CN103235068B - 双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中氯化两面针碱含量的方法 - Google Patents

双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中氯化两面针碱含量的方法 Download PDF

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本发明公开了一种双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中氯化两面针碱含量的方法，属于高效液相色谱法测定物质含量的技术领域。包括以下步骤：（1）绘制标准曲线图；（2）将待测牙膏放置于具塞离心管中用甲醇定容；（3）制备待测溶液；（4）利用双三元高效液相色谱法二维柱分离，紫外检测器测定氯化两面针碱，根据标准曲线得出氯化两面针碱的含量。本发明方法操作简单，快速，选择性好，重现性好；能够使目标分析物的色谱峰与杂质色谱峰达到较好的基线分离，可以排除牙膏基质中干扰物的干扰，准确地对牙膏中的氯化两面针碱进行定量分析，且分离效果好，线性范围宽。

Description

双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中氯化两面针碱含量的方法
技术领域
本发明涉及牙膏中氯化两面针碱含量的测定方法，属于高效液相色谱法测定物质含量的技术领域。
背景技术
随着食品安全事件引起社会广泛关注，部分学者和社会舆论将视角延伸到“入口形”日化用品领域中，而牙膏作为口腔清洁用品是这一类产品的典型代表，关系到人身安全。对于功能性牙膏的质量与安全监督不可松懈。我国在中草药功效方面的研究有着辉煌悠久的历史，中草药功效型牙膏从面试至今已有几十年的历史，已经成为国内牙膏市场中的主类产品，一些国际日化用品企业为了加入中国市场也纷纷对中草药功效型牙膏进行开发和生产。这其中不免出现真假难辨、鱼目混珠的现象。
氯化两面针碱为芸香科花椒属植物两面针Zanthoxylum nitidum(Roxb.) DC 的干燥根两面针中的苯并菲定类生物碱，英文名称：Nitidine chloride ，分子式：C21H18NO4·Cl  ，CAS号：13063-04-2 ，分子量：382.82 ，标准品为淡黄色针状结晶，溶于甲醇等有机试剂。氯化两面针碱是两面针的主要活性有效成分，具有抗炎、镇痛、解毒等作用。
近年来，两面针药材资源开始出现匮乏，出现了较多根茎混用现象或伪品，如常见的飞龙掌血属的飞龙掌血Toddalia asiatica Lam 等，影响药材质量，随之影响了牙膏中所添加的两面针活性成分的质量。中国药典以氯化两面针碱为两面针含量测定的指标进行检测。
牙膏基质为复杂的混合物，通常由摩 擦剂、保湿剂、表面活性剂、增稠剂、甜味剂、色素、香精和活性添加物等组成。某些添加成分的化合物碳链比较长，在前处理中难以去除，同时，也对色谱柱的柱效有影响。用传统的高效液相色谱方法去分离、检测，其中的杂质对标准品氯化两面针碱的测定有干扰。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中氯化两面针碱含量的方法，本发明方法操作简单，快速，选择性好，重现性好；能够使目标分析物的色谱峰与杂质色谱峰达到较好的基线分离，可以排除牙膏基质中干扰物的干扰，准确地对牙膏中的氯化两面针碱进行定量分析，且分离效果好，线性范围宽。
本发明所采取的技术方案是：一种双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中氯化两面针碱含量的方法，包括以下步骤：（1）绘制氯化两面针碱的标准曲线图；
（2）准确称取待测牙膏放置于具塞离心管中，加入甲醇振荡、摇匀，用甲醇定容；
（3）将步骤（1）的具塞离心管室温下超声处理，离心，取上清液用0.22μm的有机相滤膜过滤得待测溶液；
（4）利用双三元高效液相色谱法二维柱分离，紫外检测器测定待测溶液中氯化两面针碱，根据步骤（1）的标准曲线得出牙膏待测溶液中氯化两面针碱的含量；
采用C18二维色谱柱测定；
第一维色谱柱为富集柱C18柱（2.1mm×100mm，5μm），第二维色谱柱为分析柱C18柱（4.6mm×250mm，5μm）。
所述步骤（4）中采用C18二维色谱柱测定的优选条件为：以乙腈和0.02mol/L KH2PO4溶液为流动相，流动相加H3PO4调节pH值为2.61～2.75，检测波长为328nm，进样量为50uL，色谱柱柱温为40℃，等梯度洗脱，乙腈与KH2PO4溶液的体积比是35:65，流速为0.5～1.2mL/min；
十通阀的切换优选时间如下：
时间（min） 阀 柱类型
0.000 1-2 分析柱
0.600 10-1 富集柱+分析柱
1.100 1-2 分析柱
步骤（2）中每克待测牙膏定容至10mL。
步骤（3）中超声处理的时间优选为15分钟。
步骤（3）中10000rpm离心处理优选为5分钟。
优选的步骤（4）中流动相的流速优选为1.0mL/min。
本发明所用仪器为双三元高效液相色谱仪 美国戴安公司 UltiMate 3000。
C18柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。C18二维色谱柱，为两个单独的C18色谱柱，两个C18色谱柱，为第一维色谱柱作为富集柱可选用C18（2.1mm×100mm ，5μm ）柱或性能相当者，第二维色谱柱作为分析柱可选用C18（4.6mm×250mm，5μm）柱或性能相当者。
