標的化部分（例えば抗ＨＥＲ２抗体、例えばトラスツズマブ）、例えばＨＥＲ２に特異的な標的化部分である。ＨＥＲ２は、特定の種類の癌細胞、例えば乳癌細胞の表面に過剰発現している細胞マーカーである。標的化部分としては、アレムツズマブ、ペルツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレファセプト、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベズロトクスマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、インフレクトラ、イピリムマブ、イキセキズマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、セクキヌマブ、ウステキヌマブ等が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、標的化部分が標的とする細胞マーカーは、上述の抗体が標的とする細胞マーカーのいずれかを含む（が、これらに限定されない）。特定の実施形態において、標的化部分は、抗ＣＤ５３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅｐ－ＣＡＭ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＭＳＬＮ抗体、抗ＣＤ３１９抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＦＧＦＲ抗体（例えば抗ＦＧＦＲ２抗体）、抗ＣＤ４４抗体、抗Ｎｏｔｃｈ１抗体、抗ムチン抗体、抗ＭＣＰ－１抗体、抗ルイス－Ｙ抗原抗体、抗ＰＣＤＣ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗グリピカン３抗体、抗ＰＴＫ７抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗Ｂリンパ腫細胞抗体、抗ＤＲ５抗体、抗ＣＬＤＮ１９抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＨＥＲ１抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ７０抗体等でもよい。
[0039]標的化部分－薬物複合体はさらに、薬物、例えば細胞毒性薬物を含む。本発明により使用し得る薬物の非限定的な例としては、エムタンシン（ＤＭ１）、ブレンツクスマブベドチン、ゲムツズマブオオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン、トラスツズマブエムタンシン、ＢＴ－０６２、ＣＤＸ－０１１、ミラツズマブ－ｄｏｘ、ＳＡＲ３４１９、ＡＧＳ－１６Ｍ８Ｆ、ＡＳＧ－２２ＭＥ、ＡＳＧ－５ＭＥ、ＢＡＹ ７９－４６２０、ＢＡＹ ９４－９３４３、ＢＩＩＢ０１５、ＩＭＧＮ５２９、ＩＭＭＵ－１３０、ロルボツズマブメルタンシン、ＭＤＸ－１２０３、ＰＳＭＡ ＡＤＣ、ＲＧ７５９３、ＳＡＲ５６６６５８、ＳＧＣ－７５等が挙げられる。標的化部分－薬物複合体は、リン脂質－ＰＥＧリンカーを介して免疫細胞に連結するか、または結合している。リン脂質－ＰＥＧリンカーは、標的化部分にコンジュゲートしていてもよい。特定の実施形態において、リン脂質－ＰＥＧリンカーは、標的化部分（例えば標的化部分－薬物複合体）、例えば標的化部分－薬物複合体に事前にコンジュゲートしていてもよい。特定の実施形態において、本発明は、標的化部分－薬物複合体から離れたリン脂質－ＰＥＧリンカーを提供する。リン脂質は、細胞の表面に疎水的に結合することができる任意の適当なリン脂質でもよい。例えば、リン脂質としては、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンおよび１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リン脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）でもよい。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、１ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量を有し得る。特定の実施形態において、ＰＥＧは２ｋＤａ～１０ｋＤａ、例えば２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態において、ＰＥＧは、４．５ｋＤａ～５．５ｋＤａ（例えば５ｋＤａ）の分子量を有する。
[0040]本組成物は、リン脂質－ＰＥＧリンカーに連結した標的化部分－薬物複合体を含み得る。特定の実施形態において、組成物は、標的化部分－薬物複合体および免疫細胞を含み、例えば、組成物は、免疫細胞およびリン脂質－ＰＥＧリンカーを介して免疫細胞に連結した標的化部分－薬物複合体を含み得る。
[0041]方法
本発明はまた、本発明の組成物を調製する方法、例えば、標的化部分－薬物複合体を調製する方法、標的化部分－薬物複合体を細胞、例えば免疫細胞に連結させる方法等を特徴とする。一例として、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ－ＡＤＣ（例えば、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）を抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に連結するポリエチレングリコール（ＰＥＧ））は、使用準備済の製剤として調製し得る。免疫細胞、例えば事前に増殖させた免疫細胞を、免疫細胞とＤＭＰＥ－ＰＥＧ－ＡＤＣを共に一定期間（例えば任意の適当な期間、例えば１５分間）混合することによって化学免疫療法の標的形態に変換させ得る。ＡＤＣを備えた免疫細胞は、ＡＤＣによる標的抗原の認識を介して標的腫瘍部位へ向かって遊走し得る。標的腫瘍組織において、ＡＤＣは、標的癌細胞のアポトーシスを誘導し、近接して存在する免疫細胞が、ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を発現する瀕死の癌細胞を破壊する。
[0042]本発明はまた、本発明の組成物を使用する方法、例えば、標的化部分－薬物複合体による表面処理細胞を使用する方法を特徴とする。本発明はまた、免疫細胞の養子移入、例えば本明細書に記載する表面処理免疫細胞を含む本発明の組成物の養子移入を特徴とする。本発明はまた、標的化学免疫療法の方法を特徴とする。本発明はまた、処置を必要とする対象における、疾患または病状を処置する方法、例えば腫瘍を処置する方法を特徴とする。
[0043]本明細書の組成物の調製に関しては、本明細書に記載する特定の化合物は市販のものでもよい。合成調製を必要とするものがあってもよい。
[0044]特定の実施形態において、リン脂質－ＰＥＧは、ＰＥＧの末端上に反応性官能基を保持し、これは、標的化部分－薬物複合体とのカップリングに使用し得る。例えば、反応性官能基がＮＨＳである場合、中間体は反応性アミノ基を有する標的化部分とカップリングして、アミドを形成し得る。反応性官能基がアミンである場合、中間体は反応性イソチオシアネートとカップリングして、チオカルバメートを形成し得る。反応性官能基がアジドである場合、中間体は、反応性ニトリルまたは反応性アルキン基を有する標的化部分とカップリングして、テトラゾールまたはトリアゾールを形成し得る。反応性官能基がマレイミドである場合、中間体は、反応性チオール基を有する標的化部分とカップリングして、チオールの硫黄と得られたスクシンイミドの炭素との間に結合を形成し得る。
[0045]当業者には理解し得るように、本明細書に記載の化合物を合成するさらなる方法は、当技術分野の当業者には明らかであろう。さらに、種々の合成ステップは、所望の化合物を得るために他の順序または順番で行ってもよい。本明細書に記載する化合物の合成に有用な合成化学変換および保護基の方法論（保護および脱保護）は当技術分野で公知であり、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ． Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２ｄ．Ｅｄ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ、Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；およびＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ、ｅｄ．、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）およびその後続版に記載されているものが挙げられる。
