CN100394178C

CN100394178C - 一种特异性转移因子主要有效成分含量的检测方法

Info

Publication number: CN100394178C
Application number: CNB2006100182791A
Authority: CN
Inventors: 王建; 汤华东; 陈煌; 陈亚
Original assignee: WUHAN HAITE BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Four ring Biological Industry Group Co Ltd
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2006-01-23
Publication date: 2008-06-11
Anticipated expiration: 2026-01-23
Also published as: CN1834639A

Abstract

本发明涉及一种特异性转移因子主要有效成分含量的检测方法，该方法包括以下步骤：1)用特异性转移因子原液为起始材料纯化制备主要有效成分，并将制备的主要有效成分冻干、分装、标定，作为检测主要有效成分对照品；2)将上述主要有效成分对照品及特异性转移因子供试品分别用水稀释至多肽含量为0.1～1.0mg/ml，分别上样至已用流动相A液平衡的分析型色谱柱中，用流动相B液线性梯度洗脱，洗脱时，流速0.5～2.0ml/min；3)分别用紫外检测器在同一波长处检测上述对照品和供试品色谱图，以面积归一法计算供试品色谱图中与主要有效成分对照品色谱图主峰保留时间一致的色谱峰百分含量，即得。该检测方法专属性强、精密度高，线形关系良好。

Description

一种特异性转移因子主要有效成分含量的检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种特异性转移因子主要有效成分含量的检测方法。

背景技术

转移因子(Transfer Factor，TF)的研究始于40年代。1949年劳伦斯(Lawrence)发现白细胞裂解物中的可透析提取物(DialysableLeukocyte Extract，DLE)能传递迟发性皮肤超敏反应，并把引起这种效应的因子称作“转移因子”。

TF是从具有免疫活性的淋巴细胞中释放出来的一种物质。免疫活性淋巴细胞在抗原刺激下释放的TF又能使未致敏的淋巴细胞转化为具有免疫活性的淋巴细胞。因此，TF可将供体淋巴细胞的一些特定或非特定的细胞免疫功能转移给非免疫的受体，使受体具有供体的细胞免疫能力，以提高和诱发受体的免疫防御能力，改善受体免疫状态。

特异性转移因子(Specific Transfer Factor，STF)是用特定抗原(各种肿瘤、各种病毒、结核菌素、乙肝疫苗、卡介苗等)免疫的动物体内脾脏、淋巴细胞或外周血白细胞透析液制成的一种转移因子，是多肽、多核苷酸以及其他成分组成的复合物质，相对分子质量大约为2 000～5 000。STF本身没有抗原性，依赖抗原激活，可激发非致敏淋巴细胞成为致敏淋巴细胞，发挥细胞免疫效应。STF无种属特异性，可以在不同种属之间相互传递。因此，可用动物来大量制备STF以满足人类临床治疗某些疾病的需要。

STF作为一种免疫制剂，可提高机体的细胞免疫功能，其临床效果已得到肯定，目前主要用于恶性肿瘤、病毒性感染和细菌性感染的治疗。

经过对各种动物脾脏制备的转移因子组分分析，发现其组成为非均一性的小分子混合物，其内含物包括游离氨基酸、核酸和多肽等(佟世德，蒋忠军，宋旸.不同动物脾转移因子的成分分析[J].中国兽医科技，1995，25(9)：6-8.)。因此，尽管特异性转移因子具有明确的生物活性和临床治疗效果，但其终究是一个未知有效成分的多组分混合物，不符合药品“安全有效，质量可控”的标准，即存在以下两个主要风险：(1)因主要有效成分不明，无法对产品进行有效的质量控制；(2)因为是多组分混合物，各种非有效成分存在安全性风险。因而，寻求一种分离纯化特异性转移因子主要有效成分的方法并对该主要有效成分的含量进行质控至关重要，势在必行。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性转移因子主要有效成分含量的检测方法，以便对特异性转移因子的生产及其制剂实施有效的质量监控。

