CN107789366A - 细胞‑抗体复合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了细胞‑抗体复合物，其包含免疫细胞以及位于所述免疫细胞表面的抗体或其抗原结合片段。本申请还提供了制备上述细胞‑抗体复合物的方法，以及包含上述细胞‑抗体复合物的药物组合物。本申请还提供了上述细胞‑抗体复合物或包含其的药物组合物在治疗肿瘤或感染性疾病中的应用。

Description

细胞-抗体复合物及其制备方法

技术领域

本申请涉及医学领域，具体地，本申请提供了用于治疗疾病的细胞-抗体复合物以及其制备方法。

发明背景

癌症已经成为人类第一位致死性病因。癌症的标准疗法包括手术、化疗、放疗。然而，这些方法毒副作用大、预后较差、复发率高，因此总体疗效并不理想。

近年来，癌症免疫疗法成为科研人员的新宠。癌症免疫疗法，也可称为“生物疗法”、“细胞疗法”或“自体血活化疗法”等，本质上来说就是试图通过增强人体本身的免疫系统，以清除体内的肿瘤细胞。目前癌症免疫疗法主要有四大类：过继细胞疗法、免疫检查点阻断剂、非特异性免疫激活剂与癌症疫苗，但这些方法治疗癌症的效果并不理想。在感染性疾病治疗方面，例如病毒感染性疾病，也已经尝试利用生物免疫疗法治疗，但其疗效并不确切。

发明概述

第一方面，提供了细胞-抗体复合物，其包含免疫细胞以及位于所述免疫细胞表面的抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，免疫细胞为T细胞、NK细胞、CIK细胞等，优选为T淋巴细胞，更优选为CD8+T淋巴细胞。

在一些实施方案中，所述免疫细胞为使用还原剂处理过的细胞，优选地，所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、β-巯基乙醇和2-巯基乙醇胺(2-MEA)。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段能够特异性结合至疾病或病症相关抗原，所述疾病或病症相关抗原例如可以为肿瘤相关的抗原或病原体特异性的细胞表面抗原。在一具体的实施方案中，所述疾病或病症相关抗原为肿瘤相关抗原，更优选为肿瘤细胞表面抗原。优选地，所述肿瘤相关抗原选自以下的一种或多种：CD20、HER2、EGFR、CD33、CD52、VEGF、CTLA-4、CD30、RANKL、HER2、VEGF-R2、Her3、A33抗原、CD5、CD19、CD22、CD23(IgE受体)、CA242抗原、5T4、VEGFR-1、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、NPC-1C、波形蛋白、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、癌胚抗原(CEA)、整合素α_vβ₃、整合素α₅β₁、成纤维细胞活化蛋白、FAP-α、TAG-72、MUC1、MUC16、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、EGP40泛癌抗原、糖蛋白EpCAM、程序性死亡-1、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、Lewis-Y抗原、GD2、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)和间皮素。在另一具体实施方案中，所述疾病或病症相关抗原为病原体特异性细胞表面抗原，所述病原体例如为HIV、HCV、HBV、CMV和EB病毒。

在一些实施方案中，上述细胞-抗体复合物是通过基因工程方法或化学方法制备的。优选地，所述细胞-抗体复合物通过化学偶联方法制备。

在一些实施方案中，所述抗体是用能够提供马来酰亚胺基团的试剂修饰的抗体，优选地，所述试剂选自4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)、琥珀酰亚胺基3-[溴代乙酰基氨基]丙酯、N-琥珀酰亚胺基碘代乙酯、N-琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯、琥珀酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]丁酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)2-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)4-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)6-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)8-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)12-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)24-马来酰亚胺、琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺丙酰胺基)]己酯、4-琥珀酰亚胺基氧羰基-甲基-α[2-吡啶基二硫]甲苯、N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酯、N-[ε-马来酰亚胺乙酰基氧]硫代琥珀酰亚胺酯、N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯、N-[κ-马来酰亚胺十一酰氧]-硫代琥珀酰亚胺酯、硫代琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯酰胺基]己酯、硫代琥珀酰亚胺基6-[3’-(2-吡啶基二硫)-丙酰胺基]己酯、m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯、硫代琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯、硫代琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧化物和硫代琥珀酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]丁酯。

第二方面，提供了制备本文公开的细胞-抗体复合物的方法，其包括以下步骤：

(1)对抗体进行修饰；以及

(2)使步骤(1)中得到的修饰的抗体和免疫细胞接触，得到免疫细胞-抗体复合物。

在一些实施方案中，本文公开的方法中的步骤(1)包括用能够提供马来酰亚胺基团的试剂修饰抗体，例如，所述试剂为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)等。

在一些实施方案中，本文公开的方法还包括在上述步骤(2)之前，用还原剂处理免疫细胞，例如，所述还原剂可以选自二硫苏糖醇(DTT)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、β-巯基乙醇和2-巯基乙醇胺(2-MEA)等。

在一些实施方案中，在本文公开的方法的步骤(2)中，所述修饰的抗体量与所述免疫细胞的反应比例为：每10⁶个细胞对应于≥5μg抗体，在优选的实施方案中，每10⁶个细胞对应于50μg抗体。

在一些实施方案中，上述步骤(2)中的免疫细胞的密度为1-5×10⁶/ml。

在一些实施方案中，所述还原剂为NAC，所用NAC的反应浓度为1-50mM，优选为10-20mM，更优选为20mM；任选地直接将NAC添加到免疫细胞培养基中；优选的反应PH为6.8-7.8，更优选为PH＝7.4。

在一些实施方案中，所用NAC与免疫细胞的反应时间为0.5-13个小时，优选为1-2小时。

在一些实施方案中，所述还原剂为DTT，所用DTT的反应浓度为1mM；任选地直接将DTT添加到免疫细胞培养基中；优选的反应PH为6.8-7.8，更优选为PH＝7.4。

在一些实施方案中，所述DTT与免疫细胞的反应时间大于或等于15分钟，优选为15分钟。

在一些实施方案中，所述修饰的抗体量与所述免疫细胞进行反应的PH为6.8-7.8，优选为PH＝7.4；任选地反应时间为1小时。

第三方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的细胞-抗体复合物，以及药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，药物组合物用于治疗、改善或预防个体的肿瘤。

在一些实施方案中，药物组合物用于治疗、改善或预防个体的感染性疾病。

第四方面，本申请提供了治疗、改善或预防个体的肿瘤或传染性疾病的方法，其包括给予个体第一方面所述的细胞-抗体复合物或第三方面所述的药物组合物。

第五方面，本申请提供了第一方面所述的细胞-抗体复合物或第三方面所述的药物组合物在制备用于治疗、改善或预防个体的肿瘤或感染性疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，适合用本文公开的细胞-抗体复合物、药物组合物或药物治疗的肿瘤为原发性肿瘤或转移性肿瘤。优选地，所述肿瘤选自肺癌例如非小细胞肺癌、结直肠癌、膀胱癌、造血系统癌症例如白血病、乳腺癌、胃癌、胃食管结合部腺癌、B淋巴细胞型非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，间变大细胞淋巴瘤、头颈癌例如头颈部鳞状细胞癌、恶性胶质瘤，肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、骨癌、骨巨细胞瘤、胰腺癌、肉瘤、肝癌、皮肤鳞癌、甲状腺癌、宫颈癌、鼻咽癌、子宫内膜癌，或上述肿瘤的转移癌。

在另一些实施方案中，适合用本文公开的细胞-抗体复合物、药物组合物或药物治疗的感染性疾病为病毒感染性疾病。在一些实施方案中，所述病毒感染可以选自肝炎病毒感染、疱疹病毒感染例如EB病毒感染、人乳头瘤病毒感染、人类嗜T淋巴细胞病毒1型感染、巨细胞病毒感染和人类免疫缺陷病毒感染。

