CN103940936B - 一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法，属于分析领域。本发明是利用4α-羟基-L-脯氨酸和L-脯氨酸与氯甲酸对硝基苄酯反应后，所得到的衍生物具有紫外吸收的特性，然后再用高压液相色谱仪进行检测分析。本发明具有衍生时间短、能耗低、反应条件温和，操作简便、安全、高效，专属性、重复性及准确好，灵敏度高等优点。本方法适合工业化生产中4α-羟基-L-脯氨酸的快速检验。
Description
技术领域
本发明属于分析领域，涉及一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法。
背景技术
4α-羟基-L-脯氨酸是合成多个第二代碳青霉烯类抗生素及其它药物的起始原料，现行制备4α-羟基-L-脯氨酸的生产工艺不可避免地会伴生痕量的L-脯氨酸，而L-脯氨酸会参与后续反应，产生影响最终产物含量的杂质。4α-羟基-L-脯氨酸和L-脯氨酸均为环烷羧酸，结构中无紫外发色基团，因此无法直接用具紫外检测器的高压液相色谱仪检测其纯度和含量。
4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的分析检测方法主要有化学比色法、电泳法、氨基酸分析仪测定法、高效液相色谱法、液质联用法等。化学比色法、电泳法及氨基酸分析仪法操作复杂，分析时间短，分析时间长，价格昂贵。液质联用法仪器普及性不广。而柱前衍生与高效液相色谱相结合具有其操作简单、分析时间短，方法灵敏、线性范围宽，结果准确可靠及普及型广等优点，因此是分析检测4α-羟基-L-脯氨酸的最有力工具。
高效液相色谱柱前衍生4α-羟基-L-脯氨酸常用的衍生剂有异硫氰酸苯酯(PITC)、2,4二硝基氟苯(DNFB)、9-芴基甲氧羟酰氯(FMOC)等。但是异硫氰酸苯酯(PITC)操作较复杂，且衍生化时间过长；2,4二硝基氟苯(DNFB)室温下即融化，影响操作，且衍生出的副产物影响分离结果；9-芴基甲氧羟酰氯(FMOC)易水解，影响分离，效果欠佳。因此目前，对4α-羟基L-脯氨酸的分析检测缺乏快速、准确的方法。
发明内容
本发明提供一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法，即一种衍生方法工时短、能耗低、工艺条件温和，操作简便、安全、高效，灵敏度高的检测4α-羟基-L-脯氨酸的新的方法。
为实现上述的发明目的，本发明采取的实施方式如下：
一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法，其包括以下步骤：
(1)取4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸对照品加水溶解，制得4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液；
(2)取4α-羟基-L-脯氨酸样品加水溶解，制得样品溶液；
(3)将步骤(1)及步骤(2)所得混合标准品溶液及样品溶液分别加入氯甲酸对硝基苄酯二氯甲烷溶液，混匀，静置后分别取上层溶液稀释，得衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液和衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液；
(4)吸取步骤(3)获得的衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液和衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液注入液相色谱仪中，进行4α-羟基-L-脯氨酸测定，其中，色谱条件为：
流动相：0.1％磷酸水溶液:乙腈＝1:1v/v；
色谱柱：Agilent HC-C18,4.6×250mm,5μm；
流速：1.0mL/min；
进样量：5μL；
检测器：VWD；
(5)根据步骤(4)所得的色谱图计算4α-羟基-L-脯氨酸样品中4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸含量。
具体为称取2g 4α-羟基-L-脯氨酸样品置于25ml容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，制得4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液；取制得的4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液0.5ml，置于25ml容量瓶中，加入0.5ml 50％氯甲酸对硝基苄酯的二氯甲烷溶液，强力振荡10min，再加入1ml 1mol/L NaOH，振荡1min，最后加纯化水稀释至刻度，静置备用。得到对应的衍生物1-对硝基苄氧羰基-4α-羟基-L-脯氨酸钠(痕量的1-对硝基苄氧羰基-L-脯氨酸钠)，该衍生物均具有紫外吸收，再用高压液相色谱仪进行检测分析。
