JPH05508847A - 伝達因子および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 伝達因子および使用方法 発明の分野 本発明は、本質的に純粋な伝達因子（ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｆａｃｔｏｒｓ）をヒ トまたは動物に投与することによる細胞介在免疫の伝達に関する。より詳細には 、本質的に純粋な伝達因子を得るための方法、本質的に純粋な伝達因子それら自 身、および本質的に純粋な伝達因子を用いて病気を治療する方法に関する。

発明の背景 言葉「抗原決定基（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）　Ｊおよび ［エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）　Ｊは、免疫応答に関連した細胞または体液生 成物と特異的に相互作用し得る分子の一部として定義される。言葉［抗原（ａｎ ｔｉｇｅｎ）　Ｊは、免疫応答のための標的として働き得るいずれでもあると定 義される。

この免疫応答は細胞もしくは体液のどちらかであってもよい。言葉「細胞介在免 疫（ｃｅｌｌ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｍｕｎｉｔｙ）　Ｊは、抗体ではな（細 胞が介在する免疫応答として定義される。言葉［遅延型過敏性（ｄｅｌａｙｅｄ 　ｔｙｐｅｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）　Ｊは、刺激する抗原を注射す るか或はそれを投与する部位の近隣で生じるＴリンパ球介在炎症応答として定義 する。これには、これに限定されるものではないが、遅延型過敏性および細胞毒 性Ｔ細胞が含まれる。「ハブテン（ｈａｐｔｅｎ）　Ｊは、ここでは、適当な抗 体またはＴ細胞と選択的に反応する物質として定義されるが、このノ１ブテンそ れ自身は、通常、免疫原性を示さない。大部分の／％ブテンは、小型分子である か或は巨大分子の小さい部分であるが、いくつかの巨大分子もまたハブテンとし て機能し得る。言葉「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）　Ｊは、抗原と結合する分子を 意味しているが、しかしながら、これらは、抗体が有する分子量がおおよそ１６ ０．０００ダルトンから１．０００，０００ダルトンである点で、伝達因子と区 別されている。

伝達因子は、透析可能材料としてか、或はヒトおよび特定の他の動物が有するリ ンパ系細胞から抽出され得るものでありそして１つの個体からもう１つの個体（ 種間でさえ）に免疫応答を伝達する能力を有する材料の族として定義されてきた 。この材料は、感作する（ｓｅｎｓｉｔｔｚｉｎｇ）抗原に対して遅延型過敏性 または他の細胞介在応答を発現するように感作させられたヒトおよび他のを推動 物から、通常に溶解させた、白血球から得られる物質である。伝達因子は、同族 抗原と結合し、そして１つの個体から他の個体への、遅延型過敏性および他の細 胞介在免疫応答の伝達を介在する能力を有する。このような状態で、この伝達因 子の由来となる個体は、興味の持たれている抗原に対して感作させられている。

上記特性にも拘らず、これらの伝達因子は抗体よりも小さく、そして抗体介在応 答を伝達することもな（また抗体生産を誘発することもない！、　ｆｆｉ、　３ ゜伝達因子が有するこれらの特性はまた、５ｐｉｔｌｅｒ他によっても説明され ており、これは、健康なドナーの白血球から入手した「伝達因子」を考察してい る４゜この材料は、病気の兆候を抑制する。５ｐｉｔｌｅｒ他は、この材料は熱 安定性を示しそして２０．０００ダルトン未満の分子量を有する、ことを記述し ている。これは、白血球を溶解した後、この溶解産物をＭ　ｇ−１およびＤＮア ーゼと一緒に培養し、そして続いてミリポアフィルタ−で濾過することによって 得られる。

伝達因子と呼ばれている物質を特徴づける数多くの試みが更に存在しており、こ れらは、科学および特許文献の両方で報告されている。これらの報告の全てにお いて、この伝達因子材料は細胞溶解産物の粗両分であった。本発明者の理解する 限り、本質的に純粋な伝達因子を製造した人はいない。Ｂａｒａｍ他は、ジエチ ルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ）使用イオン交換クロマトグラフィーを用 いてヒト白血球抽出物を分別した−この研究は継続しており、そしてＢａｒａ鵬 他が報告しているように、更にヒト白血球抽出物を分別する目的でゲル濾過およ びペーパークロマトグラフィーが用いられた６゜この研究で示された結論の中に は、伝達因子がヌクレオシドを含んでいることがあった。感作させたヒトの白血 球抽出物に対するゲル濾過クロマトグラフィーを用いたム訂ｅｎｃｅ他の研究に よって、伝達因子は（ｉ）水溶性であり、（ｉ　ｉ）透析可能であり、（ｉ　ｉ 　１）１０．０００ダルトン未満の分子量を有し、（ｉｖ）デオキシリボヌクレ アーゼ、リボヌクレアーゼおよびトリプシン消化に対して耐性を示し、そして（ ｖ）２８０ｎｍではなく２６０ｎｍにより大きい吸収を示すクロマトグラフィー ピークを有する、ことの提案がもたらされた７、ｓ、−これらの因子の組み合わ せにより、伝達因子はりボヌクレアーゼ耐性を示す小型のポリリボヌクレオチド であることの提案がもたらされた。

伝達因子に関する分子特性記述に対する進歩は遅く、適当な精製方法が不足して いることによって大きく制限されており、定量的分析方法の必要性が存在してい た。伝達因子活性を示す分子は、天然形態で、比較的小さい、即ち６０００ダル トン未満であり、親水性を示し、そして極性を示す、ことが示された。更に、伝 達因子活性は５６℃の加熱に生き残るが、７５℃で３０分、および少なくとも９ ５％エタノールに対する短期間の暴露で失活する。酵素敏感性および活性減少に 関する研究で得られる結果は、伝達因子の構造に関する核ペプチドまたは核蛋白 質モデルに適合する結果をもたらした。しかしながら、従来技術の結果を解釈す るには注意が必要である、と言うのは、純粋でない調製物が研究されており、そ して量的測定は行われていなかったからである。従って、伝達因子が有する分子 的性質はまだよく理解されていない。

ヌクレオチドもしくはヌクレオシドが該伝達因子分子の一部であるとの仮定に対 する傾向を、Ｇｏｔｔｌｉｅｂ他が継続して示していた１・　Ｉｌ、　Ｉｔ。

Ｇｏｔｔｌｉｅｂは、免疫モジュレータ−（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）から伝達因 子を区別しく’３７９特許）、そして増幅させた（’０７９特許）　。Ｌａｎｃ ｅｔ出版物で、Ｇｏｔｔｌｉｅｂは、伝達因子は１２個のアミノ酸とオリゴヌク レオチドから成っていると仮定した。その結果として、研究の焦点は、２５４ｎ ｍもしくはそれ以上の波長の溶離物に関する研究に対して向けられていた。

多くの報告は、高い２５４／２６０ｎｍから２８０ｎｍの吸収比を示しており、 再び伝達因子画分の一部としてオリゴヌクレオチド類を示唆していた１３．目　 １ｊ　ｌｊ　１７．　Ｉｌ、　Ｉｊ　！＋１．　！＋。同様に、Ｗａｒｒｅｎは 、蛋白質とＲＮＡを含んでおりそして分子量が５０００から１０．０００ダルト ンの分子を仮定している２２゜Ｇｏｕｓｔ他は、分子量が一般に４０００から７ ０００ダルトンでありそしてリボヌクレオチドを含んでいる分子の混合物として 透析可能伝達因子を記述している２３゜再び、Ｗｉｌｓｏｎ他２４は、全２４ヌ クレオチド部分とペプチド部分を含んでいる３つの形態の伝達因子を記述してい る（この文献のコラム１１を参照）。

純粋でない伝達因子材料の特徴づけで成された進歩がＫｉｒｋｐａｔｒｉｃｋに よる論評の中で要約されている２ｓ０この論評で、伝達因子活性を含んでいる透 析可能材料は、４０００から６０００ダルトンの分子量を有するポリペプチドと して記述されておりそしてこれはプロテアーゼ敏感性を示す。この伝達因子材料 は、明らかに、抗原に特異的に結合する！６゜この論評では、核酸、リボースお よびホスホジエステル基が存在している可能性はない、と述べられているニア。

従って、この伝達因子材料の物理的特性記述は、本質的に純粋な材料が単離され ていなかったため信頼できる程には成されていなかった。

伝達因子はヌクレオチド／蛋白質の複合体である、ことを本分野の従来技術が示 唆していたことは分かるであろう。しかしながら、本質的に純粋な伝達因子が単 離されていなかったため、結論的にこの伝達因子材料を特徴づけすることは不可 能である。

その分子および構造に関する興味は、どちらかと言えば、それが有する治療学的 効果のため増大してきた。上に挙げた文献によって記述された治療学的用途とは 別に、例えばＶｉｚａ他！８を参照することが可能であり、彼らは、単純ヘルペ ス（Ｂｅｒｐｅｓ　ｓｉ■ｐｌｅｘ）ウィルスに関する伝達因子治療を示唆して いる。その１つに、斑点、アクネ、コンジロームおよびＨ８■に関する皮膚科学 効力を記述している１ａｒｒｅｎ”が挙げられる。この伝達因子画分は、Ｋｉｒ ｋｐａｔｒｉｃｋ他３８（この開示はここでは参照にいれられる）に示されてい るように、Ｃ，アルビカンス（Ｃ１ａｌｂｉｃａｎｓ）に対して効力を示すこと が示されている。更に、単純ヘルペスに対して効力を示すものも見られる３１． 　Ｉｔ！、　！！。バリセラ・シスチル（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ　ｚ。

５ｔｅｒ）感染が伝達因子によって予防されたｓ４゜伝達因子は、エイズ患者に おけるクリブトスポリジオシス（ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｏｓｉｓ）に対し て効力を示した３Ｂ、　３＠。これらの全ての研究は、部分的にのみ精製された 伝達因子画分を用いて行われたものである。純粋な伝達因子材料を単離しそして 特徴づけするのが困難であるため、今日まで、本質的に純粋な伝達因子を用いて 行われた臨床もしくは生化学研究は存在していない。

伝達因子に対する文献に関する前記論評から分かるように、研究団体による本質 的に純粋な伝達因子材料の単離および特徴づけは３０年に渡り失敗に終わりてい た。多大な科学的および臨床的興味が持たれており、そしてこの捕まえずらい伝 達因子材料に関するいくつかの重要な物理的パラメーターが引き出されたにも拘 らず、本質的に純粋な材料を実際に物理的に単離することは不可能であった。

必要とされているものは本質的に純粋な伝達因子材料である。本質的に純粋な材 料が手に入れば、この材料の配列決定をし、そして化学的もしくは組換え方法に よってこの材料を作り出すことが可能である。その後、これらの分子をヒトまた は動物に投与することにより、特異的な抗原またはエピトープに免疫性を伝達す ることが可能になる。本質的に純粋な伝達因子を作り出して、既に感染している ヒトもしくは動物を治療するか、或はこれを用いて病気を予防することが可能に なる。本質的に純粋な伝達因子を単離しそして精製することは、病気の治療にと って大きな利点となるものである。

発明の要約 本発明は、精製した伝達因子、精製伝達因子の製造方法、およびこの精製伝達因 子を用いて種々の病気を治療する方法を提供するものである。

この出願に開示する精製方法は、何らかの抗原に対して特異的な如何なる伝達因 子の単離に対しても適用されるため、本発明は、ＡＵ□４当たり５，０００単位 以上の特異的活性を有する全ての本質的に純粋な伝達因子を包含するものと考え られる。本発明者が知る従来技術の伝達因子調製物が示す特異的活性は、２１４ ｎｍの吸収単位当たりおおよそ１゜０００単位以下である、と見積もられる。

本発明は、天然源から単離されたか或は合成的に製造された本質的に純粋な伝達 因子を包含している。このどちらかの給源から得られる本質的に純粋な伝達因子 を、本発明に従って用いることで、幅広い種類の病理学的状態を治療することが 可能である。例えば、単純ヘルペスウィルスに対する細胞介在免疫を伝達する伝 達因子もしくは因子類を用いて、単純ヘルペス感染を治療するか、或は単純ヘル ペス感染から人を保護することができる。

免疫を与える目的で伝達因子を用いる利点は数多い。これらには、免疫伝達の速 度が含まれる。この伝達因子を投与した後数時間と言った少ない時間で、特異的 抗原に対する免疫が検出され得る。これは、保護を与えるに数週間から数カ月か かる通常の免疫化に対する多大な改良である。

