CN112386688B - 一种用于病毒治疗的含有免疫细胞的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于病毒治疗的含有免疫细胞的药物组合物。该免疫细胞组合物中包含特异性针对水痘‑带状疱疹病毒包膜糖蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有较好的结合特性以及抑制病毒的效果，同时通过与免疫细胞一起在小鼠模型中实验发现，可以有效的提高对小鼠皮肤的病毒感染的治疗作用，具有较好的应用价值和应用前景。

Description

一种用于病毒治疗的含有免疫细胞的药物组合物
技术领域
本发明涉及生物领域，更具体的涉及一种用于病毒治疗的含有免疫细胞的药物组合物。
背景技术
带状疱疹(HZ)是长期潜伏在脊髓神经后根神经节或颅神经感觉神经节的水痘－带状疱疹病毒(VZV)，经再激活生长繁殖后，沿神经纤维移至皮肤而引起的急性感染性皮肤炎症，常常表现在感觉神经相应节段引起疱疹，并伴严重神经痛。一般说来，好发部位有4个区域:肋间神经、颈神经、三叉神经和腰骶神经支配区域，患处起初常出现潮红斑，随后变成呈簇状分布而不融合的粟粒至黄豆大小的丘疹，最后成为簇集成群的水疱，疱壁紧张发亮，疱液澄清，外周绕以红晕，各簇水疱群间皮肤正常，皮损多沿一侧周围神经呈带状排列。病程一般2～3周，水疱干涸、结痂脱落后留有暂时性的淡红斑或色素沉着。
研究发现，维持细胞免疫功能正常的重要因素之一是Th1/Th2的平衡，而HZ患者的Th1/Th2细胞因子水平恰恰失去平衡，其主要表现为:与正常人相比，代表Th1型的白细胞介素－2(IL－2)和肿瘤坏死因子α(TNF－α)水平明显降低，相应的细胞免疫功能减弱，而代表Th2型的IL－4水平明显增高。Th1细胞免疫功能减弱意味着机体内对疱疹病毒具有抑制作用的特异性细胞的免疫功能减弱，而HZ患者体内白细胞介素－4(IL－4)升高，Th2类细胞功能增强，其抑制IL－2和TNF－α生物活性的作用也增强;高水平的IL－4免疫状态可能会导致机体活化淋巴细胞和NK细胞的功能降低，使其溶解被病毒感染细胞的能力降低。也就是说，感染VZV患者体内细胞的Th1/Th2的平衡被破坏后，身体特异性免疫功能下降，VZV在患者体内的更容易存活并大量繁殖，进而破坏身体更多的免疫机制，触发身体患处神经病变。
带状疱疹急性期治疗药物包括抗病毒药物、非抗病毒药物等西药，以及中药方剂和中成药等。常用的抗病毒药物泛昔洛韦、喷昔洛韦等，为核苷类抗疱疹病毒药物，均可用于带状疱疹的急性期治疗。抗病毒药物阿昔洛韦又称无环鸟苷，为合成的嘌呤核苷类似物，主要通过干扰病毒脱氧核糖核酸(DNA) 合成起到抗病毒的作用，为治疗带状疱疹的首选药物，常用剂型有口服、外用两种，但一般口服生物利用度低，需要大剂量及多次口服才能达到治疗效果。伐昔洛韦为阿昔洛韦的前体药物，吸收好，转化快，生物利用度比阿昔洛韦高3-4 倍，但夏永江等对比伐昔洛韦与阿昔洛韦治疗带状疱疹的临床疗效，结果显示，伐昔洛韦治疗带状疱疹的临床总有效率与阿昔洛韦差异无统计学意义。干扰素(IFN) 为广谱抗病毒药物，分为α-( 白细胞) 型、β-( 成纤维细胞) 型和γ-( 淋巴细胞) 型。IFN 能够抑制病毒转录、复制和释放，并能增加自然杀伤淋巴细胞毒素的活性。乌日勒等将IFN 与伐昔洛韦联合应用于带状疱疹，结果显示，联合用药组有效率为97.78%，明显高于单用伐昔洛韦组，且止痛、止疱和结痂时间以及PHN 的发生率等均较单用伐昔洛韦组低。
临床上治疗带状疱疹的中成药主要作用为凉血解毒、去湿热、活血化瘀和行气止痛等。安郁菊临床应用复方板蓝根颗粒、丹参注射液和黄芪注射液联合阿昔洛韦滴眼液治疗带状疱疹，结果显示，中成药联合阿昔洛韦滴眼液能迅速止痛、止疱，有利于神经恢复、减少PHN的发生。龙胆泻肝丸与同仁牛黄清心丸同服治疗带状疱疹，结果治疗30d后总有效率达93.3%。苏文桂应用清开灵注射液联合中药外洗治疗带状疱疹，结果表明，清开灵注射液含有的牛黄、水牛角、黄芩、金银花和山栀子等成分具有清热泻火、清热解毒等作用，能提高带状疱疹的治愈率、缩短痊愈时间、控制后遗症的发生率。此外，还有双黄连、穿琥宁和喜炎平注射液等中成药用于带状疱疹治疗的报道，均有较好的治疗效果。
近年来，抗体药物用于病毒的治疗变得尤为火热。但是，针对带状疱疹病毒的单克隆抗体的研究还不多。2018年中国科学院武汉病毒研究所在筛选针对单纯疱疹病毒中和抗体的研究中取得重要进展，该团队成功筛选到一株新的单克隆抗体m27f，发现其识别包膜糖蛋白中一段新的连续抗原表位，具有较高的中和抗体活性。但是没有进一步的带状疱疹病毒相关抗体的研究。
