CN104359989A

CN104359989A - 焦糖色素中2、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-四羟基-丁基咪唑的液相色谱检测方法

Info

Publication number: CN104359989A
Application number: CN201410626380.XA
Authority: CN
Inventors: 荣维广; 马永建; 吉文亮
Original assignee: JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Current assignee: JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Priority date: 2014-11-07
Filing date: 2014-11-07
Publication date: 2015-02-18

Abstract

一种焦糖色素中副产物2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-四羟基-丁基咪唑的固相萃取结合高效液相色谱的检测方法，该方法包括以下步骤：1.待测样品溶液制备；2.样品检测；3.结果分析。该方法具有快速检测，高灵敏度、准确度高、成本低和通用性强等优点。

Description

焦糖色素中2、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-四羟基-丁基咪唑的液相色谱检测方法

技术领域

本发明涉及一种焦糖色素中副产物2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-四羟基-丁基咪唑的检测方法，属于食品安全检测的检验方法。

背景技术

焦糖色素是一种食品添加剂，俗称酱色，是一种浓红褐色的胶体物质，占整个食品着色剂销量的90 %以上。可应用于酱油，醋，啤酒，酱菜，罐头，糖果，汤料，焙烤食品，烤烟及止咳糖浆等各个方面。在焦糖色素的形成过程中主要发生两大类反应——美拉德反应和焦糖化反应，其中普通焦糖色素的生产过程中主要发生焦糖化反应，生产过程中加入氨（铵）催化剂的焦糖色素生产以美拉德反应为主。研究发现，美拉德反应过程中能够产生许多对人体有害的化学物质，如2-甲基咪唑（2-MEI）、4-甲基咪唑（4-MEI）和2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羟基丁基）咪唑（THI）。2-MEI 和4-MEI作为神经毒素，具有强烈的致惊阙作用，并且美国国家毒品管理计划和其它研究者已经有明确的毒理学数据证明其具有致癌的风险。2011年，国际肿瘤研究机构(IARC)将甲基咪唑类化合物认定为2B类致癌物，而THI可引起免疫毒性。鉴于咪唑类化合物的毒性，欧盟委员会已经对III类焦糖色素中THI和4-MEI建立了限量规定，分别为10和200 mg/kg。因此，建立焦糖色素中2-MEI、4-MEI和THI的检测方法对保证焦糖色素的品质乃至使用焦糖色素着色的包括食品在内的众多产品的品质尤其重要。

焦糖色素是一种黑褐色粘稠液体或固体，基质极其复杂。如何去除大量基质的干扰，成为准确分析微量甚至痕量的目标物的关键。目前，针对焦糖色素中4-MEI含量的测定，我国唯有食品添加剂焦糖色卫生标准GB8817-2001，采用薄层法测定，而对于2-MEI和THI的测定尚无国家标准，也没有限量规定。近年来，国内的分析工作者仅在2-MEI和4-MEI的检测方法有报道，对于THI检测方法研究尚无报道；而国内外一些分析工作者建立的焦糖色素中2-MEI、4-MEI或THI的检测方法，前处理方法主要有：柱层析、液液萃取、离子对萃取、固相萃取等。柱层析、液液萃取、离子对萃取操作繁琐，对于大量的样品分析十分不利，且这些前处理方法用于THI提取净化的报道较少。三种目标物的的检测方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、离子色谱法、毛细管电泳法、气-质联用技术和液-质联用技术。其中的方法大多数都只能检测2-MEI、4-MeI或THI中的一种或两种物质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种焦糖色素中副产物2-MEI、4-MEI和THI同时检测的方法，该方法包括如下步骤：（1）待测样品溶液的制备；（2）样品检测；和（3）结果分析。

（1）待测样品溶液的制备包括如下具体步骤：

（a）制备固相萃取上样溶液：称取焦糖色素样品1 g（准确至0.001 g），置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度。取0.2 mL上述样品溶液，加入0.1 mL盐酸溶液（0.1 moL/L），加水定容至2mL，混匀后待固相萃取净化。

（b）固相萃取柱活化：选择混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg、3 mL，使用前依次用 2 mL 甲醇、2 mL 水活化。