ユニークな伝達因子分子の各々が特異的抗原もしくはエピトープに対して免疫を 伝達すると考えられるため、異なる抗原に特異的ないくつかの異なる伝達因子分 子を混合して、要求に応じた複合免疫応答を設計することができる。

この本質的に純粋な伝達因子は、特別な伝達因子が有するアミノ酸配列を決定す ることを可能にし、そしてこの得られる情報を用いて、化学的もしくは組換え方 法でこの伝達因子を合成することが可能になる。従って、本発明の結果として、 多量の伝達因子を製造することがここに可能になる。これによって、多数のヒト もしくは動物への所望免疫応答の伝違が可能になる。

更に、伝達因子の貯蔵ももう１つの利点である。本発明の一部と見なされる伝達 因子分子は非常に安定である。従って、本発明に従い、これらの伝達因子分子は 、この材料を維持するか或は投与するに過剰な注意を必要としない。

従って、本発明の１つの目的は、本質的に純粋な伝達因子を提供することにある 。

本発明の別の目的は、Ａ０□４当たり少なくとも５０００単位の特異的活性を有 する本質的に純粋な伝達因子を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、所望の免疫応答を伝達する目的でヒトもしくは動物に 投与することが可能な本質的に純粋な伝達因子を提供することにある。

本発明の別の目的は、細胞溶解産物から本質的に純粋な伝達因子を製造する方法 を提供することにある。

本発明の別の目的は、感染症を治療するための本質的に純粋な伝達因子を提供す ることにある。

本発明の別の目的は、感染症に対する保護を行うための本質的に純粋な伝達因子 を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、単純ヘルペス、帯状ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ　ｚｏｓ ｔｅｒ）　、サイトメガロウィルレス会ミーズレス（ｃｙｔｏｗｅｇａｌｏｖｉ ｒｕｓ　ｍｅａｓｌｅｓ）、ＨＩＶなどのウィルス、そしてヒトおよび動物に病 気をもたらす他のウィルスに特異的な本質的に純粋な伝達因子を提供することに ある。

本発明の別の目的は、カンジダ・アルビカンス（ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａ ｎｓ）、ヒストブラズ？−カブスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ　ｃａｐｓ ｕｌａｔｕｍ）　、コクシジオイデス・イミチス（ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｉｅｓ 　ｆｓｍｉｔｉｓ）およびニューモジステイス・カリニイ（Ｐｎｅｕ＋５ｏｃｙ ｓｔｕｓ　ｃａｒｉｎｉｉ）の如き菌・カビに特異的な本質的に純粋な伝達因子 を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、マイコバクテリア・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ ｉａ　１ｅｐｒａｅ）　、マイコバクテリウム・ラベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａ ｃｔｅｒｉｕ＋＊　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリウム・ア ビウム・コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ　ｃｏｍｐ ｌｅｘ）を含むマイコバクテリアに特異的な本質的に純粋な伝達因子を提供する ことにある。

本発明の更に別の目的は、原生動物門に特異的な本質的に純粋な伝達因子を提供 することにある。

本発明の更に別の目的は、１つの種から単離しそして免疫を他の種に伝達するた めに用いられ得る本質的に純粋な伝達因子を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、経口投与され得る本質的に純粋な伝達因子を提供する ことにある。

本発明の上記および他の目的、特徴および利点は、以下に開示する具体例および 添付請求の範囲の詳細な記述を再考することで明らかになる図１は、伝達因子を 精製する目的で用いた方策の図式である。

図２は、伝達因子を含んでいる溶解スプレノサイト（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ） の透析物に関する用量応答関係を示している。

図３は、アフィニティー精製後の伝達因子に関する用量応答関係を示している。

図４は、アフィニティー精製した、フェリチンに特異的な伝達因子の逆相高圧液 クロを示している。

図５は、アフィニティー精製した、オボアルブミンに特異的な伝達因子の逆相高 圧液クロを示している。

図６は、逆相高圧液クロ精製した伝達因子に関する用量応答関係を示している。

図７は、フェリチンに特異的な伝達因子の逆相高圧液クロ画分の分析を示してい る。

図８は、ゲル濾過高圧液クロカラムを用いてアフィニティーおよび逆相高圧液ク ロ精製した伝達因子の半型クロマトグラフィーを表している。

図９は、半型ゲル濾過高圧液グロの個々の両分からの、フェリチンのための伝達 因子に関する活性データを表している。

図１０は、図８に記述した画分に関する用量応答関係を示している。

図１１は、図８と同様な伝達因子画分のゲル濾過クロマトグラフィーを表してい る。

図１２は、分子量マーカーのゲル濾過クロマトグラフィーで得られる標準曲線を 示している。

図１３は、フェリチンに特異的な伝達因子のＵＶ吸収スペクトルを示している。

図１４は、高純度の伝達因子に関する抗原特異性を示している。

図１５Ａは、還元およびアルキル化ブランクサンプルからの溶離プロファイルを 示している。

図１５Ｂは、伝達因子の還元およびアルキル化サンプルからの溶離プロファイル を示している。

図１６Ａは、対照サンプルに関する５ｅｐｈａｄｅｘ　ＧＩＯ溶離プロファイル を示している。

図１６Ｂは、画分ＩＩＩ伝達因子に関する５ｅｐｈａｄｅｘ　ＧＩＯ溶離プロフ ァイルを示している。

図１７は、非還元条件下での伝達因子の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動プロファイルを示している。

図１８Ａは、伝達因子のトリプシン消化物に関する対照溶離プロファイルを示し ている。

図１８Ｂは、トリプシン消化を行った後の両分ＡＩＩＩフェリチン特異的伝達因 子に関する溶離プロファイルを示している。

図１９Ａは、ｖ８プロテアーゼで消化した、伝達因子の対照溶離プロファイルで ある。

図１９Ｂは、■８プロテアーゼで消化した鶏の卵アルブミンに特異的な伝達因子 の溶離プロファイルである。

図１９Ｃは、■８プロテアーゼで消化したフェリチンに特異的な伝達因子の溶離 プロファイルである。

詳細な説明 本発明は、本質的に純粋な伝達因子、および天然源から本質的に純粋な伝達因子 を製造する方法を含んでいる。本発明はまた、この本質的に純粋な伝達因子を用 いて種々の病気を治療する方法も含んでいる。

特異的には、本発明は、Ａ　Ｕ　ｔ　Ｉａ当たり少なくとも５．０００単位の特 異的活性を有する本質的に純粋な伝達因子を含んでいる。この好適な特異的活性 は、ＡＵ！１４当たり少なくとも１０．０００単位であり、最も好適にはＡＵ！ Ｉａ当たり少なくとも２０，０００単位からＡＵＨ４当たリ６０．０００単位で ある。この本質的に純粋な伝達因子は、おおよそ４９００から５５００ダルトン の分子量を有するポリペプチドである。

この本質的に純粋な伝達因子は、遅延型細胞介在免疫を、免疫化されていないヒ トまたは動物に伝達し得る。

この本質的に純粋な伝達因子は、ヒトまたは動物において、幅広い種類の抗原も しくはエピトープに関する細胞介在免疫を伝達するに有効性を示す。この本質的 に純粋な伝達因子は、注射で投与され得るか、或は経口投与され得る。注射は静 脈注射、筋肉的注射または皮下注射であるか、或はこれらのルートの組み合わせ であってもよい。

注射する場合、ヒトに免疫を与えるに必要な伝達因子用量は、おおよそｌｎｇか ら５０００ｎｇであり、好適な用量範囲は２５ｎｇから２５０ｎｇであり、最も 好適な用量はおおよそ５０ｎｇである。特別な伝達因子いずれかに関する最適用 量は、その述べた段階の範囲内で変化し得る。

特定のウィルス類、特にヒトのヘルペスウィルスに対する免疫は、この細胞介在 免疫システムに依存している、ことに対する強力な証拠が存在している。特定の 伝達因子を用いた細胞介在免疫性の活性化によって、活性を示すウィルス感染を 奇麗にする作用を示す正常な機構が改良されると期待される。伝達因子による特 異的免疫性の同様な活性化によって、それに遭遇する前でも、このウィルスに対 する保護免疫を与えることができる。この後者の提案は、５ｔｅｅｌｅ他の報告 によって支持されており、ここでは、帯状ヘルペスにニワトリ酸）に特異的な伝 達因子画分を投与することによって、急性白血病の子供がニワトリ酸に対して保 護された３丁。伝達因子の作用の速さを考慮することは重要である。これらの受 容個体は２４から４８時間で特異的免疫性を取得する。これは、通常のワクチン によって免疫性を誘発するに必要な２から６週間よりもずっと速い。

「異常な」マイコバクテリア（即ち、マイコバクテリウム・アビウム・コンプレ ックス）で引き起こされる結核症、癩病および感染は、その患者に免疫不全を作 り出すか、或はこの有機体が感染を確立することを可能にする免疫不全を患者が 有することで、それが生じ得る。同様な証拠が特定の菌・カビ感染に関しても存 在している。これらの病気を有する数多くの患者が悪化した細胞介在免疫を有し ており、そしてこれらの免疫不全が特定の伝達因子によって補正され得る、証拠 が存在している。

腸内寄生生物に対する免疫機構も利用できる。しかしながら、エイズ、即ち細胞 介在免疫がひどく悪化する病気は、ヒトの特定寄生生物病が細胞介在免疫応答に 関係していることの証拠を与えている。これらには、クリブトスポリジオシスお よびイソスポロシス（ｉｓｏｓｐｏｒｏｓｉｓ）が含まれる。腸内クリブトスポ リジオシスを有する患者における、特異的な伝達因子に関するブラセボ対照を用 いた臨床的試行で、この伝達因子受容個体で有意に有益な応答が示された３８゜ 適当な伝達因子を用いて子供を治療することによってニワトリ痘感染を予防する ことができることを、５ｔｅｅｌｅ他が観察したことは、特定の感染症を予防す るための薬剤として伝達因子が重要な役割を果していることの示唆を与えている 。伝達因子は細胞介在免疫システムを活性化しそして非常に迅速に作用するため 、これらは、現在用いられているワクチン（これらは抗体産生を刺激するため用 いられている）では与えられない予防的免疫性に対し、重要で新規なアプローチ を提供するものである。

特定例には、これに限定されるものではないが、次のものが含まれる：ａ、　水 痘の予防： ｂ、　寄生性感染、即ち風土病がある領域への旅行者に関する皮膚リーシュマニ ア症の予防： Ｃ１器官移植を受けた人における、サイトメガロウィルス感染の予防； ｄ、ウィルス感染（即ちＨＩＶ）による細胞免疫不全を有する患者におけるニュ ーモジステイス・カリニイ肺炎の予防または免疫抑制治療； ｅ、　特定の地理的領域における風土病である特定の感染症（即ちリーシュマニ ア症）に対する予防。

本発明の本質的に純粋な伝達因子は、ヒトおよび動物における幅広い種類の病理 学的状態の治療で有効性を示す。例えば、本発明の本質的に純粋な伝達因子を用 いることで、これに限定されるものではないが、単純ヘルペスの■およびＩＩ型 、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス、サイトメガロウィルス・ミーズレス、ヒ ト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）　、そしてヒトおよび動物に病気をもたらす他の ウィルスを含むウィルス感染を治療もしくは予防するために用いられ得る。本発 明の本質的に純粋な因子は、これに限定されるものではないが、カンジダ・アル ビカンス、ヒストプラズマ・カブスラーツム、コクシジオイデス・イミチスおよ びニューモジステイス・カリニイを含む菌・カビ感染を治療もしくは予防するた めに用いられ得る。本発明の本質的に純粋な伝達因子は、これに限定されるもの ではないが、マイコバクテリア・レプラエ、マイコｌくクテリウム・ラベルクロ シスおよびマイコバクテリウム・アビウム・コンプレックスを含むマイコバクテ リウム感染を治療もしくは予防するために用いられ得る。本発明の本質的に純粋 な伝達因子は、これに限定されるものではないが、クリプトスポリジア（ｃｒｙ ｐｔｏｓｐｏｒｉｊｉａ）　、イソスボロラ（ｉｓｏｓｐｏｒａ）　、リーシュ マニア種、コシシア（ｃｏｃｃｉｄｉａ）　、そしてヒトおよび動物に感染する 他の寄生生物を含む寄生生物感染を治療もしくは予防するために用いられ得る。

特定の免疫不全症候群は、細胞介在免疫性の選択的欠陥によって特徴づけられる 。これらの障害を有する患者は、通常に存在している有機体、例えばカンジダ・ アルビカンス、ヘルペスウィルス、ニューモジステイス・カリニイおよび特定の 腸内寄生生物に関する感染に対して敏感性を示す。