附图简要描述

图1显示了T细胞表型分析的结果，其中分别使用了CD3、CD4、CD8、CD56流式抗体对T细胞进行流式细胞术分析。

图2显示了T细胞表面巯基(-SH)检测的结果。A.只含T细胞，不添加iFluor染料；B.向T细胞添加1000ng iFluor染料；C.向T细胞添加50μg iFluor染料；D.A、B和C直方图叠加。

图3显示了用还原剂处理后，T细胞表面的最大抗体负载量检测。图A-F为使用不同抗体量时的流式直方图，图G为抗体量分别为1000ng、10000ng、100000ng、200000ng条件下的叠加图。

图4显示用DTT处理T细胞，T细胞上分别偶联美罗华(抗CD20抗体)和西妥昔(抗EGFR抗体)的流式细胞分析结果，A图深色实线为未偶联抗体的T细胞，浅色实线代表T细胞偶联上美罗华；B图深色实线为未偶联抗体的T细胞，浅色实线代表T细胞偶联上西妥昔。

图5显示使用DTT处理的NK92细胞偶联美罗华的流式细胞分析结果。A图中的NK92细胞未用还原剂处理，B图中的NK92细胞使用还原剂处理，其中深色实线代表未偶联抗体的NK92细胞，浅色实线代表将NK92细胞与美罗华-SMCC(带马来酰亚胺基团的美罗华)混合反应，A图中的浅色实线显示NK92细胞未偶联上抗体；B图中的浅色实线显示NK92细胞偶联上抗体。

图6显示了用不同浓度的NAC处理T细胞后，T细胞吸附HERCEPTIN抗体的结果。图A.对照组T细胞未用NAC处理，反应结束后加入HERCEPTIN-SMCC进行偶联。B.T细胞使用10mMNAC处理，反应结束后加入HERCEPTIN-SMCC进行偶联。C.T细胞使用20mM NAC处理，反应结束后加入HERCEPTIN-SMCC进行偶联。D.T细胞使用1mM DTT处理，反应结束后加入HERCEPTIN-SMCC进行偶联。E.20mM NAC与1mM DTT的比较。

图7显示了5637细胞表面HER2检测的结果。A.使用二抗即抗人IgG FITC与5637细胞冰上孵育30min；B.先使用一抗HERCEPTIN与5637细胞冰上孵育30min，PBS洗涤，再使用二抗抗人IgG FITC冰上孵育30min；C.A和B直方图叠加。

图8显示了A549细胞表面HER2检测的结果。A.只使用二抗抗人IgG FITC与A549冰上孵育30min；B.A549HER2实验组先使用一抗HERCEPTIN与A549冰上孵育30min，PBS洗涤，再使用二抗抗人IgG FITC冰上孵育30min；C.A和B直方图叠加。

图9显示了colo205细胞表面HER2检测的结果。A.只使用二抗抗人IgG FITC与colo205冰上孵育30min；B.先使用一抗HERCEPTIN与colo205冰上孵育30min，PBS洗涤，再使用二抗抗人IgG FITC冰上孵育30min；C.A和B直方图叠加。

图10显示了K562细胞表面HER2检测的结果。A.只使用二抗抗人IgG FITC与K562冰上孵育30min；B.先使用一抗HERCEPTIN与K562冰上孵育30min，PBS洗涤，再使用二抗抗人IgG FITC冰上孵育30min；C.A和B直方图叠加。

图11显示了在用或不用DTT处理的情况下，单独的T细胞以及与HERCEPTIN或HERCEPTIN-SMCC结合的T细胞对A549细胞的杀伤活性。-DTT：T细胞未使用还原剂处理；+DTT：T细胞预先用还原剂DTT处理。T+A549：T细胞与A549混合；T+HERCEPTIN+A549：T细胞先与HERCEPTIN混合反应，离心，PBS洗涤未结合的HERCEPTIN，T细胞再与A549混合；T+HERCEPTIN-SMCC+A549：T细胞先与HERCEPTIN-SMCC(带马来酰亚胺基团抗体)混合反应，离心，PBS洗涤未结合的HERCEPTIN-SMCC，T细胞再与A549混合。

图12显示了在用或不用DTT处理的情况下，单独的T细胞以及与HERCEPTIN或HERCEPTIN-SMCC结合的T细胞对colo205细胞的杀伤活性。-DTT：T细胞未使用还原剂处理。+DTT：T细胞预先用还原剂DTT处理。T+colo205：T细胞与colo205混合。T+HERCEPTIN+colo205：T细胞先与HERCEPTIN混合反应，离心，PBS洗涤未结合的HERCEPTIN，T细胞再与colo205混合。T+HERCEPTIN-SMCC+colo205：T细胞先与HERCEPTIN-SMCC(带马来酰亚胺基团抗体)混合反应，离心，PBS洗涤未结合的HERCEPTIN-SMCC，T细胞再与colo205混合。

图13显示了在用或不用DTT处理的情况下，单独的T细胞以及与HERCEPTIN或HERCEPTIN-SMCC结合的T细胞对K562细胞的杀伤活性。-DTT：T细胞未使用还原剂处理。+DTT：T细胞预先用还原剂DTT处理。T+K562：T细胞与K562混合。T+HERCEPTIN+K562：T细胞先与HERCEPTIN混合反应，离心，PBS洗涤未结合的HERCEPTIN，T细胞再与K562混合。T+HERCEPTIN-SMCC+K562：T细胞先与HERCEPTIN-SMCC(带马来酰亚胺基团抗体)混合反应，离心，PBS洗涤未结合的HERCEPTIN-SMCC，T细胞再与K562混合。

图14显示了在用或不用DTT处理的情况下，单独的T细胞以及与HERCEPTIN或HERCEPTIN-SMCC结合的T细胞对5637细胞的杀伤活性。-DTT：T细胞未使用还原剂处理。+DTT：T细胞预先用还原剂DTT处理。T+5637：T细胞与5637混合。T+HERCEPTIN+5637：T细胞先与HERCEPTIN混合反应，离心，PBS洗涤未结合的HERCEPTIN，T细胞再与5637混合。T+HERCEPTIN-SMCC+5637：T细胞先与HERCEPTIN-SMCC(带马来酰亚胺基团抗体)混合反应，离心，PBS洗涤未结合的HERCEPTIN-SMCC，T细胞再与5637混合。

图15显示了使用Amix小动物成像仪检测T细胞体外杀伤5637细胞的荧光图像。使用带Luciferase标记的5637进行体外杀伤实验，加入底物D(-)-Luciferin，利用Amix小动物成像仪检测剩余活细胞数。T+5637：T细胞与5637进行混合；T(DTT/NAC)+HERCEPTIN-SMCC+5637：吸附上抗体HERCEPTIN的T细胞与5637进行混合。

图16显示T细胞偶联CD20抗体后对Daudi靶细胞的杀伤作用。-NAC：未用NAC处理T细胞；+NAC：用20mM浓度的NAC处理T细胞。T+Daudi：T细胞与Daudi细胞混合；T+美罗华+Daudi：T细胞与美罗华混合，在37℃，5％CO₂下孵育1h后，离心，洗涤，再与Daudi细胞混合；T+美罗华-SMCC+Daudi：T细胞与美罗华-SMCC混合，在37℃，5％CO₂下孵育1h后，离心，洗涤，再与Daudi细胞混合。

发明详细描述

本申请总体上涉及包含免疫细胞以及位于所述免疫细胞表面的抗体或其抗原结合片段的细胞-抗体复合物，以及其制备和使用方法。本申请通过将免疫细胞与抗体形成复合物，利用抗体与靶细胞蛋白例如疾病或病症相关抗原的结合特异性，赋予了免疫细胞特异性靶向功能，从而促进了免疫细胞定向清除靶细胞例如肿瘤细胞、病原体细胞等的能力。例如，上述抗体为特异性结合至肿瘤细胞表面的抗体时，则本申请的复合物为既具有特异性靶向作用，又具有细胞免疫功能的抗肿瘤复合物产品。