本发明目的的实现方式为：

一种特异性转移因子主要有效成分含量的检测方法，该方法包括以下步骤：

1)用特异性转移因子原液为起始材料纯化制备主要有效成分，并将制备的主要有效成分冻干、分装、标定，作为检测主要有效成分对照品；

2)将上述主要有效成分对照品及特异性转移因子供试品分别用水稀释至多肽含量为0.1～1.0mg/ml，分别上样至已用流动相A液平衡的分析型色谱柱中，用流动相B液线性梯度洗脱，洗脱时，流速0.5～2.0ml/min；

3)分别用紫外检测器在同一波长处检测上述对照品和供试品色谱图，以面积归一法计算供试品色谱图中与主要有效成分对照品色谱图主峰保留时间一致的色谱峰百分含量，即得。

其中所述的色谱柱为以4～18碳烷基硅烷键合硅胶为填充剂的分析型色谱柱。

所述流动相A液和B液均为水、乙腈和三氟乙酸的混合液，A液中水的体积含量为94.9％～99.9％，乙腈的体积含量为0％～5％，三氟乙酸的体积含量为0.1％～1％；B液中水的体积含量为4.9％～49.9％，乙腈的体积含量为50％～95％，三氟乙酸的体积含量为0.1％～1％。

所述的特异性转移因子供试品可以为特异性转移因子原液或特异性转移因子制剂成品。

所述用流动相B液线性梯度洗脱是采用0％→20％～50％的流动相B液线性梯度洗脱，柱温20～40℃。

所述紫外检测器最好在波长200～300nm处检测。

所述紫外检测器的检测波长，优选254nm、260nm或280nm。

在上述方案中，所述步骤1)中以特异性转移因子原液为起始材料纯化制备主要有效成分的方法，可以包括以下步骤：

1)将特异性转移因子原液上样至已用流动相A液平衡的制备型色谱柱中，用流动相B液线性梯度洗脱，洗脱时，流速10.0～30.0ml/min；

2)用紫外检测器检测，收集目的峰，即为主要有效成分。

在上述以特异性转移因子原液为起始材料纯化制备主要有效成分的方法中：

所述的色谱柱为以4～18碳烷基硅烷键合硅胶为填充剂的制备型色谱柱。

所述的流动相A液和B液均为水、乙腈和三氟乙酸的混合液，A液中水的体积含量为94.9％～99.9％，乙腈的体积含量为0％～5％，三氟乙酸的体积含量为0.1％～1％；B液中水的体积含量为4.9％～49.9％，乙腈的体积含量为50％～95％，三氟乙酸的体积含量为0.1％～1％。

所述紫外检测器最好在波长200～300nm处检测。

所述紫外检测器的检测波长，优选254nm、260nm或280nm。

本发明所述的特异性转移因子原液为用特定抗原免疫的动物的组织提取所得。该特定抗原包括各种肿瘤、各种病毒、结核菌素、乙肝疫苗、卡介苗中的一种或几种的组合；其供体动物可以为人、狗、猪、牛、山羊、鸡或兔；原材料组织可以为脾脏、淋巴和外周血中的一种或几种的组合。

本发明的主要有效成分含量检测方法经方法学验证表明该方法精密度高、专属性强、线性关系良好。

附图说明

图1抗结核特异性转移因子主要有效成分RP-HPLC法纯度测定色谱图。

图2抗结核特异性转移因子主要有效成分紫外吸收特性分析扫描图。

图3抗结核特异性转移因子主要有效成分含量专属性色谱图。

具体实施方式

实施例1.抗结核特异性转移因子主要有效成分的制备

1.制备方法

以抗结核特异性转移因子原液为材料，用制备型反相高效液相色谱柱进行主要有效成分的分离纯化，采用以下步骤：

1)将抗结核特异性转移因子原液50ml上样至已用流动相A液平衡的制备型色谱柱中，采用0％→20％的流动相B液线性梯度洗脱；流速20.0ml/min，柱温25℃。

2)用紫外检测器在波长280nm处检测，收集最后一个保留主峰，即为主要有效成分。

其中制备型色谱柱：Symmetry300^TM C18色谱柱(5um，20×250mm)；

流动相：A液和B液均为水-乙腈-三氟乙酸，A液中水的体积含量为94.9％，乙腈的体积含量为5％，三氟乙酸的体积含量为0.1％；B液中水的体积含量为4.9％，乙腈的体积含量为95％，三氟乙酸的体积含量为0.1％。