特定の病気、例えばＷｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群および慢性の粘膜皮 膚カンジダ症に関する免疫学的不全は、遺伝学的に測定され、そして通常、その 寿命の最初の数年内に診断される。他のものは、免疫抑制治療、免疫抑制病また は知られていない機構を通して得られる。

Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ他は、特定の伝達因子治療によって慢性粘膜皮膚カンジ ダ症を有する患者の免疫不全が補正され、そしてこれらの患者は、抗菌・−カゼ 剤を用いてそれらの感染を奇麗にした後、再発に対して抵抗性を示す、ことを示 している。本発明の本質的に純粋な伝達因子を用いて治療可能な免疫不全病気の 特定例には、これに限定されるものではないが、次のものが含まれる： ａ、　慢性粘膜皮膚カンジダ症； ｂ、　高１ｇＥ症候群； ｃ、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群。

以下に示す仮定で範囲を限定することを望むものではないが、伝達因子は特定の 抗原もしくはエピトープに特異的であると考えられる。従って、伝達因子分子の 各々は、特定エピトープに対して免疫を伝達し得る。

本発明に従って行った本質的に純粋な伝達因子から得られるデータから、各々の 伝達因子分子は、一定のアミノ酸配列を有する領域を有している、と考えられる 。もう１つの領域では、アミノ酸配列が変化し昌い。これは５．特別な抗原に対 する特異性を与える可変領域にある。

特別なエピトープに特異的な本質的に純粋な伝達因子を単離することにより、こ の伝達因子の配列決定を行うことが可能であり、そしてこの配列決定データを用 い、化学合成もしくは組換え技術によって大量にこの伝達因子を製造することが 可能である。

更に、ここに記述した方法で免疫化した動物から多量の本質的に純粋な伝達因子 を製造することも本発明の一部と見なされる。この本質的に純粋な伝達因子を用 いて、次に、他の免疫化していない動物もしくはヒトに免疫を伝達することがで きる。

本発明に従う本質的に純粋な伝達因子は、１つの種、例えばウシを用いて生産す ることが可能であり、そしてこのウシ給源から得られる本質的に純粋な伝達因子 を用いて成功裏に、特異的な免疫を他の種、例えばヒトに伝達することができる 。

以下に示す仮定で範囲を限定することを望むものではないが、結果は、ＣＤＪ＋ （Ｌ３Ｔ４＋）末梢Ｔ細胞で伝達因子が産生される、ことを示唆している。活性 的に感作させたマウスからマクロファージ、Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣ Ｄ８＋Ｔ細胞を単離し、これらの細胞から透析物を調製し、そしてナイーブな（ ｎａｉｖｅ）受容マウスの中でこれらの調製物を用いて、伝達因子活性に関する 用量応答試験を行うことにより、上記実験を行った。各々の透析ｖＲ製物に関す る滴定曲線を、各々の細胞調製物の純度に対するデータ（シトフルオログラフィ ー（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｙ）　）と比較することにより、ＣＤ４＋ Ｔ細胞が全ての伝達因子活性に寄与している、ごとの示唆が得られる。主要な組 織適合性複合体で制限された、伝達因子の産生は、Ｔ細胞がそれらを産生ずるこ との見解に適合している。他の抗原特異的分子の再配列を行うことが知られてい るそれらと同様な方法を通して再配列されるＣＤＪ＋細胞中の、１組の生殖系遺 伝子によって、伝達因子がコードされると考えられる。異なる抗原特異性を有す る伝達因子の同様な物理化学特性により、伝達因子に関する一定および可変領域 をコードする遺伝子が示唆される。更に、クローン様式で伝達因子が産生され、 そして一定のＴ細胞が産生ずる伝達因子は、そのＴ細胞上のＴ細胞レセプタ（Ｔ ＣＲ）と同様な抗原のエピトープに対して特異性を示す、ことも示唆されている 。伝達因子産生に関するクローン性（ｅｌｏｎａｌｉｔｙ）は、伝達因子が抗原 に特異的な活性を有することと適合している。これに関連して、伝達因子および それの相当するＴＣＲは、同じエピトープを含有しているペプチドの上の異なる アミノ酸残基を認識する、ことも示唆されている。

恐らくは、上記提案によって生じてきた最も刺激的なものは、Ｔ細胞レセプタ遺 伝子のランダムな再配列を伝達因子遺伝子の再配列に同調させ得る機構である。

このモデルから得られる意味は、ＴＣＲと伝達因子遺伝子との間の特異的なシグ ナル機構である。このような複雑なシステムの同調に関するデータは文献中には 見られない。これに関連して、伝達因子遺伝子の再配列を調節するユニークな１ 組のトランス作用因子を思い描くことが可能である。二者択一的に、この目的で 働く抗原、再刊用ＴＣＲ，またはこれらの１つのフラグメントを思い描くことが 可能である。これは、この機構がいかなるものであろうとも、このモデルに関す る最も不可解な特徴の１つである。伝達因子遺伝子のランダム再配列のモデルと は逆に、このモデルは、オートロガス抗原に特異性を示す伝達因子を産生じ得る 細胞の消滅を提供している。即ち、それらが有するＴＣＲ反応性を基とする自己 反応性を示す（ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ）　Ｔ細胞をクローン的に欠失させる こともまた、相当する特異性を示す伝達因子を消滅させるものである。これに関 連して、Ｂｕｒｎｅｔ”は、伝達因子遺伝子のための生殖系モデルを提案してお り、これはまた、しばしば「ミニレセプタ仮説０ｉｎｉｒｅｅｅｐｔｏｒ　ｈｙ ｐｏｔｈｅｓｉｓ）　Ｊと呼ばれるものの一部として、伝達因子のクローン産生 を提案している。この引き出された遺伝子再配列に関する同調調節の他に、この モデルは、免疫グロブリンおよびＴＣＲ遺伝子の形成および再配列で知られてい るものと良く似ている。

伝達因子は構成的に産生されるものではなく、第１次免疫応答の誘発にとって必 要ではない、と考えられる。インビボ系の実験における伝達因子活性は、感作さ せたドナーからの調製物に関してのみ明らかである。

上記調製物では伝達因子活性が最低でも１．Ｏ，ＯＯＯ倍増強されることが示さ れている。また、伝達遺伝子受容個体におけるＤＴＨ応答の迅速（２４時間）誘 発は、第１次免疫応答の誘発における伝達因子のための自然の役割とは一致して いない。

記憶（園ｅ謹ｏｒｙ）　Ｔリンパ球から伝達因子を得ることが可能であると考え られる。インビボ実験モデルを用いた伝達因子活性で観察される速度（即ち２４ 時間以内の応答誘発）は、第１次免疫応答速度に一致している。伝達因子はイン ビトロでＴ細胞増殖を誘発することができないのは、記憶Ｔ細胞が伝達因子活性 を含んでいることの意見に適合している。周期的な抗原由来Ｔ細胞活性が存在し ていない時の抗原対抗に対する記憶Ｔ細胞応答の減少は、同様な条件下で時間と 共に伝達因子受容個体のＤＴＨ応答が同様に低下することと適合している。高純 度の伝達因子を投与することによって生じるＤＴＨ応答が急激に誘発されること は、これらの分子が第２次免疫応答で重要な役割を果していることを示唆してい る可能性があり、これもまた、記憶Ｔ細胞の中に伝達因子が存在している可能性 があるとの意見と適合している。

要約として、ＣＤ４＋Ｔ細胞中で再配列された生殖系遺伝子が伝達因子をコード すると考えられる。更に、第１次のＭＨＣ制限感作の結果として伝達因子が産生 された後、記憶Ｔ細胞から得られる可能性がある、と考えられる。

天然の条件下では、適当な伝達因子含有Ｔ細胞にＭＨＣ制限抗原を表示した後で 伝達因子が機能を示すと考えられる。実験的なインビボモデルで得られる結果は 、同種異系間そして異種間の受容個体でさえも、伝達因子機能を示している。そ れとは対照的に、クローン化ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いたＤＴＨの受動的伝達（これ はＤＴＨを仲介することが示されている）は、ＭＨＣｉｌｉ１限様式で機能する 。実験的なインビボモデルで外因性伝達因子を投与すると、伝達因子機能活性が 発現する前に、ＭＨＣ制限抗原表示に関する他の自然の必要条件を満足させる、 と考えることで、上記の結果を満足させることが可能である。

更に、このＴＣＲにＭＨＣ制限抗原を表示した後、伝達因子が反応に参加し、こ れが、伝達因子含有Ｔ細胞に関する第２次免疫応答表現型をもたらす、と考えら れる。更に、伝達因子は伝達因子含有Ｔ細胞によって放出されて細胞外環境に入 り、ナイーブなＴ細胞の近隣に入り、そしてそれらが伝達因子産生細胞に対して 及ぼすのと同様に、上記細胞に同様な影響を及ぼす、と考えられる。これは、外 因性伝達因子を投与すると、ナイーブな受容体動物もしくはヒトに関するＤＴＨ 応答が刺激される、ことを示す実験的なインビボモデルで得られる結果と適合し ている。

ナイーブなＴ細胞への侵入は、伝達因子と結合するこれらの細胞の表面の上に存 在しているまだ同定されていないレセプタを伴っている可能性がある。Ｂｕｒｎ ｅｔ”は、構造的に伝達因子に相補的な「ミニレセプタ」の存在を提案した。従 って、一定の抗原特異性を有する伝達因子では、その伝達因子と特異的に結合す るミニレセプタが存在している。ここに示すモデルでは、非多型レセプタが提案 される。このような伝達因子レセプタに関する証拠は入手されていないが、この レセプタの候補として記憶Ｔ細胞ではなくナイーブなＴ細胞の上で多量に発現さ れる分子、例えばＣＤ−４５Ｋを思い描くことができる。

この伝達因子のそれに相当している抗原に特異性を示すＴ細胞中でのみ伝達因子 が機能すると考えられる。従って、伝達因子を放出するＴ細胞の近隣に存在して いるいずれかのＴ細胞が、いずれかの伝達因子と結合してそれを吸収する能力を 有している可能性があるが、この適当な伝達因子を吸収した後、同系間の抗原表 示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｅｅｌｉｓ）（ＡＰＣ）によ って適当な抗原で表示されるもののみが、この伝達因子活性に応答する。

伝達因子は、伝達因子が特異的に抗原に結合することを通してＴ細胞活性に参加 している、と考えられる。伝達因子活性の遺伝子調節に関する研究から得られる 結果は、伝達因子は、そうでなければ決定基選択機構を通して耐性が明らかにな るシステムで、高い応答個体表現型を低い応答個体マウスに与えることが可能で ある。１つの実験で、高応答個体のＢＡＬＢ／ｅＢｙ　（Ｈ−２つマウス由来の 伝達因子調整物を用い、低応答個体であるＣＢＡ／Ｊ　（Ｈ−Ｓｋ）マウスにニ ワトリオボアルブミンまたは他のオボアルブミン免疫優性ペプチドに対してＤＴ Ｈ応答が確立された。この抗原に対してＨ−２’マウスを応答させることができ なかったのは、抗原性オボアルブミンペプチドはＨ−２’の種類のＩｆ抗原に結 合することができないことによる。更に、これらの結果は、特異的な様式で、ニ ワトリオボアルブミンを含む無傷の蛋白質抗原に伝達因子が結合することを示し ている。−緒に、これらの結果は、Ｔ細胞に対する抗原表示における伝達因子の 役割と適合している。これは、ＡＰＣ表面上にＭＨＣ産生物／伝達因子／抗原の 複合体が生成することを通して生じ得る。同種異系および異種間システムにおけ る伝達因子活性の観察は、ＭＨＣ産生物に結合する超抗原に対して提案されたの と類似した様式で、この抗原結合割れ目（ｃｌｅｆｔ）の遠方末端に存在してい るＭＨＣコード化分子の保存部分と伝達因子とが相互作用を行うことの意見と適 合し得る。従って、この割れ目の中に伝達因子結合抗原を位！させる配向で、こ の抗原結合割れ目σ麹方末端で伝達因子が結合するＭＭＣコード化分子は、機能 的ＭＨＣ産生物／伝達因子／抗原複合体の配置を含んでいる。

