CN102406749B

CN102406749B - 一种同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的hplc测定方法

Info

Publication number: CN102406749B
Application number: CN2010105554551A
Authority: CN
Inventors: 欧金秀; 谷陟欣; 熊灿娟; 朱丽; 王实强; 张妮瑜; 毛威
Original assignee: Jiuzhitang Co Ltd
Current assignee: Jiuzhitang Co Ltd
Priority date: 2010-11-22
Filing date: 2010-11-22
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2030-11-22
Also published as: CN102406749A

Abstract

本发明涉及一种同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC测定方法，其包含步骤：提供驴胶补血制剂样品；提供氨基酸标准品；将驴胶补血制剂样品和氨基酸标准品分别加入异硫氰酸苯酯-乙腈溶液中，混匀静置后分别加入正己烷，再次混匀静置后分别取其下层溶液，过滤得衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液；吸取衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液注入液相色谱仪，进行氨基酸的测定。本发明通过采用反相高效液相测定了驴胶补血制剂中6种主要氨基酸的含量，样品处理方法较简单，测试方法的专属性、重复性、准确度都较好，能很好地控制驴胶补血颗粒的内在质量。

Description

一种同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC测定方法

技术领域

本发明涉及药学领域中质量控制的运用方法，尤其涉及一种同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC测定方法。

背景技术

在驴胶补血制剂的处方中，阿胶是君药，所占的比例最大，是中国传统的补血药，其中阿胶中的蛋白质和氨基酸是其补益药效的营养物质基础。

在中药部颁标准中，驴胶补血颗粒检查项中有针对阿胶的总氮量的检查。总氮量的测定方法只能粗略地反映样品中含氮的化合物的量，不能很好地反映阿胶中蛋白质和氨基酸的情况。

现有文献中，也仅有记载：高效液相色谱_蒸发光散射法测定驴胶补血颗粒中黄芪甲苷的含量、高效液相色谱法测定驴胶补血颗粒中阿魏酸含量、驴胶补血颗粒中微量铁的含量测定”，也并没有记载对氨基酸的含量测定。

尽管2010版药典中收载了阿胶原料氨基酸的含量测定，但仅限于单方药材，而且样品的处理方法较复杂，只测定了其中L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸4种氨基酸的含量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC测定方法，其主要包含步骤：

1)将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中，加入5-7mol/l(最佳为6mol/l)盐酸，130℃-160℃(最佳为150℃)水解，将水解后的溶液移入蒸发皿中，用水洗涤，将洗液并入蒸发皿，水浴蒸干，残渣加入0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至量瓶中，加入0.05-0.15mol/L(最佳为0.1mol/L)盐酸溶液稀释，摇匀、离心后取上清液即得驴胶补血制剂待测品溶液；

2)取6种氨基酸对照品：L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸，将以上6种氨基酸对照品加入0.1mol/L盐酸溶液溶解，制得氨基酸混合标准品溶液；

3)将步骤1)所述驴胶补血制剂待测品溶液和步骤2)所述基酸混合标准品溶液分别加入异硫氰酸苯酯-乙腈溶液中，混匀、静置后分别加入正己烷，再次混匀、静置后分别取其下层溶液，进行过滤，得衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液；

4)吸取步骤3)获得的衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液注入液相色谱仪，进行驴胶补血制剂中氨基酸的测定，其中，色谱条件为：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈与醋酸钠、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾三种中的任意一种或两种的组合，流动相B为乙腈-水，检测波长为254nm，流速为1.0ml·min^-1，柱温为30℃，按下表中的梯度进行洗脱：

5)根据步骤4)所得色谱图计算驴胶补血制剂中L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸的含量。

步骤1)具体可以为：将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中，精密称定，加入5-7mol/l盐酸5ml，置酒精喷灯上拉丝封口，超声30分钟使其溶解，130℃-160℃水解，放冷，移入蒸发皿中，用10ml水分次洗涤，洗液并入蒸发皿，水浴蒸干，残渣加入0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至量瓶中，加入0.05-0.15mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，离心后取上清液即得驴胶补血制剂待测品溶液。