[0046]免疫細胞の表面改変に関して、特定の実施形態において、細胞の表面改変は、細胞の脂質二重層膜と相互作用し、そこに結合する化合物のリン脂質部によって達成し得る。組成物の各構成要素または可変部を評価して、より好ましい構成要素およびその細胞の表面の改変能を決定し得る。例えば、異なる分子量のＰＥＧを有する組成物を使用して、どのＰＥＧサイズが、リン脂質と細胞膜との間の相互作用に好ましいかを決定し得る。ＰＥＧの末端に結合させる反応性官能基の選択もまた、結合している標的化部分およびそれが有する反応性官能基の適合性によって評価し得る。さらに、細胞の最小インキュベーション時間もまた、細胞改変に必要とされる化合物の最適量と共に決定し得る。
[0047]表面改変（または表面処理）細胞の特定の能力を決定し得る実験を行い得る。これらは、細胞接着、毒性、増殖および回復速度に着目した実験を含み得る。さらに、動体学的実験は、化合物が細胞の表面上に固定化されたままでいることができる時間の長さを決定し得る。さらに、異なる標的化部分の使用を評価して、細胞の改変能に対する影響を決定し得る。異なる蛍光化学的実体、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もまた、組成物の細胞の改変能を評価するために標的化部分に結合されるか、これを置換してもよい。
[0048]標的（例えば、目的の細胞の受容体）の免疫細胞の表面上の標的化部分への結合の評価は、種々の手段により達成し得る。一例として、特定の実施形態において、免疫細胞の表面上の標的化部分への標的の結合の評価は、蛍光標識した標的リガンドを、蛍光標識した標的化部分を含有する本明細書の組成物によって改変された細胞と共にインキュベートすることを含み得る。本明細書の組成物によって改変された細胞の適当な標的（例えば目的の細胞の受容体）の勾配に対する遊走は、改変した免疫細胞の標的とのインキュベーションにより達成し得る。改変した細胞の遊走能の評価は、適当な細胞計数アッセイまたは他の適当な手段により決定し得る。
[0049]本明細書に記載の方法には、処置を必要とする対象における疾患状態を処置する方法が含まれる。かかる方法は、治療上有効量の本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含み得る。必要とする対象に投与するための組成物は、標的化部分－薬物複合体を保持するように処理された免疫細胞を含んでいてよく、ここで、標的化部分は、特定の目的の細胞に特異的である。本明細書にはまた、目的の細胞の標的への記載する組成物のインビボホーミングを促進する方法が記載されており、ここで、標的化部分は、目的の細胞、例えば、特定の疾患組織に関連する細胞の標的と結合または相互作用することができ、改変細胞は疾患組織に動員され得る。
[0050]本明細書の組成物の適当な投与量は、患者間で変動し得ることは理解されるであろう。最適な投与量を決定することは、一般的に、本明細書に記載の処置のいかなるリスクまたは有害な副作用に対する治療上の利点のレベルを平衡化することを伴う。選択される投与量レベルは、種々の要因に依存するものであり、要因としては、特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、組成物（例えば薬物部分）の排出速度、処置期間、組合せで使用する他の薬物、化合物および／または材料、および、患者の年齢、性別、体重、状態、健康全般および既往歴が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一般的に投与量は、作用部位において実質的に有毒または有害な副作用を引き起こすことなく所望の効果を達成することができる、局所濃度を達成することができるものであるが、化合物の量および投与経路は、医師の自由裁量でもよい。
[0051]特定の実施形態において、インビボ投与は、処置過程を通して、単回投与で、連続的に、または間欠的に（例えば適当な間隔で分割した用量で）行ってもよい。投与の最も効果的な手段および投与量を決定する方法は、当技術分野の当業者には周知であり、治療に使用される製剤、治療の目的、処置される標的細胞および、処置される対象によって変動する。単回および多回投与は、処置する医師によって選択されている用量レベルおよびパターンで行ってもよい。
[0052]本発明はまた、本発明による免疫細胞を改変するためのキットを特徴とする。いくつかの実施形態において、キットは、リン脂質－ＰＥＧリンカー、標的化部分－薬物複合体および、リン脂質－ＰＥＧリンカーを標的化部分－薬物複合体に連結するための試薬を含む。いくつかの実施形態において、キットは、リン脂質－ＰＥＧリンカーと既に連結した標的化部分－薬物複合体を含む。いくつかの実施形態において、キットは、免疫細胞をさらに含む。本発明において使用される構成要素、例えば、細胞、標的化部分、リンカー、薬物、試薬等の１つまたは複数の任意の組合せを組み合わせてキットを形成し得る。
[0053]次の実施例は、ＨＥＲ２に特異的な表面処理ナチュラルキラー細胞の産生および使用を記載している。本発明は、本明細書に記載の方法および組成物に限定されていない。端的には、モデルＡＤＣである、トラスツズマブエマタンシン（Ｔ－ＤＭ１）を、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）コンジュゲートポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を最初に結合させることによって改変し、得られた疎水化Ｔ－ＤＭ１（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１）を、モデル免疫細胞である、同種異系ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面を改変するのに用いた。これらのＴ－ＤＭ１表面処理ＮＫ（ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１）細胞は、Ｔ－ＤＭ１およびＮＫ細胞の組合せ活性を介して、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）－陽性癌細胞を認識し、破壊した。この単回注入製剤化学免疫療法であるＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞は、ＮＫ細胞とＴ－ＤＭ１との共処理物と比較して、有意に標的腫瘍の進行を抑制した。
[0054]免疫細胞の表面処理：ＮＫ細胞およびＪＫ細胞を、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１またはＤＭＰＥ－ＰＥＧ－ＴＺを用いて３回改変し、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞、ＳＥ－ＮＫ／ＴＺ細胞およびＳＥ－ＪＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞を生成した。端的には、５×１０５の免疫細胞を、異なる量のＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１またはＤＭＰＥ－ＰＥＧ－ＴＺと共に、１００μＬのＰＢＳ中で、室温で１５分間インキュベートした。改変後、細胞を１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。ワンステップ法を５×１０５の免疫細胞あたり１００μｇのＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１により最適化した。
[0055]表面処理細胞の特性決定：ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞は、上述の手順にしたがって、ＦＩＴＣ－標識ＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１を用いて調製した。ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１－ＦＩＴＣ細胞を、共焦点顕微鏡により可視化した（Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ、Ｎｉｋｏｎ；Ｅｘ／Ｅｍ＝４９５／５２０ｎｍ）。収集した画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて処理した。改変後の細胞生存率および増殖機能の変化を、ＣＣＫ－８を用いて判定した。ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞膜上でのＴ－ＤＭ１の表面滞留時間は、Ａｌｅｘａ ４８８－コンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｅｘ／Ｅｍ＝４９５／５２０ｎｍ）を用いて測定した。完全増殖培地中でインキュベートしたＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞を各タイムポイントで集め、１０μｇのＡｌｅｘａ ４８８－コンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）抗体で標識した。蛍光シグナルは、フローサイトメトリーにより測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより解析した。表面処理後のＮＫ細胞受容体の利用可能性を、ＡＰＣ－コンジュゲート抗ＣＤ５６抗体（Ｅｘ／Ｅｍ＝６５０／６６０ｎｍ）またはＡＰＣ－コンジュゲート抗２Ｂ４抗体（Ｅｘ／Ｅｍ＝６５０／６６０ｎｍ）を用いて試験した。各抗体は、製造業者の推奨量にしたがってＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１－ＦＩＴＣ細胞上に適用した。ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１上のＣＤ５６および２Ｂ４の利用可能性を、フローサイトメトリーによって検出し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより解析した。