実験的インビボモデルで得られる結果は、受容個体に投与するに先立って溶液中 の無傷の相同性抗原と伝達因子が相互作用する場合、その伝達因子活性が廃棄さ れる、ことを示している。これらの結果は、伝達因子は、抗原と相互作用するに 先立って、免疫系の成分と相互作用する必要がある、ことを示唆している。これ は、結果として観察するＤＴＨ応答に関する抗原対抗を行う前に伝達因子を投与 する必要があることを示している結果と適合している。二者択一的に、この現象 は、生理学的条件下では適切でなく、そして伝達因子は、インビボでは伝達因子 活性を充分に保持しながら、抗原と正常に相互作用し得る。伝達因子が抗原と結 合する機能の利用は、抗原表示に関する抗原競合を減少させることである。即ち 、外来の抗原に伝達因子が結合することで、多数のオートロガス抗原がＭＨＣ分 子との結合で選択的に競合し得る条件下で、これらの抗原をＴ細胞に表示するこ とを容易にし得る。

要約として、伝達因子含有Ｔ細胞にＭＨＣ制限抗原を表示した後で伝達因子の機 能活性が可能になると考えられる。この活性は、これらの細胞に関する二次的な 免疫応答表現型をもたらす機構を通して、伝達因子含有Ｔ細胞の中で発現する。

刺激されたＴ細胞によって伝達因子が放出されて細胞外環境に入り、ここでこれ らが、ナイーブなＴ細胞の近隣表面の上で伝達因子レセプタ分子と結合する、と 考えられる。ＭＭＣ制限抗原表示の後、これらの細胞はまた二次的免疫応答表現 型を採用すると考えられる。Ｔ細胞が放出する伝達因子は、抗原表示で役割を果 しており、そしてこの抗原表示は、伝達因子が特異的抗原に結合する活性を通し て発現し、そして抗原表示細胞の表面の上にＭＨＣ産生物／伝達因子／抗原複合 体が形成することを通して促進されると考えられる。

この精製方策は、従来技術で考えられているのとは異なるいくつかの考察を基に したものであった。伝達因子に関して明記されそして最も良く確立された分析法 は、遅延型過敏性に関するインビボ分析である。従うて、この精製過程全体を通 してこれらの伝達因子が有する生物学的活性を保存する必要があった。２番目と して、伝達活性に関するインビボ分析は、従来、単一用量サンプルを用いて行わ れていた。このアプローチは、伝達因子活性の存在に対し、て重要な量的情報を 与えはするが、適切にこの精製方法を監視するための定量分析法を開発する必要 があった。

３番目として、初期の実験では、１グラムの組織からピコモル量のみの伝達因子 が得られることが示された。更に、生化学的特性記述および構造上の研究に充分 な量と品質の材料を得るための方法を探求した。サンプルの取り扱いを最小限に する、従ワて非特異的なサンプル損失を最小限にする目的で、この精製過程全体 を通して揮発性緩衝剤を用いた。通常の高圧液クロ溶媒、例えばトリフルオロ酢 酸およびアセトニトリルは伝達因子を不活性化することも見いだされた。従って 、この生物学的活性に影響を与えないで該伝達因子を精製することを可能にする 新規な溶媒系を考案する必要があった。

４番目に、予備的データは比較的大量の伝達因子活性を含む試料でさえ２３５ｎ ｍ以上の波長では非常に少量の光しか吸収しないことを示した。従って短波長で 有用なりロマトグラフィー溶媒系を選んだ。開発した戦略を図１に示す。図１に おいて２つの高圧液体クロマトグラフィ一段階を逆にすることができる、すなわ ち多量（ゲル濾過）高圧液体クロマトグラフィーを最初に行い、逆相高圧液体ク ロマトグラフィーを２番目に行うことができることに注意しなければならない。

ある場合にはアフィニティー精製段階の後に所望の比活性を得ることができる。

比活性は、２１４ｎｍにおける吸光度単位当たりの伝達因子活性により定義され る。比活性のこの測定は、従来の蛋白質決定を行うのに試料の実質的割合が必要 であり１、短波長ＵＶ光の吸光がペプチド及び蛋白質の検出のための許容し得る 非−破壊的手段であるので開発された。単位で表す伝達因子活性を蛋白質濃度に 関連づけるこの系の開発により、精製法を通じて比活性を監視することができる 。

簡単に言うと単離法は１、伝達因子−含有試料を、固定した抗原と接触させ、抗 原−特異的伝達因子が抗原に結合するのに有利な条件下で伝達因子がそれに特異 的に結合して伝達因子−抗原複合体を形成する段階を含む実質的に純粋な伝達因 子の生産法である。その後抗原−特異的伝達因子を複合体から分離する。その後 抗原−特異的伝達因子を第１の逆相高速液体クロマトグラフィーカラムに適用す る。抗原−特異的伝達因子は第１の逆相高速液体クロマトグラフィーカラムから 溶離し、第２のゲル濾過高速液体クロマトグラフィーカラム上に適用する。２つ の高速液体クロマトグラフィーカラムは、逆であることもできる。その後第２の 高速液体クロマトグラフィーカラムから実質的に純粋な伝達因子を溶離し、抗原 −特異的伝達因子は、２１４ｎｍで吸光単位当たり少なくとも５．０００単位の 比活性を有する。

以下の特別な実施例は本発明を例示するものであり、小さいハプテンへの生物の 免疫応答を強化するのに適用されている。他の実施例が当該分野における通常の 熟練者には明らかであり、本発明はこれらの特別な例示的実施例に制限されるも のではないことがわかるであろう。

実施例１ この実施例は、伝達因子を含む粗選析液の調製を説明する。

Ｐｅｔｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、４２に従い、水及びべＬ／　ット食物ａｄ１ｉ ｂｉｔｕｍで維持した８−１４週令のＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス１ｏｎ−１５０ 匹の群を“感作した“。これは、水溶液中のフェリチン又は鶴卵アルブミンを同 量のハンクス液（ＨＢＳＳ）及び完全フロインドアジュバントに乳化することを 意味する。各マウスに尾の基部の２カ所に皮下注射することにより４０μｌの容 積とした１００μｇの感作抗原を与えた。３週間後、６匹のマウスを無作為に選 び、遅延型過敏症分析を行った。この分析は２５μｌのＨＢＳＳ中の１００μｇ の抗原の注射を含み、後肢フットパッド（ｆｏｏｔｐａｄ）に皮下注射した。対 銅性フットバッドに２５μ！のＨＢＳＳを注射した。分析に使用した抗原は、以 前にマウスに投与した抗原と同一の抗原である。ダイヤルゲージマイクロメータ ーを用いて注射の前及び１８時間後にフッドバッドの厚さを測定した。これらの 値の差から評価を得た。ｐｅｒｔｅｒｓｅｎｅｔ　ａｌ、による以前の実験研究 により、注射後１８−２４時間で最大膨潤が起こることが示されている。

被実験マウスのフットバッドの抗原に対する膨潤応答が希釈剤（ｐ＜０．０５） に対する応答より有意に大きい場合、その群のマウスのすべてを犠牲にした。膵 臓を無菌的に取り出し、細胞を６０メツシユの滅菌ステンレススチールスクリー ンに穏やかに通すことにより、単細胞懸濁液を調製した。細胞をＨＢＳＳで３回 洗浄し、アリコートを取り、生体排除染料としてトリパンブルーを用いて単核を 計数した。全体の生存率は常に９０％以上であうた。その後細胞を５０ｍ１の滅 菌プロピレン遠心管中の滅菌精製水に懸濁し、ドライアイス−エタノール洛中の 凍結と３７℃の水浴中の解凍を繰り返すことにより溶解した。顕微鏡観察により 溶解が基本的に完了したことが確認されたら溶解産物を、あらかじめ精製水中で 煮沸した透析袋に入れた。この袋は、６０００−８０００ダルトンの分子量を分 離する。透析は、定常的に撹拌した５０体積の滅菌精製水に対して４℃で２４時 間行った。これを連続的に２回行った。得られた透析液をプールし、凍結乾燥し 、凍結乾燥した物質を精製滅菌水を用いて１０ｓ単核細胞当量（ｃｅ）／ｍｌに 再構成した。０．２２μｍのフィルターを通過させて滅菌し、血液寒天プレート 上でアリコートを調べることにより滅菌を確認した後、−２０℃で保存した。

実施例２ 透析液を、ここに参照４３として挿入するＫｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ　ｅｔａｌ、 による記載の通りに伝達因子活性に関して分析した。

凍結乾燥により揮発性溶媒を除去した。希釈剤として精製水を用い、試料を１ミ リリツトル当たり１０”単核細胞当量の濃度とした。試験材料をマウス１匹当た り１．０ｍｌ試料の腹腔内注射によりマウスに投与した。他に記載がなければ各 データ点に関して６匹のマウスを使用した。

遅延型過敏性の分析は、伝達因子試料の注射後２４時間で開始した。

精製段階の間の定量的回収の目的で、伝達因子活性の１単位を、フットパッド膨 潤の増分に対する単核膵臓細胞当量のｌｏｇ’ｓの投薬量一応答曲線から得た最 大フットパッド膨潤応答の半分を与える物質として定義した。粗選析液を例外と して種々の精１２ｗ剤は非常に少量の蛋白質を含み、従来の蛋白質分析には実貢 的割合の試料が必要である。本出願の目的の場合、調剤の比活性は２１４ｎｍに おける吸光単位当たりの伝達因子活性の単位数を用いて記述する。種々の揮発性 溶媒は、凍結乾燥により試料から除去した。試料は吸光度測定のために精製水に 溶解した。

この吸光度測定は、セルフマスキング石英ガラスマイクロクベット（Ｓｅｌｆ− ｍａｓｋｉｎｇ　ｑｕａｒｔｚ　ｇｌａｓｓ　ｍｉｃｒｏｃｕｖｅｔｔｅｓ）（ １８Ｍ−３型；ＮＳＧ　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｃｅ１Ｉｓ、Ｉｎｃ、、Ｆａｒｍ ｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）及びＧ１１ｆｏｒｄモデル２６０ＵＶ分光光度計（Ｇｉ ｌｆｏｒｄ　ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、０ｂｅ ｒｌｉｎ、ＯＨ）を用いて行った。

この分析は本文に記載の活性の試験すべてに用いられる案であり、その場合は常 に°生体内伝達因子分析”といわれる。

実施例３ この実施例は、ここに参照として挿入する４４Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋｅｔ　ａ ｍに従う伝達因子のアフィニティー精製を記載する。１ｍｍｕｌｏｎ　２　Ｒｅ ｍｏｖａｗｅｌｌストリップに、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，６ 中の濃度が１００−２００μＭの抗原を鵬たした。ウェルを４℃の加湿室中で終 夜インキュベートし、その後ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ　２０溶液（０，１５Ｍ　ＰＢ Ｓ、ｐＨ７，４，０゜５ｍｌ　ＴＷＥＥＮ−２０／リツトル）で３回洗浄した。

その後牛血清アルブミンを１００ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。ウェルを室温で１ 時間インキュベートして残りの蛋白質結合部位を飽和させた。

これをＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ溶液で更に３回洗浄した。その後伝達因子を含む膵臓 細胞透析液を１０”単核ｃｅ（細胞当量）／ｍｌで、及び３００μ■の体積で適 用した。前に加えた抗原に対応する透析液を用い、例えばフェリチンで免疫した 動物からの細胞溶解産物をフェリチン処理ストリップと共に用いた。その後スト リップを４℃の加湿室で２４時間インキュベートした。

ウェルをＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ　２０でさらに２回及びその後ＰＢＳでさらに１回 洗浄した。その後３００μｌのアセトニトリルを加え、ウェルを室温で１０分間 インキュベートした。上澄み液を取り、２．４ｘｌＱ”ｃｅに対応する量（２， ４ｍ１）を上記の生体内伝達因子分析のために取り置いた。試料を３７℃の水浴 中窒素下で乾燥した。分析用の試料を精製水を用いて１０’ｃｅ／ｍｌに再構成 した。さらに続く精製段階で使用する材料をｌ−５ｍ１の５ｍＭ炭酸水素アンモ ニウムに溶解した。この材料の利用は、本文に記載する。

実施例４ その後アフィニティー精製伝達因子を逆相高圧液体クロマトグラフィーにかけた 。ここで従来のカラム溶媒、すなわちトリフルオロ酢酸及びアセトニトリルを使 用すると伝達因子の失活を招くことに注意しなければならない。従ってカラムの 運転のための新規溶媒系を工夫して伝達因子活性を保護しなければならない。

１０から３０ｘｌＯ”ｃｅを０．２−０．５ｍ１体積の精製水に溶解し、これを １．０ｍｌ／分の流量で５．ＱｍＭの炭酸水素アンモニウムを用い、４．６ｘ２ ５０ｍｍ　Ｖｙｄａｃ、２１８７Ｐ５４オクタデシルシランカラムに適用した。