本发明设备具有两套三元梯度洗脱泵，平行放置，一左一右，分别为左泵和右泵；两个泵是各自独立工作的，通过阀进行切换。
双三元高效液相色谱，为拥有两个独立压力泵的溶剂/流速双梯度三元高效液相色谱仪。
待测牙膏可选用市售的商品类中药两面针牙膏或其他类型牙膏。
氯化两面针碱的标准曲线可采用本领域常规的标准曲线建立方法绘制，如外标法，根据标准品溶液的各浓度和对应峰面积的关系绘制氯化两面针碱的标准曲线。
在线二维色谱柱切换技术是通过改变切换阀位置实现进样器、不同流动相、不同色谱柱、检测器之间的变换连接，从而实现被分析物与其它干扰成分的分离，达到纯化与富集的目的，进而完成对被分析物的浓度测定。
其独特的双三元泵系统可以通过十通阀任意切换对两根色谱柱的进样、流动相和检测器之间的流路进行改变。可以实现复杂样品的直接进样分析，实现牙膏中目的重要活性有效成分。                                                         
与其它干扰杂质的在线分离，减少了传统的离线分析样品制备方法中的繁琐的步骤，避免了被分析物由于过于复杂、冗繁的前处理所造成的损失，缩短了分析时间，提高了自动化程度，实现了快速、方便、灵敏的牙膏中两面针活性有效成分氯化两面针碱的在线二维色谱柱检测。实验证明：该发明方法在牙膏中两面针活性有效成分氯化两面针碱的含量测定中具有巨大的优越性。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明方法操作简单，快速，选择性好，重现性好；能够使目标分析物的色谱峰与杂质色谱峰达到较好的基线分离，可以排除牙膏基质中干扰物的干扰，准确地对牙膏中的氯化两面针碱进行定量分析，且分离效果好，线性范围宽。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为实施例1中牙膏样品的色谱图；
图2为实施例1中氯化两面针碱的标准曲线图；
图3为0.07μg/mL氯化两面针碱标准溶液重复进样7次测定的重叠色谱图。
具体实施方式
实施例1
双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中氯化两面针碱含量的方法，包括以下步骤：（1）绘制氯化两面针碱的标准曲线图；
（2）准确称取待测牙膏2.0g放置于50mL具塞离心管中，加入5～10mL甲醇振荡、摇匀，用甲醇定容至20mL；
（3）将步骤（1）的具塞离心管室温下超声处理15分钟，10000rpm离心5分钟，取上清液用0.22μm的有机相滤膜过滤得待测溶液；
（4）利用双三元高效液相色谱法二维柱分离，紫外检测器测定待测溶液中氯化两面针碱，根据步骤（1）的标准曲线得出牙膏待测溶液中氯化两面针碱的含量；
测定条件为：采用C18二维色谱柱，以乙腈和0.02mol/L KH2PO4溶液为流动相，流动相加H3PO4调节pH值为2.61～2.75，检测波长为328nm，进样量为50uL，色谱柱柱温为40℃，等梯度洗脱，乙腈与KH2PO4溶液的体积比是35:65，流速为1.0mL/min；
第一维色谱柱为富集柱C18柱（2.1mm×100mm，5μm），第二维色谱柱为分析柱C18柱（4.6mm×250mm，5μm），十通阀的切换时间如下表1：
表1
时间（min） 阀 柱类型
0.000 1-2 分析柱
0.600 10-1 富集柱+分析柱
1.100 1-2 分析柱
1、标准曲线的建立
采用外标法测定氯化两面针碱，将0.8μg/mL、0.5μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL等不同浓度的标准溶液从低浓度到高浓度依次进液相色谱分析，得到相应谱图，以浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标作图，绘制如图2所示的氯化两面针碱的标准曲线。
结果显示，氯化两面针碱的标准溶液在 0.01～0.8 μg/mL的浓度范围内，所得峰面积对浓度呈现良好的线性关系，线性回归方程和相关性系数见表2。依据色谱峰信噪比S/N > 3 ,S/N>10计算方法检出限和定量限，得到本方法的检出限0.05mg/kg，定量限0.17/kg。线性回归方程和相关系数为：y=3.9111x-0.0385(r=0.9998)。
表2 线性方程、相关系数、检出限和定量限
2、精密度试验
将浓度为0.08μg/mL的标准溶液重复进样7次，计算其RSD值，结果如表3所示。经重复测定，计算氯化两面针碱保留时间的RSD值为0.22%，峰面积的RSD值为1.15%，浓度含量的RSD值为1.01%。
表3 0.08μg/mL氯化两面针碱标准溶液重复进样7次测定结果
序号 保留时间（min） 峰面积(mAU×min) 浓度含量(μg/mL)
1 8.667 0.2664 0.0779
2 8.653 0.2723 0.0795
3 8.653 0.276 0.0804
4 8.653 0.2681 0.0748
5 8.633 0.2666 0.078
6 8.633 0.243 0.072
7 8.64 0.2621 0.0768
平均值 8.65 0.26 0.08
RSD 0.22 1.15 1.01
图3 为0.08μg/mL氯化两面针碱标准溶液重复进样7次测定的重叠色谱图。
3、回收率试验
采用三个不同浓度水平加标试验，按照该方法前处理步骤处理样品，根据标准曲线计算器测定值，进而计算回收率，每个添加浓度重复两次试验，氯化两面针碱回收率试验结果见表4。
表4 回收率试验结果
 计算结果显示，不同牙膏基质的回收率为87.50%～101.67%。