步骤1)更具体地可以为：将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中，精密称定，加入6mol/l盐酸5ml，置酒精喷灯上拉丝封口，超声30分钟使其溶解，150℃水解1小时，放冷，移入蒸发皿中，用10ml水分次洗涤，洗液并入蒸发皿，水浴蒸干，残渣加入0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，3000r/min离心5分钟取上清液即得驴胶补血制剂待测品溶液。

步骤2)具体可以为：取6种氨基酸对照品：L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸，将以上6种氨基酸对照品加入0.1mol/L盐酸溶液溶解制成每1ml分别含L-谷氨酸73.1μg、L-羟脯氨酸86.4μg、甘氨酸0.1609mg、L-丙氨酸64.8μg、L-精氨酸59.3μg、L-脯氨酸93.9μg的混合溶液，即得氨基酸混合标准品。

步骤3)具体可以为：将步骤1)所述驴胶补血制剂待测品溶液和步骤2)所述基酸混合标准品溶液分别置10ml离心管中，加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯-乙腈溶液1.0ml，1mol/L三乙胺-乙腈溶液1.0ml，漩涡混合1分钟，室温放置1小时后，加入4ml正己烷，振摇，漩涡混合1分钟后，放置10分钟，取下层溶液，微孔滤膜滤过，即得衍生化的标准品溶液和衍生化的待测品溶液。

所述的方法，步骤4)中，流动相A中，醋酸钠的浓度为0.1mol/L。乙腈与0.1mol/L醋酸钠的比例为3∶97。

所述的方法，步骤4)中，流动相B中，乙腈与水的比例为4∶1。

本发明所具有的有益技术效果，至少包含：

a.本发明所述的同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC测定方法，首次将液相色谱技术应用于复方制剂(驴胶补血制剂)中同时测定L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸共6种氨基酸的含量。

本技术领域的技术人员公知的是，复方制剂中包含多种成分，要测定其中某一种物质的含量，受到的干扰远远大于单方药材中的干扰。正因为如此，尽管在2010版中国药典中，收载了阿胶原料中氨基酸的含量测定，但其仅用于测定单方药材中的氨基酸，在含有阿胶的其他复方中药中皆未采用HPLC进行氨基酸的含量测定，而且，药典中收载的阿胶原料中氨基酸的含量测定方法所测定的氨基酸的种类也仅有4种，且处理方法复杂。

所以，本发明的方法解决了复方中药制剂中氨基酸含量测定的技术难题，并且扩展了能同时测定的氨基酸的种类，为更好地控制驴胶补血制剂的质量提供了一种可靠、有效的方法。

b.本发明提供的同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC测定方法，样品处理方法较简单，选择了6种主要的氨基酸含量测定能较好地反映阿胶中蛋白质及氨基酸的情况，测试方法的专属性、重复性、准确度都较好，能很好地控制驴胶补血制剂的内在质量。

c.本发明通过柱前衍生化法，采用反相高效液相测定了驴胶补血制剂中6种主要氨基酸的含量，本方法对仪器的要求和操作人员的操作熟练程度的要求较低，很容易普及推广，并且能得到很好的重现性。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是6种氨基酸混合标准品HPLC色谱图；

图2是驴胶补血颗粒流动相1色谱图；

图3是驴胶补血颗粒流动相2色谱图；

图4是驴胶补血颗粒流动相3色谱图。

具体实施方式

仪器与试药

仪器：岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外可见检测器，N2000数据工作站；KQ2200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AE240分析天平(METTLER)；SZ-1型旋涡混合器(金坛市大地自动化仪器厂)；DHG-9101-15A型电热恒温鼓风干燥箱(扬州鸿都电子有限公司)；Milli-Q A10型超纯水机(美国密里博公司)；80-2型离心机(上海手术器械厂)；色谱柱：大连依利特公司Hypersil ODS2 C₁₈色谱柱(4.6mm×200mm，5μm)。

试药：

驴胶补血颗粒样品17批由湖南省九芝堂股份有限公司提供，批号：200801090、200806016、200811091、200901010、200903002、200908029、200909036、200909066、200909068、200909069、200909071、200909072、200909073、200909075、200909076、200909077、200909078；