[0056]Ｔ－ＤＭ１の選択的結合、移入および内在化：ＳＫ－ＢＲ－３ ２７細胞、Ｃａｌｕ－３細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、２×１０－６ｍ２８のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸ（Ｅｘ／Ｅｍ＝５７７／６０２ｎｍ）により標識した。癌細胞を処理の２４時間前に４×１０４の細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレート上に播種した。ＤＭＥＰ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１による表面処理の前に、ＮＫ細胞を、１×１０－６ｍのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ ＣＭＡＣ（Ｅｘ／Ｅｍ＝３５３／４６６ｎｍ）により標識した。癌細胞を、非改変ＮＫ細胞、Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物およびＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞と、１０：１のＥ：Ｔ比率で共インキュベートした。３０分後に、非結合ＮＫ細胞を除去し、全残存細胞を収集した。ＮＫ細胞の数をフローサイトメトリーにより、１×１０４の癌細胞あたりで定量し、残存Ｅ：Ｔ比率を算出した。ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞から標的癌細胞へのＴ－ＤＭ１の移入を共焦点顕微鏡を用いて調べた。ＳＫ－ＢＲ－３細胞、Ｃａｌｕ－３細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、２×１０－６ｍのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸで標識し、処理の２４時間前に、１×１０４の細胞／ウェルの密度でＬａｂ－Ｔｅｋ ＩＩ ８チャンバーガラススライド上に播種した。１×１０－６ｍのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ ＣＭＡＣで標識したＮＫ細胞を１００μｇのＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１－ＦＩＴＣを用いて改変した。改変後、１×１０５のＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞を、癌細胞と３０分間共インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、非結合エフェクター細胞を除去した。共インキュベートした細胞を、共焦点顕微鏡により撮像し、収集した画像をＩｍａｇｅＪソフトウェアにより処理した。Ｔ－ＤＭ１の内在化は、同様の手順により可視化した。ＮｕｃＢｌｕｅ Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅｘ／Ｅｍ＝３６０／４６０ｎｍ）で標識した癌細胞を、処理の２４時間前に１×１０４の細胞／ウェルの密度でＬａｂ－Ｔｅｋ ＩＩ ８チャンバーカバーガラス上に播種した。１×１０－６ｍのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸで標識したＮＫ細胞を、１００μｇのＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１－ＦＩＴＣを用いて改変した。癌細胞をＴ－ＤＭ１－ＦＩＴＣまたはＣＭＰＴＸ－標識したＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１－ＦＩＴＣ細胞により１０：１のＥ：Ｔ比率で処理した。非結合Ｔ－ＤＭ１－ＦＩＴＣおよびＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１－ＦＩＴＣ細胞を３０分後に完全に除去した。Ｔ－ＤＭ１－ＦＩＴＣ（Ｅｘ／Ｅｍ＝４９５／５２０ｎｍ）の内在化を、最初のタイムポイントおよび６時間後に共焦点顕微鏡を用いてした。収集した画像はＩｍａｇｅＪソフトウェアにより処理した。
[0057]ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の癌標的化細胞毒性：ＳＫ－ＢＲ－３細胞、Ｃａｌｕ－３細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を２×１０－６ｍのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ ＣＭＡＣで標識し、処理の２４時間前に１×１０４の細胞／ウェルの集団で４８ウェルプレート上に播種した。癌細胞を、非改変ＪＫ細胞、非改変ＮＫ細胞、ＴＺ、Ｔ－ＤＭ１、Ｔ－ＤＭ１＋ＪＫ共処理物、Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞、ＳＥ－ＮＫ／ＴＺ細胞またはＳＥ－ＪＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞と、１０：１のＥ：Ｔ比率で、６００μＬの完全培地中で共インキュベートした。Ｔ－ＤＭ１処理を受ける癌細胞は、１０：１のＥ：Ｔ比率で処理したＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１上のＴ－ＤＭ１量に相当する、２．１μｇのＴ－ＤＭ１を受けた。全処理物を共培養の２時間後に洗浄し、残存癌結合エフェクター細胞をさらに２４時間インキュベートした。共インキュベーションの２４時間後に、全細胞を回収し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８およびヨウ化プロピジウムのキット（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｅｘ／Ｅｍ＝４９５／５２０ｎｍおよびプロピジウムＥｘ／Ｅｍ＝５３５／６１７）で標識した。癌細胞死をフローサイトメトリーにより解析した。抗体、化学療法剤および免疫細胞の効果を区別するために、ＣＭＡＣで標識した癌細胞を、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞、ＳＥ－ＮＫ／ＴＺ細胞、ＳＥ－ＪＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞、または他の相当する処理物と共に、１０：１のＥ：Ｔ比率で６００μＬの完全培地中で共インキュベートした。非結合エフェクター細胞を最初の共インキュベーションの２時間後に除去し、残存細胞混合物をさらに２４時間インキュベートした。Ｔ－ＤＭ１処理を受ける癌細胞は、１０：１のＥ：Ｔ比率で処理したＡＤＣによる表面処理免疫細胞上のＴ－ＤＭ１量に相当する２．１μｇのＴ－ＤＭ１を受けた。得られた癌細胞死は、フローサイトメトリーを用いてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８およびヨウ化プロピジウムのキット（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｅｘ／Ｅｍ＝４９５／５２０ｎｍおよびプロピジウム Ｅｘ／Ｅｍ＝５３５／６１７）により識別し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより解析した。
