CN110118833A - 一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法 - Google Patents

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Abstract

一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法。包括以下步骤：(1)标准样品的配制；(2)待测样品处理；(3)取标准样品和待测样品上超高效液相色谱‑串联三重四级杆质谱法对供试样品进行定性定量测定；(4)使用机器自带的LabSolutions Ver.5.80分析软件极性线性拟合，以浓度为横坐标，待测样品峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，内标法制作校准曲线，根据得到的回归方程计算待测样品中杂环胺的含量。本发明的检测方法具有快速准确、精密度好、灵敏度高的优点，可以很好地满足烟熏培根中杂环胺的检测分析工作的需求和发展趋势。

Description

一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法
技术领域
本发明属于肉制品分析检测技术领域，具体涉及一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法。
背景技术
烟熏肉制品其口感除带有适口的咸味外，还具有浓郁的烟熏香味。传统加工工艺中主要采用木屑燃烧产生的烟气对腌制好的培根肉进行熏制，以达到抑菌和改善口味的目的。但是，烟熏会产生一类具有较强的致突变、致癌性物质-杂环胺(Heterocyclic Amines,HAAs)。长期食用含有此类化合物的食物会诱发细胞DNA损伤(如基因突变，染色体畸变)及肝脏、血管、肠道等器官的癌变。目前肉制品中杂环胺的提取和测定存在回收率低，稳定性差等特点。因此，发展一种快速，高效，灵敏，准确的检测烟熏肉制品中杂环胺的方法至关重要。
目前，国内外杂环胺的检测方法主要有液相色谱-质谱法和气相色谱法-质谱法等。其中液相色谱-质谱(LC-MS)和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)是定性和定量大多数杂环胺的重要方法，并结合热喷雾离子化，电喷雾离子化(ESI)或两种方式组合。虽然高效液相色谱在杂环胺的检测中应用较广泛，但高效液相色谱的选择性较低，当基质较为复杂时分离效果不理想。此外受检测极限的限制，无法对痕量杂环胺进行检测。相比于液相色谱，气相色谱(GC)具有更高的选择性，可应用于肉制品中多种杂环胺的同步检测。然而杂环胺是非挥发性物质，使用气相色谱法测定时气相色谱柱上往往会过度保留，从而导致色谱峰的拖尾现象，使得气相色谱法在HAAs测定中的应用受到了限制。此外，杂环胺又有极性和非极性两种，这也为分离纯化带来了一定的难度。GB 5009.243-2016中也仅仅测定了5种极性杂环胺。目前烟熏肉制品中杂环胺测定方法的研究还不能满足市场监管的需要，急需建立一套快速准确灵敏的测定方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有检测烟熏肉制品中杂环胺方法的不足，提供一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，所述的方法具体步骤如下：
步骤一：内标溶液的配制：将内标4，7，8-TriMeIQx先用甲醇溶解后，再用乙腈稀释配制成标准储备液，使用乙腈继续稀释，即得到内标溶液；
步骤二：标准溶液的配制：先将12种杂环胺分别用甲醇溶解，再使用乙腈进行稀释，得到标准溶液；
步骤三：混合标准液的配制：吸取步骤二中配制的12种杂环胺的标准溶液及步骤一中配制的内标溶液进行混合定容，使得混合标准液中12种杂环胺浓度均为100μg/L，随后用乙腈-水溶液逐级稀释成0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L及50.0μg/L，其中每种梯度混合标准液中内标溶液浓度均为20μg/L，置于4℃备用；
步骤四：待测样品的处理：向待测样品中加入内标溶液和氢氧化钠与甲醇的混合液，均质1min，离心，净化，30℃下氮吹浓缩至体积小于20μL，复溶，涡旋混匀，滤膜过滤后得到待测样品溶液；
步骤五：分析检测：取步骤三得到的混合标准液和步骤四得到的待测样品溶液上超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱仪对步骤四得到的待测样品溶液中的杂环胺进行定性定量测定。
本发明相对于现有技术的有益效果为：
(1)12种杂环胺及1种内标物首先用甲醇溶解，然后再用乙腈对溶解后的杂环胺及内标进行稀释，确保了杂环胺的完全溶解。
(2)本发明能够同时检测12种杂环胺，其中有7种极性杂环胺，5种非极性杂环胺。
(3)本发明采用多反应检测模式进行检测，具有快速高效、精密度好、灵敏度高，检出限<0.1285μg/L，定量限<0.3924μg/L。
附图说明
图1为4，8-DiMeIQx的空白猪肉样品MRM色谱图；
图2为7，8-DiMeIQx的空白猪肉样品MRM色谱图；