细胞-抗体复合物

本申请提供了细胞-抗体复合物，其包含免疫细胞，以及位于所述免疫细胞表面的抗体或其抗原结合片段。

免疫细胞

本文使用的术语“免疫细胞”指参与免疫反应的细胞，也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。根据功能，免疫细胞可分为非特异性免疫细胞、特异性免疫细胞和抗原提呈细胞。非特异性免疫细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞、肥大细胞等，特异性免疫细胞包括T细胞和B细胞，抗原提呈细胞包括树突状细胞、巨噬细胞和B细胞等。

在一些实施方案中，免疫细胞可以为T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、CIK细胞等。在具体的实施方案中，使用的免疫细胞为CD8+淋巴细胞。在另一具体的实施方案中，使用的细胞为NK细胞。

T淋巴细胞(也称T细胞)在免疫反应中扮演着重要的角色，是淋巴细胞的主要组分，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，能够抵御疾病感染、肿瘤等。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫的效应形式主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一种是释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。T细胞膜表面分子与T细胞的功能相关，也是T细胞的表面标志，可以用以分离、鉴定不同亚群的T细胞。目前公认CD3抗原为所有T淋巴细胞的共同表面标志物。

NK细胞是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，其主要来源于骨髓CD34+的淋巴细胞，是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。

CD8+T淋巴细胞是指在其表面上表达CD8抗原的T淋巴细胞，主要包括细胞毒性T细胞。CD8+T细胞通过直接杀伤作用，主要负责对靶细胞的清除，例如被病毒感染的细胞和表达有肿瘤特异性抗原的细胞。

在具体的实施方案中，本申请使用的免疫细胞为从外周血中分离的T细胞。在更具体的实施方案中，从外周血中收获的T细胞中CD8+T细胞所占比例大于50％，例如约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约100％等，包括上述任意两数值之间的所有整数和小数。在一示例性实施方案中，CD8+T细胞的比例为约70％-约90％。

外周血可以从任何哺乳动物中获得。在一些实施方案中，T淋巴细胞可以根据已知技术来收集，并通过已知技术来富集或消减，如流式细胞分选和/或免疫磁珠选择等。经过富集和/或消减步骤以后，可以根据需要，利用本领域的已知技术(包括但不限于描述于Riddell等人的美国专利No.6,040,177中的内容)或对本领域技术人员来说其他容易想到的技术，任选地对期望的T淋巴细胞进行体外扩增。

在一些实施方案中，用于本文公开的细胞-抗体复合物中的免疫细胞在其表面天然表达有与抗体反应的物质，例如反应基团。例如，本申请发明人发现，在外周血分离的T细胞表面天然存在巯基。

在一些实施方案中，用于本文公开的细胞-抗体复合物中的免疫细胞为预先用试剂处理过的免疫细胞，例如在分离富集后用还原剂处理，以增加与抗体的反应性。在具体的实施方案中，免疫细胞使用二硫苏糖醇(DTT)和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)处理，以增加免疫细胞表面的巯基，利于与抗体的结合。

在其他实施方案中，本申请使用的免疫细胞是经基因工程重组修饰的免疫细胞，以在其表面表达相关抗体或其抗原结合片段，增加免疫细胞的靶向性。

抗体

用于本文公开的细胞-抗体复合物中的抗体或抗原结合片段可以为任何类型。具体实例包括治疗性和诊断性抗体。如本领域所熟知的，抗体是能通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个表位识别位点而特异性结合靶标(如碳水化合物、多肽、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文中所使用，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其片段(如dAb、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv)、单链(ScFv)、其合成变体、天然存在的变体、包含具有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分的融合蛋白、人源化的抗体、嵌合的抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型。

如本文中使用的术语“抗原结合片段”是指含有结合目标抗原例如肿瘤抗原(如人Her2/neu蛋白)的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个CDR(互补性决定区)的多肽片段。在一些实施方案中，本文中描述的抗体的抗原结合片段可以包含来自抗体的VH和VL序列的1、2、3、4、5或所有6个CDRs。CDR主要负责抗原结合位点的特异性。

术语“抗原”是指能被选择性结合剂如抗体结合的分子或分子部分，还能用于动物中以制备能结合该抗原的表位的抗体。抗原可以具有一个或多个结合表位。

本文使用的术语“肿瘤相关抗原”指肿瘤细胞单独表达或主要表达或过表达的任何分子(例如蛋白、肽、脂质、碳水化合物等)，以使所述抗原与肿瘤相关。肿瘤相关抗原可以是仅一种类型的肿瘤表达的抗原，以使所述肿瘤抗原仅与一种类型的肿瘤相关或者仅是一种类型的肿瘤所特有的。可选地，肿瘤抗原可以是多种类型肿瘤相关或者特有的肿瘤抗原。例如，肿瘤相关抗原可以被乳腺癌细胞和结肠癌细胞都表达，但不被正常的、非肿瘤或非癌细胞所表达。示例性的肿瘤相关抗原为肿瘤细胞表面抗原，这类抗原更利于为治疗性和诊断性抗体所识别。

在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包括下述中的任何一种或多种：CD20、HER2、EGFR、CD33、CD52、VEGF、CTLA-4、CD30、RANKL、HER2、VEGF-R2、Her3、A33抗原、CD5、CD19、CD22、CD23(IgE受体)、CA242抗原、5T4、VEGFR-1、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、NPC-1C、波形蛋白、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、癌胚抗原(CEA)、整合素α_vβ₃、整合素α₅β₁、成纤维细胞活化蛋白、FAP-α、TAG-72、MUC1、MUC16、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、EGP40泛癌抗原、糖蛋白EpCAM、程序性死亡-1、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、Lewis-Y抗原、GD2、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)和间皮素。

在一些实施方案中，用于本文公开的细胞-抗体复合物中的抗体能够特异性结合病原体相关的细胞表面抗原。在具体实施方案中，所述病原体相关的细胞表面抗原为病毒相关的抗原，例如HIV抗原、HCV抗原、HBV抗原、CMV抗原和EB病毒抗原。

术语“特异性结合”是本领域熟知的术语，并且测定抗体与抗原此类特异性结合的方法也为本领域所熟知。例如，在一些实施方案中，“特异性结合”是指抗体与预期的靶标结合，但不与其他靶标显著结合。相比与其他表位的结合，抗体以明显增加的亲和力和/或以更长的持续时间结合预期的靶表位。

在具体的实施方案中，用于本文公开的细胞-抗体复合物中的抗体为单克隆抗体。术语“单克隆抗体”指从基本同质的抗体群中获得的抗体，即构成该群抗体的单个抗体之间是相同的，除了可以少量存在的可能自然发生的变异外。单克隆抗体高度特异性的针对单一抗原表位。本文公开的单克隆抗体不限于抗体来源或其制备方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体挑选、重组表达、转基因动物等)。该术语包括在“抗体”定义下的完整免疫球蛋白以及其片段等。