2.抗结核特异性转移因子主要有效成分性质测定

1)纯度测定

取分离纯化的抗结核特异性转移因子主要有效成分，用水稀释至多肽含量为0.2mg/ml，按实施例2方法测定，色谱结果显示(图1)，主要有效成分为单一主峰，经面积归一法计算，纯度大于95％。

2)活性测定

将收集的抗结核特异性转移因子主要有效成分冻干，用0.2ml水复溶，同时取制备主要有效成分时使用的抗结核特异性转移因子原液0.2ml，用白细胞粘附抑制试验测活。结果(表1)显示，主要有效成分保留了制品(原液)大部分的特异性活性。

表1主要有效成分特异性活性测定结果

实施例2.抗结核特异性转移因子制剂成品主要有效成分含量测定

1.主要有效成分含量的测定，采用以下步骤：

1)将实施例1制备的主要有效成分冻干、分装、并标定，作为主要有效成分对照品。

2)将主要有效成分对照品及特异性转移因子制剂成品分别用水稀释至多肽含量为0.2mg/ml，各取20μl分别上样至已用流动相A液平衡的分析型色谱柱中，采用0％→50％的流动相B液线性梯度洗脱；流速1.0ml/min，柱温25℃。

3)用紫外检测器在波长280nm处检测，以面积归一法计算供试品色谱图中与主要有效成分对照品色谱图主峰保留时间一致的色谱峰百分含量，即得。

其中分析型色谱柱：Symmetry300^TM C18色谱柱(5um，4.6×250mm)；

流动相：A液为水-三氟乙酸；B液为水-乙腈-三氟乙酸。A液中水的体积含量为99.9％，三氟乙酸的体积含量为0.1％；B液中水的体积含量为49.9％，乙腈的体积含量为50％，三氟乙酸的体积含量为0.1％。

2.方法学验证

(1)色谱条件与系统适应性试验

色谱柱：Symmetry300^TM C18色谱柱(5um，4.6×250mm)；流动相：A为(99.9％超纯水，0.1％三氟乙酸)，B为(50％乙腈，49.9％超纯水，0.1％三氟乙酸)；色谱条件：上样量20μl，波长280nm，流速1.0ml/min，柱温室温，梯度洗脱条件为0％→50％的B液线性梯度洗脱。

波长选择依据：本品经紫外扫描分析，最大紫外吸收波长为280nm，因此检测波长定为280nm。(图2)

(2)系统适用性试验

①理论塔板数

取抗结核特异性转移因子有效成分对照品，用水稀释至多肽含量为0.2mg/ml，在上述色谱条件下进样，记录色谱图，以主峰峰面积计算理论塔板数，理论塔板数为20086，分离度为6.49，拖尾因子为1.5。

②重复性

取抗结核特异性转移因子有效成分对照品，用水稀释至多肽含量为0.2mg/ml，在上述色谱条件下重复进样6次，记录峰面积，结果显示重复性良好(表2)。

表2抗结核特异性转移因子主要有效成分重复性测定结果(n＝6)

③分离度

取抗结核特异性转移因子有效成分对照品，用水稀释至多肽含量为0.2mg/ml，加入1％原液做为杂质，在上述色谱条件下进样，记录色谱图，以主峰和邻近杂质峰计算分离度，分离度为3.45l，结果显示分离度很好。

(3)专属性试验

取抗结核特异性转移因子有效成分对照品，用水稀释至多肽含量为0.2mg/ml即得供试液1；按本品制剂成品辅料配方，配制2×空白辅料溶液(120mg/ml甘露醇)，取对照品溶液等量加入其中即得供试液2；分别加入等体积0.1mol/L HCL和NaOH，得供试液3和供试液4，照色谱条件测定，记录色谱图。结果显示，加入辅料样品和酸处理样品对色谱行为无影响，其目的峰保留时间未改变，经碱处理样品降解峰与主峰明显分开，不会干扰主峰测定，因此表明本方法专属性较好(图3)。