本发明所涉及部分化合物的结构式：
4α-羟基-L-脯氨酸的结构式如下所示
L-脯氨酸的结构式如下所示
氯甲酸对硝基苄酯的结构式如下所示
1-对硝基苄氧羰基-4α-羟基-L-脯氨酸的结构式如下所示
1-对硝基苄氧羰基-L-脯氨酸的结构式如下所示
本发明的反应原理如下：
本发明的有益效果是：采用本发明所述的方法，工时短、能耗低、工艺条件温和，操作简便、安全、准确，高效，重现性好，灵敏度高。
为了便于描述，4α-羟基-L-脯氨酸下述简称羟脯氨酸，L-脯氨酸下述简称脯氨酸，氯甲酸对硝基苄酯下述简称PNZ。
附图说明
图1是未加羟脯氨酸直接衍生化的空白图谱；
图2是羟脯氨酸及脯氨酸混合标准品溶液0.5ml直接衍生化的图谱；
图3是羟脯氨酸样品溶液0.5ml直接衍生化的图谱；
图4是实施例6的羟脯氨酸线性关系图；
图5是实施例6的脯氨酸线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做出详细说明。
仪器与试药
仪器：岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外检测器，LC Solution数据工作站；超声波清洗器；AL204分析天平(METTLER)；色谱柱：Agilent HC-C18,4.6×250mm,5μm。
试药：羟脯氨酸对照品(批号：111578-200201)及脯氨酸对照品(批号：140677-200405)由中国药品生物制品检定所提供(供含量测定用)，羟脯氨酸样品(批号：20120705)由河北冀海生物科技有限公司提供；乙腈为色谱纯；50％PNZ为我公司自制产品；其他试剂为分析纯；水为纯净水。
实施例1制备羟脯氨酸及脯氨酸混合标准品溶液
称取2g羟脯氨酸对照品及10mg脯氨酸置于25ml容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，制得羟脯氨酸及脯氨酸混合标准品溶液。
实施例2制备羟脯氨酸样品溶液
称取0.8g羟脯氨酸样品置于10ml容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，制得羟脯氨酸样品溶液。
实施例3衍生化
取步骤1制得的羟脯氨酸及脯氨酸混合标准品溶液及步骤2制得的羟脯氨酸样品溶液0.5ml，分别置于2个25ml容量瓶中，再分别加入0.5ml 50％PNZ的二氯甲烷溶液，强力振荡10min，再分别加入1ml 1mol/L NaOH振荡1min，最后加纯化水稀释至刻度，静置备用。
实施例4色谱测定
分别精密吸取衍生化后的羟脯氨酸及脯氨酸混合标准品溶液及羟脯氨酸样品溶液5μL，注入液相色谱仪中，按照下述色谱条件进样分析：
流动相：0.1％磷酸水溶液:乙腈＝1:1(v/v)；
色谱柱：Agilent HC-C18,4.6×250mm,5μm；
流速：1.0mL/min；
检测器：VWD。
其中，0.1％磷酸水溶液的配制：移取磷酸1ml置1000ml容量瓶，加水稀释至1000ml，摇匀。此色谱条件下各物质的保留时间(RT)见表1：
表1：物质保留时间
| 名称 | 羟脯氨酸衍生物 | PNZ水解物 | 脯氨酸衍生物 |
| RT(min) | 3.9 | 5.1 | 6.1 |
实施例5专属性考察
移取0.5ml 50％PNZ的二氯甲烷溶液于1个25ml容量瓶中，加入1ml 1mol/L NaOH振荡1min，最后加纯化水稀释至刻度，静置并按照色谱条件测定。色谱图见附图1，从图中可看出，本实验所用试剂对羟脯氨酸及脯氨酸的检测无干扰。
实施例6线性关系考察
分别取步骤1制得的羟脯氨酸及脯氨酸混合标准品溶液0.1ml,0.2ml,0.3ml,0.4ml,0.5ml,0.6ml，分别置于6个25ml容量瓶中，再分别加入0.5ml 50％PNZ的二氯甲烷溶液，强力振荡10min，再分别加入1ml 1mol/L NaOH振荡1min，最后加纯化水稀释至刻度，静置后按照色谱条件分别测定。测定其峰面积积分值，以对照品进样质量为横坐标，相应峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，羟脯氨酸回归方程为：y＝1716435.80x+2948289.33，R＝0.9998；脯氨酸回归方程为：y＝9032.8x-9701，R＝0.9996。结果表明羟脯氨酸在1.6μg～9.6μg范围内，脯氨酸在8ng～48ng范围内具有良好的线性关系。