Claims (5)

1.一种双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）绘制氯化两面针碱的标准曲线图；
（2）准确称取待测牙膏放置于具塞离心管中，加入甲醇振荡、摇匀，用甲醇定容；
（3）将步骤（1）的具塞离心管室温下超声处理，离心，取上清液用0.22μm的有机相滤膜过滤得待测溶液；
（4）利用双三元高效液相色谱法二维柱分离，紫外检测器测定待测溶液中氯化两面针碱，根据步骤（1）的标准曲线得出牙膏待测溶液中氯化两面针碱的含量；
采用C18二维色谱柱测定；
第一维色谱柱为富集柱C18柱，内径为2.1mm，柱长为100mm，填料粒径为5μm，第二维色谱柱为分析柱C18柱，内径为4.6mm，柱长为250mm，填料粒径为5μm；
所述步骤（4）中采用C18二维色谱柱测定的条件为：以乙腈和0.02mol/L KH2PO4溶液为流动相，流动相加H3PO4调节pH值为2.61～2.75，检测波长为328nm，进样量为50uL，色谱柱柱温为40℃，等梯度洗脱，乙腈与KH2PO4溶液的体积比是35:65，流速为0.5～1.2mL/min；
十通阀的切换时间如下：
时间（min） 阀 柱类型 0.000 1-2 分析柱 0.600 10-1 富集柱+分析柱 1.100 1-2 分析柱
。
2.如权利要求1所述的双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于：步骤（4）中流动相的流速为1.0mL/min。
3.如权利要求1所述的双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于：步骤（2）中每克待测牙膏定容至10mL。
4.如权利要求1所述的双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于：步骤（3）中超声处理的时间为15分钟。
5.如权利要求1所述的双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于：步骤（3）中10000rpm离心处理5分钟。
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