CN111679021B - 一种用于检测固体样品中杂环胺的方法 - Google Patents

一种用于检测固体样品中杂环胺的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒，包括第一提取试剂和第二提取试剂，所述第一提取试剂由氯化钠、SDS、碳酸钠、醋酸铅中的一种或多种组成；所述第二提取试剂为Fe3O4@PDA。使用所述试剂盒对杂环胺检测时的固体样品进行净化，除去脂类、色素等基质干扰。所述净化方法包括步骤：取第一提取试剂溶于水，得第三提取试剂；取待净化样品，加入第三提取试剂匀浆并清洗匀浆刀头，将洗涤所得液体与匀浆液混合，离心取上清液，加入第二提取试剂震荡，将固体取出加入甲醇震荡，取甲醇层，得净化样品制备液。可用高效液相色谱‑紫外检测法和高效/超高效液相色谱串联二级质谱等方法，对净化样品制备液中的杂环胺进行检测。

Description

一种用于检测固体样品中杂环胺的方法
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒及净化方法。
背景技术
杂环胺是富含蛋白质的食品在加热过程中经过化学反应产生的一系列致癌、致突变的化合物。流行病学报告显示：过量的杂环胺摄入会使患食道癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌等癌症的风险增大。现阶段，杂环胺的检测技术已较为成熟，最为常用的是高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）和高效/超高效液相色谱串联二级质谱法（HPLC/UPLC-MS-MS），这两种方法自动化程度高，仪器重复性好。但这些测试方法需要对样品特别是固体样品进行净化，以除去样品中脂类、色素等基质干扰。现有前处理手段实验过程耗时长，试剂消耗量大，无法实现大批量样品杂环胺分析。本发明的目的是建立一种简单、快速、稳定、试剂消耗量小的样品前处理试剂盒，改进现有杂环胺分析技术效率和性能。
发明内容
本发明的目的是提供一种样品处理时间短、检测成本低、试剂消耗量小、无需过固相萃取小柱净化的快速测定固体样品中杂环胺的试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种用所述试剂盒净化固体样品的方法。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒，包括第一提取试剂和第二提取试剂，所述第一提取试剂由氯化钠、SDS、碳酸钠、醋酸铅中的一种或多种组成；所述第二提取试剂为Fe3O4@PDA；
优选方式下，所述Fe3O4@PDA的制备方法，包括步骤：
S1：取三羟甲基氨基甲烷(Tris)，溶于超纯水中，用盐酸调至pH为7.5～9，得到Tris-HCl溶液；所述Tris和超纯水的质量体积比是(1～10):2g/L；
S2：取多巴胺(PDA)，溶于步骤S1所述Tris-HCl溶液中，得到PDA-Tris-HCl溶液；所述PDA与Tris-HCl溶液的质量体积比是(1～10):2g/L；
S3：取四氧化三铁(Fe3O4)，置于PDA-Tris-HCl溶液中，超声使Fe3O4在溶液中分散均匀，得到Fe3O4 @PDA制备液，震荡；所述Fe3O4与PDA-Tris-HCl溶液的质量体积比是(1～10):2g/L；
S4:用磁铁将震荡后的Fe3O4@PDA制备液中的固液分离，弃去液体；依次使用醇和去离子水清洗去除杂质，磁力分离，弃去液体；干燥至恒重，得到Fe3O4@PDA。
优选方式下，步骤S3所述震荡参数为：100～300rpm，室温震荡2～12h。
优选方式下，步骤S4所述醇是甲醇或乙醇，所述醇的添加量与步骤S2所述Tris-HCl溶液的体积比为(0.5～5):1；所述去离子水的添加量与步骤S2所述Tris-HCl溶液的体积比为(0.5～5):1；步骤S4所述清洗次数为2～5次。
最优方式下，所述Fe3O4@PDA的制备方法，包括步骤：
S1：称取0.07g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，溶于100mL超纯水中，用盐酸调至pH为8.5，得到Tris-HCl溶液；
S2：称取10mg多巴胺(PDA)，溶于10mL Tris-HCl溶液中，得到PDA-Tris-HCl溶液；
S3：称取5mg四氧化三铁(Fe3O4)，置于10mL PDA-Tris-HCl溶液中，800W水浴超声1min使Fe3O4在溶液中分散均匀，得到Fe3O4@PDA制备液，100rpm震荡4h；
S4：用磁铁将震荡后的Fe3O4@PDA制备液中的固液分离，弃去液体；使用20mL甲醇清洗三次，再使用20mL去离子水清洗三次，以去除杂质，磁力分离，弃去液体；60℃干燥4h，得到Fe3O4@PDA。
所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒可以用于杂环胺检测时，对固体样品进行净化。
一种使用所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒净化固体样品的方法，包括步骤:
S1：取第一提取试剂，溶于超纯水中，得到第三提取试剂；所述第一提取试剂和超纯水的质量体积比是(2～20):50g/mL；
S2：称取待净化样品，加入第三提取试剂A，匀浆，得匀浆液；用第三提取试剂B洗涤匀浆机刀头，将洗涤后所得液体与所述匀浆液混合，离心取上清液；取所述上清液，加入第二提取试剂，漩涡震荡，磁力分离后弃去上清液，将所得固体加入甲醇，漩涡震荡，磁力分离，取甲醇层，得净化样品制备液；
其中，所述待净化样品可以是固体样品；所述待净化样品和所述第三提取试剂A的质量体积比为(1～5):10g/mL；所述上清液和所述第二提取试剂的体积质量比为(0.5～5):(5～100)mL/mg；所述甲醇的添加量为0.5～5mL；
S3：不称待净化取样品，其余操作同步骤S2，得到试样空白液。