L-谷氨酸对照品(140690-200401)、L-羟脯氨酸对照品(111578-200201)、甘氨酸对照品(110735-200102)、L-丙氨酸对照品(140680-200401)、L-精氨酸对照品(140685-200802)、L-脯氨酸对照品(140677-200405)由中国药品生物制品检定所提供(供含量测定用)；乙腈为色谱纯；异硫氰酸苯脂为化学纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

实施例1 6种氨基酸混合标准品的制备

取L-谷氨酸对照品、L-羟脯氨酸对照品、甘氨酸对照品、L-丙氨酸对照品、L-精氨酸对照品、L-脯氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml分别含L-谷氨酸73.1μg、L-羟脯氨酸86.4μg、甘氨酸0.1609mg、L-丙氨酸64.8μg、L-精氨酸59.3μg、L-脯氨酸93.9μg的混合溶液，即得6种氨基酸混合标准品。

实施例2待测品溶液的制备

方法1.将待测的驴胶补血颗粒研磨成粉后，取0.25g置安瓿瓶中，精密称定，加5mol/l盐酸5ml，置酒精喷灯上拉丝封口，超声30分钟使其溶解，130℃水解1小时。放冷，移入蒸发皿中，用10ml水分次洗涤，洗液并入蒸发皿，水浴蒸干。残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶中，加0.05mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，3000r/min离心5分钟取上清液即得待测品溶液。

方法2.将待测的驴胶补血颗粒研磨成粉后，取0.25g置安瓿瓶中，精密称定，加6mol/l盐酸5ml，置酒精喷灯上拉丝封口，超声30min使其溶解，150℃水解1小时。放冷，移入蒸发皿中，用10ml水分次洗涤，洗液并入蒸发皿，水浴蒸干。残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，3000r/min离心5分钟取上清液即得待测品溶液。

方法3.将待测的驴胶补血颗粒研磨成粉后，取0.25g置安瓿瓶中，精密称定，加7mol/l盐酸5ml，置酒精喷灯上拉丝封口，超声30分钟使其溶解，160℃水解1小时。放冷，移入蒸发皿中，用10ml水分次洗涤，洗液并入蒸发皿，水浴蒸干。残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶中，加0.15mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，3000r/min离心5分钟取上清液即得待测品溶液。

实施例3衍生化

取上述标准品溶液和待测品溶液各2ml，分别置10ml离心管中，加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯(PITC)-乙腈溶液(取120μl异硫氰酸苯脂于10ml容量瓶中，乙腈稀释并加至刻度，摇匀，当日配制当日使用)1.0ml，1mol/L三乙胺-乙腈溶液(取三乙胺1.4ml于10ml容量瓶中，乙腈稀释并加至刻度，摇匀)1.0ml，漩涡混合1min，室温放置1小时后，加入4ml正己烷，振摇，漩涡混合1min后，放置10分钟，取下层溶液，微孔滤膜滤过，即得衍生化的标准品溶液和衍生化的待测品溶液。

实施例4色谱测定

分别精密吸取衍生化后的标准品溶液与待测品溶液各5μl，注入液相色谱仪，进行测定。

其中，流动相1：以乙腈-0.1mol/L醋酸钠溶液(3∶97)为流动相A(称取13.2g结晶醋酸钠，加水970ml溶解，用冰醋酸调节pH值至6.5，加乙腈30ml，摇匀，微孔滤膜滤过即得)，以乙腈-水(4∶1)为流动相B，按表1进行梯度洗脱。

流动相2：以乙腈-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液(3∶97)为流动相A(称取13.4g结晶醋酸钠，加水970ml溶解，用冰醋酸调节pH值至6.5，加乙腈30ml，摇匀，微孔滤膜滤过即得)，以乙腈-水(4∶1)为流动相B，按表1进行梯度洗脱。

流动相3：以乙腈-0.1mol/L磷酸二氢钾溶液(3∶97)为流动相A(称取13.2g结晶醋酸钠，加水970ml溶解，用冰醋酸调节pH值至6.5，加乙腈30ml，摇匀，微孔滤膜滤过即得)，以乙腈-水(4∶1)为流动相B，按表1进行梯度洗脱。