图3为AaC的空白猪肉样品MRM色谱图；
图4为Harman的空白猪肉样品MRM色谱图；
图5为IQ的空白猪肉样品MRM色谱图；
图6为IQx的空白猪肉样品MRM色谱图；
图7为MeAaC的空白猪肉样品MRM色谱图；
图8为MeIQ的空白猪肉样品MRM色谱图；
图9为MeIQx的空白猪肉样品MRM色谱图；
图10为Norharmane的空白猪肉样品MRM色谱图；
图11为PhIP的空白猪肉样品MRM色谱图；
图12为Phe-P-I的空白猪肉样品MRM色谱图；
图13为4，8-DiMeIQx的0.5ng/mL加标回收MRM色谱图；
图14为7，8-DiMeIQx的0.5ng/mL加标回收MRM色谱图；
图15为AaC的0.5ng/mL加标回收MRM色谱图；
图16为Harman的0.5ng/mL加标回收MRM色谱图；
图17为IQ的0.5ng/mL加标回收MRM色谱图；
图18为IQx的0.5ng/mL加标回收MRM色谱图；
图19为MeAaC的0.5ng/mL加标回收MRM色谱图；
图20为MeIQ的0.5ng/mL加标回收MRM色谱图；
图21为MeIQx的0.5ng/mL加标回收MRM色谱图；
图22为Norharmane的0.5ng/mL加标回收MRM色谱图；
图23为PhIP的0.5ng/mL加标回收MRM色谱图；
图24为Phe-P-I的0.5ng/mL加标回收MRM色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，所述的方法具体步骤如下：
步骤一：内标溶液的配制：将内标4，7，8-TriMeIQx先用甲醇溶解后，再用乙腈稀释配制成标准储备液，使用乙腈继续稀释，即得到内标溶液；所述的4，7，8-TriMeIQx为2-氨基-3，4，7，8-四甲基-咪唑并[4，5-f]-喹喔啉；
步骤二：标准溶液的配制：先将12种杂环胺分别用甲醇溶解，再使用乙腈进行稀释，得到标准溶液；所述的12种杂环胺分别为4，8-DiMeIQx(2-氨基-3，4，8-三甲基-咪唑并[4，5-f]喹喔啉)、7，8-DiMeIQx(2-氨基-3，7，8-三甲基-咪唑并[4，5-f]-喹喔啉)、AaC(2-氨基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚)、Harman(1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚)、IQ(2-氨基-3-甲基-咪唑并[4，5-f]-喹啉)、IQx(2-氨基-3-甲基-咪唑并[4，5-f]-喹喔啉)、MeAaC(2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚)、MeIQ(2-氨基-3，4-二甲基-咪唑并[4，5-f]-喹啉)、MeIQx(2-氨基-3，8-二甲基-咪唑并[4，5-f]-喹喔啉)、Norharman(9H-吡啶并[3，4-b]吲哚)、PhIP(2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]-吡啶)、Phe-P-I(2-氨基-5-苯基吡啶)；
步骤三：混合标准液的配制：吸取步骤二中配制的12种杂环胺的标准溶液及步骤一中配制的内标溶液进行混合定容，使得混合标准液中12种杂环胺浓度均为100μg/L，随后用乙腈-水(体积比为5:95)溶液逐级稀释成0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L及50.0μg/L，其中每种梯度混合标准液中内标4，7，8-TriMeIQx溶液浓度均为20μg/L，置于4℃备用；
步骤四：待测样品的处理：向待测样品中加入内标溶液和氢氧化钠与甲醇的混合液，均质1min，离心，净化，30℃下氮吹浓缩至体积小于20μL，复溶，涡旋混匀，滤膜过滤后得到待测样品溶液；均质器刀头分别用5.0mL 40g/L氢氧化钠-甲醇混合溶液(氢氧化钠:甲醇为7:3)各洗涤两次，洗涤液合并至样品提取离心管中。
步骤五：分析检测：取步骤三得到的混合标准液和步骤四得到的待测样品溶液上超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱仪对步骤四得到的待测样品溶液中的杂环胺进行定性定量测定。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，步骤一中，所述的标准储备液的浓度为100μg/mL，所述的内标溶液的浓度为200μg/L。
具体实施方式三：具体实施方式一所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，步骤二中，所述的标准溶液的浓度均为100μg/mL。
具体实施方式四：具体实施方式一所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，步骤四中，所述的待测样品、内标溶液、氢氧化钠与甲醇的混合液三者的混合比例为2g：200μL：9.8mL；所述的氢氧化钠与甲醇的混合液中氢氧化钠与甲醇的质量比为7：3。