CIK细胞是外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子诱导培养产生的一类细胞群，培养简易，扩增迅速，是具有高细胞毒性的杀伤细胞，其抗病毒活性显著。CIK细胞疗法是过继性免疫疗法之一，在多种细胞因子IL-2，IL-1、IFN-r，抗CD3单克隆抗体等诱导下将从外周血，骨髓或脐血中分离出的淋巴细胞群，经过一定时间的培养而获得的一种具有NK细胞作用的活性免疫细胞，能识别多种病毒感染的细胞，通过与靶细胞直接接触、杀伤或分泌IFN-r、TNF-a，IL-6等多种抗病毒的细胞因子，抑制杀伤肿瘤细胞和病毒的复制，有效调节机体的免疫功能，提高患者机体抗肿瘤抗病毒能力。但是现有技术中采用免疫细胞治疗疱疹病毒还不多，有待进一步的开发。
发明内容
本发明一方面克服现有技术的缺陷，提供了一种采用免疫细胞以及特异性针对水痘-带状疱疹病毒包膜糖蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有较好的结合特性以及抑制病毒的效果。
本发明一方面，提供一种制备的CIK细胞，所述CIK细胞是采用本领域常规的方法制备获得。也可以采用实施例1的方法制备获得的CIK细胞的方法。
另外一方面，CIK细胞采用如下方法制备：取正常外周血加入生理盐水1：1，稀释后用吸管将血液混合物沿管壁缓慢地加入Ficoll淋巴细胞分离液之上，于800g、4℃，离心20min；用吸管小心吸取第二层白色云雾状的单个核细胞层于离心管内，加入生理盐水于400g、4℃、离心10min洗涤3次后调整细胞浓度1.0×106/mL；接种于提前包被好CD3单抗的T175培养瓶，加入含有10%胎牛血清的BPMI-1640 培养基，其中添加50μg/L的IL-2、50μg/L的 IFN-γ以及25μg/L IL-22放置于37℃，5%的CO2细胞培养箱中诱导培养，隔天半量替换所述培养基，培养10d收获所述细胞即为CIK细胞。
本发明另外一个方面，提供一种特异性针对水痘-带状疱疹病毒包膜糖蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有较好的结合特性以及抑制病毒的效果。具体的，所述单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，所述单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ IDNO：2所示。
本发明的另外一个方面，其中所述单克隆抗体是抗体片段。
优选的，其中所述抗体片段选自scFv片段、Fab片段、F(ab’)2片段和Fab’片段。
更进一步的，本发明所述的单克隆抗体可以人源化。
进一步的，本发明还提供一种如上述抗水痘-带状疱疹病毒单克隆抗体的编码基因。
进一步的，抗水痘-带状疱疹病毒单克隆抗体编码基因的表达载体。
更进一步的，本发明提供了水痘-带状疱疹病毒抗体在制备抗水痘-带状疱疹病毒的药物中的应用。
本发明的更进一步的，提供CIK细胞与水痘-带状疱疹病毒抗体一起制备的药物组合物。
所述药物组合物进一步的还含有药学上可接受的载体。
所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂。
本发明最后一个方面，提供CIK细胞与水痘-带状疱疹病毒抗体在制备抗水痘-带状疱疹病毒的药物中的用途。
有益效果
本发明开发了特异性针对水痘-带状疱疹病毒包膜糖蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有较好的结合特性以及抑制病毒的效果，同时通过与CIK细胞一起在小鼠模型中实验发现，可以有效的提高对小鼠皮肤的病毒感染的治疗作用，具有较好的应用价值和应用前景。
附图说明
图1 Western-blot 结果图，泳道1-6分别是单抗与VZV-pOKA病毒株、BTV-8、CHUV、EHDV-1、乙型流感病毒Malaysia 2506/04的结合反应结果。
图2 单克隆抗体检测的ELISA 结果图。
具体实施方式
本发明公开了单抗和免疫细胞在制备预防和/或治疗人疱疹病毒感染药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1 CIK细胞的制备