在一些实施方案中，本申请复合物中所用的单克隆抗体选自以下的一种或多种：利妥昔单抗(Rituximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、吉妥珠单抗-奥佐米星(Gemtuzumabozogamicin)、阿仑单抗(Alemtuzumab),贝伐单抗(Bevacizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(Panitumumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、贝伦妥单抗-维多汀(Brentuximab vedotin)、地诺单抗(Denosumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab),Obinutuzumab、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、3F8、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿夫土珠单抗(afutuzumab)、培化阿珠单抗(alacizumab(pegol))、阿麦妥昔(amatuximab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐珠单抗(bivatuzumab)、莫-坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、拉-坎妥珠单抗(cantuzumab(ravtansine))、卡罗单抗-喷地肽(capromab(pendetide))、卡妥索单抗(catumaxomab)、泊-西他珠单抗(citatuzumab(bogatox))、西妥木单抗(cixutumumab)、clivatuzumab(tetraxetan)、可那木单抗(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛珠单抗(dalotuzumab)、地莫单抗(Detumomab)、drozitumab、依美昔单抗(ecromeximab)、依决洛单抗(edrecolomab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、enavatuzumab、恩司昔单抗(ensituximab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、伊瑞西珠(etaracizumab)、法利珠单抗(farletuzumab)、FBTA05、flanvotumab、加利昔单抗(galiximab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、ganitumab、吉瑞昔单抗(girentuximab)、格莱木单抗-维多汀(glembatumumab(vedotin))、替-伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、icrucumab、伊戈伏单抗(igovomab)、拉-英达西单抗(indatuximab ravtansine)、英妥木单抗(intetumumab)、伊珠单抗-奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)(MDX-101)、伊妥木单抗(iratumumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、莫-洛伏珠单抗(lorvotuzumab(mertansine))、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫加珠单抗(mogamulizumab)、moxetumomab(pasudotox)、他那可单抗(nacolomab(tafenatox))、他那莫单抗(naptumomab(estafenatox))、narnatumab、奈昔木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、nivolumab、NR-LU-10、olaratumab、莫奥珠单抗(oportuzumab(monatox))、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、普立木单抗(pritumumab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、radretumab、、罗妥木单抗(robatumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、帕他普莫单抗(taplitumomab(paptox))、替妥莫单抗(tenatumomab)、替妥木单抗(teprotumumab)、替西木单抗(ticilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、西莫白介素单抗(tucotuzumab(celmoleukin))、ublituximab、乌瑞鲁单抗(urelumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、伏洛昔单抗(volociximab)、伏妥昔单抗(votumumab)和扎鲁木单抗(zalutumumab)。

在具体的实施方案中，用于本申请复合物中的抗体为抗-Her2/neu抗体，例如曲妥珠单抗或其片段或衍生物。曲妥珠单抗是可以用于治疗癌症的Her2/neu特异性单克隆抗体。如本文所示，相比单独使用T细胞相比，将曲妥珠单抗结合至T细胞后出人意料地显著增加了对癌症细胞的杀伤力。这表明，用于本申请复合物中的抗体增加了免疫细胞的靶向性，提高了免疫细胞定向清除靶细胞的能力。在另一具体实施方案中，抗-Her2/neu抗体为帕妥珠单抗(Pertuzumab)，其可以用于治疗例如乳腺癌。

在一些实施方案中，抗-Her2/neu抗体的抗原结合片段包含Her2/neu抗体的一个或多个CDRs。相关现有技术已经表明抗体的抗原结合片段可以仅包含抗体的VHCDR3，同时仍然保留期望的特异性结合(Barbas et al.,PNAS(1995)92:2529-2533)。还参见，McLaneet al.,PNAS(1995)92:5214-5218,Barbas et al.,J.Am.Chem.Soc.(1994)116:2161-2162。

在具体的实施方案中，用于本申请复合物中的抗体为抗CD20抗体，例如利妥昔单抗(Rituximab)或其片段或衍生物。利妥昔单抗可以用于治疗B淋巴细胞型非霍奇金淋巴瘤。在一具体的实施方案中，用于本申请复合物中的抗体为抗CD33抗体，例如吉妥珠单抗-奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)或其片段或衍生物。吉妥珠单抗可以用于治疗急性髓系白血病。在一具体的实施方案中，用于本申请复合物中的抗体为抗CD52抗体，例如阿仑单抗(Alemtuzumab)或其片段或衍生物。阿仑单抗可以用于治疗慢性淋巴细胞白血病。在具体的实施方案中，用于本申请复合物中的抗体为抗VEGF抗体，例如贝伐单抗(Bevacizumab)或其片段或衍生物。贝伐单抗可以用于治疗恶性胶质瘤、肾癌、结直肠癌和非小细胞肺癌。在具体的实施方案中，用于本申请复合物中的抗体为抗EGFR抗体，例如西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(Panitumumab)等或其片段或衍生物。抗EGFR抗体可以用于结直肠癌，头颈部鳞状细胞癌等的治疗。

可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来制备抗体。可以制备对目标多肽具有特异性的单克隆抗体，例如，使用Kohler and Milstein,Eur.J.Immunol.6:511-519,1976中记载的技术及对其进行改进的方法。还包括利用转基因动物如小鼠表达人抗体的方法。参见例如，Neuberger et al.,Neuberger et al.,Nature Biotechnology14:826,1996；Lonberg et al.,Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101,1994；和Lonberg et al.,Internal Review of Immunology 13:65-93,1995。

还可以通过使用噬菌体展示文库或酵母展示文库产生或鉴定抗体(参见例如第7,244,592号美国专利；Chao et al.,Nature Protocols.1:755-768,2006)。可用文库的非限制性实例包括克隆的或合成的文库，如人组合抗体文库(HuCAL)。还包括用人供体来源的编码轻链可变区的片段、重链CDR-3、编码重链CDR-1中多样性的合成DNA和编码重链CDR-2中多样性的合成DNA来设计的人文库。

细胞-抗体复合物的制备

本文公开的细胞-抗体复合物可以通过本领域人员已知的任何合适的方法制备，例如通过重组技术产生，或者化学方法制备。例如，基因重组技术包括将表达上述抗体的基因通过本领域已知的方法导入免疫细胞中，在细胞中进行基因表达，并使编码的抗体蛋白表达于免疫细胞的表面。化学方法包括化学偶联方法等，例如使细胞与抗体发生结合反应。

在一些实施方案中，制备本文公开的细胞-抗体复合物的方法包括以下步骤：

(1)对抗体进行修饰；以及

(2)使步骤(1)中得到的修饰的抗体和免疫细胞混合，进行反应，从而获得免疫细胞-抗体复合物。

在一些实施方案中，制备本文公开的细胞-抗体复合物的方法还包括在上述步骤(2)之前使免疫细胞与还原剂反应。因此，在一些具体的实施方案中，步骤(2)中的免疫细胞为使用还原剂处理过的细胞。

在具体的实施方案中，分别用试剂处理免疫细胞和抗体，使免疫细胞和抗体分别连接上可相互发生反应的基团，从而能够在细胞表面负载上抗体。

在具体的实施方案中，上述步骤(1)包括用能够使抗体携带上马来酰亚胺基团的试剂处理抗体。在更具体的实施方案中，用SMCC偶联剂处理抗体，SMCC偶联剂的实例例如4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)。在一具体的实施方案中，复合物中的抗体为马来酰亚胺修饰的抗体。

SMCC是一类含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂，可以将分别含有巯基和氨基的化合物键接在一起。NHS活性酯与伯胺在PH 7-9的环境形成酰胺键。马来酰胺与巯基在PH 6.5-7.5的环境下形成稳定的硫醚键。SMCC结构里的环己烷环可以降低马来酰胺的水解速率。这使得蛋白质在用SMCC修饰之后可以冻干存放一段时间。

在具体实施方案中，能够提供马来酰亚胺基团的试剂可以选自4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)、琥珀酰亚胺基3-[溴代乙酰基氨基]丙酯、N-琥珀酰亚胺基碘代乙酯、N-琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯、琥珀酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]丁酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)2-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)4-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)6-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)8-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)12-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)24-马来酰亚胺、琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺丙酰胺基)]己酯、4-琥珀酰亚胺基氧羰基-甲基-α[2-吡啶基二硫]甲苯、N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酯、N-[ε-马来酰亚胺乙酰基氧]硫代琥珀酰亚胺酯、N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯、N-[κ-马来酰亚胺十一酰氧]-硫代琥珀酰亚胺酯、硫代琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯酰胺基]己酯、硫代琥珀酰亚胺基6-[3’-(2-吡啶基二硫)-丙酰胺基]己酯、m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯、硫代琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯、硫代琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧化物、和硫代琥珀酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]丁酯。