表1梯度洗脱表

检测波长：254nm；流速：1.0ml·min^-1；柱温：30℃；进样量：5μl。

色谱测定时，在选定的色谱条件下，经HPLC法测定L-羟脯氨酸和样品中其它组的峰可达基线分离，且与其它相邻峰分离度大于1.5；按L-羟脯氨酸计算，理论板数在4000以上。色谱图请参照图1-2，图1是6种氨基酸混合标准品HPLC色谱图；图2是驴胶补血颗粒流动相1色谱图；图3是驴胶补血颗粒流动相2色谱图；图4是驴胶补血颗粒流动相3色谱图。

实施例5线性关系考察

分别精密称取L-谷氨酸对照品、L-羟脯氨酸对照品、甘氨酸对照品、L-丙氨酸对照品、L-精氨酸对照品、L-脯氨酸对照品，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml分别含L-谷氨酸0.338mg、L-羟脯氨酸0.356mg、甘氨酸0.762mg、L-丙氨酸0.324mg、L-精氨酸0.236mg、L-脯氨酸0.506mg的混合溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置于10ml容量瓶中，用0.1mol/L盐酸加至刻度，摇匀，分别衍生化。分别吸取5μl注入液相色谱仪中，测定其峰面积积分值，以对照品浓度为横坐标，相应峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，L-谷氨酸回归方程为：y＝419353x+25116，r＝0.9995；L-羟脯氨酸回归方程为：y＝1322317x+28128，r＝0.9999；甘氨酸回归方程为：y＝1917735x+167893，r＝0.9995；L-丙氨酸回归方程为：y＝1240844x+59284，r＝0.9995；L-精氨酸回归方程为：y＝495902x+9913.5，r＝0.9996；L-脯氨酸回归方程为：y＝1497459x+41779，r＝0.9999。结果表明L-谷氨酸在0.169～1.014μg范围内；L-羟脯氨酸在0.178～1.068μg范围内；甘氨酸在0.381～2.286μg范围内；L-丙氨酸在0.162～0.972μg范围内；L-精氨酸在0.118～0.708μg范围内；L-脯氨酸在0.253～1.518μg范围内均具有良好的线性关系。结果见表2～7。

表2L-谷氨酸线性关系考察结果表

表3L-羟脯氨酸线性关系考察结果表

表4甘氨酸线性关系考察结果表

表5L-丙氨酸线性关系考察结果表

表6L-精氨酸线性关系考察结果表

表7L-脯氨酸线性关系考察结果表

实施例6仪器精密度试验

取装量差异合格的本品(批号：200909072)，研细，取约0.25g，依法制备供试品溶液并进行衍生化。精密吸取同一份衍生化后的供试品溶液5μL，重复进样6次，测定其峰面积积分值，结果见表8。

表8精密度试验(n＝6)

结果：6种氨基酸的峰面积积分值RSD均小于2.0％，表明本方法精密度良好。

实施例7被测溶液稳定性试验

取装量差异合格的本品(批号：200909072)，研细，取约0.25，照上述方法制备供试品溶液并进行衍生化后，分别于0、2、4、8、12、24小时进样5μL，测定其峰面积，结果见表9。

表9稳定性试验(n＝6)

结果：6种氨基酸的峰面积积分值RSD均小于2.0％，供试品溶液在24小时内基本稳定。

实施例8重复性试验

取同一批号样品(批号：200909072)6份，照上述方法平行制备供试品溶液，进行衍生化后测定样品中L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸含量，结果见表10。

表10重复性试验(n＝6)

结果：六种氨基酸含量RSD均小于2％，本方法重复性好。

实施例9准确度试验

取同一批号(批号：200909072)样品约0.125g，共6份，精密称定，分别精密加入混合对照品溶液(L-谷氨酸对照品浓度为0.997mg.mL^-1、L-羟脯氨酸对照品浓度为1.08mg.mL^-1、甘氨酸对照品浓度为2.222mg.mL^-1、L-丙氨酸对照品浓度为0.893mg.mL^-1、L-精氨酸对照品浓度为0.705mg.mL^-1、L-脯氨酸对照品浓度为1.43mg.mL^-1)1mL，以下操作按前述含量测定项下的方法进行，按下式计算加样回收率，结果见表11-17。