表2：羟脯氨酸线性关系考察结果表
| 羟脯氨酸进样量(μg) | 峰面积 |
| 1.6 | 5579338 |
| 3.2 | 8473337 |
| 4.8 | 11226532 |
| 6.4 | 14076530 |
| 8 | 16722051 |
| 9.6 | 19284191 |
表3：脯氨酸线性关系考察结果表
| 脯氨酸进样量(ng) | 峰面积 |
| 8 | 57243 |
| 16 | 139767 |
| 24 | 210764 |
| 32 | 278649 |
| 40 | 348782 |
| 48 | 424091 |
实施例7脯氨酸检出限考察
取步骤1制得的羟脯氨酸及脯氨酸混合标准品溶液0.25ml至一100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，取0.1ml稀释液，置于25ml容量瓶中，再加入0.5ml 50％PNZ的二氯甲烷溶液，强力振荡10min，再加入1ml 1mol/L NaOH振荡1min，最后加纯化水稀释至刻度，静置并按照色谱条件测定。脯氨酸衍生物1-对硝基苄氧羰基-L-脯氨酸信噪比为2～3:1，对应的脯氨酸进样量(0.02ng)为即为本方法检出限。本发明为羟脯氨酸中脯氨酸含量的检测提供了一种高灵敏的检测手段。
实施例8重复性考察
取步骤1制得的羟脯氨酸及脯氨酸混合标准品溶液0.5ml，置于25ml容量瓶中，再加入0.5ml 50％PNZ的二氯甲烷溶液，强力振荡10min，再加入1ml 1mol/L NaOH振荡1min，最后加纯化水稀释至刻度，静置并按照色谱条件重复测定6次。结果表明：羟脯氨酸及脯氨酸含量的RSD均小于2％，本方法重复性好。
表4：重复性试验(n＝6)
| 样品编号 | 羟脯氨酸 | 脯氨酸 |
| 1 | 15732174 | 353754 |
| 2 | 16310487 | 348582 |
| 3 | 15922462 | 345854 |
| 4 | 15958614 | 353952 |
| 5 | 16168724 | 339975 |
| 6 | 16247652 | 356932 |
| RSD(％) | 1.38 | 1.80 |
实施例9溶液稳定性考察
取重复性考察所制得溶液，分别于0h，12h，24h，48h后按照色谱条件进样分析。结果表明：羟脯氨酸及脯氨酸含量的RSD均小于2％，本方法在48h内基本稳定，可提供准确的分析结果。
表5：稳定性试验
| 时间 | 羟脯氨酸 | 脯氨酸 |
| 0h | 15732174 | 353754 |
| 12h | 16135894 | 351463 |
| 24h | 15975439 | 344586 |
| 48h | 15816453 | 347246 |
| RSD(％) | 1.12 | 1.18 |
实施例10回收率考察
取同一批号样品约0.4g，共6份，精密称定，分别置于10ml容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，制得4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液；分别取此6份羟脯氨酸样品溶液0.25ml,置于6个25ml容量瓶中,再分别加入0.25ml羟脯氨酸及脯氨酸混合标准品溶液及0.5ml50％PNZ的二氯甲烷溶液，强力振荡10min，再分别加入1ml 1mol/L NaOH振荡1min，最后加纯化水稀释至刻度，静置备用。将制备后溶液分别按照色谱条件进样分析。结果表明，羟脯氨酸及脯氨酸的回收率均在90％～110％之间，本方法回收率较好。
表6：羟脯氨酸回收率测定结果表
| 称样量(g) | 样品含量(μg) | 加入量(μg) | 实测量(μg) | 回收率(％) |
| 1.0041 | 3.98 | 3.99 | 7.93 | 99.0 |
| 1.0023 | 3.97 | 3.99 | 8.03 | 101.8 |
| 1.0044 | 3.98 | 3.99 | 8.02 | 101.3 |
| 1.0036 | 3.97 | 3.99 | 7.87 | 97.7 |
| 1.0056 | 3.98 | 3.99 | 7.86 | 97.2 |
| 1.0035 | 3.97 | 3.99 | 8.07 | 102.8 |
表7：脯氨酸回收率测定结果表
| 称样量(g) | 样品含量(ng) | 加入量(ng) | 实测量(ng) | 回收率(％) |
| 1.0041 | 8.73 | 20.24 | 28.04 | 95.4 |
| 1.0023 | 8.71 | 20.24 | 28.44 | 97.5 |