１分間隔で留分を集め、ＵＶデータにより検出した。これは１．０秒間隔で２０ ３−２８０ｎｍのＵＶスペクトルをとり、２１．４ｎｍの吸収を監視することに より行った。

囲の場合すべての伝達因子活性が空容積（ｖｏ　ｉ　ｄ　ｖｏ　１　ｕｍｅ）中 に溶離することを示した。従って平等に５ｍＭ炭酸水素アンモニウムを用いて溶 離を行い、非保持ピークを集めた。通常２．５ｘｌＯ”ｃｅを含むアリコートを 生体内伝達因子分析のために取り置いた。残りを凍結乾燥し、１、Ｑｍｌの１０ ｍＭ蟻酸を用いて再構成し、ゲル濾過カラム上の多望（ｐｏｌｙｔｙｐｅ）高圧 液体クロマトグラフィーによりさらに精製するために一２０℃で保存した。

実施例５ この実施例は、ゲル濾過カラム上の多型高圧液体クロマトグラフィーを用いた伝 達因子の精製を目的とする。

カラムの製造者は、試料成分とカラム床材料の間の非特異的相互作用を最小にす るために、イオン濃度が少なくとも０．１Ｍの溶離剤を薦めている。製造者の推 薦による濃度より１０倍低いイオン濃度を用いて伝達因子試料の最も高い分離が 達成された。

これを行うために、２Ｏ−３０ｘｌＯ”ｃｅの単核細胞を０．　２−０゜５ｍｌ の体積で、直列に結合した２本の７．８ｘ３００ｍｍゲル濾過高圧液体クロマト グラフィーカラムに適用した。これを９．５ｍｌ／ｍｍの流量でポンプにより汲 み上げたｌＱｍＭの蟻酸を用いて溶離した。この系の空容積は１２．２ｍｌであ り、１．０分間隔で留分を集め、上記の通りに検出を行った。

実施例６ イオン対形成剤ＴＢＡＰ及び逆相高圧液体クロマトグラフィーのための４．Ｏｘ ３００ｍｍオクタデシルシランカラムを用い、比較データを得た。出発溶媒とし て５ｍＭのＴＢＡＰを、最終溶媒として８０％アセトニトリルを用いた試験実験 における勾配溶離は、伝達因子のすべてが２５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル濃度 以前に溶離することを示した。溶媒”Ａ”　として５ｍＭのＴＢＡＰ／アセトニ トリル（９２：　８　；　ｖ／ｖ）、溶媒“Ｂ”として５ｍＭのＴＢＡＰ／アセ トニトリル（７５：２５：ｖ／Ｖ）を用いて直線勾配を行った。勾配の形式は、 ０％Ｂ（１０分間）、０−１００％Ｂ（５分間）及び１００％Ｂ（５，５分間） であった。流量は０．５ｍｌ／分であり、検出は上記の通りに行った。

実施例７ Ｍｅｙｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、により開発されたゲル濾過高圧液体クロマトグ ラフィー法を採用して分子量決定を行った。各試料を直列蕃こ結合した２本の７ ．８ｘ３００ｍｍのゲル濾過高圧液体クロマトグラフィーカラムに、溶離剤とし て２００ｍＭのＮａＣ１を含む５ＯｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，０を 用いて通した。試料をその溶解性に依存して溶離剤又は１．ＯｍＭのＨＣｌのい ずれかに溶解した。溶離剤に関して実験的に決定した０、４９ｍ１／分の流量を 用いた。空容積は１２ｍ１　（２４，４分）であり、合計透過容積は２２．　５ ｍｌ　（４６，０分）であった。

実施例８ 微量透析法を用いて精製伝達因子調剤の分析を行った。微量透析法は、０ｖｅｒ ａｌｌ”に記載の方法の修正法であった。５ｐｅｃｔｒａ／Ｉ）ｏｒ７透析管を 小さい四角に切断し、精製水中で洗浄した。濯いだ透析膜を、２５μｍ／ｍｌの グルタミン酸三元ポリマー、Ｍｒ４０５を２５μｌ／ｍｌのペプチドＬＷＭＲＦ Ａ、Ｍｒ８２３と共に含む０．１％（Ｗ／Ｖ）のＮａ１Ｎ溶液と共に４℃にて１ ６時間インキュベートすることにより、可能なペプチド結合部位を飽和した。上 澄み液を捨て、精製水を管に加え、その後穏やかに振った。少なくとも８回濯ぎ を繰り返した。

この後、加熱したパスツールピペットの広い端を用いて１．５ｍｌの微量遠心管 のキャップに穴を開けた。２００−１０００μｌの範囲の透析試料を管に入れ、 透析膜片を解放端を横切って置いた。キャップを閉め、管を逆さにし、テープを 用いて５００ｍ１の純水を含む透析室の内壁に固定した。チューブの小片で覆っ た“Ｕ”型又はフック型のチップドパスツールピペット（ｔｉｐｐｅｄ　ｐａｓ ｔｅｕｒ　ｐｉｐｅｔ）を用いて、捕獲された空気を除去した。

透析は４℃にて定常的に撹拌しながら、試料の容積に依存して２−６時間行った 。透析液を捨て、必要な場合は上記を繰り返した。微量遠心管を取り出し、微量 遠心で１０秒遠心した。滅菌したチツブドマイクロピペットを用いて試料を注意 深く取り出した。

実施例９ 膵臓細胞透析及び上記のアフィニティー精製材料を用いて投薬量一応答研究を行 った。これらの実験では、上記のフットバッドの遅延片過敏症分析を行った。各 データ点に関した６匹のマウスの群を使用し、試料の腹腔内注射の２４時間後に 抗原を注射することにより試験を行った。

バックグラウンドフットバッド応答は、腹腔内試料を与えないマウスを示す。こ れは図２及び３にて“Ｑｃｅ”により示す。決定の係数は、ｒ２により表す。

図２及び３はこれらのデータを示す。いずれの場合も“Ａ”はオボアルブミン特 異的伝達因子を用いた結果、及び“Ｂ”はフェリチン特異的伝達因子を用いて得 た結果を示す。

これらのデータにおいてフットバッド膨潤の大きさは、粗選析液を用いた場合投 薬量のｌｏｇ、。に比例した。これはＲｏｚｚｏ　ｅｔ　ａｌ。

により以前に観察されている。決定の係数（ｒ２）は、０．９７（図２Ａ）及び ０．９９Ｃ図２Ｂ）であり、従ってデータは関連性を良く表している。

図３に示す通り、曲線は類似しているが決定の係数が図３Ａの場合０゜８０及び 図３Ｂの場合０．８２と低い。

実施例１０ 上記の精製案に従い、やはり上記の通りにして収率及び特異的活性を算出した。

これらの結果を下記の表１に示す。オボアルブミン伝達因子は、収率６６％で特 異的活性の４６倍の増強を示し、フェリチン伝達因子は５９％及び５３倍の値を 与えた。

表１において、“ＲＰＬＣ”は逆相液体クロマトグラフィーを言い、“ＧＦＣ″ はゲル濾過カラム上の多型高圧液体クロマトグラフィーを言精製材料に関する収 率及び比活性１ 表１の脚注 １　伝達因子活性の単位は、最大フッドパブト膨潤応答の半分を与えるのに必要 な伝達因子−含有試料の量（それが誘導される単核細胞当量（ｃ　ｅ）数で表す ）として定義する。比活性は、２１４ｎｍにおける吸光度当たりの伝達因子活性 の単位の数として定義する。

２　炭酸水素アンモニウムに基づく逆相高圧液体クロマトグラフィー法を用いて 調製。

３　多型用途のゲル濾過高圧液体クロマトグラフィーカラムを用いて調製。

実施例１１ 上記の過りアフィニティー精製材料につき、イオン対形成剤として５ｍＭのＴＢ ＡＰを挿入したｒｐｌｃを用いてクロマトグラフィー分析を行った。”ＴＢＡＰ ’はテトラブチルアンモニウムホスフェートに基づく溶媒系を言う。これらの実 験では、４３．２ｘｌＯ”ｃｅを４００μｍ容積で適用した。実施例６を参照し て留分を分析した。主発色団を２１４ｎｒｈで検出した。（留分３；時間＝２６ ．４分）は、伝達因子活性を含んだ。フェリチン特異的伝達因子を用いて得たデ ータを示す図４を参照してわかる通り、留分１及び５も非常に低い程度で活性を 示した。

活性は、前記のフットパッド分析を用いて測定した。

これらの結果により留分３に焦点を当てることを余儀なくされた。

実施例１２ アフィニティー伝達因子の溶離分布を得、典型的なものを図５に示す。

これを得るために、２３．３ｘｌＯ”ｃｅのアフィニティー精製アルブミン特異 的伝達因子を、ｒｐｌｃを用いて５０μｌ容積で適用した。すべての伝達因子活 性は非保持ピーク（留分Ａ）に溶離し、汚染物が保持された。上記のフットパッ ド分析を用いて伝達因子活性を測定した。留分Ａは１７．３３±１．２０ｘｌＯ −”ｍｍ　（ｐ＜０．００１）の膨潤を示し、留分Ｂ（不純物）は５．５±１． ６１ｘｌＯ−”ｍｍを示し、ｐは有意でなかった。

実施例１３ 上記の留分Ａを分析し、比活性が７％しか濃縮されていないことを示した。しか し表１に示す通り収率は１００％であった。これらのデータは、凍結乾燥して再 構成した留分Ａの再クロマトグラフィーが基本的に同一の非保持ピークを示すこ とを示した研究により確認された。

実施例１４ オボアルブミン伝達因子を得る場合と同様にして、フェリチン特異的伝達因子に 関して留分Ａの盟の材料を得た。この留分は、２．７５倍の濃縮を示した（表１ ）が、アフィニティー精製材料より明らかに２倍（２１２％）の収率、及び粗選 析液に対して１２５％の収率があった。

実施例１５ 実施例９に示す要領で、オボアルブミン及びフェリチン特異的伝達因子の両方の 場合の“留分Ａ”に関して投薬量応答曲線を得た。結果を図６Ａ及び６Ｂ（それ ぞれオボアルブミン及びフェリチン）に示す。決定の係数はそれぞれ０．９６及 び０１９７であった。

実施例１６ 留分Ａフェリチン特異的伝達因子材料をＴＢＡＰ系を用いて分析した。

１０．５ｘｌＯ”ｃｅを１００μｍの容積でカラムに適用した。図７に示す通り 分析は、４．７．１６．１．２１．３及び２６．４分で溶離する４種類の成分を 含んだ。伝達因子活性は、これらの最後で見いだされた。勾配の溶媒ベースライ ン吸光特性を修正した後、これは２１４ｎｍにおける吸光材料の約９０％に相当 した。

実施例１７ 多望ゲル濾過高圧液体クロマトグラフィーを用いて留分Ａ材料をさらに精製した 。そのために、２５．４ｘｌＯ”ｃｅを２００μｌの容積でカラムに適用した。

溶離剤は１０ｍＭの蟻酸であり、フェリチン特異的伝達因子留分Ａの溶離分布を 図８に示す。留分“ＡＩＩＩ”、すなわち溶離液の第３留分がすべての伝達因子 活性を含み、それをさらに研究した。

実施例１８ ゲル濾過高圧液体クロマトグラフィーからの７工リチン特異的伝達因子留分Ａｌ 夏１を、各留分からの５０μｌアリコートを５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムを 用いて中和し、無菌精製水で１．８ｘｌＯ’ｃｅ／ｍｌに希釈することにより分 析した。各留分に関して活性を分析した。

“ｐｒｅ”留分は、留分２４から３２までのプールを示し、“ｐｏｓｔ”留分は ４７−６０までである。伝達因子活性は、留分３９−４２のみで見いだされた（ 図９）。

実施例１９ 前の実験の場合と同様にして“留分ＡＩＩＩ“材料（両方の種類）に関して投薬 量応答曲線を誘導した。これらの結果をそれぞれオボアルブミン及びフェリチン 特異的伝達因子に関して図１０Ａ及びＩＯＢに示す。