取正常外周血100mL加入生理盐水1：1，稀释后用吸管将血液混合物沿管壁缓慢地加入Ficoll淋巴细胞分离液之上，于800g、4℃，离心20min。用吸管小心吸取第二层白色云雾状的单个核细胞层于离心管内，加入生理盐水于400g、4℃、离心10min洗涤3次后调整细胞浓度1.0×106/mL。接种于提前包被好CD3单抗的T175培养瓶，加入含有10%胎牛血清的BPMI-1640 培养基，其中添加50μg/L的IL-2、50μg/L的 IFN-γ以及25μg/L IL-22放置于37℃，5%的CO2细胞培养箱中诱导培养。隔天半量替换所述培养基。分别取诱导前的单个核细胞和诱导培养至第10天CIK 细胞1×106，离心去上清，用600μL PBS 重悬，计数。结果显示，悬浮的单个核细胞均匀分布于培养瓶中，边缘规则成圆形。在细胞因子的诱导下，细胞成集落生长，细胞数见表1。
表1 CIK 细胞体外增殖情况
Figure 737896DEST_PATH_IMAGE002
由表1可见，通过三种因子诱导的CIK细胞能够较快的增殖。
将增殖10d的细胞以及原始分离的在每只流式管内加入100μL 细胞悬液分别标记带荧光的单克隆抗体（CD3-FITC）+（IgG1-PE）、（CD8-PE）+（IgG1-FITC）、（CD56-PE）+（IgG1-FITC）、（CD3-FITC）+（CD56-PE）、（CD3-FITC）+（CD8-PE）、（IgG1-FITC）+（IgG1-PE）为阴性对照，室温避光20min 后PBS 离心洗涤，每管加入200μLPBS 重悬，上机检测。得到CIK细胞的表型分析结果，如表2所示。
表2 CIK 细胞的表型分析（x±s）
组别 CD3 ⁺ CD8 ⁺ CD56 ⁺ CD3 ⁺ +CD8 ⁺ CD3 ⁺ +CD56 ⁺
PBMC细胞 67.01±3.17 43.52±4.53 21.86±2.87 32.11±0.97 9.01±1.27
CIK细胞 98.09±2.97 76.53±3.12 25.37±3.01 90.31±1.94 25.30±1.83*
从表2 中可以看出，诱导培养10天后的CIK主要效应细胞CD3⁺+CD56⁺双阳性细胞比例与未经诱导的PBMC 细胞大幅上升（P＜0.05）。
实施例2 靶向水痘-带状疱疹病毒包膜糖蛋白的单克隆抗体的制备
水痘-带状疱疹病毒包膜糖蛋白高抗原表位肽的免疫
根据水痘-带状疱疹病毒包膜糖蛋白序列，通过疏水指数、结构域，并通过多株B病毒序列比对查找保守区间获得了高抗原表位肽，其序列为vaatlylghfatsvifttyfcgrgkldetn。将所多肽委托上海生工进行合成。分别取2 mg 多肽干粉溶于500μl 2-( N-吗啉) 乙磺酸一水合物( MES) 缓冲液、2 mg BSA 溶于200 μl MES缓冲液以及10 mg EDC溶于1 ml ddH2O，先将500 μl 的多肽溶液与200 μl的BSA 溶液混合，再加入100 μl EDC 溶液，室温混匀2 h 后至PBS 透析，－20℃保存备用。将所述融合
多肽与等体积弗氏完全佐剂混合，颈背部多点注射方式免疫6只7周龄的BALB/c雌鼠（抗原量100ug/只），之后第14天和第28天以相同方法及剂量（用弗氏不完全佐剂替代弗氏完全佐剂）分别进行第2次和第3次免疫。第3次免疫后第10天，选择抗体水平最高的小鼠，腹腔注射方式进行1次加强免疫（抗原量100ug/只），4 d 后取脾细胞进行细胞融合。
取1×108个脾细胞与（1～2）×107个对数生长期的骨髓瘤细胞7∶1于50mL离心管中混合，使用PEG1500融合剂按照常规方法进行细胞融合，并用免疫多肽为包被原通过间接ELISA筛选出阳性杂交瘤细胞株，以有限稀释法连续进行3次亚克隆，直到获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。使用抗体亚类鉴定试剂盒，按照说明书进行单克隆抗体亚类鉴定。
被免疫小鼠的脾淋巴细胞及SP2/0细胞融合后，经3次亚克隆筛选，最终获得2株阳性效果最好的、稳定分泌抗水痘-带状疱疹病毒包膜糖蛋白高抗原表位肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞及其单克隆抗体均被命名为“HHV-5F3”和“HHV-6D6”。
将获得的单克隆杂交瘤细胞扩大培养后，注射至F1小鼠（广东省医学实验动物中心）腹腔，待小鼠腹部肿胀后收集腹水，并通过Protein-A亲和层析柱纯化获得单克隆抗体。使用抗体亚类鉴定试剂盒对杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行鉴定，确定二个单克隆抗体均是由IgG1重链及κ轻链组成。
实施例3 HHV-6D6单克隆抗体特异性鉴定