(4)线形试验

取抗结核特异性转移因子有效成分对照品，用水稀释至多肽含量为0.6mg/ml然后分别用注射用水进行1/2、4/1、1/8和1/16倍稀释，记录色谱图，以浓度对峰面积进行线性回归，用最小二乘法计算，得回归方程：Y＝9742.7X-30426 R²＝0.9993。

结果显示(表3)，在37.5μg/ml～600μg/ml浓度范围内，对照品浓度与峰面积线性关系良好。

表3抗结核特异性转移因子主要有效成分线性测定结果

(5)精密度试验

照上述色谱条件，取抗结核特异性转移因子原液制备高、中、低三种不同浓度的样品溶液(0.4、0.2和0.1mg/ml)，4℃条件下保存，测定其主要有效成分百分含量，分别在一天内测定五次，得日内相对标准偏差。三种溶液每天测定一次，连续测定五天，得日间相对标准偏差，结果(表4)显示，日内、日间相对标准偏差均在2％以内，精密度良好。

表4抗结核特异性转移因子主要有效成分含量精密度测定结果

(n＝5)

综合上述验证试验结果，可以看出该检测方法精密度、专属性、线性均良好。

实施例3.抗乙型肝炎转移因子主要有效成分的制备

以抗乙型肝炎转移因子原液为材料，用制备型反相高效液相色谱柱进行主要有效成分的分离纯化，采用以下步骤：

1)将抗乙型肝炎转移因子原液40ml上样至已用流动相A液平衡的制备型色谱柱中，采用0％→30％的B液线性梯度洗脱；流速10.0ml/min，柱温20℃。

2)用紫外检测器在波长254nm处检测，收集最后一个保留主峰，即为主要有效成分。

其中制备型色谱柱：Hypersil C8色谱柱(5um，20×250mm)；

流动相：A液为水-三氟乙酸；B液为水-乙腈-三氟乙酸。A液中水的体积含量为99.5％，三氟乙酸的体积含量为0.5％；B液中水的体积含量为24.5％，乙腈的体积含量为75％，三氟乙酸的体积含量为0.5％。

实施例4.注射用抗乙型肝炎转移因子原液主要有效成分含量测定

注射用抗乙型肝炎转移因子原液主要有效成分含量的测定，采用以下步骤：

1)将实施例3制备的主要有效成分冻干、分装、并标定，作为主要有效成分对照品。

2)将主要有效成分对照品及注射用抗乙型肝炎转移因子原液分别用水稀释至多肽含量为0.1mg/ml，各取20μl分别上样至已用流动相A液平衡的分析型色谱柱中，采用0％→20％的B液线性梯度洗脱；流速0.5ml/min，柱温20℃。

3)用紫外检测器在波长254nm处检测，以面积归一法计算供试品色谱图中与主要有效成分对照品色谱图主峰保留时间一致的色谱峰百分含量，即得。

其中分析型色谱柱：Hypersil C8色谱柱(5um，4.6×250mm)；

流动相：A液和B液均为水-乙腈-三氟乙酸，A液中水的体积含量为94.5％，乙腈的体积含量为5％，三氟乙酸的体积含量为0.5％；B液中水的体积含量为4.5％，乙腈的体积含量为95％，三氟乙酸的体积含量为0.5％。

实施例5.抗乙型肝炎胎盘转移因子主要有效成分的制备

以抗乙型肝炎胎盘转移因子原液为材料，用制备型反相高效液相色谱柱进行主要有效成分的分离纯化，采用以下步骤：

1)将抗乙型肝炎胎盘转移因子原液60ml上样至已用流动相A液平衡的制备型色谱柱中，采用0％→50％的B液线性梯度洗脱；流速30.0ml/min，柱温40℃。

2)用紫外检测器在波长260nm处检测，收集目的峰，即为主要有效成分。

其中制备型色谱柱：Zorbax C4色谱柱(5um，20×250mm)；

流动相：A液和B液均为水-乙腈-三氟乙酸，A液中水的体积含量为96％，乙腈的体积含量为3％，三氟乙酸的体积含量为1％；B液中水的体积含量为49％，乙腈的体积含量为50％，三氟乙酸的体积含量为1％。

