CN107976496B - 一种牙膏中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇分离及含量分析的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及牙膏防腐剂的检测及分析，具体涉及牙膏中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇分离及含量分析的方法。包括步骤：所述方法包括如下步骤：(1)利用高效液相色谱法，绘制苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的标准工作曲线；(2)称取牙膏试样，用甲醇水溶液溶解，经过搅拌、超声溶解后定容得到样品液；(3)将步骤(2)样品液离心后，取上清液用微孔滤膜过滤得到待测液；(4)用高效液相色谱法测试步骤(3)中的待测液，得到牙膏样品中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的峰面积，由步骤(1)中标准工作曲线得出牙膏样品中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的含量。本发明提供的方法使苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇完全分离，而且具有柱效高、选择性好、重复性好、线性范围宽、检测限高、操作简单等特点。

Description

一种牙膏中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇分离及含量分 析的方法

技术领域

本发明涉及牙膏防腐剂的检测及分析，具体涉及牙膏中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇分离及含量分析的方法。

背景技术

近年来，食品安全问题层出不穷，引起了社会的广泛关注。随后，部分学者和舆论将视角转到了口腔清洁护理用品中，而牙膏作为口腔清洁护理用品的代表，关系到人身安全问题。因此牙膏中各种添加剂的含量和安全监督尤为重要。而苯甲酸、山梨酸、水杨酸、苯氧乙醇作为防腐剂，加入牙膏中延迟微生物的生长或化学变化引起的腐败。

苯甲酸为具有苯或甲醛的气味的鳞片状或针状结晶，它的蒸气有很强的刺激性，吸入后易引起咳嗽。水杨酸本身刺激性强，仅作为抗真菌药和角质溶解药；山梨酸是国际粮农组织和卫生组织推荐的高效安全的防腐保鲜剂，广泛应用于食品、饮料、烟草、农药、化妆品等行业，但是如果食品中添加的山梨酸超标严重，消费者长期服用，在一定程度上会抑制骨骼生长，危害肾、肝脏的健康。苯氧乙醇是化妆品中常见的防腐剂，属于相对比较安全的防腐剂之一，苯氧基乙醇在化妆品中的限定使用浓度最高为1％，溶液剂为0.1％-2％(其中加乙醇10％)。总之，防腐剂超标准使用会对人体造成一定损害。我国还制定了标准GB2760-2011《食品添加剂使用标准》中严格规定了各种防腐剂的使用限量，并且建立了防腐剂的标准检测方法。牙膏中许用防腐剂苯甲酸、水杨酸、山梨酸和苯氧乙醇的含量最高分别为0.5％、0.5％、0.6％和1.0％。因此，亟待建立一种牙膏中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇同时分离检测的方法。

近年来，文献报道(GB/T5009.29-2003)可通过气相色谱法、薄层色谱法和高效液相色谱法分析检测果汁中的苯甲酸和山梨酸的含量。但同时实现苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇分离检测的方法却鲜有报道。这主要由于四种防腐剂结构和性质相似，一种分析方法较难实现以上四种化合物的同时分离和检测。此外，牙膏中还含有大量干扰组分，现有的分离方法不能实现以上四种化合物的有效分离。因此，建立牙膏中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的同时分析检测方法具有重要意义。

中国专利(申请号201110168425.X)以甲醇、醋酸铵为流动相，采用三波长通道等度洗脱分离防腐剂苯甲酸、山梨酸、水杨酸，该专利虽然分析时间较短，但是采用三通道进行分析检测，对于分析仪器要求较高，不适合于样品中多指标的高通量分析；中国专利(申请号201510484674.8)以甲醇、乙腈、水、磷酸二氢钠四种溶剂组成流动相，在室温条件下梯度洗脱40min，来分离化学品中的苯氧乙醇和苯甲酸，该方法虽然具有较好的检测限，但是该方法采用四相流动相混合进行分析，对于实际样品分析的干扰较大。

发明内容

为了解决上述现有技术方案中的不足，本发明针对以上问题，在同一波长条件下优化分析条件，采用C8色谱柱进行分离，以醋酸-醋酸铵缓冲盐和乙腈为流动相，通过梯度洗脱程序实现四种防腐剂的快速分析，具有较宽的线性范围和较高的检测限。本发明提供了一种高效液相色谱法在同一波长下同时分析检测牙膏中的苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的含量，而且采用分离效果更好的C8色谱柱和更为简便的流动相进行分离，具有选择性好、灵敏度高、回收率高和重现性好等特点。本发明有效弥补了现有方法的诸多不足，有望进一步应用于食品安全和日化等领域的品控监测。

本发明提供了一种牙膏中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇分离及含量分析的方法，操作简单、选择性好、重复性好、检测限低。

本发明提供一种牙膏中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇分离及含量分析的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)利用高效液相色谱法，绘制以甲醇水溶液为溶剂的苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的标准工作曲线；