[0058]インビボ腫瘍有効性および生体分布：インビボ試験は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した６週齢の雌ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ（ＮＳＧ、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスを用いて行った。各マウスは、１×１０７のＣａｌｕ－３細胞またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を左側腹部に皮下接種した。癌細胞は、１０％（ｖ／ｖ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を補充したＰＢＳ中で懸濁した。腫瘍体積を、カリパスを用いて腫瘍の長さおよび幅を測定し、腫瘍の最長（ａ）および最短（ｂ）の径を用いて、次の式Ｖ＝０．５ａｂ２に基づいて腫瘍体積を算出することにより、週に３回記録した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達すると、腫瘍接種マウスを無作為に実験群に割り当てた。対照群（Ｃａｌｕ－３モデルについてｎ＝４、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１モデルについてｎ＝３）は全く処置を受けなかったが、試験群（各群ｎ＝４）は、毎週０．２１ｍｇのＴ－ＤＭ１、１×１０７のＮＫ細胞、０．２１ｍｇのＴ－ＤＭ１＋１×１０７のＮＫ共処理物または１×１０７のＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞を、尾静脈注入により２週間投与された（０日目および７日目）。全ての剤は、２５０μＬのＰＢＳ中で新しく調製し、注入は１分以内に完了した。腫瘍増殖および体重を１４日間モニターし、相対腫瘍体積を、記録した体積を最初の体積で割ることにより算出した。生体分布について、Ｃａｌｕ－３腫瘍保有ＮＳＧマウス（ｎ＝３）は、処理を全く受けなかったか、１×１０７のＮＫ細胞、０．２１ｍｇのＴ－ＤＭ１＋１×１０７のＮＫ共処理物、または１×１０７のＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の、尾静脈注入による投与を受けた。全ての剤は、１分間の注入用に、２５０μＬのＰＢＳ中で新しく調製した。腫瘍および主要器官、例えば心臓、腎臓、肝臓、肺および脾臓を処理の２４時間後に回収した。回収した各器官の単個細胞の浮遊液を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒおよび組織分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の提供する指示にしたがって使用して調製した。各細胞混合物の半分を３０μｇのＡＰＣ－コンジュゲート抗ＣＤ５６抗体（Ｅｘ／Ｅｍ＝６５０／６６０ｎｍ）と共に１時間４℃でインキュベートした。得られた細胞混合物を、冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＮＫ細胞の有無をフローサイトメトリーにより１×１０５の総細胞を計数することにより検出した。収集した結果は、ＦｌｏｗＪｏにより解析した。
[0059]実験結果
Ｔ－ＤＭ１は、哺乳類細胞におけるトラスツズマブ（ＴＺ）の発現およびそれに次ぐＤＭ１のコンジュゲートにより生成した。調製したＴ－ＤＭ１は次いで、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳを結合させることにより疎水化し、これによりＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１が産生された。合成したＴ－ＤＭ１は、市販品であるＫａｄｃｙｌａと比較して同等の細胞毒性を示した。種々の量のＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１によるＮＫ細胞の表面処理は、ＮＫ細胞の生存率（図１Ａを参照のこと）、ＮＫ細胞の増殖活性のいずれにも影響を与えない。５×１０５の免疫細胞の信頼性のある改変には、１００μｇのＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１が必要であり、これにより、１×１０５のＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の細胞膜上に埋込まれた約２．１μｇのＴ－ＤＭ１が得られた。Ｔ－ＤＭ１は、完全増殖培地中で４８時間を超えて、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の表面上で検出され（図１Ｂを参照のこと）、重要なＮＫ細胞特異的マーカーの２つである、ＣＤ５６および２Ｂ４は、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の表面上で利用可能であった。これらの結果は、Ｔ－ＤＭ１が内在化することなくＮＫ細胞表面上に埋込まれていること、および、ＡＤＣによるＮＫ細胞の表面処理は、ＮＫ細胞受容体のアクセス可能性に干渉しないことを実証しており、このことは、ＮＫ細胞の固有の細胞溶解活性が表面処理時に保持されていることを示唆している（図１Ｃを参照のこと）。本試験で使用する同種異系ＮＫ細胞である、ＮＫ－９２細胞は、抗体内在化および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を開始することができるＣＤ１６、ＣＤ３２およびＣＤ６４ ＩｇＧ受容体を欠損しているため、Ｔ－ＤＭ１による表面処理は、ＮＫ細胞の代謝および生存率に対する効果が最小であると考えられる。癌細胞において、Ｔ－ＤＭ１内在化は、ＨＥＲ２受容体介在性エンドサイトーシスを介して生じる。ＮＫ細胞は、その膜上にＨＥＲ２を発現しないため、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の表面上に埋込まれたＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１は内在化せず、無視できる程度の細胞毒性を示した。さらに、ＤＭＥＰとＴ－ＤＭ１の間のＰＥＧスペーサーは、内在化の物理的な障壁を提供する。試験により、ＰＥＧスペーサーが長くなると、生体分子の内在化を阻害するだけでなく、立体障害の増加により、膜挿入効率が低下することが報告されている。長いＰＥＧスペーサーの存在によりもたらされたＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１の上述の膜挿入効率は、約１０％であった。
[0060]ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の標的癌細胞に対する特異的結合を実証するために、残存ＮＫ細胞の数を、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞を標的癌細胞または非標的癌細胞と共インキュベートした後に決定した。非改変ＮＫ細胞、Ｔ－ＤＭ１およびＮＫ細胞（Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ）共処理物またはＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞を、ＨＥＲ２－陽性ＳＫ－ＢＲ－３細胞、ＨＥＲ２－陽性Ｃａｌｕ－３細胞、またはＨＥＲ２－陰性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と共に、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比率１０：１でインキュベートした（図２を参照のこと）。３０分間の共インキュベーション後、非結合ＮＫ細胞を完全に洗浄し、残存細胞を、フローサイトメトリーを用いて計数した。癌細胞をＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞、Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物、および非改変ＮＫ細胞で処理した場合の残存Ｅ：Ｔ比率は、それぞれ、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対して約３．８、０．５および０．３であり、Ｃａｌｕ－３細胞に対して３．７、０．８および０．３であった。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に結合したままであったＮＫ細胞の数は無視できる程度であった。これらの結果から、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞は、ＨＥＲ２－陽性癌細胞を特異的に認識し、結合することが明らかになった。Ｔ－ＤＭ１が、癌細胞に対するその抗癌活性を発揮するために、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞上のＴ－ＤＭ１は、癌細胞を標的とするように移入しなければならない。