CN101101284A - 一种同时测定水果中多种有机酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种同时测定水果中多种有机酸含量的高效液相色谱法。采用包含有紫外检测器的液相色谱仪和反相键合硅胶色谱柱。采用了有机溶剂流动相A和一定浓度和pH值的水溶液流动相B作梯度洗脱剂。本发明仅在常用的高效液相色谱仪上一次完成水果中主要有机酸的定量检测过程。本发明方法先进、准确、简便，选用的色谱柱，分析时间可缩短在8min以内，大大提高了分析效率。同时方法使用Carrez试剂作为水果样品的净化剂，这是Carrez试剂首次用于水果有机酸的测定。

Description

一种同时测定水果中多种有机酸含量的方法

技术领域

本发明涉及水果有机酸的含量测定方法，使用通常的高效液相色谱仪特定的色谱条件，就可以完成水果中草酸、酒石酸、维生素C、苹果酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸等有机酸的测定，得到准确的结果。

背景技术

水果中的有机酸的分析方法主要有：酸碱滴定法、薄层色谱法、气相色谱法(GC)、离子色谱法(HPIC)及高效液相色谱法等。酸碱滴定法只能测定总酸量，且操作繁琐；薄层色谱法定量精度差；气相色谱法常因酸的沸点较高不宜气化而需衍生步骤，误差较大，方法繁琐；离子色谱法是近年来应用较多的测定植物体有机酸的方法，可同时测定溶液中有机酸根离子和无机阴离子，但大量无机阴离子的存在通常增加了低含量有机酸检测难度。

测定维生素C的方法主要有2，6-二氯靛酚钠盐滴定法、2，4-二硝基苯肼比色法、荧光分光光度法等。由于维生素C有较强的还原性，在中性和碱性条件下不稳定，遇热容易被破坏，因而上述方法灵敏度低、操作繁琐费时，测定值往往偏低。

有机酸是水果中主要风味营养物质之一，其含量高低与水果品质有密切联系。用高效液相色谱法测定水果中有机酸虽然操作简便、准确度高、重现性好，也可同时定量测定多种有机酸，但是时间偏长，降低了效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、准确性好、效率高的水果中有机酸同时测定的方法。

本发明同时测定水果中有机酸含量的高效液相色谱法包括下述步骤：

1.分别用流动相水相作溶剂制备待测有机酸不同浓度梯度的标准溶液；

2.制备待测样品：选果-削皮-切片-榨汁-过滤。所得果汁用流动相水相制备果汁质量浓度为0.1～1.0g/L的待测液，在定容时向体系中加入Carrez(卡瑞)试剂I和II各0.05～0.25ml进行净化处理。摇匀、静置；

3.使用包括四元泵(可梯度洗脱即可)、恒温箱、紫外检测器以及工作站所组成的HPLC仪。在反相键合色谱柱上，以甲醇/磷酸二氢钠-磷酸缓冲液为其流动相梯度洗脱分离草酸、酒石酸、维生素C、苹果酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸。

色谱条件如下：

分析柱：反相键合硅胶色谱柱；

流动相：甲醇/0.01mol/L磷酸二氢钠-磷酸缓冲液，pH＝2.6～3.2；

流速：0.4～1.0ml/min；

洗脱方式：梯度洗脱；

检测：UV 200～280nm；

温度：20～35℃；

进样体积：15.0～25.0μL；

分别取0.20μm或0.45μm针头过滤后的20μL(定量环)系列标准溶液进行谱图及回归曲线的测定。经处理后的待测样品用0.20μm或0.45μm针头过滤后进样，在上述色谱条件下测定有机酸含量。

4.依据色谱峰面积，利用外标法由各标准溶液的回归方程计算样品中各有机酸的含量。

本发明中洗脱梯度为流动相A和流动相B在0～8min内体积比在1.5∶98.5～10∶90梯度范围。本发明中待测样品的制备时使用Carrez试剂即卡瑞试剂作为样品净化剂。本发明中反向键合色谱柱为C₈或C₁₈硅胶色谱柱，当反相键合色谱柱为C₈硅胶色谱柱时，本发明能在8min内完成对一个水果样品注射液的定量检测。本发明中用外标法计算有机酸的含量。本发明中测定的有机酸为草酸、酒石酸、维生素C、苹果酸、乳酸、柠檬酸、富马酸或琥珀酸。本发明中水果是梨、苹果、草莓或油桃。

本发明采用了Carrez试剂即卡瑞试剂作为样品净化剂处理样品不仅可达到净化样品、保护色谱柱的目的，同时测量精度和回收率都不同程度得到提高。

液体维生素C具有较强的还原性，易受空气、热、光等因素影响，通常用研磨法制样，用水定容的方法往往在有机酸的测定中不能测定出维生素C。本发明采用榨汁法制样，用流动相水相定容，从而实现了维生素C的检测，且效果良好。