在一些实施方案中，步骤(2)中使用的免疫细胞的密度例如为1-5×10⁶/ml。在具体的实施方案中，所用免疫细胞为T淋巴细胞，例如从外周血中分离的T淋巴细胞。

在一些实施方案中，直接将免疫细胞与经修饰的抗体进行接触，就能够形成细胞-抗体复合物。本申请发明人发现，这可能是由于免疫细胞表面天然存在与抗体反应的基团。例如，在一具体的实施方案中，本申请发明人发现，T细胞表面天然存在巯基。

在一些实施方案中，用于预先处理免疫细胞的还原剂可以为例如二硫苏糖醇(DTT)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、β-巯基乙醇、2-巯基乙醇胺(2-MEA)等能够提供巯基的还原剂。

在一些实施方案中，将还原剂直接添加到免疫细胞培养基中，例如，培养基中T细胞的密度例如为1-5×10⁶/ml。

在一些实施方案中，NAC的反应浓度(工作浓度)为1-50mM，优选为10-20mM，例如为20mM。在具体的实施方案中，NAC与免疫细胞的接触时间为0.5-13个小时，优选为1-2小时，例如1个小时。反应的PH偏碱性，例如为6.8-7.8。在优选的实施方案中，PH为7.4。

在一些实施方案中，DTT处理免疫细胞的反应浓度为0.1-5mM，优选为1mM。在具体的实施方案中，DTT与免疫细胞的接触时间大于或等于15分钟，优选为15分钟。反应的PH偏碱性，例如为6.8-7.8。在优选的实施方案中，PH为7.4。

在一些实施方案中，被修饰的抗体的量与免疫细胞(例如还原的免疫细胞)的比例为：大于或等于5μg抗体/10⁶个细胞，在优选的实施方案中，上述比例为50μg抗体/10⁶个细胞。在具体的实施方案中，步骤(1)得到的抗体为马来酰亚胺修饰的抗体，步骤(2)中的免疫细胞表面富含巯基，利用巯基与马来酰亚胺之间的反应，使抗体结合至免疫细胞表面。

在一更具体的实施方案中，T淋巴细胞与抗体反应的示例性条件为：媒介为含1％血清的PBS，PH为7.4，温度为37℃，5％CO₂，反应1小时。

在一些实施方案中，使用流式细胞术来检测免疫细胞表面的偶联抗体。可使用本领域已知的任何合适的方法来实施流式细胞术。流式细胞术可以使用任何合适的抗体和染色剂来实施。优选地，选择的抗体应该能特异地识别被选择的特定生物标志物并与之结合。可将一种或多种抗体与珠(例如磁珠)或者荧光染料结合。例如，流式细胞术可以为荧光激活细胞分选术(FACS)。

利用本申请公开的上述方法，可以获得负载抗体的免疫细胞，这种免疫细胞一方面具有特异靶向性，另一方面还能发挥常规的细胞免疫功能，有利于对靶标的定向清除和精准治疗。

细胞-抗体复合物的医疗用途

本申请还提供了药物组合物，其包含本文公开的细胞-抗体复合物，以及药学上可接受的载体。

细胞-抗体复合物与药学上可接受的载体可按制药领域的常规方法混合而制备所需剂型。在一些实施方案中，细胞-抗体复合物所述药物组合物优选为液体或悬浮液剂型。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体为不减弱免疫细胞活力以及功能、不影响抗体或其抗原结合片段与抗原特异性结合的载体，包括但不限于细胞培养基、缓冲液、生理盐水和平衡盐溶液等。缓冲液的实例包括等渗磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐以及碳酸盐等。在具体的实施方案中，所述药学上可接受的载体为含1％血清的磷酸盐缓冲液。

本文公开的细胞-抗体复合物以及包含其的药物组合物能够用于治疗、改善或预防个体的肿瘤或感染性疾病。

“治疗”既指治疗性处理，也指预防性或防止性的措施，其目的就是预防或减缓(减轻)目标病理状态或病症。需要治疗的个体包括那些已经存在所述病症的个体，还包括那些将发展为该病症的或欲对其病症进行预防的个体。因此，本文中欲被治疗的个体已经被诊断为患有该病症或倾向于或易患该病症。

本文使用的术语“个体”是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。优选地，哺乳动物为非人类的灵长类或者人类。特别优选的哺乳动物是人。

在某些实施方案中，所述肿瘤为原发性癌症或转移性癌症。在具体的实施方案中，肿瘤选自肺癌例如非小细胞肺癌、结直肠癌、膀胱癌、造血系统癌症例如白血病、乳腺癌、胃癌、胃食管结合部腺癌、B淋巴细胞型非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，间变大细胞淋巴瘤、头颈癌例如头颈部鳞状细胞癌、恶性胶质瘤，肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、骨癌、骨巨细胞瘤、胰腺癌、肉瘤、肝癌、皮肤鳞癌、甲状腺癌、宫颈癌、鼻咽癌、子宫内膜癌，或上述肿瘤的转移癌。

在一些实施方案中，肿瘤或肿瘤细胞与以下至少一种蛋白的表达相关：CD20、HER2、EGFR、CD33、CD52、VEGF、CTLA-4、CD30、RANKL、HER2、VEGF-R2、Her3、A33抗原、CD5、CD19、CD22、CD23(IgE受体)、CA242抗原、5T4、VEGFR-1、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、NPC-1C、波形蛋白、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、癌胚抗原(CEA)、整合素α_vβ₃、整合素α₅β₁、成纤维细胞活化蛋白、FAP-α、TAG-72、MUC1、MUC16、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、EGP40泛癌抗原、糖蛋白EpCAM、程序性死亡-1、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、Lewis-Y抗原、GD2、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)和间皮素。在具体实施方案中，细胞-抗体复合物中的单克隆抗体部分特异性结合一种或多种前述癌症相关的抗原或癌症抗原。

某些实施方案涉及与Her2/neu表达相关的癌症治疗。例如，本发明的一个实施方案提供了通过将治疗有效量的本文公开的复合物给予个体来治疗、抑制或预防癌症的方法，所述癌症包括但不限于表达Her2/neu的结肠癌和转移性结肠癌。给予后，以统计上显著的方式(即相对于如本领域技术人员已知的适当对照)抑制、预防或延缓癌症的进展和/或转移的量被认为是有效的。

本文中所用的“治疗有效量”可以根据具体情况而定，本领域普通技术人员根据实际所需药量可以很容易地掌握，如可根据患者体重、年龄和病症情况来确定。

本申请提供了通过给予个体治疗有效量的本文公开的复合物或包含其的药物组合物来治疗、改善或预防个体的肿瘤或感染性疾病的方法。

在一些实施方案中，本文公开的复合物中的抗体能够特异性结合肿瘤细胞表面抗原，可以赋予免疫细胞特异性靶向作用，从而实现免疫细胞的定向清除肿瘤细胞的能力。因此本文公开的治疗方法有望实现肿瘤的精准治疗，为改善肿瘤患者的健康提供新的治疗方案。

在一些实施方案中，上述感染性疾病为病毒感染。在具体的实施方案中，病毒感染可以包括以下的一种或多种：肝炎病毒感染、疱疹病毒感染例如EB病毒感染、人乳头瘤病毒感染、人类嗜T淋巴细胞病毒1型感染、巨细胞病毒感染和人类免疫缺陷病毒感染。