优选方式下，步骤S2所述待净化样品为牛肉、鸡肉或鲫鱼等固体样品；所述匀浆的参数为：4000～8000rpm匀浆1～3min；所述离心的转速为3000～10000rpm、时间5～20min；所述漩涡震荡的转速为3000～6000rpm、时间0.5～2min；步骤S2所述第三提取试剂B和第三提取试剂A的体积比是(0.2～1):1。
可以使用高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)和高效/超高效液相色谱串联二级质谱法(HPLC/UPLC-MS-MS)等方法，对所述净化样品制备液中的杂环胺进行检测。
可以按下述方法，以试样空白液为对照，对净化样品制备液中的杂环胺进行测定，再通过公式计算待净化样品中的杂环胺含量：
S1：将所述净化样品制备液过0.22μm的有机系微孔滤膜，进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定，得到第一色谱图；
S2：以甲醇为溶剂，配制六个不同质量体积浓度的杂环胺混合标准溶液，该六个标准溶液中杂环胺的质量体积浓度依次分别为：0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；将杂环胺系列混合标准溶液于附带三重四级杆质谱的高效液相色谱仪中测定，得第二色谱图，由该第二色谱图得到系列标准溶液中杂环胺在该色谱条件下的出峰时间和不同浓度的峰面积；并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制杂环胺标准溶液的工作曲线；
S3：根据步骤S1测得的净化样品制备液的峰面积值，从步骤S2绘制的系列杂环胺标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的杂环胺的含量，按下式计算待测固体样品中杂环胺的含量X：
式中：X表示试样(即待净化样品)中的杂环胺含量，单位ng/g；C1表示步骤S1测得的样品制备液的峰面积所对应的杂环胺的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中杂环胺的含量，单位ng/mL；m表示试样质量(即所述待净化样品的质量)，单位g；V表示第三提取试剂的体积(即第三提取试剂A和第三提取试剂B的体积之和)，单位mL；V1表示净化样品制备液的体积，单位mL；V2表示上清液的体积，单位mL。
本发明试剂盒制造成本低，对杂环胺有一定的吸附性，对油脂、淀粉等大分子杂质不产生吸附，可以有效地净化样品。实验过程中采用磁性材料对样品中杂环胺进行吸附，易
于分离。
附图说明
图1是本发明实施例1，对烤牛肉净化后，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹啉色谱图；
图2是本发明实施例1，对烤牛肉净化后，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉色谱图；
图3是本发明实施例1，对烤牛肉净化后，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉色谱图；
图4是本发明实施例1，对烤牛肉净化后，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉色谱图；
图5是本发明实施例1，对烤牛肉净化后，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉色谱图；
图6是本发明实施例1，对烤牛肉净化后，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的9H-吡啶并[3,4-b]吲哚色谱图；
图7是本发明实施例1，对烤牛肉净化后，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚色谱图；
图8是本发明实施例1，对烤牛肉净化后，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚色谱图；
图9是本发明实施例1，对烤牛肉净化后，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚色谱图；
图10是本发明实施例1，对烤牛肉净化后，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-1,6-二甲基咪唑[4,5-b]-吡啶色谱图；
图11是本发明实施例1，对烤牛肉净化后，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-1,5,6-三甲基咪唑[4,5-b]-吡啶色谱图；
图12是对混合标准溶液进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹啉色谱图；
图13是对混合标准溶液进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉色谱图；
图14是对混合标准溶液进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉色谱图；
图15是对混合标准溶液进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉色谱图；
图16是对混合标准溶液进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉色谱图；
图17是对混合标准溶液进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的9H-吡啶并[3,4-b]吲哚色谱图；
图18是对混合标准溶液进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚色谱图；
图19是对混合标准溶液进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚色谱图；