本发明分别获得了对同时测定水果中多种有机酸含量的高效液相色谱法有重要影响的几个条件：检测波长、温度、样品溶剂、流动相配比和流速及洗脱梯度等，并考察了水果有机酸的回归方程、相关系数、最小检出限，及本发明方法的精密度与回收率。其中，回收率是向已知浓度样品中加入一定量标准溶液，按相同色谱条件及实验方法测定，利用增量法计算回收率。同一个水果样品平行测定三次，所得结果相对标准偏差在4％以内，方法的回收率在91.48％～101.50％之间，因此本发明还具有准确度高，重现性好的优点。

本发明使用甲醇/磷酸二氢钠-磷酸缓冲液为流动相，进行梯度洗脱，分离结果的重现性较好，通过选择水相缓冲区间和在区间内微调pH值，使分析方法适用于不同品牌反相键合色谱柱和各种水果试样类型(例如：梨、苹果、草莓、油桃等水果)中的有机酸的测定，并能得到准确的结果。本发明不需增加设备，即可适合于一般HPLC分析室采用。

本发明能在8min内完成对一个水果样品注射液的定量检测，并且具有分析范围广，分析效率高、操作方便的特点。

附图说明

图1为本发明实施例混合对照品溶液的色谱图。

图2为本发明实施例水晶梨供试品溶液的色谱图。

图3为本发明实施例8条标准曲线回归方程、相关系数、线性下限及检出限。

图4为本发明实施例方法精密度及回收率。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明。

1、对照品溶液的制备：

分别取纯度≥99％的草酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、L-(-)-苹果酸、富马酸、乳酸、维生素C试剂，用流动相水相配制以上8种有机酸约0.3g/L的标准贮备液。根据水果中有机酸的实际含量及每种有机酸在一定紫外检测波长下的响应值，稀释一定倍数配制成含有上述8种有机酸的混合标准溶液，再将上述溶液稀释成不同的浓度梯度，即上述混合标准溶液浓度的0.2，0.4，0.6，0.8，1.0倍。

2、待测溶液的制备：

榨汁法制样：选取水晶梨-削皮-切片-榨汁-过滤。所得果汁称3g左右，用流动相水相稀释，于25ml容量瓶定容。定容时向体系中加入Carrez(卡瑞)试剂各0.1mL。(注：Carrez试剂I配制按GB1273；Carrez试剂II配制按GB666)静置。

3、色谱条件：

色谱柱：Eclipse XDB-C₈柱(4.6×150mm，5μm)；柱温：25℃；流速：0.5ml/min；进样体积：20.0μL；检测器：紫外检测器；检测波长：214nm。流动相A：甲醇，流动相B：0.01mol/L磷酸二氢钠-磷酸缓冲液(pH＝2.6)；采用梯度洗脱程序：0～2.4min内，由7.5％A变化为1.5％A。

4、分别取对照品及待测溶液经0.45μm针头过滤后注入液相色谱仪进行分析测定，由化学工作站得到8条标准曲线回归方程及样品的色谱图。混合对照品溶液的色谱图见图1；水晶梨待测溶液的色谱图见图2；8条标准曲线回归方程见图3。进一步用外标法得到水果中各有机酸的含量：

水果名称	草酸	酒石酸	维生素C	苹果酸	乳酸	柠檬酸	富马酸	琥珀酸
									水晶梨(mg/g)	0.307	0	0.450	1.651	0.121	1.027	0.0010	0

Claims (8)

1、一种同时测定水果中多种有机酸含量的方法，其特征在于采用高效液相色谱法进行同时测定水果中有机酸，具体测定方法为：

(1)用流动相的水相制备标准溶液在0.01～0.3g/L的浓度范围；

(2)待测样品的制备：利用榨汁法取得样品，用流动相的水相稀释至浓度为0.1～1.0g/L，净化；静置后，取清液经0.20或0.45μm针头过滤后待分析；

(3)  使用包括四元泵、恒温箱、紫外检测器以及化学工作站所组成的HPLC仪，在反相键合色谱柱上，以甲醇/磷酸二氢钠-磷酸缓冲液为流动相，梯度洗脱分离有机酸，色谱条件如下：

分析柱：反相键合柱；

流动相：A：甲醇；

B：0.01mol/L磷酸二氢钠-磷酸缓冲液，pH＝2.6～3.2；

流速：0.4～1.0ml/min；

洗脱方式：梯度洗脱；

检测：UV 200～280nm；

温度：20～35℃；

进样体积：15.0～25.0μL；

(4)用外标法定量分析计算水果中几种主要有机酸的含量。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于洗脱梯度为流动相A和流动相B在0～8min内体积比在1.5∶98.5～10∶90梯度范围。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于待测样品的制备时使用Carrez试剂即卡瑞试剂作为样品净化剂。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于反相键合色谱柱为C₈或C₁₈硅胶色谱柱。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于反相键合色谱柱为C₈硅胶色谱柱。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于用外标法计算有机酸的含量。

7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于测定的有机酸为草酸、酒石酸、维生素C、苹果酸、乳酸、柠檬酸、富马酸或琥珀酸。

8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于水果是梨、苹果、草莓或油桃。

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