在具体的实施方案中，本文公开的复合物中的抗体能够特异性结合病毒细胞表面的抗原，从而使复合物中的免疫细胞特异性靶向病毒，促进了免疫细胞定向清除病毒的能力。

本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。

应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。尽管本文中使用了特殊的术语和值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本申请的范围。除非特别指明，本说明书中的实验方法和技术为本领域常规的方法和技术。

上述公开内容总体上描述了本申请，通过下面的实施例进一步示例本申请。描述这些实施例仅为说明本申请，而不是限制本申请的范围。

实施例

实施例1：修饰抗体的制备

将0.1mol/L Na₂HPO₄.12H₂0、0.15mol/L NaCl和0.01mol/L EDTA酸溶于去离子水中得到缓冲液A(BufferA)，PH值为7.2。将1mg sulfo-SMCC(购自Sigma，货号为M6035)溶于500μl DMSO中备用。通过如下步骤制备三种修饰的抗体(即Herceptin-SMCC，美罗华-SMCC，西妥昔-SMCC)：

1、取2.5mg曲妥珠单抗((购自Roche公司，抗Her 2的单克隆抗体)或者2.5mg利妥昔单抗((购自Roche公司)，抗CD20的单克隆抗体)或者2.5mg西妥昔单抗(购自默克公司，抗EGFR抗体)溶于2.5ml缓冲液A中，使其浓度为1mg/ml。

2、加入25μlsulfo-SMCC轻轻混匀。

3、室温孵育1h。

4、用PD-10脱盐柱去除游离的sulfo-SMCC(2.5ml样品上样，弃去流出液；3.5mlBuffer A洗脱，收集洗脱液3.5ml)。

5、获得3.5ml溶液，利用30KD浓缩管浓缩到625μl(总抗体浓度4mg/ml)体积，立即使用，或-80℃下分管冻存。

实施例2：T细胞的收集以及流式检测

首先通过下述步骤从外周血中分离T细胞并对其进行培养：

1、无菌条件下抽取志愿者50ml外周血。

2、3000rpm，离心10min。

3、小心吸取上层血浆，56℃处理30min，1000rpm离心10min，将上清转移到新的50ml无菌离心管备用；剩余外周血用生理盐水稀释至70ml。

4、取2支无菌50ml离心管，每支加入15ml外周血淋巴分离液，缓慢地在上层铺上35ml外周血，1800rpm，离心10min。

5、小心的吸取白膜层细胞，生理盐水洗涤1次。

6、加入5倍体积的红细胞裂解液室温处理3-5min，加入适量生理盐水稀释，1800rpm，离心10min。

7、使用TAKARA GT-T551无血清培养基，重悬细胞，调整细胞密度为1-2×10⁶个/ml，并添加5％自体血浆，IL-2 1000IU/ml，CD3抗体500ng/ml，CD28抗体1000ng/ml，37℃，5％CO₂培养。

8、3天后，添加含5％自体血浆，IL-2 1000IU/ml的TAKARA GT-T551无血清培养基，根据细胞生长密度，适量添加，保证每次细胞传代后密度为1×10⁶个/ml。

9、培养14天，利用流式细胞术对T细胞进行分析(使用流式抗体CD3、CD4、CD8、CD56)，收获成熟的T细胞，用于下一步实验。

10、对于培养14天的部分T细胞，使用10％DMSO+90％FBS按5×10⁶个/ml的密度冻存，供下次复苏使用。

T细胞流式检测的步骤如下。

1、离心1500rpm，5min，离心收集培养14天的T细胞，将其重悬于PBS中，细胞密度1×10⁷个/ml。

2、取2份各100μl重悬的T细胞，一份加入CD56同型对照，一份加入CD3-PC5.5\CD4-PE\CD8-FITC\CD56-APC，冰上避光孵育30min。

3、离心4000rpm，3min，PBS洗涤2次，进行流式细胞术检测。本申请所用流式细胞仪购自贝克曼库尔特有限公司，型号为CytoFLEX。

图1显示了T细胞表型分析的结果。下表1显示了T细胞流式分析结果，结果显示74.59％的T细胞为CD3+CD8+细胞。

表1：T细胞流式分析

实施例3：还原的免疫细胞的制备

收集通过实施例2获得的培养14天的T细胞，用还原剂进行处理，具体步骤如下。

1、用二硫苏糖醇(DTT)处理T细胞

(1)使用PBS将DTT配成1M浓度的母液，过滤除菌，-20℃冻存。

(2)将DTT直接添加到含T细胞的TAKARA GT-T551无血清培养基中(T细胞密度为1-5×10⁶个/ml)，DTT工作浓度为1mM，37℃，5％CO₂，处理15min。

(3)使用含1％血清的PBS洗涤1次，将T细胞重悬于含1％血清的PBS中，T细胞密度为4×10⁶个/ml。

2、用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)处理T细胞

(1)使用TAKARA GT-T551无血清培养基将NAC配制成1M母液：将NAC添加到TAKARAGT-T551无血清培养基(含IL-2 1000IU/ml)中，PH＝7.4，NAC工作浓度为10-20mM，过滤除菌，-20℃冻存备用。

(2)使用步骤(1)中的培养基将细胞密度调整为4×10⁶个/ml，37℃，5％CO₂，处理1h-13h。

(3)使用含1％血清的PBS洗涤1次，将T细胞重悬于含1％血清的PBS中，所得T细胞密度为4×10⁶个/ml。

实施例4：T细胞表面巯基(-SH)的检测

进行T细胞表面巯基(-SH)检测的操作方法如下：

1、1500rpm下离心5min收集T细胞，将细胞重悬于PBS中，细胞密度为1×10⁷个/ml。

2、取100ul重悬的T细胞，加入iFluor^TM Dye染料(AAT Bioquest公司)，37℃下反应1h。

3、1500rpm下离心5min，PBS洗涤2次，利用流式细胞术检测T细胞表面巯基(-SH)。

在该实施例中，分别在1×10⁶个T细胞中加入0ng、1000ng、50000ng iFluor Dye染料进行流式检测。

图2显示了T细胞表面巯基(-SH)检测的结果。A.只含T细胞，不添加iFluor Dye染料；B.向T细胞添加1000ng iFluor Dye染料；C.向T细胞添加50μg iFluor染料；D.A、B和C直方图叠加。

图2的结果显示，T细胞表面存在巯基(-SH)，随着加入的iFluor Dye染料增加，T细胞表面iFluor Dye染料越多。

实施例5：将修饰的抗体Herceptin-SMCC与还原的免疫细胞进行偶联

将实施例1制备的Herceptin-SMCC与实施例3中制备的还原的T细胞在37℃、5％CO₂的条件下反应1小时，PH＝7.4，其中将50μg Herceptin-SMCC与1×10⁶个T细胞进行偶联，得到免疫细胞-抗体复合物。使用的Herceptin-SMCC的浓度大于或等于4mg/ml，T细胞密度为4×10⁶个/ml。

实施例6：T细胞表面偶联抗体Herceptin的检测

检测T细胞表面偶联抗体Herceptin的步骤如下：

1、将实施例5制备的T细胞-Herceptin复合物使用PBS洗涤2次，然后用PBS重悬，细胞密度为1×10⁶个/100μl。

2、加入流式抗体抗人Ig G-PE(1mg/ml)1μl。

3、冰上孵育20-60min，PBS洗涤1次，将细胞重悬于PBS中，进行流式检测。

实施例7：T细胞表面最大负载抗体量的检测

本实施例用于确定T细胞表面的最大抗体负载量，具体通过如下操作步骤来进行：

1、使用PBS将DTT配成1M浓度的母液，过滤除菌，-20℃冻存。

2、将DTT直接添加到含T细胞的培养基中(T细胞密度为1-5×10⁶个/ml)，DTT工作浓度1mM，37℃，5％CO₂，处理15min。

3、使用含1％血清的PBS洗涤1次，用含1％血清的PBS重悬T细胞，T细胞密度为4×10⁶个/ml。

4、向2×10⁶个T细胞分别加入0ng、100ng、1000ng、10000ng、100000ng、200000ngHERCEPTIN-SMCC，37℃，5％CO₂，反应1h。