（c）固相萃取：将（a）制备好的样品溶液加入（b）中刚活化好的小柱中，控制流速小于0.5 mL/min，抽干，加入1 mL水和1 mL甲醇淋洗，控制流速小于1.0 mL/min，抽干，用洗脱液（氨水+甲醇=5+95（v/v））2 mL洗脱收集，控制流速小于0.5 mL/min，抽干。将收集液在低于50 ℃条件下，氮气吹干，残渣用1.0 mL乙腈-0.05 %氨水（10:90，V/V）定容，涡旋混合1 min，过0.22 μm水系微孔滤膜，即制得待测样品溶液。

本发明的实施方案中，步骤（a）中称量1g样品定容到10mL水中，取0.1~0.3mL样品溶液准备固相萃取，优选0.2mL，上样溶液加水定容至2~3mL，优选2mL。

本发明的实施方案中，步骤（c）中1 ~2mL水和1~2 mL甲醇淋洗，优选1mL水和1 mL甲醇淋洗，优选2mL洗脱液洗脱。收集液可以在低于50 ℃条件下吹干或者旋转浓缩挥干，残渣加入定容溶液后需要涡旋1min或者超声波30秒溶解并过0.22 μm水系微孔滤膜。

（2）样品检测包括如下具体步骤：

标准品溶液的制备：分别准确称取2-MEI、4-MEI和THI标准品，用水溶解，分别配成0.5 mg/mL的储备溶液，使用时，用水稀释成标准使用溶液。

用液相色谱-光电二极管阵列检测器（LC-DAD）测定待测样品溶液和标准品溶液。仪器参考条件如下：

色谱柱：Agilent Polaris C18-A柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相： A 为乙腈，B 为0.05 %氨水溶液，A:B=10:90；流速：0.6 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；DAD检测器检测波长：2-MEI、4- MEI为 215 nm；THI为287 nm。

测定各化合物峰面积，然后分别作2-MEI（4-MEI 或THI）—2-MEI （4-MEI或THI）浓度（ng/mL）标准曲线，曲线方程见式（1）：

y=ax +b ·········(1)

式中： x——2-MEI 或4-MEI或THI峰面积；

y——2-MEI 或4-MEI 或 THI的浓度，单位为钠克每毫升（ng/mL）。

（3）结果分析包括如下具体步骤：

试样溶液的测定：待测试样溶液中2-MEI或 4-MEI或THI的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。

定性判定：按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的目标物色谱峰保留时间与标准工作溶液一致（变化范围在±2.5 %之内）；并且样品色谱峰的光谱图与标准溶液的一致，则可判断样品中存在目标化合物2-MEI 或4-MEI或THI。

分析结果的表述：

试样中2-MEI（4-MEI 或THI）含量按公式（2）计算：

X=（C-C₀）*V*10³/m/10⁶……………………………………（2）

式中：

X——试样中2-MEI或4-MEI或THI的含量，单位为克每千克( mg/kg )；

C——由标准曲线得试样进样液中2-MEI或4-MEI或THI的浓度，单位为钠克每毫升( ng/mL )；

C0——由标准曲线查得空白试样进样液中2-MEI或4-MEI或THI的浓度，单位为钠克每毫升( ng/mL )；

V——试样制备液总体积，单位为毫升( mL )；

m——试样质量，单位为克( g ) ；

结果保留三位有效数字。

本发明检测方法的可行性证实：

配制浓度分别为10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL和1000 ng/mL的2-MEI 、4-MEI和THI标准工作液，在优化的前处理方法和分离检测条件下进行线性范围试验，2-MEI、 4-MEI和THI线性相关系数分别可达到0.9992、0.9994和0.9990以上。

方法的检出限和定量限是衡量方法灵敏度的指标。本研究根据3倍信噪比（S/N=3）得到2-MEI 、4-MEI和THI的最低检出浓度为0.05 μg/mL、0.06 μg/mL和0.03 μg/mL。当称样为1 g时，经本研究确定的前处理方法处理后最终定容到1 mL检测分析，得到2MEI、4-MEI和THI的检出限分别为2.6 mg/kg、3.0 mg/kg和1.5 mg/kg，根据10 倍信噪比（S/N=10）得到定量限分别为8.5 mg/kg、10.0 mg/kg和5.0 mg/kg。