非改変ＮＫ細胞およびＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１－ＦＩＴＣ細胞を、ＳＫ－ＢＲ－３細胞、Ｃａｌｕ－３細胞またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と、８チャンバーカバーガラス面上で共インキュベートした。非結合ＮＫ細胞を３０分後に除去し、Ｔ－ＤＭ１－ＦＩＴＣの移入を共焦点顕微鏡により観察した。ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞のＳＫ－ＢＲ－３細胞およびＣａｌｕ－３細胞への結合時に、Ｔ－ＤＭ１は、接触エリアに向かって遊走し、エフェクター細胞－癌細胞接合部においてクラスターを形成し、次いで、標的癌細胞上に移入した。ＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１に含有される脂質により、Ｔ－ＤＭ１のＮＫ細胞膜を通過する側方移動が可能になる。この特性を介して、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１は、ＨＥＲ２が提示されているＮＫ細胞と癌細胞との間の接触点に向かって極性化することができた。ＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１が癌細胞上のＨＥＲ２に結合すると、これらの抗原－抗体複合体は、癌細胞上のＨＥＲ２の側方移動後に癌細胞膜を通過して拡散する。ＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１の極性化、抗原－抗体複合体の形成およびＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１の移入は、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞をＨＥＲ２－陰性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に処理した際には見られなかった。これらの結果は、ＮＫ細胞の表面上に埋込まれたＴ－ＤＭ１は、抗原－抗体複合体の形成後に標的癌細胞膜上に再局在することを示している。
[0061]Ｔ－ＤＭ１の内在化は、その抗癌有効性にとって重要であり、これは、ＤＭ１が癌細胞中の細胞内標的に作用するためである。Ｔ－ＤＭ１の細胞取り込み、Ｔ－ＤＭ１のリソソームへの輸送およびＤＭ１の放出についての以前に報告された観察と一致して、焦点は、標的癌細胞中の、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞から移入したＴ－ＤＭ１の内在化を確認することにあった。８チャンバーカバーガラススライド上にプレーティングした癌細胞を核染色色素（ｎｕｃｌｅａｒ ｓｔａｔｉｎｇ ｄｙｅ）（青色）で標識し、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１－ＦＩＴＣ細胞（赤色）から移入したＦＩＴＣ－標識Ｔ－ＤＭ１（緑色）の局在を観察した。上述の試験と同様に、非結合ＮＫ細胞を、共インキュベーションの３０分後に完全に除去した。評価したＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞からの移入後の、内在化したＴ－ＤＭ１を表す明確な蛍光ドットが、標的癌細胞の細胞質中で検出され、これは、標的癌細胞中へのＴ－ＤＭ１の内在化を表している。ＨＥＲ２－陽性癌細胞で使用したものと同一の条件で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では蛍光活性は全く観察されず、このことから、ＨＥＲ２－陰性癌細胞では、Ｔ―ＤＭ１の内在化が全く起こっていないことが確認される。Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物を上回るＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の治療上の利点を検証するために、癌細胞を最初にＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞およびＴ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物により、非結合免疫細胞を除去せずに２４時間処理した（図３Ａ、図３Ｂを参照のこと）。いずれの処理も同様のレベルの癌細胞死を誘導し、このことは、Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物への連続的に暴露は、閉鎖されたウェルシステム中において、Ｔ－ＤＭ１の影響を受けた瀕死の癌細胞をＮＫ細胞が特定するのに十分な時間を与えることが可能であることを示している。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞においては、両方の処理群において、ＮＫ細胞の抗癌活性のみが観察された（図３Ｃを参照のこと）。次いで、癌細胞を同一の処理で２時間インキュベートし、非結合エフェクター細胞を除去して、インビボ癌標的化ホーミング効果を模倣した。本発明者らはさらに、残存癌結合エフェクター細胞を、標的細胞と共に２４時間インキュベートし、結果として生じた癌細胞死を記録した。ＳＫ－ＢＲ－３細胞およびＣａｌｕ－３細胞において、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞により誘導される癌細胞死のレベルは、ＮＫ細胞またはＴ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物により誘導されるものよりも高いことが見出された一方で、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞においては有意な細胞死は全く認められなかった（図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆを参照のこと）。これは、より多数のＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞が、ＳＫ－ＢＲ－３細胞およびＣａｌｕ－３細胞へ結合したままであったことによるものであり、これにより、抗癌活性のレベルの上昇がもたらされた。
[0062]次いで、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞に含有されるトラスツズマブ、ＤＭ１およびＮＫ細胞の癌細胞生存率に対する効果を評価した。ＤＭ１の抗癌作用を特定するために、トラスツズマブ表面処理ＮＫ（ＳＥ－ＮＫ／ＴＺ）細胞を調製し、ＳＥ－ＮＫ／ＴＺ細胞およびＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞により誘導される癌細胞死を比較した。癌細胞死は、処理の２時間後に非結合ＮＫ細胞を除去した後の共インキュベーションの２４時間後に解析した。予期するように、Ｔ－ＤＭ１は、ＴＺよりもＳＫ－ＢＲ－３細胞に対してより優れた細胞溶解作用を示した。得られた、増強した癌細胞死は、ＤＭ１の添加によるものであった。ＮＫ細胞およびＴＺ（ＴＺ＋ＮＫ）共処理物は、ＮＫ細胞単独と比較すると、わずかに細胞毒性の改善を示したが、Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物と比較するとはるかに小さかった。Ｔ－ＤＭ１を含む処理は、ＨＥＲ２陽性癌細胞に対する抗癌活性をさらに増強し、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞は、他の全ての処理よりも優れた抗癌活性を示した。Ｔ－ＤＭ１に含有されるＤＭ１は、ＨＥＲ２陽性癌細胞死の約２０％の増加を誘導したと推定された。ＮＫ細胞の非特異的細胞溶解活性を除いては、いずれの処理も、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞においては、有意な細胞毒性を誘導しなかった。ＮＫ細胞を、同一の実験設定における代替の陰性Ｔ細胞株であるＪｕｒｋａｔ（ＪＫ）細胞と比較した。Ｔ－ＤＭ１表面処理ＪＫ（ＳＥ－ＪＫ／Ｔ－ＤＭ１）細胞およびＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の細胞毒性を、ＳＫ－ＢＲ－３細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対して試験した。予期されるように、ＮＫ細胞は、ＪＫ細胞と比較して、ＳＫ－ＢＲ－３細胞においてより高い細胞溶解活性を示した。Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物は、Ｔ－ＤＭ１のＪＫ細胞との共処理物（Ｔ－ＤＭ１＋ＪＫ）と比較して、約２７％多い癌細胞死を引き起こした。同様に、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞は、ＳＥ－ＪＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞と比較して、ＳＫ－ＢＲ－３細胞において約５８％多い癌細胞死を誘導した。