5、PBS洗涤两次，向1×10⁶个T细胞中加入1μg抗IgG-PE抗体(Abcam，ab7005)，避光，冰上孵育30min。

6、4000rpm下离心3min，PBS洗涤1次，将细胞重悬于100μl PBS中，进行流式检测。

图3显示了还原剂处理后T细胞表面最大抗体负载量检测的结果，图A-F为使用不同抗体量时的流式直方图，图G为抗体量分别为1000ng、10000ng、100000ng、200000ng条件下的叠加图。

结果显示，当细胞数量一定的情况下，随着HERCEPTIN量的增加，T细胞表面偶联的抗体量也随之增加；但随着抗体加入量的进一步增加，T细胞表面偶联的抗体量不再增加，甚至有所下降。数据显示，当1×10⁶个T细胞对应50μg抗体HERCEPTIN时，偶联抗体量达到最大。也就是说，1×10⁶个T细胞与50μg抗体HERCEPTIN反应可实现最佳偶联量。

实施例8：T细胞偶联修饰的抗体美罗华-SMCC的流式检测

检测T细胞表面偶联实施例1制备的抗体美罗华-SMCC的步骤如下：

1、使用PBS将DTT配成1M浓度的母液，过滤除菌，-20℃冻存。

2、将DTT直接添加到含T细胞的培养基中(T细胞密度为1-5×10⁶个/ml)，DTT工作浓度1mM，37℃，5％CO₂，处理15min。

3、使用含1％血清的PBS洗涤1次，用含1％血清的PBS重悬T细胞，T细胞密度为4×10⁶个/ml。

4、向2×10⁶个T细胞分别加入100μg美罗华-SMCC，37℃，5％CO₂，反应1h。

5、PBS洗涤两次，向1×10⁶个T细胞中加入1μg抗IgG-PE抗体(Abcam，ab7005)，避光，冰上孵育30min。

6、4000rpm下离心3min，PBS洗涤1次，将细胞重悬于100μl PBS中，进行流式检测。

图4A显示经过马来酰亚胺修饰过的CD20抗体成功地偶联在用DTT处理的T细胞表面。

实施例9：T细胞偶联修饰的抗体西妥昔-SMCC的流式检测

检测T细胞表面偶联实施例1制备的抗体西妥昔-SMCC的步骤如下：

1、使用PBS将DTT配成1M浓度的母液，过滤除菌，-20℃冻存。

2、将DTT直接添加到含T细胞的培养基中(T细胞密度为1-5×10⁶个/ml)，DTT工作浓度1mM，37℃，5％CO₂，处理15min。

3、使用含1％血清的PBS洗涤1次，用含1％血清的PBS重悬T细胞，T细胞密度为4×10⁶个/ml。

4、向2×10⁶个T细胞分别加入100μg西妥昔-SMCC，37℃，5％CO₂，反应1h。

5、PBS洗涤两次，向1×10⁶个T细胞加入1μg抗IgG-PE抗体(Abcam，ab7005)，避光，冰上孵育30min。

6、4000rpm下离心3min，PBS洗涤1次，将细胞重悬于100μl PBS中，进行流式检测。

图4B显示经过马来酰亚胺修饰过的EGFR抗体成功地偶联在用DTT处理的T细胞表面。

实施例10：NK细胞偶联修饰的抗体美罗华-SMCC的流式检测

NK92细胞购买自ATCC，通过以下步骤进行NK细胞表面偶联实施例1制备的抗体美罗华-SMCC的检测:

1、使用PBS将DTT配成1M浓度的母液，过滤除菌，-20℃冻存。

2、将NK92细胞分成两份，一份不使用DTT处理，一份将DTT直接添加到含NK92细胞的培养基中(NK92细胞密度为1-5×10⁶个/ml)，DTT工作浓度1mM，37℃，5％CO₂，处理15min。

3、使用含1％血清的PBS洗涤1次，用含1％血清的PBS重悬NK92细胞(DTT处理的和未用DTT处理的)，NK92细胞密度为4×10⁶个/ml。

4、向2×10⁶个NK92细胞(DTT处理和未用DTT处理)分别加入100μg美罗华-SMCC，37℃，5％CO₂，反应1h。

5、离心，PBS洗涤两次，向1×10⁶个NK92细胞加入1μg抗IgG-PE抗体(Abcam，ab7005)，避光，冰上孵育30min。

6、4000rpm下离心3min，PBS洗涤1次，将细胞重悬于100μl PBS中，进行流式检测。

结果如图5所示，使用DTT处理过的NK92细胞成功地与美罗华-SMCC发生偶联(图5B)；而未用DTT处理过的NK92细胞不能与美罗华-SMCC发生偶联(图5A)。

实施例11：NAC最佳反应浓度的确定

为了确定NAC处理T细胞的最佳浓度，进行下述操作：

1、1500rpm下离心5min，收集培养14天的T细胞。

2、分别配制含N-乙酰半胱氨酸(NAC)0mM、10mM、20mM浓度的TAKARA GT-T551无血清培养基，调整PH＝7.4。

3、分别用含不同浓度的NAC在37℃，5％CO₂下处理T细胞2h，细胞密度为2×10⁶个/ml。

4、1500rpm下离心5min，用PBS重悬T细胞，密度为4×10⁶个/ml。

5、向1×10⁶个T细胞中加入50μg修饰的抗体HERCEPTIN-SMCC(4mg/ml)，在37℃，5％CO₂下反应1h。

6、PBS洗涤两次，向1×10⁶个T细胞中加入1μg抗人IgG–PE抗体(Abcam，ab7005)，避光，冰上孵育30min。

7、4000rpm下离心3min，PBS洗涤一次，将细胞重悬于100μl PBS中，进行流式检测。

图6显示了用不同浓度的NAC处理T细胞后，T细胞偶联HERCEPTIN抗体的结果。

结果表明，与对照相比，NAC处理T细胞后，可以增强T细胞与HERCEPTIN的偶联；随NAC浓度的增加，偶联的抗体越多，最适NAC浓度为20mM。当NAC浓度为20mM，反应2h，与DTT浓度为1mM，反应15min吸附的抗体量相当。

实施例12：杀伤肿瘤细胞的体外实验

A.测定T细胞杀伤活性的实验方法

测定T细胞杀伤肿瘤活性的实验方法包括如下步骤：

1、将肿瘤细胞用TAKARA GT-T551(含1％血清)重悬，以1×10⁵个/ml的密度接种于96孔板中，每孔100μl。

2、将效应细胞(T细胞或T细胞-HERCEPTIN)用TAKARA GT-T551(含1％血清)重悬，密度为1×10⁶个/ml。

3、按下表2中的组合方案，将效应细胞与靶细胞以10:1的比例混合，每组3个重复，在37℃，5％CO₂条件下处理4h，2000rpm下离心5min，收集上清，使用乳酸脱氢酶检测试剂盒(购自碧云天生物技术公司)检测杀伤效率，或者对于含荧光素酶(Luciferase)标记的肿瘤细胞系，直接添加相应底物D(-)-Luciferin，使用小动物活体成像仪(Amix)进行检测，计算杀伤效率。