图20是对混合标准溶液进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚色谱图；
图21是对混合标准溶液进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-1,6-二甲基咪唑[4,5-b]-吡啶色谱图；
图22是对混合标准溶液进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定得到的2-氨基-1,5,6-三甲基咪唑[4,5-b]-吡啶色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一种用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒，包括第一提取试剂和第二提取试剂，所述第一提取试剂由氯化钠、SDS、碳酸钠、醋酸铅中的一种或多种组成；所述第二提取试剂为Fe3O4@PDA；
优选方式下，所述Fe3O4@PDA的制备方法，包括步骤：
S1：取三羟甲基氨基甲烷(Tris)，溶于超纯水中，用盐酸调至pH为7.5～9，得到Tris-HCl溶液；所述Tris和超纯水的质量体积比是(1～10):2g/L；
S2：取多巴胺(PDA)，溶于Tris-HCl溶液中，得到PDA-Tris-HCl溶液；所述PDA与Tris-HCl溶液的质量体积比是(1～10):2g/L；
S3：取四氧化三铁(Fe3O4)，置于PDA-Tris-HCl溶液中，超声使Fe3O4在溶液中分散均匀，得到Fe3O4@PDA制备液，震荡；所述Fe3O4与PDA-Tris-HCl溶液的质量体积比是(1～10):2g/L；
S4:用磁铁将震荡后的Fe3O4@PDA制备液中的固液分离，弃去液体；依次使用醇和去离子水清洗去除杂质，磁力分离，弃去液体；干燥至恒重，得到Fe3O4@PDA。
优选方式下，步骤S3所述震荡参数为：100～300rpm，室温震荡2～12h；步骤S4所述醇是甲醇或乙醇，所述醇的添加量与步骤S2所述Tris-HCl溶液的体积比为(0.5～5):1；所述去离子水的添加量与步骤S2所述Tris-HCl溶液的体积比为(0.5～5):1；步骤S4所述清洗次数为2～5次。
所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒可以用于杂环胺检测时，对固体样品进行净化。
一种使用所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒净化固体样品的方法，包括步骤:
S1：取第一提取试剂，溶于超纯水中，得到第三提取试剂；所述第一提取试剂和超纯水的质量体积比是(2～20):50g/mL；
S2：称取待净化样品，加入第三提取试剂A，匀浆，得匀浆液；用第三提取试剂B洗涤匀浆机刀头，将洗涤后所得液体与所述匀浆液混合，离心取上清液；取所述上清液，加入第二提取试剂，漩涡震荡，磁力分离后弃去上清液，将所得固体加入甲醇，漩涡震荡，磁力分离，取甲醇层，得净化样品制备液；
其中，所述待净化样品可以是固体样品；所述待净化样品和所述第三提取试剂A的质量体积比为(1～5):10g/mL；所述上清液和所述第二提取试剂的体积质量比为(0.5～5):(5～100)mL/mg；所述甲醇的添加量为0.5～5mL；
S3：不称取样品，其余操作同步骤S2，得到试样空白液。
优选方式下，步骤S2所述待净化样品为牛肉、鸡肉或鲫鱼等固体样品；步骤S2所述匀浆的参数为：4000～8000rpm匀浆1～3min；所述离心的转速为3000～10000rpm、时间5～20min；所述漩涡震荡的转速为3000～6000rpm、时间0.5～2min；步骤S2所述第三提取试剂B和第三提取试剂A的体积比是(0.2～1):1。
可以使用高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)和高效/超高效液相色谱串联二级质谱法(HPLC/UPLC-MS-MS)等方法，对所述净化样品制备液中的杂环胺进行检测。
可以按下述方法，对净化样品中的杂环胺含量进行测定：
S1：所述净化样品制备液过0.22μm的有机系微孔滤膜，然后进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定；色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0～0.1min：10％B，0.1～18min：10％～30％B，18～20min：30％～100％B，20～21min：100％～10％B，21～25min：10％B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；质谱条件：见表1；得图1～11所示的第一色谱图；
S2：以甲醇为溶剂，配制六个不同质量体积浓度的11种杂环胺混合标准溶液，该六个标准溶液中杂环胺的质量体积浓度依次分别为：0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；将杂环胺系列混合标准溶液于附带三重四级杆质谱的高效液相色谱仪中测定，色谱条件：色谱柱：C82.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0～0.1min：10％B，0.1～18min：10％～30％B，18～20min：30％～100％B，20～21min：100％～10％B，21～25min：10％B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；质谱条件：见表1。得图12～22所示的第二色谱图，由该第二色谱图得到的系列标准溶液中杂环胺在该色谱条件下的出峰时间和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制杂环胺标准溶液的工作曲线；该标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数见表2。