水痘-带状疱疹病毒VZV-pOKA病毒株购买自中国科学院武汉病毒研究所；将VZV-pOKA病毒株与其他不同病毒株BTV-8、CHUV、EHDV-1、乙型流感病毒Malaysia 2506/04，分别感染6孔板中培养的BHK 细胞，于细胞病变明显时约72 h提取细胞蛋白。取相同蛋白量的样品进行PAGE 电泳，再电转至PVDF 膜，5％脱脂奶室温封闭1 h，4 ℃过夜孵育一抗（HHV-6D6），洗膜后室温孵育二抗1 h，洗膜后进行化学发光自显影。Western-blot 结果说明单克隆抗体HHV-6D6能特异性识别VZV-的蛋白，而不与其他病毒蛋白发生反应（图1）。
ELISA：以200 ng/ 孔的蛋白量进行包被（每个样品加3孔），使用HHV-6D6单克隆抗体为一抗，按照常规方法进行间接ELISA检测。单克隆抗体HHV-6D6进行检测的ELISA 结果也证明了该抗体的特异性，其OD达到了0.38（图2）。
实施例4 HHV-6D6单克隆抗体亲和力以及可变区鉴定
本实验使用Fortebio Octet分子相互作用仪检测单HHV-6D6单克隆抗体与免疫多肽的亲和力常数。
Fortebio Octet分子相互作用仪检测HHV-6D6单克隆抗体与免疫多肽的亲和力常数实验方法简述如下：样品稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4。1μg/mL的多肽固定在HIS1K传感器上，时间40s，传感器在缓冲液中平衡55s，固定在传感器上的多肽与抗体结合，抗体浓度为0.1-50nM，时间100s，抗体在缓冲液中解离，时间100s。传感器使用10mM甘氨酸，pH1.5再生，时间5s，重复4次。检测温度为30℃，频率为0.3Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。
结果显示，HHV-6D6单克隆抗体可以与多肽结合，亲和力常数为5.37E-09M，具有较好的亲和效果。
使用Trizol试剂从培养的HHV-6D6单克隆细胞株中提取总RNA。用Taraka的逆转录cDNA试剂盒把总RNA变为cDNA。cDNA进一步在3’端加PolyG。以加尾的cDNA为模板进行抗体可变区的基因扩增。获得了单克隆抗体的轻链可变区序列和重链可变区序列如下：
轻链可变区（SEQ ID NO：1 ）
DIVITQSPALSAASPGEKVTITCCVSDDISTCYLGWYQQKSGISPKPWIYSTSNAALGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCQQWSSSPLTFGAGTKLELK
重链可变区（SEQ ID NO：2）
EVQLEESGTELARPAASVKLSCKASGYIFSEYAMSWIKQRPGQGLEWIGSIYPGCAGTRYTQATLGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGSNFAYDSWGLGTTLAVSS
实施例5 HHV-6D6单克隆抗体抑制病毒实验
Vero细胞用含2％胎牛血清的DMEM培养基按5×104个/mL浓度接种96孔培养板，每孔100μL，置37℃、5％CO2培养箱中培养过夜形成细胞单层。弃上清后，用PBS将细胞洗涤1次，以洗去残留的胎牛血清，加入不含胎牛血清的DMEM培养基稀释至100TCID50 VZV-pOKA病毒，每孔100μL，35℃孵育2h后，弃去病毒液。用2％胎牛血清的DMEM培养基将HHV-6D6单克隆抗体和阳性对照药物阿昔洛韦配制成不同浓度，分别加入单层Vero细胞中，设3个复孔，Vero细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养48h，每日观察细胞病变现象。48h后，弃上清后，加入100μL10％甲醛固定1h，0.1％(w/v)结晶紫染色15min，酶标仪570nm测定吸光度。计算病毒抑制率，并计算HHV-6D6单克隆抗体对病毒的EC50(半数有效浓度)。试验结果见表3：
表3 HHV-6D6单抗对VZV-pOKA的抗病毒活性
药物 EC50
HHV-6D6单抗 0.67μM
阿昔洛韦 1.26μM
表1结果显示：HHV-6D6单抗在体外对人疱疹病毒VZV-pOKA所致细胞病变具有明显抑制作用，其EC50为0.67μM，具备应用于抗疱疹病毒感染治疗的体外药效学基础。
实施例6 HHV-6D6单克隆抗体抑制病毒的小鼠实验