一貫して、ＮＫ細胞活性を上回る細胞死の有意な差は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では観察されなかった。ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞は、ＮＫ細胞単独と比較して、ＨＥＲ２－陰性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対して細胞毒性の増強を示さなかった。これらの結果から、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の個々の構成要素が、組合せ抗癌有効性をもたらす要素であることが確認された。さらに、本発明者らのワンステップ法を用いてＡＤＣを免疫細胞内に埋込むことは、ＡＤＣ単独、免疫細胞単独、またはＡＤＣおよび免疫細胞の共処理物を上回って抗癌有効性が増強される。ＤＭＰＥ－ＰＥＧ－Ｔ－ＤＭ１が表面上に取り込まれる際に、ＮＫ細胞が活性化されたか否かを決定するために、有名な脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７ａのＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１および非改変ＮＫ細胞上の発現レベルを、標的癌細胞への係合時に評価した。陽性対照として、ＮＫ細胞およびＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞を、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激を介して活性化させた。ＮＫ細胞とＴ－ＤＭ１＋ＮＫ細胞の共処理物群において、ＣＤ１０７ａの発現レベルは、癌細胞と共にインキュベートした場合であってすら、基本レベルにとどまっていた。しかしながら、ＣＤ１０７ａの発現は、標的癌細胞である、ＳＫ－ＢＲ－３細胞およびＣａｌｕ－３細胞との接触時には、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞中で増幅した。この上昇は、非標的ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では見られなかった。これらの結果は、ＤＭＰＥ－ＰＥＧＴ－ＤＭ１による表面改変後のＮＫ細胞の非特異的な活性化がないことを示唆しており、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の標的特異的な活性化を支持している。ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞のインビボ抗癌活性を、ＨＥＲ２－陽性Ｃａｌｕ－３モデルおよびＨＥＲ２－陰性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１モデルを使用して、Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物の抗癌活性と比較した。１×１０７のＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の投与を受けた腫瘍保有ＮＯＤ ｓｃｉｄ Ｇａｍｍａ（ＮＳＧ、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスは、約２１０μｇのＴ－ＤＭ１の投与を受け、これは、マウスモデルについての文献に見られる推奨された用量と類似している（７～１０ｍｇ ｋｇ－１）。ＨＥＲ２－陽性腫瘍モデルにおいて、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞は、組合せ効果を介して最も強い抗癌有効性を示した（図４Ａを参照のこと）。Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物は、対照群と比較して、腫瘍増殖を阻害した。ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞の処理は、Ｔ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物と比較して、腫瘍増殖の実質的な抑制を実証した。ＨＥＲ２－陰性腫瘍モデルにおいては、全ての処理群間で、腫瘍増殖抑制に有意な差は観察されなかった（図４Ｂを参照のこと）。Ｃａｌｕ－３モデルおよびＭＤＡ－ＭＢ－２３１モデルは、試験期間の間一定の体重を有しており、このことは、処理が重篤な毒性を引き起こさないことを示している。
[0063]ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞のＣａｌｕ－３腫瘍モデルにおける生体分布について、心臓、腎臓および肺において、無視できる程度のＮＫ細胞の蓄積が観察された（図４Ｃを参照のこと）。ＮＫ細胞は肝臓および脾臓では検出されたが、ＮＫ細胞の数の有意な差は処理群間で観察されなかった。非改変ＮＫ細胞およびＴ－ＤＭ１＋ＮＫ共処理物と比較して、より多くの数のＮＫ細胞が、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞を受けた腫瘍組織において点在化していた。有効性および生体分布試験からのインビボ実験結果により、本発明のワンステップ法により調製されたＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞が、標的腫瘍組織に向かって選択的に遊走し、癌細胞死を誘導することが確認された。Ｔ－ＤＭ１によるＮＫ細胞の表面処理により、標的腫瘍組織におけるＴ－ＤＭ１およびＮＫ細胞の同時蓄積が可能になった。Ｔ－ＤＭ１のＨＥＲ２－陽性癌細胞への結合により、ＰＩ３ＫおよびＡＫＴに関連する下流シグナル経路を阻害し、化学療法剤であるＤＭ１は、標的細胞中の微小管ネットワークを妨害し、これらは共に細胞周期停止および細胞アポトーシスをもたらす。標的癌細胞との物理的接触部から、ＳＥ－ＮＫ／Ｔ－ＤＭ１細胞は抗原発現癌細胞に向かって遊走し、次いで、これにより、ＮＫ細胞の細胞溶解性機能を刺激する可能性が上昇した。これらの標的癌細胞と近接接触しているＮＫ細胞は、次いで、瀕死の癌細胞上に発現しているダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を認識することによって、アポトーシスを起こしている癌細胞を根絶した。本明細書のワンステップ法により武器となる目的の細胞である同種異系免疫細胞は、その低頻度の有害作用、高い腫瘍特異的細胞毒性、予測可能な抗癌活性およびエクスビボの大細胞集団の増殖、維持および活性化の容易さにより、癌患者における、減少している活性免疫細胞集団を増強するための適当な解決策として注目を得ていた。本明細書のワンステップ法を使用することにより、化学免疫療法に基づいた特異的な腫瘍ホーミング能力および強力な抗癌活性を有する進歩した免疫細胞を臨床で即座に生成することができ、これは、十分な腫瘍反応性免疫細胞を得るのに必要な時間および費用を大幅に低減させる。より重要なことに、本明細書で生成するＡＤＣによる表面処理免疫細胞は、固形腫瘍においても増強した有効性を有すると思われるが、これは、抗体、化学療法剤、および全てが本発明の先進的免疫細胞を含む免疫細胞が、標的癌を根絶するために協調して作用するからである。疎水化したＡＤＣの適用を他の免疫細胞にまで拡張することについての１つの考慮点は、Ｆｃ受容体の存在であり得る。ＤＭＰＥ－ＰＥＧのＡＤＣへのコンジュゲートは、Ｆｃ領域を被覆して、免疫細胞上のＦｃ受容体の結合親和性を低下させる立体障害を増大させることにより、当問題を回避し得る。他の創造的な抗体処理方法、例えば一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の使用およびＦｃ受容体結合親和性を低下させるためのＦｃ領域の変更を、表面処理のための代替戦略として使用し得る。
[0064]本明細書に記載するものに加えて、本発明の種々の改変は、上述の記載から当技術分野の当業者には明らかであろう。かかる改変もまた、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。本出願で引用される各参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本発明の好ましい実施形態は示されており、記載されているが、添付の特許請求の範囲を超えない改変を行い得ることは、当技術分野の当業者には容易に明らかであろう。したがって、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲に限定されるに過ぎない。いくつかの実施形態において、語句「含む」を用いて本明細書に記載する本発明の記載は、「からなる」として記載し得る実施形態を含み、したがって、語句「からなる」を使用する本発明の１つまたは複数の実施形態を特許請求するための記述要件は満たされている。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］癌細胞を標的とするための化学免疫療法組成物であって、