表1杂环胺的质谱条件
测定物质 定量离子对（m/z） 去簇电压（V） 碰撞电压（V）
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 199.2/184.1 156 35
2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 213.0/198.1 109 33
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 200.0/185.0 138 35
2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 214.0/199.0 172 36
2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 227.9/213.1 167 33
9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 170.0/116.0 132 45
1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 182.8/115.0 136 42
2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 184.1/167.1 191 30
2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 198.1/181.0 194 28
2-氨基-1,6-二甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 163.1/148.0 165 32
2-氨基-1,5,6-三甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 176.9/162.0 128 32
表2标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数
组分名称 线性范围（ng/mL） 回归方程 相关系数（R2）
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 0.5~1000 y=84361.2x-40404.6 0.99118
2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 0.5~1000 y=61095.1x-32556.4 0.99134
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 0.5~1000 y=27906.3x-2938.3 0.99250
2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 0.5~1000 y=14527x-5647.5 0.99932
2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 0.5~1000 y=26158.9x-13251.4 0.99440
9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 0.5~1000 y=8853.2x-1718.9 0.99266
1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 0.5~1000 y=61979.5x-15312.4 0.99509
2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 0.5~1000 y=2068x+1452.9 0.99148
2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 0.5~1000 y=14503.6x+4747.3 0.99272
2-氨基-1,6-二甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 0.5~1000 y=39768.4x-13637.4 0.99191
2-氨基-1,5,6-三甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 0.5~1000 y=6005.2x-17311.5 0.99443
表2中所述回归方程中，x表示杂环胺的浓度，y表示杂环胺的色谱峰面积；
S3：根据步骤S1测得的净化样品制备液的峰面积值，从步骤S2绘制的系列杂环胺标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的杂环胺的含量，按下式计算待测固体样品中杂环胺的含量X：
式中：X表示试样(即待净化样品)中的杂环胺含量，单位ng/g；C1表示步骤S1测得的样品制备液的峰面积所对应的杂环胺的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中杂环胺的含量，单位ng/mL；m表示试样质量(即所述待净化样品的质量)，单位g；V表示第三提取试剂的体积(即第三提取试剂A和第三提取试剂B的体积之和)，单位mL；V1表示净化样品制备液的体积，单位mL；V2表示上清液的体积，单位mL。
下述各实施例中使用的Fe3O4@PDA的制备方法，步骤如下：
S1：称取0.07g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，溶于100mL超纯水中，用盐酸调至pH为8.5，得到Tris-HCl溶液；
S2：称取10mg多巴胺（PDA），溶于10mL Tris-HCl溶液中，得到PDA-Tris-HCl溶液；