オボアルブミンの場合決定の係数、ｒ２は０．８６であり、１．　３ｘｌＯ’ｃ ｅ当たり１活性単位でありだ。フェリチン特異的伝達因子はｒ！が０６９９であ り、］、、６８ｘｌＯ’ｅｅ当たり１活性単位であった。これらの結果は、１． 感作投薬量の抗原を与えられ、０．　５−２．　０ｘｌＯ８単核白血球を含むマ ウスからの膵臓が、オボアルブミンに関する３゜５ｘ４０’から１．５Ｘ１０’ 単位の伝達因子を与えるという結果を与える。フェリチンに関するデータは、図 １の精製案を用いた同様のマウスの場合３ｘｌＯ’から１．５ｘｌＯ’単位を示 唆している。

オボアルブミン特異的留分の比活性は一１曹分Ａ材料より１１％低いが、収率は ８５％であり、４４倍の濃縮を示唆している。フェリチン特異的留分に関して、 比活性は留分Ａより４８％低いが、アブィニティー精製材料より１．４倍高く、 透析液より７６倍高い。収率は４７％であり、累積収率は５０％となる。

実施例２０ Ｍｅｙｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、”のゲル濾過高圧液体クロマトグラブイ−法を 用いて留分ＡＩＩＮの純度を分析し、伝達因子の分子量も決定した。この系に適 用した留分ＡＩＩ！材料の溶離分布を図１１に示す。

２本のピークが観察され、主発色団（ピークｂ）が積算ビーク面積により定量し て２１４−ｎｍ吸光材料の９８％を与える。非常に少量の蛋白質につき従来の透 析を行うと回収率が低いことが多いので、生体内伝達因子活性の分析の前に、０ ｖｅｒａ１１”（８６）により報告された微量透析法の普正法により各ピークか らの材料を脱塩した。試験実験の場合この方法を用いると、伝達因子活性が定量 的に回収された（データは示していない）。微量透析の後、試料を１ｍｌ当たり ４Ｘ１０７ｃｅの濃度とし、伝達因子活性に関して調べた。活性はピークｂ中の 材料の場合のみに検出された。

この系を用いて（１０ｇ＋ｏ分子量＝５．７７６９−（０，１１５９）（溶離容 積）　；　ｒ”＝０．　８７８図１２の形態の）標準的曲線を得、そわに関する データは別々の実験で８種類の各分子量マーカーを適用することにより得た。鶏 卵アルブミンを用いて系の空容積（１２，０ｍ１）を決定し、アセトンを用いて 合計透過容積（２２，５）を決定した。

ピークｂの保持時間を用いて溶離容積（１７，９８ｍ１）を決定し、今度はそれ を用いて伝達因子の場合の相対的分子量を４，９００ダルトンと算出した。フェ リチン特異的材料の場合の伝達因子活性は、１７゜９８ｒｎｌ　（留分ｂ）の溶 離容積に相当する。留分ａの場合、４ｘｌＯ’ｃｅの受容体によるフットバッド 応答は５．８３±１０−”ｍｍ　（ｐは有意でない）であり、留分すの場合１９ ．５０±１．８２ｘｌＯ−”ｍｍ（ｐ＜０．００１）であった。留分すを示すピ ークは、２１４ｎｍ吸光材料の９８％を含んだ。

分子量の決定のために、同一系を用いて図１２に示す標準的曲線を得、そのため に別々の実験で分子量マーカーを用いることによりデータを得た。分析により伝 達因子の分子量が約４９００から約５５００ダルトンであると算出された。

実施例２１ 精製伝達因子に関するスペクトルデータ（溶媒吸光度に関して修正した）ピーク ｂの最大で得た紫外スペクトルを図１３に示す。２．５ｘｌＯ”単核細胞当量の 材料から得たこれらのデータは、伝達因子精製を監視するために古典的に用いら れた波長、例えば２５４ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍを含む２３５ｎｍ以上 の波長で比較的低い吸光度を示す。実際に伝達因子は、２１４ｎｍで２５４又は ２８０ｎｍより１００倍大きい吸光度を有する。従って紫外分光光度計を用いて クロマトグラフィーを監視する場合、２１４ｎｍなどの低波長を使用することが できるクロマトグラフィー溶媒が、伝達因子検出の感度に実質的に有益であると 思われる。

実施例２２ 精製ＡＩＩＩ留分伝達因子の抗原特異性を研究する。オボアルブミン又はフェリ チン（１，Ｏｍｌ中１０”Ｃｅ）のひとつに応答し、２４時間後にオボアルブミ ン又はフェリチンを用いて攻撃して生産した伝達因子調剤をマウスに注射した。

どちらの調剤も非対応抗原に対する応答は誘起しないが、両方とも対応材料を用 いて遅延型過敏症を示し、伝達因子が抗原特異性を保持していることを示した（ 図１４）。

本文に示す伝達因子−含有透析液は、非常に類似した特異的活性を示しくオボア ルブミン：２１４ｎｍで４９５単位：フエリチン：　２１４ｎｍで４３６単位） 、非常に有力な調剤であることを示す。表１のデータは、約１０ｓ！の単核白血 球を含む１匹の感作マウスの膵臓が、少なくとも１０００、おそら＜１０．００ ０匹もの多くの非感作受容体に有意な遅延型過敏症を伝達するのに十分な伝達因 子を生産することを示唆している。

アフィニティー精製段階、すなわち伝達因子がその抗原と反応する段階は、伝達 因子活性の約４０％の損失を引き起こすが、比活性を約５０倍増強する。従つて 精製伝達因子は非常に特異的で非常に活性である。

ＮＨ，ＨＣＯ，に基づく系で使用した場合、アフィニティー精製伝達因子は空容 積溶離液中に溶離し、材料の極性が高いことを示す。アフィニティー精製オボア ルブミン特異的伝達因子に関して得たデータは、比活性が少し強化され活性材料 の損失がないことを示す。フェリチン特異的伝達因子は、予測性の低い結果を与 えた。比活性の２．７５倍の向上を２１３％という見掛けの収率及び紫外吸光度 の減少と併せて考えると、中でも伝達因子の阻害剤が除去されたことを示唆して いる。実際Ｒｏｚｚｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｏｔｋｏｅｄｋｙ　ｅｔ　ａｌ、及び Ｇｏｔｔｌｉｅｂは、そのような因子の存在を示唆している。４嘗、　Ｓ＠、　 ｍｌ以前の研究が伝達因子分子の一部としてオリゴヌクレオチド残基を仮定した ことに注意した。記載の方法がこの残基を除去することは可能性があるが、それ は２８０ｎｍに有意な吸光がないことを説明もしていないし、生物学的活性の保 持の説明もしていない。従つて抗原特異的伝達因子は、分子量が約４９００−約 ５０００ダルトンのペプチド分子であると思われる。これらの伝達因子は、感作 動物中で非常に少量であるが非常に有力な量で生産される。

実施例２３ 精製された伝達因子のアミノ酸組成分析精製された伝達因子をこれらの分子の特 徴および性質に関する情報を得るために分析した。フラクション１１１（セファ デックスＧ−１０上でのポリタイプクロマトグラフィーから）およびフラクシヨ ンＡＩＩＩ　（高圧液体クロマトグラフィーから）の試料をこの目的用に使用し た。可能なら、最少量の試料処理を必要とし且つ高感度を与える非破壊方法を適 用した。これは物理的に少量の使用材料のためおよびある場合には生物学的活性 を保有するために重要であった。

アミノ酸組成分析、還元およびアルキル化並びにその後のクロマトグラフィー分 析および質量分光、ゲル濾過高圧液体クロマトグラフィー、５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動、および紫外線分光分析を行って伝達因子の純度および分 子特徴を試験した。精製された伝達因子の受容体による応答の抗原特異性も研究 した。

主要な構造情報を得るために数種の方法を使用した。その後、臭化シアン、トリ プシンまたはｖ８プロテアーゼを用いる一連のペプチド地図作成実験を行って切 断し、その後、微孔高圧液体クロマトグラフィーを行った。これらの実験の生成 物に対してアミノ酸配列分析を行った。

５．３Ｘ１０”ｃｅの補正値を含むフェリチン−特異性フラクションＩＩＩ物質 をアミノ酸組成分析にかけた。結果を表ＩＩに示す。結果は６５％の極性アミノ 酸類からなる伝達因子に関する蛋白質性質と一致している。データは、約０．５ ｐモルの伝達因子が１０８個の単核細胞から得られることを示唆している。

伝達をフェニルアラニンのモル含有量への標準化によりモルフラクション値に変 換した。モルフラクション値を基にして、約５．５００ダルトンの分子量が伝達 因子に対して予期された。

生成された伝達因子の能力。約６．０００単位のフェリチン伝達因子活性が１× １０８個の単核牌細胞から得られ（表ＩＩ）そして約０．５ピコモルの伝達因子 がｌ　Ｑ”ｃ　ｅから得られるため、この結果はＩＱ−１１モルの桁の量の伝達 因子がＤＴＨ応答の表示用の意義ある感度を与えるのに充分であることを示唆し ている。この結果は伝達因子の高い生物学的能力を強調するものである。

表ＩＩ フェリチン伝達因子−含有フラクシヨンＩＩＩのアミノ酸組成分析アミノ酸　量 （ピコモル）　残基の数１　分子量に対する寄与＾ｓｘ　２．３　１　１３３ Ｇｌｘ　１０．７　３　４４０ ３　２２、０　６　５２２ Ｇ　４４．４　１２　６８５ ＩＩ　５．８　２　２７４ Ｒ７，５２３１２ Ｔ　１３．８　４　４０４ Ａ　１９．０　５　３５５ Ｐ　５．８９　２　１９４ Ｙ　１０．４　３　４９０ Ｖ　７．９　２　１９ｇ 菖８．８２２６２ Ｉ　５．４　２　２２６ Ｌ　１７．２　５　５６６ Ｆ　３．６　１　１４７ Ｋ　６．７　２　２５６ 合計”　１９１．３　５４　５４８２”重　データはフェニルアラニンに標準化 された。

２　ＷおよびＣは加水分解中に破壊されたため、含まれていない。

３　非−ベビチジル残基に対して１モルの水に調節された。

実施例２４ 還元されそしてアルキル化された伝達因子のクロマトグラフィー分析フラクシコ ンＩＩＩフェリチン−特異性伝達因子をそれぞれジチオスレイトールおよび４− ビニルピリジンを用いて還元しそしてアルキル化して構造情報を得た。還元され そしてアルキル化された試料をオクタデシルシランマトリックスを含有している 高圧液体クロマトグラフィーカラムに適用した。出発溶媒として５．０ｍＭ炭酸 水素アンモニウムを用いモしてＯから６０％へのアセトニトリルの線状勾配を導 入して、溶出を行った。図１５Ａは還元およびアルキル化生試料からの溶出像を 示しており、図１５Ｂは還元されそしてアルキル化されたフラクシヨンＩＩＩ伝 達因子のものを示している。非保有ピークは還元されそしてアルキル化されたフ ラクシヨンＩＩＩ伝達因子に関するものの方が生試料より相当大きかった。２種 のクロマトグラムの間には他の明白な差はなかった。

非保有フラクション中の還元されそしてアルキル化されたワラクシ３ンＩＩＩ伝 達因子の、炭酸水素アンモニウムを基にした逆相高圧クロマトグラフィーシステ ム（図１５Ｂ）からの溶出量は、疎水性の損失または少量増加量と一致している 。

非保有ピークを集めそして個別にセファデックブスＧＩＯクロマトグラフィーシ ステムに適用した。図１６Ａおよび１６Ｂはそれぞれ対照用およびフラクシヨン ＩＩＩ試料に関する溶出像を示している。単独のユニークなピークが実験試料に 関して観察された（ｔＲ＝６７．６０分）。

非保存フラクシコンのセファデックッスＧ−１０システムへの適用では、空試験 （図１６Ａ）と比べて単独の保有ピーク（図１６Ｂ）を発現させた。天然のフラ クシジンＩＩＩと比べて還元されそしてアルキル化されたフラクシヨンＩＩＩに 関する保有時間は変動するようである。

実施例２５ 精製された伝達因子の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析フラクショ ンＡＩＩＩ材料の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を非−還元性条 件下で行った。図１７に示されている結果は、ゲル濾過クロマトグラフィーによ る分析を用いて観察された結果を立証している。銀染色を用いる過剰現像後の各 調整物に関して単独の帯が観察された。２種の調整物は「陰に」染色されており そして分離用ゲル中への同じ泳動距離を有する帯を生じたが、オバルブミシー特 異性伝達因子に関する帯の方がフェリチン−特異性伝達因子に関するものより顕 著であった。銀をイオン状態から金属状態に還元させることができるアミノ酸類 の明白な相対的不足のために、その後我々はクーマツシープルーＲ−３５０を用 いてゲルを染色した。これはオバルブミシー特異性伝達因子に関する透明領域に より囲まれている陽の像を発現させたが、それより顕著でないフェリチン−特異 性伝達因子帯に関しては帯／バックグラウンドコントラストに幾らかの減少があ りだ。この結果は両者の伝達因子に関する５、　４００ダルトンの相対的分子量 を示しており、そして各調整物に関する高い純度を示している。