(2)用甲醇水溶液搅拌、超声溶解牙膏，定容得到样品液；

(3)用高效液相色谱法测试步骤(2)中的样品液的上清液，得到牙膏样品中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的峰面积，由步骤(1)中标准工作曲线得出牙膏样品中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的含量；

所述步骤(1)、(3)中的高效液相色谱法的条件为：用C8色谱柱，(优选的为AcclaimTM 120型C8色谱柱)，用流动相A和缓冲盐B，在20～60℃(优选35℃)的条件下梯度洗脱，用紫外可见检测器检测；所述流动相A为含有含体积分数为0.01％～0.5％(优选0.0733％)的醋酸的乙腈；所述缓冲盐B为pH值为2.0～6.5(优选4.5)的醋酸和醋酸铵的混合溶液。

其中，所述步骤(1)、(2)中甲醇水溶液的体积百分比为10～90％(优选30％)。

其中，所述步骤(1)、(3)中高效液相色谱的条件为0.5～2.0mL/min(优选 1.0mL/min)的流速，进样量为1～50μL(优选10μL)。

其中，所述步骤(1)、(3)中高效液相色谱的检测波长为190～300nm(优选 225nm)。

其中，所述步骤(1)、(3)中高效液相色谱的运行时间10～90min(优选35 min)。

其中，所述步骤(1)、(3)中高效液相色谱的所述C8色谱柱的内径为4.6mm，柱长为50～300mm(优选250mm)，填料粒径为1～10μm(优选5μm)。

其中，所述步骤(3)中样品液的清液的制备方法为将步骤(2)样品液离心后，取上清液用0.10～1.0μm(优选0.45μm)微孔滤膜过滤得到。

其中，所述步骤(1)、(3)中高效液相色谱的梯度洗脱方式为:0～3min，流动相A体积分数10％；3～20min，流动相A体积分数35％；20～35min，流动相A体积分数50％；35～28min，流动相A体积分数50％；28～29min，流动相 A体积分数10％；29～35min，流动相A体积分数10％；35min，停止分析。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、采用高效液相色谱法，按照上述色谱条件，使苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇较好的分离开，柱效高、选择性好、重复性好、检测限低、操作简单；

2、本实验采用C8色谱柱，C8色谱柱是反相色谱柱的一种，适用于分析弱极性的物质，C8在弱极性较强的一侧，也就是说，C8适合分析弱极性物质里极性稍强的一类物质。具有高度可控的单分子层形成和封尾技术，同时具有柱间重现性高、选择性好和分离效率高等优点；酸性、中性和碱性化合物均能分离，无条件限制；因此可将四种目标分析物与其他杂志较好的分离开，排除了牙膏样品中其他干扰物质的影响。

3、以乙腈、醋酸-醋酸铵为流动相，在20～60℃(优选35℃)的条件下梯度洗脱，四种物质的色谱峰型良好，而且均能得到完全分离，分离度大于2，此外，本方法具有更宽的线性范围和更高的检测灵敏度。

4、采用高效液相色谱法分离苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇，方法的检出限分别为0.0372μg/mL、0.0133μg/mL、0.0230μg/mL和0.0106μg/mL，定量限分别为0.1240μg/mL、0.0443μg/mL、0.0767μg/mL和0.03533μg/mL，因此，本方法可应用于痕量苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的分析检测。

附图说明

图1是苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的色谱图；

图2是苯甲酸的标准工作曲线；

图3是山梨酸的标准工作曲线；

图4是水杨酸的标准工作曲线；

图5是苯氧乙醇的标准工作曲线；

具体实施方式

以下部分是具体实施方式对本发明做进一步说明，但以下实施方式仅仅是对本发明的进一步解释，不代表本发明保护范围仅限于此，凡是以本发明的思路所做的等效替换，均在本发明的保护范围。

实施例1

对高效液相色谱法测定苯甲酸、山梨酸、水杨酸、苯氧乙醇含量的精密度进行确认：

(1)苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的标准工作曲线绘制；

准确称取一定量的苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇标准品，用30％的甲醇水溶液分别配制成浓度0.5，5，25，50，100，200，500μg/mL的标准溶液。浓度由低到高依次进高效液相色谱分析，得到对应的谱图，如图1所示。

(2)利用高效液相色谱法测定苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的峰面积，峰面积的测定可通过色谱峰与基线之间的面积积分获得，峰面积如表1 所示；用浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，标准工作曲线如图2、3、4、5所示。苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的线性方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限如表2所示。实验结果表明，在0.5～ 500μg/mL的浓度范围内，标准品的质量浓度与峰面积值具有良好的线性关系。

测定条件为：

色谱柱：AcclaimTM 120型C8色谱柱(5μm，4.6×250mm)

流动相：A：乙腈(含体积分数为0.0733％的醋酸)，缓冲盐B:醋酸-醋酸铵(pH＝4.5)

流速：1.0mL/min；进样量:10μL

检测器：紫外可见检测器；检测波长：225nm

柱温：35℃

运行时间：35min

苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的梯度洗脱方式分析如表3所示

表1苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇标准液平均峰面积

峰面积：色谱峰与基线之间的面积积分

表2苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的线性方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限