表2体外杀伤效应细胞与靶细胞组合方案

B.所用的肿瘤细胞系以及肿瘤细胞表面HER2的检测

本申请实施例中使用的示例性细胞系(购自ATCC)包括人肺癌细胞系A549、人结肠癌细胞系colo205、人白血病细胞系K562以及人膀胱癌细胞系5637等，其中5637带荧光细胞系通过本实验室改造赋予5637荧光基因Luciferase)。

检测肿瘤细胞表面HER2的方法如下：

1、收集肿瘤细胞，PBS洗涤2次，细胞密度为1×10⁷个/ml，取100μl。

2、加入1μg抗体HERCEPTIN(购自Roche公司)，冰上孵育30min。

3、4000rpm下离心3min，PBS洗涤2次，加入1μg二抗即抗人IgG FITC(康为世纪生物科技公司，CW0242S)，避光，冰上孵育30min。

4、4000rpm下离心3min，PBS洗涤2次，将肿瘤细胞用100μl PBS重悬，进行流式检测。

以上四种肿瘤细胞表面HER2的检测结果分别显示在图7-10中。从图7-10中可以看出，四种肿瘤细胞表面均表达HER2，其中5637细胞、A549细胞和colo205细胞属于中等表达量，而K562细胞低量表达HER2。C.T细胞-抗体复合物对肿瘤细胞的杀伤效应

按照实施例9A中的方法检测了T细胞对人肺癌细胞系A549、人结肠癌细胞系colo205、人白血病细胞系K562以及人膀胱癌细胞系5637的杀伤作用。结果分别显示于图11-15中。

结果显示，相比于单独的T细胞或预先仅与HERCEPTINT混合反应的T细胞相比，预先与HERCEPTIN-SMCC(带马来酰亚胺基团抗体)混合反应的T细胞的肿瘤杀伤活性显著增强，这表明马来酰亚胺基团促进了HERCEPTIN抗体与T细胞的结合，而HERCEPTIN抗体负载于T细胞后，能够显著促进T细胞的细胞免疫功能。而且，相比于未用还原剂处理的T细胞，用还原剂处理的T细胞与HERCEPTIN-SMCC混合反应后，其肿瘤杀伤活性显著提高，这表明用还原剂处理后，由于T细胞偶联HERCEPTIN抗体的量增加，进一步促进了其肿瘤杀伤活性。此外，发明人发现，单独的HERCEPTIN-SMCC对肿瘤细胞没有显著的杀伤作用(数据未显示)。

表3显示了负载抗体的T细胞对肿瘤细胞杀伤率与“裸露”T细胞对肿瘤细胞杀伤率的比值。

表3

肿瘤名称	杀伤率比值
		A549	3.53倍
colo205	39.67倍
		K562	1.63倍
5637	3.75倍

此外，从图15的荧光图像还可以看出，在偶联有抗体的T细胞组中，存活的5637细胞明显少于对照组，这也证实了负载抗体的T细胞的肿瘤杀伤活性显著增强。

本申请发明人还检测了负载抗体(HERCEPTIN-SMCC)的NK细胞的肿瘤细胞杀伤活性，结果表明负载抗体的NK细胞的肿瘤杀伤作用也进一步增强(数据未显示)。

实施例13：偶联CD20抗体的T细胞体外杀伤Daudi细胞的活性检测

本实施例中使用Daudi细胞作为靶细胞，96孔板每孔铺10000个Daudi细胞；将T细胞和偶联CD20抗体的T细胞作为效应细胞，每孔200000个效应细胞；然后将效应细胞与靶细胞混合，在37℃，5％CO2条件下进行体外杀伤4小时。反应结束后，使用LDH试剂盒检测杀伤效率。

体外杀伤结果显示，使用NAC处理过的T细胞偶联上抗CD20抗体后，显著提高了对Daudi细胞的体外杀伤率(图16)。

本说明书中引用的所有出版物和专利文献引入本文作为参考，如同每个出版物或专利被分别明确指明引入本文作为参考。尽管本申请以上述具体形式描述了所涉及的发明，但这些发明并不局限于这些具体形式描述的特定内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请所描述的发明精神的前提下，还可对其中所涉及的发明包含的技术特征进行各种等同变化，这些变化都应该属于所涉及的发明的范围之内。

Claims (10)

1.细胞-抗体复合物，其包含免疫细胞，以及位于所述免疫细胞表面的抗体或其抗原结合片段，优选地，所述抗体是用能够提供马来酰亚胺基团的试剂修饰的抗体。

2.如权利要求1所述的细胞-抗体复合物，其中所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞和CIK细胞，优选为T淋巴细胞，更优选为CD8+T淋巴细胞。

3.如权利要求1所述的细胞-抗体复合物，其中所述免疫细胞为使用还原剂处理过的细胞，优选地，所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、β-巯基乙醇和2-巯基乙醇胺(2-MEA)。

4.如权利要求1-3任一项所述的细胞-抗体复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合至疾病或病症相关抗原，优选地，所述疾病或病症相关抗原为肿瘤相关抗原，更优选为肿瘤细胞表面抗原；或者所述疾病或病症相关抗原为病原体特异性细胞表面抗原。

5.制备权利要求1-4任一项所述的细胞-抗体复合物的方法，其包括以下步骤：

(1)对抗体进行修饰；和

(2)使步骤(1)中得到的修饰的抗体和免疫细胞接触，得到免疫细胞-抗体复合物。

6.如权利要求5所述的方法，其还包括在步骤(2)之前使免疫细胞与还原剂进行反应；优选地，所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、β-巯基乙醇和2-巯基乙醇胺(2-MEA)。

7.如权利要求5所述的方法，其中步骤(1)包括用能够提供马来酰亚胺基团的试剂处理抗体，所述试剂选自4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)、琥珀酰亚胺基3-[溴代乙酰基氨基]丙酯、N-琥珀酰亚胺基碘代乙酯、N-琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯、琥珀酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]丁酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)2-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)4-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)6-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)8-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)12-马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)24-马来酰亚胺、琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺丙酰胺基)]己酯、4-琥珀酰亚胺基氧羰基-甲基-α[2-吡啶基二硫]甲苯、N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酯、N-[ε-马来酰亚胺乙酰基氧]硫代琥珀酰亚胺酯、N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯、N-[κ-马来酰亚胺十一酰氧]-硫代琥珀酰亚胺酯、硫代琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯酰胺基]己酯、硫代琥珀酰亚胺基6-[3’-(2-吡啶基二硫)-丙酰胺基]己酯、m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯、硫代琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯、硫代琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧化物和硫代琥珀酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]丁酯。

8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述修饰的抗体量与所述免疫细胞的比例为：大于或等于5μg抗体/10⁶个细胞，优选为50μg抗体/10⁶个细胞。

9.药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的细胞-抗体复合物，以及药学上可接受的载体。

10.权利要求1-4中任一项所述的细胞-抗体复合物或权利要求9所述的药物组合物在制备用于治疗、改善或预防个体的肿瘤或感染性疾病的药物中的用途，优选地，所述肿瘤为原发性肿瘤或转移性肿瘤，更优选地，所述肿瘤选自肺癌例如非小细胞肺癌、结直肠癌、膀胱癌、造血系统癌症例如白血病、乳腺癌、胃癌、胃食管结合部腺癌、B淋巴细胞型非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，间变大细胞淋巴瘤、头颈癌例如头颈部鳞状细胞癌、恶性胶质瘤，肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、骨癌、骨巨细胞瘤、胰腺癌、肉瘤、肝癌、皮肤鳞癌、甲状腺癌、宫颈癌、鼻咽癌、子宫内膜癌，或上述肿瘤的转移癌；优选地，所述感染性疾病为病毒感染，更优选地，所述病毒感染选自肝炎病毒感染、疱疹病毒感染例如EB病毒感染、人乳头瘤病毒感染、人类嗜T淋巴细胞病毒1型感染、巨细胞病毒感染和人类免疫缺陷病毒感染。