実施例２６ 伝達因子のペプチド地図作成および切断フラグメントの精製伝達因子に関するペ プチド地図作成は、伝達因子の切断用にＣＮＢ　ｒを用いて行われた。フェリチ ン−特異性またはオバルブミシー特異性フラクシ窪ンＡ　ＩＩＩ伝達因子のいず れかを酸性溶液中に溶解させ、そしてＣＮＢｒを加えた。培養後に、反応混合物 を凍結乾燥し、再構築し、そして逆相微孔高圧液体クロマトグラフィーに適用し た。この目的用には、水中の０１％ＴＦＡから水中の５０％アセトニトリルへの 線状勾配を用いた。空試験と比べて実験試刺では意義のあるユニークなピークは 観察されなかった。

ペプチド地図作成を行うためにフラクションＡＩＩＩブエリチシー特異性伝達因 子をトリプシンの存在下で培養した。反応混合物の微孔逆相高圧液体クロマトグ ラフィーからの溶出像は図２３に示されている。対照用試料（図１８Ａ）と比べ て伝達因子を含有している試料（図１８Ｂ）に関しては２個のユニークなピーク が観察された。これらのピークのいずれからもアミノ酸配列データは物質から得 られなかった。

フェリチン−特異性もしくはオバルブミシー特異性フラクションＡＩＩＩのいず れかまたはクロマトグラフィー流出液対照試料を炭酸水素アンモニウムおよびド デシル硫酸ナトリウムの溶液中に溶解させた。Ｖ８プロテアーゼをこれらの溶液 に加え、そして溶液を１８時間にわたり培養した。培養後に、試料をオクタデシ ルシラン充填剤を含有している１゜ＯＸ１００ｍｍ逆相微孔高圧液体クロマトグ ラフィーに直接適用した。

出発溶媒としての０，０１％（重量／容量’）ＳＤＳを含有している５ｍＭ炭酸 水素から最終的溶媒として０．０１％（重量／容量）ＳＤＳを含有しているアセ トニトリル１５ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液（６０：４０、容量／容量）まで の線状勾配で用いて溶出を行った。

これらの実験から得られた溶出像を図１９に示す。フェリチン−特異性伝達因子 に関する３種の流出液対照用およびオバルブミシー特異性伝達因子に関する２種 の流出液対照用のｖ８プロテアーゼ消化物を微孔高圧液体クロマトグラフィーを 用いて分析した。全ての５種の対照用試料に関しては本質的に同じ結果が得られ た。流出液対照用（図１９Ａ）と表ＩＩＩ 精製された伝達フラグメントのｖ８プロテアーゼ消化物に関する保有時間 オバルブミシー特異性伝達因子フラクションＡＩＩＩｐｉ　７．０’　ｐ５　３ ０．６’ ｐ２　１３．９’　ｐ６　３３．３＠ ｐ３　２１．６２ｐ７　４４．９’ ｐ４　２６．６３ｐ８　５５．３” ピーク表示　保有時間（分）　ピーク表示　保有時間（分）フェリチン−特異性 伝達因子フラクシヨンＡＩＩＩｐｉ　４．６’　ｐ５　３２．２’ ｐ２　Ｎ３．６’　ｐ６　３４．　ｌ・ｐ３　２１．０”　ｐ７　５３．７’ ｐ４　２６．０’　ｐ８　６７、０’ １、　！、　３　共通ピーク ｊ　ｊ　８．７同様であるが顕著なりロマトグラフィー移動度を有する電位的に 関連しているピーク ８、′　ユニークなりロマトグラフィー移動度を有するピークすでに示されてい る如く、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドからなる先行技術の分子は多くの病 理学的症状の治療に含まれている。精製された蛋白質伝達因子が特異性抗原に対 する遅延型過敏性を伝達すること比べた時に、鶏卵アルブミン−特異性伝達因子 消化物（図１９Ｂ）およびフェリチン−特異性伝達因子消化物（図１９Ｃ）に関 しては８Ｍの伝達因子−誘導ピークが観察された。伝達因子溶出像を互いに比べ ると、３個のピークは両方の調整物に共通であったが他の５個はそうでなかった （表ＩＩＩ）。５個のピークの中で、４個は顕著であるが同様な保有時間を有し ているようであり、そして各クロマトグラム内でのそれらの相対的位置は同様で あるようである。各調整物は他の調整物のどれと比べてもそれの保有特性におい て完全に無関係であると思われる１個のピークを生じた。

がそこに示されている。従って、本発明はある量の伝達因子を免疫応答が必要で あるかまたは非−感作性個体に対して抗原に対する細胞介在免疫の表示を刺激す るのに充分な量で投与することにより免疫不全を補正しなければならいような病 理学的症状の治療を包括している。

実施例２７ ヘルペス−特異性伝達因子を用いる慢性または再発性の単純ヘルペス感染症の治 療 この治療用の患者は、培養法で証明されているＨ８Ｖ−１またはＨ３Ｖ−２によ る皮膚の、唇のおよび／または生殖器の感染症を有している。

免疫リンパ球から抽出された伝達因子の受容者への投与量は５Ｘ１０”リンパ球 当量である。これはここで実施例１−２０中に略記されている工程成績表に従い 製造された約５０ｎｇの実質的に純粋な伝達因子である。合成された伝達因子の 受容者は各治療において約５０ｎｇの物質を受容する。全ての調整物は上記の定 量的な足踵膨潤検定による陽の試験性を有している。注射は毎月行われる。応答 の監視は病変および兆候記録カードを用いて行われそして単純ヘルペス抗原に対 しては細胞−介在免疫応答を監視することにより行われる。

“実施例２８ 特異性伝達因子を用いる慢性の粘膜皮膚カンジダ症の治療一般的工程成績表はカ ークバトリック（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ）およびグリーンベルブ（Ｇｒｅｅｎ ｂｅｒｇ）”により使用されたものに従った。患者を最初に例えばアンフォテリ シンＢ１フルコナゾール、またはケトコナゾールの如き抗菌・カビ剤で治療して 感染性有機体の作用を減少させた。

免疫リンパ球から抽出された物質を用いる特異性伝達因子治療法は６×１０９リ ンパ球当量の投与量を必要とする。この投与量は約６０ｎｇの精製された伝達因 子と解釈され、そしてこれは合成伝達因子用に使用されている投与量である。患 者はこの投与量を１．２．３および４月に毎月摂取し、次に６．８．１０および １２月に１月おきに摂取する。その後も、鎮静状態を保つために同じ投与量での 治療を４月間隔で行う。

実施例２９ 伝達因子を用いるミコバクテリア性および菌・カビ性感染症の治療これらの患者 における免疫学的に指示された治療の使用に関する理論的根拠は、細胞−介在免 疫および微生物活性が不足しているかもしれないという観察を基にしている。免 疫不全を生じる機構は部分的にだけ理解されており、そして異なる感染症の患者 においては幾らか異なる機構が存在している。

特異性伝達因子を用いる治療は１回の投与量当たり５Ｘ１０”リンパ球当量（５ ０月ｇの実質的に純粋な伝達因子）を使用する。合成伝達因子を用いる治療は１ ．２　ｐ　ｇｍの患者に影響を与える感染法に特異的な材料を使用する。各ロフ トの実際の投与量は定量的な足置検定を用いる能力検定により決められる。治療 は１月間隔で投与されそして感染症が治癒するまで続けられる。

前記の事項は本発明の好適態様にのみ関連していること並びに請求の範囲に示さ れている本発明の精神および範囲から逸脱しない限り多数の改変を行えることを 理解すべきである。

１　カークバトリック（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ）他、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 １３４：２　ビータージン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）他、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１ ２６　：　２４８０−３　ブルガー（Ｂｕｒｇｅｒ）他、Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ７．２９　：　４１０−４１３４　スピルター（Ｓｐｉｌｔｅｒ）他の米国 特許番号３．９９１．１８２暴　パラム（Ｂａｒａｍ）他、Ｊ、　Ａｌｌｅｒｇ ｙ、　３３　：　４９８　５０６　（１９６２）−バラム（Ｂａｒａｍ）他、Ｊ 、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、９７　：　４０７−４２０　（１９６６）７　ローレン ス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）他、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、３４　：　２ １９−’　ｏ　−Ｌ／　：／　７．　（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）他、Ｊ、　Ｅｘｐ、 　ｌｅｄ、、１０４　：　３２１３２３９　ローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）他 、Ｔｒａｎｓ、＾５ｓｏｃ、　Ａｍｅｒ、　Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ、７６：　８ ４−８９　（１９６３） １・　ゴチリーブ（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）他、Ｌａｎｃｅｔ、　２　：　８２２　 ８２３　（１９７３）１１　ゴチリーブ（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）他の米国特許番号 ４．４６８．３７９１！　ゴチリーブ（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）他の米国特許番号４ ．６１６．０７９盲３　アララーチューブス（Ａｒａｌａ−Ｃｈａｖｅｓ）他、 Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、Ａｌｌｅｒｇｙ、　３１：　３５３−３６５　（１９６７ ） ＋４　ネイドハ−ト（Ｎｅｉｄｈａｒｔ）他、Ｃｅ１ｌ　Ｉｍ＋５ｕｎｏ１．． ９　：　３１９−３２３＋５　レイモンド（Ｒｅｙｓ＋ａｎｄ）他、Ｖａｘｓａ ｎｇ、２９：３３８　３５１１６　デュニフク（Ｄｕｎｎｉｃｋ）他、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　７２　：＋７　ファンデン バルク（Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ）他、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１１８：１８　 デｘ　二”ｌり（Ｄｕｎｎｉｃｋ）他、Ｊ、）Ｈｕｎｏｌ、、１１８：１９４４ −■　ブルガー（Ｂｕｒｇｅｒ）他、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２２：１０９ １−１０９８２０　ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、Ｔｒａｎｓ、　Ａｓ５ｏｃ、 Ａｍｅｒ、　Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ、　９２　：Ｈポルバク（Ｂｏｒｖａｋ）他 、＾ｃｔａ　Ｖｆｒｏｌ、、２９：１１９−１２８２！　ワレン（Ｗａｒｒｅｎ ）の米国特許番号４．４３５．３８４ｚ３　ボウスト（Ｇｏｕｓｔ）他の米国特 許番号４．００１．０８０！４　ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）他の米国特許番号 ４．８１６．５６３！Ｓ　カークバトリック（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ）、Ｊ、 Ａｌｌｅｒｇｙ　ＣＨｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、８１　：　８０３−８１３．１９ ８８ ２＃　ボルコフスキイ（Ｂｏｒｋｏｗｓｋｙ）他、Ｊ、　Ｉ＋＋ｎｕｎｏ１．． １２６：４８６−４８９．１９８１ ２７　カークバトリック（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ）、上記ゴｒａｎｓｆｅｒ　 Ｆａｃｔｏｒ”、８０８頁 ＝８　ピザ（Ｙｉｚａ）他のヨーロッパ特許出願１０１，２００２９　米国特許 番号４．４３５．３８４３・　カークパトリック（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ）他 、カーノ（Ｋｈａｎ）他編集、ＩｍｍｕｎｅＲｅｇｕｌａｔｏｒｓ　Ｉｎ　Ｔｒ ａｎｓｆｅｒ　Ｆａｃｔｏｒ中、５４７−５５９頁（アカデミツク・プレス、１ ９７９） ３宣　カーノ（Ｋａｈｎ）他、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ１１６３　：１７７ 　１８５３２　デュイヤ−（Ｄｗｙｅｒ）、カークバトリック（Ｋｉｒｋｐａｔ ｒｉｃｋ）他、Ｉｓｎｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｆａｃ ｔｏｒ中、２３３−２４３頁（アカデミツク・プレス、１９８３） ３！　ピザ（Ｖｉｚａ）他、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ、　４　：　２７− ３０　（１９８５）３４ステイーレ（Ｓｔｅｅｌｅ）他、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ 、　１ｌｅｄ、、３０３　：　３５５−ｊ″　ルーイエ（Ｌｏｕｉｅ）他、Ｃｌ １ｎ、　ｒｓｍｕｎｏｌ、　ｒｗｍｕｎｏｐａｔｈ、　４４　：　３２９−３６ マツクミーキング（ＭｃＭｅｅｋｉｎｇ）他、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、 　１５１：３丁　スティーレ（Ｓｔｅｅｌｅ）他、上記文献＊　Ｉ　７　ツクミ ーキング（Ｍｃｌｌｅｅｋｉｎｇ）他、上記文献３書　スティーレ（Ｓｔｅｅｌ ｅ）他、上記文献４・　バーネット（Ｂｕｒｎｅｔ）、Ｊ、Ａｌｌｅｒｇｙ　ａ ｎｄ　Ｃ１１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５４　：４Ｉ　パーネット（Ｂｕｒｎｅ ｔ）、上記文献４！　ビータージン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）他、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、、１２６　：　２４８０−４ｓ　カークバトリック（Ｉｆｒｋｐａｔｒｆ ｃｋ）他、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３４：４４　カークパトリック（Ｋｉｒ ｋｐａｔｒｉｃｋ）他、Ｊ、　Ｉｓｍｕｎｏｌ、、１３５：ｌ　メイヤージン（ Ｍｅｙｅｒｓｏｎ）他、、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　７　：　４８１　４８９４６　 オーバーオール（Ｏｖｅｒａｌｌ）、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｉ、　、、、１ ６５　：　２０８−２１、Ｊ（１９８７） ４７　メイヤージン（Ｉｌｅｙｅｒｓｏｎ）他、上記文献４＠　オーバーオール （Ｏｖｅｒａｌｌ、）、上記文献４曹ロゾ（Ｒｏｚｚｏｏ）他、Ｃｅ１ｌ　Ｉ＊ ５ｕｎｏ１．．１１５　１．３Ｏ−１４５（１，９８８） ひ０　ポルコフスキイ（Ｂｏｒｋｏｗｓｋｙ）他、カークパトリック（Ｋｉｒｋ ｐａｔｒｉｃｋ）他編集、Ｉｓ　ｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｆｅ ｒ　Ｆａｃｔｏｒ中、９１−１１５頁（アカデミツク・プレス、１９８３） ｓｌ　ゴチリーブ（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）の米国特許番号４．６１６．０７９およ び４．４６８．３７９ ｓｌ　カークバトリック（［１ｒｋｐａｔｒｉｅｋ）他、カー２（Ｋｈａｎ）他 編集、Ｉｍｍｕｎｅｔ？ｅｇｕｌａｔｏｒｓ　Ｉｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｆａｃ ｔｏｒ中、５４７−５５９頁（アカデミツク・プレス、１９７９） 溶解された感作肺細胞 粗製透析物 親和性精製 Ｆｉｇ、　１ 投与量（ｃｅ） 投与量（ｃｅ） 投与量（ｃｅ） 投与量（ｃｅ） 時間（分） 投与量（ｃｅ） 投与量（ｃｅ） 時間（分） 投与量（ｃｅ） 時間（分） 溶出量（■１） 波長、ｎｍ 伝達因子標本 時間（分） 時間（分） 時間（分） 時間（分） ＺＧＩ７ 時間（分） ＦＩＧ　ｌ＆Ａ 時間（分） 時間（分） ＦＩＧ　１９Ａ 時間（分） ＦＩＧ　１９Ｂ ｌＧ１９Ｃ 要　約　書 本発明は、２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも５０００単位の特異的 活性を有する本質的に純粋な伝達因子に関するものである。