ａ．目的の細胞上の標的に特異的であり、結合することができる標的化部分；
ｂ．標的化部分にコンジュゲートしており、標的化部分－薬物複合体を形成している、薬物；
ｃ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結しており、リン脂質－ＰＥＧリンカーを形成しているリン脂質であって、リン脂質－ＰＥＧリンカーが標的化部分－薬物複合体に結合している、リン脂質；および
ｄ．標的化部分－薬物複合体がリン脂質－ＰＥＧリンカーを介して免疫細胞に疎水的に結合している、免疫細胞；
を含み、
標的化部分－薬物複合体が、免疫細胞を目的の細胞へ差し向け、
薬物が、目的の細胞に対して細胞毒性作用を有する、
上記組成物。
［態様２］リン脂質が、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンおよび１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンからなる群から選択される、態様１に記載の組成物。
［態様３］ＰＥＧが２ｋＤａ～１０ｋＤａの分子量を有する、態様１または２に記載の組成物。
［態様４］目的の細胞が乳癌細胞である、態様１～３のいずれかに記載の組成物。
［態様５］免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンパ球、白血球および貪食細胞からなる群から選択される、態様１～４のいずれかに記載の組成物。
［態様６］リンパ球が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、態様５に記載の組成物。
［態様７］標的がＨＥＲ２である、態様１～６のいずれかに記載の組成物。
［態様８］標的化部分が、抗体またはその断片である、態様１～７のいずれかに記載の組成物。
［態様９］標的化部分が、抗ＨＥＲ２抗体である、態様１～８のいずれかに記載の組成物。
［態様１０］標的化部分が、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ペルツズマブ、ベバシズマブまたはリツキシマブである、態様１～８のいずれかに記載の組成物。
［態様１１］標的化部分が、抗ＣＤ５３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅｐ－ＣＡＭ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＭＳＬＮ抗体、抗ＣＤ３１９抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＦＧＦＲ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗Ｎｏｔｃｈ１抗体、抗ムチン抗体、抗ＭＣＰ－１抗体、抗ルイス－Ｙ抗原抗体、抗ＰＣＤＣ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗グリピカン３抗体、抗ＰＴＫ７抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗Ｂリンパ腫細胞抗体、抗ＤＲ５抗体、抗ＣＬＤＮ１９抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＨＥＲ１抗体、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ７０抗体である、態様１～８のいずれかに記載の組成物。
［態様１２］薬物がエムタンシン（ＤＭ１）である、態様１～１１のいずれかに記載の組成物。
［態様１３］処置を必要とする対象において腫瘍を処置する方法で使用するための化学免疫療法組成物であって、該組成物が
ａ．目的の細胞上の標的に特異的であり、結合することができる標的化部分；
ｂ．標的化部分にコンジュゲートしており、標的化部分－薬物複合体を形成している、薬物；
ｃ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結しており、リン脂質－ＰＥＧリンカーを形成しているリン脂質であって、リン脂質－ＰＥＧリンカーが標的化部分－薬物複合体に結合している、リン脂質；および
ｄ．標的化部分－薬物複合体がリン脂質－ＰＥＧリンカーを介して免疫細胞に疎水的に結合している、免疫細胞；
を含み、
標的化部分－薬物複合体が、免疫細胞を目的の細胞へ差し向け、
薬物が、目的の細胞に対して細胞毒性作用を有する、
ことを特徴とする、上記組成物。
［態様１４］癌細胞を標的とするための化学免疫療法組成物であって、該組成物が
ａ．目的の細胞上の標的に特異的であり、結合することができる標的化部分；
ｂ．標的化部分にコンジュゲートしており、標的化部分－薬物複合体を形成している、薬物；
ｃ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結しており、リン脂質－ＰＥＧリンカーを形成しているリン脂質であって、リン脂質－ＰＥＧリンカーが標的化部分－薬物複合体に結合している、リン脂質；および
ｄ．標的化部分－薬物複合体がリン脂質－ＰＥＧリンカーを介して免疫細胞に疎水的に結合している、免疫細胞；
を含み、
該組成物が、対象に投与され、
標的化部分－薬物複合体が、免疫細胞を目的の細胞へ差し向け、
薬物が、目的の細胞に対して細胞毒性作用を有する、
ことを特徴とする、上記組成物。
［態様１５］リン脂質が、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンおよび１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンからなる群から選択される、態様１３または１４に記載の組成物。
［態様１６］ＰＥＧが２ｋＤａ～１０ｋＤａの分子量を有する、態様１３～１５のいずれかに記載の組成物。
［態様１７］目的の細胞が乳癌細胞である、態様１３～１６のいずれかに記載の組成物。
［態様１８］免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンパ球、白血球および貪食細胞からなる群から選択される、態様１３～１７のいずれかに記載の組成物。
［態様１９］リンパ球が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、態様１８に記載の組成物。
［態様２０］標的がＨＥＲ２である、態様１６～１９のいずれかに記載の組成物。
［態様２１］標的化部分が、抗体またはその断片である、態様１６～２０のいずれかに記載の組成物。
［態様２２］標的化部分が、抗ＨＥＲ２抗体である、態様１６～２１のいずれかに記載の組成物。
［態様２３］標的化部分が、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ペルツズマブ、ベバシズマブまたはリツキシマブである、態様１６～２２のいずれかに記載の組成物。
［態様２４］標的化部分が、抗ＣＤ５３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅｐ－ＣＡＭ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＭＳＬＮ抗体、抗ＣＤ３１９抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＦＧＦＲ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗Ｎｏｔｃｈ１抗体、抗ムチン抗体、抗ＭＣＰ－１抗体、抗ルイス－Ｙ抗原抗体、抗ＰＣＤＣ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗グリピカン３抗体、抗ＰＴＫ７抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗Ｂリンパ腫細胞抗体、抗ＤＲ５抗体、抗ＣＬＤＮ１９抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＨＥＲ１抗体、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ７０抗体である、態様１６～２３のいずれかに記載の組成物。
［態様２５］薬物がエムタンシン（ＤＭ１）である、態様１６～２４のいずれかに記載の組成物。

Claims (23)

  1. 癌細胞を標的とするための化学免疫療法組成物であって、
    ａ．目的の細胞上の標的に特異的であり、結合することができる標的化部分；
    ｂ．標的化部分にコンジュゲートしており、標的化部分－薬物複合体を形成している、薬物；