表3苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇梯度洗脱方式

(3)精密度实验

精密吸取同一浓度为50μg/mL的苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇标准溶液，在本方法的色谱条件下连续进样7次，测定其峰面积及保留时间。如下表所示，苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇标准溶液峰面积的RSD值分别为0.69％、0.65％、0.52％和0.47％，保留时间的RSD值为0.036％、0.033％、 0.056和0.025％。

苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇标准溶液保留时间、峰面积及RSD 值如表4所示：

表4苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇标准溶液保留时间、峰面积及RSD值

峰面积：色谱峰与基线之间的面积积分

实施例2

使用本发明所述方法对苯甲酸、山梨酸、水杨酸、苯氧乙醇含量进行分析。

(1)准确称取待测牙膏样品0.5g于50mL离心管中，加入10ml 30％甲醇溶解，晃匀，定容至50mL；

(2)将步骤(1)中溶液超声10min，4000rpm离心10分钟，取上清液用 0.45μm的有机相滤膜过滤得待测牙膏溶液。

(3)利用高效液相色谱法测定牙膏样品中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的峰面积，对照实施例1中制得的标准工作曲线，得出牙膏样品中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的含量。

测定条件为：

色谱柱：AcclaimTM 120型C8色谱柱(5μm，4.6×250mm)

流动相：A：乙腈(含体积分数为0.0733％的乙酸)，缓冲盐B:醋酸铵(pH ＝4.5)

流速：1.0mL/min；进样量:10μL

检测器：紫外可见检测器；检测波长：225nm

柱温：35℃

运行时间：35min

苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的梯度洗脱方式分析，如表3所示

(4)牙膏样品加标回收率实验

对于二氧化硅基质空白牙膏，分别同时加入浓度为25μg/mL、50μg/mL和 100μg/mL的苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇进行加标回收试验。每个添加浓度按照本方法的前处理条件及色谱条件进行7次平行测定，并计算回收率和相对标准偏差(即精密度)。牙膏中水杨酸、苯甲酸、山梨酸和苯氧乙醇的回收率及相对标准偏差分别如表5、6、7、8所示。结果表明苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的回收率分别为101.5％～108.7％、102.6％～109.5％、 92.24％～101.0％、93.78％～107.2％。方法重现性良好。

表5牙膏中水杨酸的回收率及相对标准偏差

ND:低于检测限

回收率：(加标后浓度-加标前浓度)/加标浓度*100％

表6牙膏中苯甲酸的回收率及相对标准偏差

ND:低于检测限

回收率：(加标后浓度-加标前浓度)/加标浓度*100％

表7牙膏中山梨酸的回收率及相对标准偏差

ND:低于检测限

回收率：(加标后浓度-加标前浓度)/加标浓度*100％

表8牙膏中苯氧乙醇的回收率及相对标准偏差

ND:低于检测限

回收率：(加标后浓度-加标前浓度)/加标浓度*100％。

Claims (4)

1.一种牙膏中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇分离及含量分析的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)利用高效液相色谱法，绘制以甲醇水溶液为溶剂的苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的标准工作曲线；

(2)用甲醇水溶液搅拌、超声溶解牙膏，定容得到样品液；

(3)用高效液相色谱法测试步骤(2)中的样品液的上清液，得到牙膏样品中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的峰面积，由步骤(1)中标准工作曲线得出牙膏样品中苯甲酸、山梨酸、水杨酸和苯氧乙醇的含量；

所述步骤(1)、(3)中高效液相色谱的条件 为0.5～2.0mL/min的流速，进样量为1～50μL；

所述步骤(1)、(3)中高效液相色谱的C8色谱柱的内径为4.6mm，柱长为50～300mm，填料粒径为5μm；

所述步骤(1)、(3)中的高效液相色谱法的条件为：用C8色谱柱，用流动相A和缓冲盐B，在20～60℃的条件下梯度洗脱，用紫外可见检测器检测；所述流动相A为含有含体积分数为0.01％～0.5％的醋酸的乙腈；所述缓冲盐B为pH值为4.5的醋酸和醋酸铵的混合溶液；

所述步骤(1)、(3)中高效液相色谱的梯度洗脱方式为：0～3min，流动相A体积分数10％；3-20min，流动相A体积分数从10%洗脱至35%；20-25min， 流动相A体积分数从35%洗脱至50%；25～28min，流动相A体积分数50％；28-29min 时流动相A体积分数从50%洗脱至10%；29～35min，流动相A体积分数10％；35min，停止分析。

2.根据权利要求1中所述方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）中甲醇水溶液的体积百分比10~90%。

3.根据权利要求1中所述方法，其特征在于，所述步骤（1）、（3）中高效液相色谱的检测波长为190~300 nm。

4.根据权利要求1中所述方法，其特征在于，所述步骤（3）中样品液的上清液的制备方法为将步骤（2）样品液离心后，取上清液用0.10~1.0μm微孔滤膜过滤得到。

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