具体实施方式五：具体实施方式一所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，步骤四中，所述的离心参数为10750g离心10min。
具体实施方式六：具体实施方式一所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，步骤四中，所述的净化过程具体为：首先依次使用3mL甲醇、3mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液活化固相萃取柱，上样10mL，弃去流出液后，然后依次用3mL氢氧化钠-甲醇混合溶液、2mL正己烷淋洗，每次淋洗完后都需要将固相萃取柱内的淋洗溶液抽干，最后用2.0mL乙醇-二氯甲烷溶液洗脱，洗脱流速小于1mL/min；所述的氢氧化钠-甲醇混合溶液中氢氧化钠与甲醇的质量比为1：1；所述的乙醇-二氯甲烷溶液中乙醇与二氯甲烷的质量比为1：9；所述的固相萃取柱为Oasis MCX固相萃取小柱(3mL/60mg)。
具体实施方式七：具体实施方式一所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，步骤四中，使用1mL乙酸铵缓冲液-乙腈混合溶液复溶。
具体实施方式八：具体实施方式七所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，所述的乙酸铵缓冲液浓度为15mmol/L，乙酸铵缓冲液-乙腈混合溶液中乙酸铵缓冲液与乙腈的体积比为1：1。
具体实施方式九：具体实施方式一所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，步骤四中，所述的滤膜的孔径为0.22um，有机系。
具体实施方式十：具体实施方式一所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，步骤五中，所述的色谱的条件为：色谱柱Shim-pack XR-ODSш(2.2μm，2.0mmI.D.×150mm)，柱温40℃，流速为0.3mL/min-1，单次进样体积为2.0μL，流动相A为10mM乙酸铵，流动相B为乙睛，梯度洗脱程序：0～3.5min，40％A、60％B；3.5～8min，10％A、90％B；8～13min，90％A、10％B；
所述的质谱的条件为：离子源ESI+，雾化气流速2.0～5.0L/min，加热气流量8.0～12.0L/min，干燥器流量8.0～12.0L/min，接口温度280～320℃，DL温度230～270℃，加热块温度380～420℃，毛细管电压3.5～4.5kV，离子源温度85～95℃，脱溶剂气温度320～380℃，脱溶剂气流量750～850L/h，扫描模式多反应监测(MRM)。
对4种市售某品牌肉制品按照前述前处理方法对样品进行检测。
实施例1
(1)内标溶液的配制：先用甲醇将内标2-氨基-3，4，7，8-四甲基-咪唑并[4，5-f]-喹喔啉(4，7，8-TriMeIQx)溶解然后用乙腈配制成100ug/mL标准储备液，再用乙腈稀释成200ug/L，得到内标溶液。
(2)标准溶液的配制：用甲醇将12种杂环胺2-氨基-3，4，8-三甲基-咪唑并[4，5-f]喹喔啉(4，8-DiMeIQx)，2-氨基-3，4，8-三甲基-咪唑并[4，5-f]喹喔啉(7，8-DiMeIQx)，2-氨基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚(AaC)，1-甲基-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚(Harman)，2-氨基-3-甲基-咪唑并[4，5-f]-喹啉(IQ)，2-氨基-3-甲基-咪唑并[4，5-f]-喹喔啉(IQx)，2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚(MeAaC)，2-氨基-3，4-二甲基-咪唑并[4，5-f]-喹啉(MeIQ)，2-氨基-3，8-二甲基-咪唑并[4，5-f]-喹喔啉(MeIQx)，9H-吡啶并[3，4-b]吲哚(Norharman)，2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]-吡啶(PhIP)，2-氨基-5-苯基吡啶(Phe-P-I)分别溶解，然后用乙腈稀释成100ug/mL标准储备液。
(3)混合标准液的配制：吸取12种杂环胺贮备液及内标混合并用乙腈逐级稀释成0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L及50.0μg/L，其中内标浓度为20ug/L，配制成混合标准液。
(4)待测样品的处理：精确称量2.00g待测样品添加到50mL离心管中，加入200uL内标溶液(200ug/L)及9.8mL 1mol/L氢氧化钠溶液和甲醇混合溶液(氢氧化钠：甲醇为7:3)，均质并用10mL氢氧化钠溶液和甲醇混合溶液清洗刀头，10750g离心10min，预先依次用3mL甲醇、3mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液活化固相萃取柱后上样10mL，上样后的固相萃取柱依次用3mL浓度为4g/L氢氧化钠-甲醇混合溶液(氢氧化钠：甲醇为1:1)、2mL正己烷洗淋，最后用2.0mL乙醇-二氯甲烷溶液(乙醇：二氯甲烷溶液为1：9)洗脱，洗脱的样品采用氮吹仪吹至近干后用1mL 15mmol/L乙酸铵缓冲液-乙腈混合溶液复溶(乙酸铵缓冲液-乙腈混合溶液比例为1:1)，用孔径为0.22um有机系滤膜过滤得到处理好的样品。