    ｃ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結しており、リン脂質－ＰＥＧリンカーを形成している、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンを含むリン脂質であって、リン脂質－ＰＥＧリンカーが標的化部分－薬物複合体に結合している、リン脂質；および
    ｄ．標的化部分－薬物複合体がリン脂質－ＰＥＧリンカーを介して免疫細胞に疎水的に結合している、免疫細胞；
    を含み、
    標的化部分－薬物複合体が、免疫細胞を目的の細胞へ差し向け、
    薬物が、目的の細胞に対して細胞毒性作用を有する、
    上記組成物。
  2. ＰＥＧが２ｋＤａ～１０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
  3. 目的の細胞が乳癌細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンパ球、白血球および貪食細胞からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. リンパ球が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項４に記載の組成物。
  6. 標的がＨＥＲ２である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 標的化部分が、抗体またはその断片であり、該断片が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、または抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 標的化部分が、抗ＨＥＲ２抗体である、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 標的化部分が、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ペルツズマブ、ベバシズマブまたはリツキシマブである、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 標的化部分が、抗ＣＤ５３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅｐ－ＣＡＭ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＭＳＬＮ抗体、抗ＣＤ３１９抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＦＧＦＲ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗Ｎｏｔｃｈ１抗体、抗ムチン抗体、抗ＭＣＰ－１抗体、抗ルイス－Ｙ抗原抗体、抗ＰＣＤＣ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗グリピカン３抗体、抗ＰＴＫ７抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗Ｂリンパ腫細胞抗体、抗ＤＲ５抗体、抗ＣＬＤＮ１９抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＨＥＲ１抗体、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ７０抗体である、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 薬物がエムタンシン（ＤＭ１）である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 処置を必要とする対象において腫瘍を処置する方法で使用するための化学免疫療法組成物であって、該組成物が
    ａ．目的の細胞上の標的に特異的であり、結合することができる標的化部分；
    ｂ．標的化部分にコンジュゲートしており、標的化部分－薬物複合体を形成している、薬物；
    ｃ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結しており、リン脂質－ＰＥＧリンカーを形成している、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンを含むリン脂質であって、リン脂質－ＰＥＧリンカーが標的化部分－薬物複合体に結合している、リン脂質；および
    ｄ．標的化部分－薬物複合体がリン脂質－ＰＥＧリンカーを介して免疫細胞に疎水的に結合している、免疫細胞；
    を含み、
    標的化部分－薬物複合体が、免疫細胞を目的の細胞へ差し向け、
    薬物が、目的の細胞に対して細胞毒性作用を有する、
    ことを特徴とする、上記組成物。
  13. 癌細胞を標的とするための化学免疫療法組成物であって、該組成物が
    ａ．目的の細胞上の標的に特異的であり、結合することができる標的化部分；
    ｂ．標的化部分にコンジュゲートしており、標的化部分－薬物複合体を形成している、薬物；
    ｃ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結しており、リン脂質－ＰＥＧリンカーを形成している、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンを含むリン脂質であって、リン脂質－ＰＥＧリンカーが標的化部分－薬物複合体に結合している、リン脂質；および
    ｄ．標的化部分－薬物複合体がリン脂質－ＰＥＧリンカーを介して免疫細胞に疎水的に結合している、免疫細胞；
    を含み、
    該組成物が、対象に投与され、
    標的化部分－薬物複合体が、免疫細胞を目的の細胞へ差し向け、
    薬物が、目的の細胞に対して細胞毒性作用を有する、
    ことを特徴とする、上記組成物。
  14. ＰＥＧが２ｋＤａ～１０ｋＤａの分子量を有する、請求項１２または１３に記載の組成物。
  15. 目的の細胞が乳癌細胞である、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンパ球、白血球および貪食細胞からなる群から選択される、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の組成物。
  17. リンパ球が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１６に記載の組成物。
  18. 標的がＨＥＲ２である、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 標的化部分が、抗体またはその断片であり、該断片が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、または抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 標的化部分が、抗ＨＥＲ２抗体である、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 標的化部分が、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ペルツズマブ、ベバシズマブまたはリツキシマブである、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 標的化部分が、抗ＣＤ５３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅｐ－ＣＡＭ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＭＳＬＮ抗体、抗ＣＤ３１９抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗ＦＧＦＲ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗Ｎｏｔｃｈ１抗体、抗ムチン抗体、抗ＭＣＰ－１抗体、抗ルイス－Ｙ抗原抗体、抗ＰＣＤＣ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗グリピカン３抗体、抗ＰＴＫ７抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗Ｂリンパ腫細胞抗体、抗ＤＲ５抗体、抗ＣＬＤＮ１９抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＨＥＲ１抗体、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ７０抗体である、請求項１４～２１のいずれか１項に記載の組成物。
  23. 薬物がエムタンシン（ＤＭ１）である、請求項１４～２２のいずれか１項に記載の組成物。
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