| 1.0044 | 8.73 | 20.24 | 29.12 | 100.7 |
| 1.0036 | 8.72 | 20.24 | 27.48 | 92.7 |
| 1.0056 | 8.74 | 20.24 | 28.39 | 97.1 |
| 1.0035 | 8.72 | 20.24 | 29.37 | 102.0 |
实施例11样品测定
取同一批号样品约0.8g，共6份，精密称定，按照制备羟脯氨酸样品溶液，衍生化同法操作，并将制备后溶液分别按照色谱条件进样分析。结果见下表。
表8：样品测定结果(n＝6)
| 样品编号 | 羟脯氨酸(μg) | 脯氨酸(ng) |
| 1 | 7.88 | 8.69 |
| 2 | 7.97 | 9.10 |
| 3 | 7.91 | 8.78 |
| 4 | 7.92 | 8.97 |
| 5 | 7.71 | 8.90 |
| 6 | 7.92 | 8.94 |
| 平均含量 | 7.89 | 8.90 |
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (4)
1.一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法，其包括以下步骤：
(1)取4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸对照品加水溶解，制得4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液；
(2)取4α-羟基-L-脯氨酸样品加水溶解，制得样品溶液；
(3)将步骤(1)及步骤(2)所得混合标准品溶液及样品溶液分别加入氯甲酸对硝基苄酯二氯甲烷溶液，混匀，静置后分别取上层溶液稀释，得衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液和衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液；
(4)吸取步骤(3)获得的衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液和衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液注入液相色谱仪中，进行4α-羟基-L-脯氨酸测定，其中，色谱条件为：
流动相：0.1％磷酸水溶液:乙腈＝1:1v/v；
色谱柱：Agilent HC-C18,4.6×250mm,5μm；
流速：1.0mL/min；
进样量：5μL；
检测器：VWD；
(5)根据步骤(4)所得的色谱图计算4α-羟基-L-脯氨酸样品中4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)具体为称取2g 4α-羟基-L-脯氨酸对照品及10mg L-脯氨酸对照品置于25ml容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，制得4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)具体为称取0.8g 4α-羟基-L-脯氨酸样品置于10ml容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，制得4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)具体为取步骤1制得的4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液及步骤2制得的4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液0.5ml，分别置于2个25ml容量瓶中，再分别加入0.5ml 50％氯甲酸对硝基苄酯的二氯甲烷溶液，强力振荡10min，再分别加入1ml 1mol/L NaOH振荡1min，最后加纯化水稀释至刻度，静置备用。
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| 高效液相色谱法测定奶粉及其他乳制品中的L-羟脯氨酸;金苏英 等;《饮料工业》;20090731;第12卷(第1期);28-30 * |
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| CN103940936A (zh) | 2014-07-23 |
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