(5)取对照样品溶液和待测样品溶液上液质联用仪对供试品溶液中杂环胺含量进行定性定量测定，其中，色谱条件：色谱柱Shim-pack XR-ODSш(2.2um，2.0mm×150mm)，柱温40℃，流速为0.3mL/min-1，单次进样体积为2.0uL，流动相A为10mM乙酸按，流动相B为乙睛，梯度洗脱程序：0～3.5min，40％A、60％B；3.5～8min，10％A、90％B；8～13min，90％A、10％B。
质谱条件：离子源ESI+，雾化气流速3.0L/min，加热气流量10.0L/min，干燥器流量10.0L/min，接口温度300℃，DL温度250℃，加热快温度400℃，毛细管电压4.0kV，离子源温度90℃，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流量800L/h，扫描模式多反应监测(MRM)。
(6)线性关系考察：将浓度为0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L和50.0μg/L的混合标准溶液加入空白猪肉样品中，按照步骤5中液质联用分析条件进行测定，内标法定量，考察12种HAAs的线性范围，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，并进行线性回归分析。所得校准曲线线性关系良好，相关系数R值在0.9940～0.9999之间，标准工作液准确度在78.5～133.5之间。
表1 HAAs的保留时间及线性曲线
(7)精密度考察：按照步骤5中液质联用分析条件进行测定，对1.0μg/L混合标准溶液连续测定6次，考察仪器的精密度。标准品保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.03％～0.3％和5.56％～36.11％之间，仪器精密度良好。
表2 HAAs的保留时间和峰面积重复性结果(n＝6)
(8)灵敏度考察：按照步骤5中液质联用分析条件进行测定，仪器检出限(IDL)按3倍的峰峰信噪比计算，仪器定量限(IQL)按3倍仪器检出限计算。各成分的检出限低于0.1285μg/L，定量限低于0.3924μg/L，灵敏度良好。
表3 HAAs的检出限和定量限
化合物名称 标准偏差(S) IQL(μg/L) IDL(μg/L)
4,8-DiMeIQx 0.0026 0.1134 0.0374
7,8-DiMeIQx 0.0017 0.0991 0.0327
AaC 0.0015 0.0937 0.0309
Harman 0.0016 0.0316 0.0104
IQ 0.0030 0.2980 0.0984
IQx 0.0028 0.1554 0.0513
MeAaC 0.0127 0.1359 0.0448
MeIQ 0.0031 0.2552 0.0842
MeIQx 0.0047 0.1065 0.0351
Norharman 0.0015 0.3924 0.1285
PhIP 0.0012 0.3569 0.0117
Phe-P-1 0.0020 0.0517 0.0170
(9)加标回收率实验：向空白猪肉样品中加入12种HAAs混合标准溶液，加标浓度为0.5μg/kg，按照步骤5检测过程，平行处理3份，重复3次，考察12种HAAs加标回收率。空白猪肉样品的检测色谱图和加标样品色谱图如图1～12和图13～24所示。结果表明，空白猪肉样品不含HAAs，结合表3和表4结果可知该方法灵敏度高，有较好的准确度和精密度，可实现快速、准确的对肉中12种HAAs含量进行分析。
表4加标样的回收率(n＝9)
(10)实际样品测定：对市售培根，红肠，熏鸡，烤鸭四种烟熏肉制品按照步骤4处理过程对样品进行处理，步骤5检测过程对样品处理结果进行检测。
表5 4种市售肉制品HAAs检出情况
化合物名称 培根 红肠 熏鸡 烤鸭
Norharman(ng/g) 29.02±1.41 4.40±0.79 70.31±8.23 41.59±6.98
Harman(ng/g) 31.87±2.98 2.21±0.46 26.02±5.73 34.96±3.17
MeAαC(ng/g) --- 0.11±0.02 8.34±1.26 4.15±0.92
AαC(ng/g) --- 0.66±0.02 --- ---
Phe-P-Ⅰ(ng/g) --- --- --- ---
IQ(ng/g) 9.17±1.62 2.36±0.23 0.88±0.17 0.78±0.06
IQx(ng/g) 1.88±0.34 0.15±0.03 0.21±0.02
MeIQ(ng/g) 4.87±0.56 2.17±0.51 0.92±0.24 0.81±0.10
MeIQx(ng/g) 6.89±0.96 1.10±0.18 --- ---