选择SPF级8周龄雄性C57小鼠30只,体重18-22 g,由上海中医药大学动物中心提供。戊巴比妥钠麻醉后，将豚鼠背部按常规方法脱毛，清洁，消毒，用标记笔把小鼠背部脱去皮毛部分分成多个皮区。在每个皮区的中心皮内注射107 PFU/mLVZV-pOKA病毒株病毒，每次注射0.1mL。在麻醉期间，动物饲养在30℃保温箱中2h。分别涉及阳性对照组，抗体组，抗体+免疫细胞组，免疫细胞组，空白对照组，其中，阳性对照组为阿昔洛韦组；抗体组为本发明的单克隆抗体组，抗体+免疫细胞组为本发明的单克隆抗体+实施例1制备的CIK细胞，免疫细胞组为实施例1制备的CIK细胞，空白对照组为使用PBS溶液涂抹。每次涂抹药液均为30μL，等药物干燥为止，每天抹药2次，连续给药5d。逐日观察小鼠病变部位痊愈情况。结果如表4所示。
表4 外用给药对小鼠皮肤疱疹病毒感染的治疗作用
Figure 655037DEST_PATH_IMAGE004
表4结果显示，小鼠皮肤接种感染病毒后，与涂抹阳性对照相比，涂抹本发明抗体以及抗体与免疫细胞的组合的组痊愈天数均显著降低，且具有统计学差异，特别是抗体+免疫细胞组，最低只要5.46天即可痊愈，提示本发明的抗体以及抗体与免疫细胞的组合对小鼠皮肤的病毒感染具有治疗作用，可以缩短痊愈时间，具有较好的效果。并且通过检测小鼠的脏器，没有实质性病变，说明本发明的药物安全性能够得到保障。
虽然已描述并详细举例说明本发明至足以使本领域技术人员制备和使用它，但是在不背离本发明的精神和范围的情况应清楚各种替代方案、修改和改进。本文所提供的实施例代表优选的实施方案，为示例性的，并且不旨在为对本发明的范围的限制。其中的修改和其他用途将是本领域技术人员能够想到的。在本发明的精神内涵盖这些修改并且由权利要求书的范围限定这些修改。
序列表
<110> 北京欣颂生物科技有限公司
<120> 一种用于病毒治疗的含有免疫细胞的药物组合物
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ser Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Cys Val Ser Asp Asp Ile Ser Thr Cys
20 25 30
Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Ala Ala Leu Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Thr Glu Leu Ala Arg Pro Ala Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Cys Ala Gly Thr Arg Tyr Thr Gln Ala Thr
50 55 60
Leu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Ser Asn Phe Ala Tyr Asp Ser Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Ala Val Ser Ser
115

Claims (6)

1.免疫细胞与HHV-6D6单克隆抗体在制备治疗人水痘-带状疱疹病毒感染药物组合物中的应用；其中所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示；其中免疫细胞采用如下方法制备：取正常外周血加入生理盐水1：1，稀释后用吸管将血液混合物沿管壁缓慢地加入Ficoll淋巴细胞分离液之上，于800g、4℃，离心20min；用吸管小心吸取第二层白色云雾状的单个核细胞层于离心管内，加入生理盐水于400g、4℃、离心10min洗涤3次后调整细胞浓度1.0×106/mL；接种于提前包被好CD3单抗的T175培养瓶，加入含有10%胎牛血清的BPMI-1640 培养基，其中添加50μg/L的IL-2、50μg/L的 IFN-γ以及25μg/L IL-22放置于37℃，5%的CO2细胞培养箱中诱导培养，隔天半量替换所述培养基，培养10d收获所述细胞即为免疫细胞。
2.根据权利要求1所述的应用，所述感染所致疾病为唇疱疹、咽炎、角膜炎或散发性脑炎。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为任意一种临床可接受的口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药剂型。
5.根据权利要求4中所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂。
6.HHV-6D6单克隆抗体，其特征在于所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
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