表11谷氨酸回收率测定结果表

表12羟脯氨酸回收率测定结果表

表13甘氨酸回收率测定结果表

表14丙氨酸回收率测定结果表

表15精氨酸回收率测定结果表

表16脯氨酸回收率测定结果表

表17六种氨基酸含量之和回收率测定结果表

结果：谷氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸及脯氨酸的平均回收率分别为101.43％，101.23％，102.87％，102.37％，102.73％，98.69％；RSD分别为3.20％，3.25％，2.32％，3.36％，2.41％，2.34％；六种氨基酸含量之和平均回收率为101.54％，RSD为1.37％，本方法回收率较好。

实施例10驴胶补血颗粒成品含量测定

按拟定的含量测定方法测定17批驴胶补血颗粒成品中L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸的含量，结果见表18。

表18含量测定结果(n＝2)

结果：17批驴胶补血颗粒L-谷氨酸的平均含量为0.743％，L-羟脯氨酸的平均含量为0.880％，甘氨酸的平均含量为1.817％，L-丙氨酸的平均含量为0.692％，L-精氨酸的平均含量为0.579％，L-脯氨酸的平均含量为1.190％，6种氨基酸平均含量和为5.900％，按平均含量的80％计算，所以本品的含量限度为L-谷氨酸不得少于0.6％，L-羟脯氨酸不得少于0.7％，甘氨酸不得少于1.5％，L-丙氨酸不的少于0.6％、L-精氨酸不得少于0.5％，L-脯氨酸不得少于1.0％，6种氨基酸含量之和不得少于5.0％。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims

1.一种同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC测定方法，其特征在于，包含步骤：

1）将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中，精密称定，加入5-7mol/l盐酸5ml，置酒精喷灯上拉丝封口，超声30分钟使其溶解，130℃-160℃水解，放冷，移入蒸发皿中，用10ml水分次洗涤，洗液并入蒸发皿，水浴蒸干，残渣加入0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至量瓶中，加入0.05-0.15mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，离心后取上清液即得驴胶补血制剂待测品溶液；

2）取6种氨基酸对照品：L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸，将以上6种氨基酸对照品加入0.1mol/L盐酸溶液溶解制成每1ml分别含L-谷氨酸73.1μg、L-羟脯氨酸86.4μg、甘氨酸0.1609mg、L-丙氨酸64.8μg、L-精氨酸59.3μg、L-脯氨酸93.9μg的混合溶液，即得氨基酸混合标准品；

3）将步骤1）所述驴胶补血制剂待测品溶液和步骤2）所述氨基酸混合标准品溶液分别加入异硫氰酸苯酯-乙腈溶液中，混匀、静置后分别加入正已烷，再次混匀、静置后分别取其下层溶液，进行过滤，得衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液；

4）吸取步骤3）获得的衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液注入液相色谱仪，进行驴胶补血制剂中氨基酸的测定，其中，色谱条件为：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈与醋酸钠、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾三种中的任意一种或两种的组合，流动相B为乙腈-水，检测波长为254nm，流速为1.0ml·min^-1，柱温为30℃，按下表中的梯度进行洗脱：

5）根据步骤4）所得色谱图计算驴胶补血制剂中L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）具体为：将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中，精密称定，加入6mol/l盐酸5ml，置酒精喷灯上拉丝封口，超声30分钟使其溶解，150℃水解1小时，放冷，移入蒸发皿中，用10ml水分次洗涤，洗液并入蒸发皿，水浴蒸干，残渣加入0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，3000r/min离心5分钟取上清液即得驴胶补血制剂待测品溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）具体为：将步骤1）所述驴胶补血制剂待测品溶液和步骤2）所述氨基酸混合标准品溶液分别置10ml离心管中，加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯-乙腈溶液1.0ml，1mol/L三乙胺-乙腈溶液1.0ml，漩涡混合1分钟，室温放置1小时后，加入4ml正已烷，振摇，漩涡混合1分钟后，放置10分钟，取下层溶液，微孔滤膜滤过，即得衍生化的标准品溶液和衍生化的待测品溶液。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤4）中，流动相A是乙腈-醋酸钠。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4）中，流动相A中，醋酸钠的浓度为0.1mol/L。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，流动相A中，乙腈与0.1mol/L醋酸钠的比例为3：97。

7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤4）中，流动相B中，乙腈与水的比例为4：1。