4，8-DiMeIQx(ng/g) --- --- --- 5.17±0.46
7，8-DiMeIQx(ug/g) --- 390.00±6.26 66.00±4.27 210±19.25
PhIP(ng/g) 19.52±2.16 1.97±0.25 2.85±0.83 5.80±1.01

Claims (10)

1.一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，其特征在于：所述的方法具体步骤如下：
步骤一：内标溶液的配制：将内标4，7，8-TriMeIQx先用甲醇溶解后，再用乙腈稀释配制成标准储备液，使用乙腈继续稀释，即得到内标溶液；
步骤二：标准溶液的配制：先将12种杂环胺分别用甲醇溶解，再使用乙腈进行稀释，得到标准溶液；
步骤三：混合标准液的配制：吸取步骤二中配制的12种杂环胺的标准溶液及步骤一中配制的内标溶液进行混合定容，使得混合标准液中12种杂环胺浓度均为100μg/L，随后用乙腈-水溶液逐级稀释成0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L及50.0μg/L，其中每种梯度混合标准液中内标溶液浓度均为20μg/L，置于4℃备用；
步骤四：待测样品的处理：向待测样品中加入内标溶液和氢氧化钠与甲醇的混合液，均质1min，离心，净化，30℃下氮吹浓缩至体积小于20μL，复溶，涡旋混匀，滤膜过滤后得到待测样品溶液；
步骤五：分析检测：取步骤三得到的混合标准液和步骤四得到的待测样品溶液上超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱仪对步骤四得到的待测样品溶液中的杂环胺进行定性定量测定。
2.根据权利要求1所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，其特征在于：步骤一中，所述的标准储备液的浓度为100μg/mL，所述的内标溶液的浓度为200μg/L。
3.根据权利要求1所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，其特征在于：步骤二中，所述的标准溶液的浓度均为100μg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，其特征在于：步骤四中，所述的待测样品、内标溶液、氢氧化钠与甲醇的混合液三者的混合比例为2g：200μL：9.8mL；所述的氢氧化钠与甲醇的混合液中氢氧化钠与甲醇的质量比为7：3。
5.根据权利要求1所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，其特征在于：步骤四中，所述的离心参数为10750g离心10min。
6.根据权利要求1所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，其特征在于：步骤四中，所述的净化过程具体为：首先依次使用3mL甲醇、3mL0.1mol/L氢氧化钠溶液活化固相萃取柱，上样10mL，弃去流出液后，然后依次用3mL氢氧化钠-甲醇混合溶液、2mL正己烷淋洗，每次淋洗完后都需要将固相萃取柱内的淋洗溶液抽干，最后用2.0mL乙醇-二氯甲烷溶液洗脱，洗脱流速小于1mL/min；所述的氢氧化钠-甲醇混合溶液中氢氧化钠与甲醇的质量比为1：1；所述的乙醇-二氯甲烷溶液中乙醇与二氯甲烷的质量比为1：9；所述的固相萃取柱为Oasis MCX固相萃取小柱。
7.根据权利要求1所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，其特征在于：步骤四中，使用1mL乙酸铵缓冲液-乙腈混合溶液复溶。
8.根据权利要求7所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，其特征在于：所述的乙酸铵缓冲液浓度为15mmol/L，乙酸铵缓冲液-乙腈混合溶液中乙酸铵缓冲液与乙腈的体积比为1：1。
9.根据权利要求1所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，其特征在于：步骤四中，所述的滤膜的孔径为0.22um，有机系。
10.根据权利要求1所述的一种同步检测烟熏肉制品中12种杂环胺的方法，其特征在于：步骤五中，所述的色谱的条件为：色谱柱Shim-pack XR-ODSш，柱温40℃，流速为0.3mL/min-1，单次进样体积为2.0μL，流动相A为10mM乙酸铵，流动相B为乙睛，梯度洗脱程序：0～3.5min，40％A、60％B；3.5～8min，10％A、90％B；8～13min，90％A、10％B；
所述的质谱的条件为：离子源ESI+，雾化气流速2.0～5.0L/min，加热气流量8.0～12.0L/min，干燥器流量8.0～12.0L/min，接口温度280～320℃，DL温度230～270℃，加热块温度380～420℃，毛细管电压3.5～4.5kV，离子源温度85～95℃，脱溶剂气温度320～380℃，脱溶剂气流量750～850L/h，扫描模式多反应监测。
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