本発明はまた、細胞溶解物からの該伝達因子の製造方法にも関するものである。

本発明は、感染性の病気を治療するための２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少 なくとも５０００単位の特異的活性を有する本質的に純粋な伝達因子の使用も含 んでいる。

国際調査報告 、−、＝　ＰＣＴ／υ５９１１０４７７９　−ＰＣＴ１０５９１／＠４７７９　 ＾ｔｔｓＩｃｈ＋５ｅｎｔ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも５０００単位の特異的活性を 有する本質的に純粋な伝達因子。 ２．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも１０，０００単 位である、請求項１に記載の本質的に純粋な伝達因子。 ３．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも２０，０００単 位である、請求項１に記載の本質的に純粋な伝達因子。 ４．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも６０，０００単 位である、請求項１に記載の本質的に純粋な伝達因子。 ５．逆相高性能液体クロマトグラフィー上での単独ピークとして泳動し、２１４ ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも５０００単位の特異的活性を有している 、アミノ酸分析により測定された約４５００−５５００ダルトンの間の分子量を 有する本質的に純粋な伝達因子。 ６．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも１０，０００単 位である、請求項５に記載の本質的に純粋な伝達因子。 ７．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも２０，０００単 位である、請求項５に記載の本質的に純粋な伝達因子。 ８．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも６０，０００単 位である、請求項５に記載の本質的に純粋な伝達因子。 ９．ａ．抗原−特異性伝達因子が抗原と結合して伝達因子複合体を生成し易い条 件下で特異的に伝達因子が結合している運動抑制された抗原に、伝達因子−含有 試料を接触させ、そしてｂ．生じた本質的に純粋な伝達因子が２１４ｎｍにおけ る吸収単位当たり少なくとも５０００単位の特異的活性を有する抗原−特異性伝 達因子を複合体から分離する 段階を含んでなる、本質的に純粋な伝達因子を製造する方法。 １０．伝達因子−含有試料を最初に約６，０００ダルトンより多い分子量分割点 を有する濾過手段により濾過する、請求項９に記載の方法。 １１．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも１０，０００ 単位である、請求項９に記載の方法。 １２．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも２０，０００ 単位である、請求項９に記載の方法。 １３．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも６０，０００ 単位である、請求項９に記載の方法。 １４．本質的に純粋な伝達因子含有試料が細胞溶解物である、請求項９に記載の 方法。 １５．ａ．抗原−特異性伝達因子が抗原と結合して伝達因子複合体を生成し易い 条件下で特異的に伝達因子が結合している運動抑制された抗原に、伝達因子−含 有試料を接触させ、 ｂ．抗原−特異性伝達因子を複合体から分離し、ｃ．分離された抗原−特異性伝 達因子を逆相高性能液体クロマトグラフィーカラム上に適用し、そして ｄ．本質的に純粋な伝達因子が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも５ ０００単位の特異的活性を有する本質的に純粋な伝達因子を溶出させる 段階を含んでなる、本質的に純粋な伝達因子を製造する方法。 １６．伝達因子−含有試料を最初に約６，０００ダルトンより多い分子量分割点 を有する濾過手段により濾過する、請求項１５に記載の方法。 １７．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも１０，０００ 単位である、請求項１５に記載の方法。 １８．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも２０，０００ 単位である、請求項１５に記載の方法。 １９．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも６０，０００ 単位である、請求項１５に記載の方法。 ２０．本質的に純粋な伝達因子含有試料が細胞溶解物である、請求項１５に記載 の方法。 ２１．ａ．抗原−特異性伝達因子が抗原と結合して伝達因子複合体を生成し易い 条件下で特異的に伝達因子が結合している運動抑制された抗原に、伝達因子−含 有試料を接触させ、 ｂ．抗原−特異性伝達因子を複合体から分離し、ｃ．分離された抗原−特異性伝 達因子をゲル濾過高性能液体クロマトグラフィーカラム上に適用し、そして ｄ．本質的に純粋な伝達因子が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも５ ０００単位の特異的活性を有する木質的に純粋な伝達因子を溶出させる 段階を含んでなる、本質的に純粋な伝達因子を製造する方法。 ２２．伝達因子−含有試料を最初に約６，０００ダルトンより多い分子量分割点 を有する濾過手段により濾過する、請求項２１に記載の方法。 ２３．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも１０，０００ 単位である、請求項２１に記載の方法。 ２４．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも２０，０００ 単位である、請求項２１に記載の方法。 ２５．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも６０，０００ 単位である、請求項２１に記載の方法。 ２５．本質的に純粋な伝達因子含有試料が細胞溶解物である、請求項２１に記載 の方法。 ２７．ａ．抗原−特異性伝達因子が抗原と結合して伝達因子複合体を生成し易い 条件下で特異的に伝達因子が結合している運動抑制された抗原に伝達因子−含有 試料を接触させ、 ｂ．抗原−特異性伝達因子を複合体から分離し、ｃ．分離された抗原−特異性伝 達因子を第一の逆相高性能液体クロマトグラフィーカラム上に適用し、 ｄ．第一の逆相高性能液体クロマトグラフィーカラムから抗原−特異性伝達因子 を溶出させ、 ｅ．該抗原−特異性伝達因子を第二のゲル濾過高性能液体クロマトグラフィーカ ラムに適用し、そして ｆ．本質的に純粋な伝達因子が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも５ ０００単位の特異的活性を有する本質的に純粋な伝達因子を第二のゲル濾過高性 能液体クロマトグラフィーカラムから溶出させる段階を含んでなる、本質的に純 粋な伝達因子を製造する方法。 ２８．伝達因子−含有試料を最初に約６，０００ダルトンより多い分子量分割点 を有する濾過手段により濾過する、請求項２７に記載の方法。 ２９．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも１０，０００ 単位である、請求項２７に記載の方法。 ３０．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも２０，０００ 単位である、請求項２７に記載の方法。 ３１．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも６０，０００ 単位である、請求項２７に記載の方法。 ３２．本質的に純粋な伝達因子含有試料が細胞溶解物である、請求項２７に記載 の方法。 ３３．ａ．抗原−特異性伝達因子が抗原と結合して伝達因子複合体を生成し易い 条件下で特異的に伝達因子が結合している運動抑制された抗原に、伝達因子−含 有試料を接触させ、 ｂ．抗原−特異性伝達因子を複合体から分離し、ｃ．抗原−特異性伝達因子を第 一のゲル濾過高性能液体クロマトグラフィーカラム上に適用し、 ｄ．第一のゲル濾過高性能液体クロマトグラフィーカラムから抗原−特異性伝達 因子を溶出させ、 ｅ．分離された抗原−特異性伝達因子を第二の逆相高性能液体クロマトグラフィ ーカラムに適用し、そして ｆ．本質的に純粋な伝達因子が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも５ ０００単位の特異的活性を有する本質的に純粋な伝達因子を第二の逆相高性能液 体クロマトグラフィーカラムから溶出させる段階を含んでなる、本質的に純粋な 伝達因子を製造する方法。 ３４．伝達因子−含有試料を最初に約６，０００ダルトンより多い分子量分割点 を有する濾過手段により濾過する、請求項３３に記載の方法。 ３５．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも１０，０００ 単位である、請求項３３に記載の方法。 ３６．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも２０，０００ 単位である、請求項３３に記載の方法。 ３７．特異的活性が２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも６０，０００ 単位である、請求項３３に記載の方法。 ３８．本質的に純粋な伝達因子含有試料が細胞溶解物である、請求項３３に記載 の方法。 ３９．微生物により引き起こされる感染症に罹っているヒトまたは動物に治療的 有効量の２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少なくとも５０００単位の特異的活 性を有する微生物に特異的な本質的に純粋な伝達因子を投与する段階を含んでな る、微生物により引き起こされる感染症に罹っているヒトまたは動物を治療する 方法。 ４０．微生物がウィルスである、請求項３９に記載の方法。 ４１．微生物がバクテリアである、請求項３９に記載の方法。 ４２．微生物が菌・カビである、請求項３９に記載の方法。 ４３．微生物が原生動物である、請求項３９に記載の方法。 ４４．本質的に純粋な伝達因子を注射により投与する、請求項３９に記載の方法 。 ４５．ウィルスが単純ヘルペスである、請求項３９に記載の方法。 ４６．ヒトまたは動物に治療的有効量の２１４ｎｍにおける吸収単位当たり少な くとも５０００単位の特異的活性を有する微生物に特異的な本質的に純粋な伝達 因子を投与する段階を含んでなる、ヒトまたは動物を微生物による感染症から予 防する方法。 ４７．微生物がウィルスである、請求項４６に記載の方法。 ４８．微生物がバクテリアである、請求項４６に記載の方法。 ４９．微生物が菌・カビである、請求項４６に記載の方法。 ５０．微生物が原生動物である、請求項４６に記載の方法。 ５１．本質的に純粋な伝達因子を注射により投与する、請求項４６に記載の方法 。 ５２．治療的有効量の請求項１に記載の本質的に純粋な伝達因子を薬学的に許容 可能な賦形薬中に含んでいる、微生物により引き起こされる感染症を治療するた めの薬学的組成物。 ５３．治療的有効量の請求項１に記載の本質的に純粋な伝達因子を薬学的に許容 可能な賦形薬中に含んでいる、微生物により引き起こされる感染症を予防するた めの薬学的組成物。