样品加标回收率和相对标准偏差测定：

采用本发明的焦糖色素中副产物2-MEI 、4-MEI和THI的检测方法，在焦糖色素中添加三个浓度水平（见表4，10mg/kg、20mg/kg、200mg/kg）2-MEI、 4-MEI和THI的混合标准溶液进行加标回收率实验，实验步骤同样品检测步骤，每个浓度重复6次，结果见表4，2-MEI、4-MEI和THI的加标回收率分别在80.4~93.4 %、80.2~93.0 %和75.0~84.6 %之间。相对标准偏差小于10%。

表4 方法的回收率及相对标准偏差（n=6）

“…”表示未检出

本发明检测焦糖色素中副产物2-MEI、4-MEI和THI的方法对于焦糖色素能够有效的分离净化，测定结果准确可靠。

附图说明

图1为2-MEI、4-MEI和THI标准溶液的液相色谱图

图2为某品牌焦糖色素样品的液相色谱图

在附图中，横坐标为保留时间（min），纵坐标为峰强度（mAU）。

其中图1、图2中

1. 2-甲基咪唑（2-Methylimidazole，2-MEI）；2. 4-甲基咪唑（4-Methylimidazole，4-MEI）；

3. 2-乙酰基-4-四羟基-丁基咪唑（2-acetyl-4-tetrahydroxy-butylimidazole，THI)

具体实施方式

实施例

（1）待测样品溶液的制备包括如下具体步骤：

（b）固相萃取柱活化：选择混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg、3 mL，或相当者。使用前依次用 2 mL 甲醇、2 mL 水活化。

（c）固相萃取：将（a）制备好的样品溶液加入（b）中刚活化好的小柱中，控制流速小于0.5 mL/min，抽干，加入1 mL水和1 mL甲醇淋洗，控制流速小于1.0 mL/min，抽干，用洗脱液（氨水+甲醇=5+95（v/v））2 mL洗脱收集，控制流速小于0.5 mL/min，抽干。将收集液在低于50 ℃条件下，氮气吹干，残渣用1 mL流动相溶液乙腈-0.05 %氨水（10:90，V/V）定容，涡旋混合1 min，过0.22 μm水系微孔滤膜，即制得待测样品溶液。

（2）样品检测包括如下具体步骤：

（a）标准品溶液的制备：分别准确称取2-MEI、4-MEI和THI标准品，用水溶解，分别配成0.5 mg/mL的储备溶液，使用时，用水稀释成标准使用溶液。

（b）用液相色谱-光电二极管阵列检测器（LC-DAD）测定待测样品溶液和标准品溶液。仪器参考条件如下：

y=ax +b ·········(1)

式中： x——2-MEI 或4-MEI或THI峰面积；

y——2-MEI 或4-MEI 或 THI的浓度，单位为钠克每毫升（ng/mL）。

用上述方法对任意焦糖色素样品进行检测，检测结果如下表5。

表5 样品检测结果

样本名称	2-MEI测定值（mg/kg）	4-MEI测定值（mg/kg）	THI测定值（mg/kg）
				某品牌焦糖色素（亚硫酸氨法）	29.1	195.3	…
某品牌氨法焦糖色素	41.9	295.8	5.5

“…”表示未检出。

Claims

1.焦糖色中副产物2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-四羟基-丁基咪唑的固相萃取结合高效液相色谱的检测方法，其特征在于，1g样品溶于10mL水，取0.2mL样品溶液，加入0.1moL/L盐酸溶液0.1mL，加水定容至2mL，混匀后待固相萃取净化。

2.选择混合型阳离子交换固相萃取柱进行净化，使用前依次用2mL甲醇、2mL水活化。

3.固相萃取过程中样品溶液加入刚活化好的小柱中，特征性在于控制上样流速小于0.5mL/min，抽干，加入1mL水和1mL甲醇淋洗，控制流速小于1.0mL/min，抽干，用洗脱液比例为氨水+甲醇＝5+95(v/v)2mL洗脱收集，控制流速小于0.5mL/min，抽干。

4.样品检测过程特征性在于使用Polaris C18-A柱检测，流动相：A为0.05％氨水溶液；B为乙腈，并且A:B＝10:90。