实施例6.抗乙型肝炎胎盘转移因子制剂成品主要有效成分含量测定

抗乙型肝炎胎盘转移因子注射液主要有效成分含量的测定，采用以下步骤：

1)将实施例5制备的主要有效成分冻干、分装、并标定，作为主要有效成分对照品。

2)将主要有效成分对照品及抗乙型肝炎胎盘转移因子注射液分别用水稀释至多肽含量为1.0mg/ml，各取20μl分别上样至已用流动相A液平衡的分析型色谱柱中，采用0％→40％的B液线性梯度洗脱；流速2.0ml/min，柱温40℃。

3)用紫外检测器在波长260nm处检测，以面积归一法计算供试品色谱图中与主要有效成分对照品色谱图主峰保留时间一致的色谱峰百分含量，即得。

其中分析型色谱柱：Zorbax C4色谱柱(5um，4.6×250mm)；

流动相：A液和B液均为水-乙腈-三氟乙酸，A液中水的体积含量为96％，乙腈的体积含量为3％，三氟乙酸的体积含量为1％；B液中水的体积含量为34％，乙腈的体积含量为65％，三氟乙酸的体积含量为1％。

Claims

1.一种特异性转移因子主要有效成分含量的检测方法，所述特异性转移因子为抗乙肝、抗结核特异性转移因子，或抗乙型肝炎胎盘转移因子，该方法包括以下步骤：

2)将上述主要有效成分对照品及特异性转移因子供试品分别用水稀释至多肽含量为0.1～1.0mg/ml，分别上样至已用流动相A液平衡的分析型色谱柱中，用流动相B液线性梯度洗脱，洗脱时，流速0.5～2.0ml/min，所述流动相A液和B液均为水、乙腈和三氟乙酸的混合液，A液中水的体积含量为94.9％～99.9％，乙腈的体积含量为0％～5％，三氟乙酸的体积含量为0.1％～1％；B液中水的体积含量为4.9％～49.9％，乙腈的体积含量为50％～95％，三氟乙酸的体积含量为0.1％～1％；

2.根据权利要求1所述一种特异性转移因子主要有效成分含量的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中以特异性转移因子原液为起始材料纯化制备主要有效成分的方法，包括以下步骤：

1)将特异性转移因子原液上样至已用流动相A液平衡的制备型色谱柱中，用流动相B液线性梯度洗脱，洗脱时，流速10.0～30.0ml/min，所述流动相A液和B液均为水、乙腈和三氟乙酸的混合液，A液中水的体积含量为94.9％～99.9％，乙腈的体积含量为0％～5％，三氟乙酸的体积含量为0.1％～1％；B液中水的体积含量为4.9％～49.9％，乙腈的体积含量为50％～95％，三氟乙酸的体积含量为0.1％～1％；

2)用紫外检测器检测，收集目的峰，即为主要有效成分。

3.根据权利要求1或2所述一种特异性转移因子主要有效成分含量的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为以4～18碳烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。

4.根据权利要求1或2所述一种特异性转移因子主要有效成分含量的检测方法，其特征在于，所述的特异性转移因子供试品为特异性转移因子原液或特异性转移因子制剂成品。

5.根据权利要求1或2所述一种特异性转移因子主要有效成分含量的检测方法，其特征在于，所述用流动相B液线性梯度洗脱是采用0％→20％～50％的流动相B液线性梯度洗脱，柱温20～40℃。

6.根据权利要求1或2所述一种特异性转移因子主要有效成分含量的检测方法，其特征在于，所述紫外检测器在波长200～300nm处检测。

7.根据权利要求1或2所述一种特异性转移因子主要有效成分含量的检测方法，其特征在于，所述紫外检测器检测波长为254nm、260nm或280nm。