S3：称取5mg四氧化三铁（Fe3O4），置于10mL PDA-Tris-HCl溶液中，800W水浴超声1min使Fe3O4在溶液中分散均匀，得到Fe3O4@PDA制备液，100rpm震荡4h；
S4：用磁铁将震荡后的Fe3O4@PDA制备液中的固液分离，弃去液体；使用20mL甲醇清洗三次，再使用20mL去离子水清洗三次，以去除杂质，磁力分离，弃去液体；60℃干燥4h，得到Fe3O4@PDA。
如无特殊说明，下述各例使用的烤牛肉为普通烤肉店购买的同一批次的烤牛肉，各例之间烤牛肉样品中的杂环胺含量无显著差异
实施例1：
一种用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒，包括第一提取试剂和第二试剂，所述第一提取试剂是氯化钠；所述第二提取试剂为Fe3O4@PDA；
使用所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒净化固体样品的方法，包括步骤:
S1：称取3.00g第一提取试剂，溶于50mL超纯水中，得到第三提取试剂；
S2：称取2.00g烤牛肉于离心管中，加入10mL第三提取试剂A，6000rpm匀浆1min，得匀浆液；用5mL第三提取试剂B洗涤匀浆机刀头，将洗涤后所得液体与所述匀浆液合并，4000rpm离心10min，得上清液和沉淀物；取1mL所述上清液，加入10mg第二提取试剂，5000rpm漩涡震荡30s，磁力分离后弃去上清液，加入1mL甲醇，5000rpm漩涡震荡30s，磁力分离，取甲醇层，得净化样品制备液；
S3：不称取样品，其余操作同步骤S2，得到试样空白液。
取本实施例获得的净化样品制备液，进行杂环胺的测定，包括步骤：
S1：所述净化样品制备液过0.22μm的有机系微孔滤膜，然后进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定；色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；质谱条件：见表1；得第一色谱图。
S2：以甲醇为溶剂，配制六个不同质量体积浓度的11种杂环胺混合标准溶液，该六个标准溶液中杂环胺的质量体积浓度依次分别为：0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；将杂环胺系列混合标准溶液于附带三重四级杆质谱的高效液相色谱仪中测定；
色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；
质谱条件：见表1。得第二色谱图，由该第二色谱图得到的系列标准溶液中杂环胺在该色谱条件下的出峰时间和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制杂环胺标准溶液的工作曲线；根据测得的样品制备液的峰面积值，从表2绘制的系列杂环胺标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的杂环胺的含量，按下式计算待测固体样品中杂环胺的含量X：
式中：X表示试样（即烤牛肉）中的杂环胺含量，单位ng/g；C1表示测得的样品制备液的峰面积所对应的杂环胺的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中杂环胺的含量，单位ng/mL；m表示试样质量（即2.00g），单位g；V表示步骤2中第三提取试剂的体积（即15mL），单位mL；V1表示净化样品制备液的体积（即1mL），单位mL；V2表示上清液的体积（即1mL），单位mL。
本实施例测得的结果，见表3。
表3烤牛肉中杂环胺的含量
杂环胺 含量（ng/g）
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 0.43±0.03
2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 1.82±0.51
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 3.06±0.21
2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 33.51±3.63
2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 1.36±0.15
9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 20.68±2.98
1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 23.14±3.38
2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 0.30±0.02
2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 -
2-氨基-1,6-二甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 11.70±2.09
2-氨基-1,5,6-三甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 98.19±2.18
注：-未检测出
实施例2：
一种用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒，包括第一提取试剂和第二试剂，所述第一提取试剂由：氯化钠和醋酸铅按质量比2:5组成；所述第二提取试剂为Fe3O4@PDA；
使用所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒净化固体样品的方法，步骤为:
S1：称取7g第一提取试剂，溶于50mL超纯水中，得到第三提取试剂；
S2：称取2.00g烤牛肉于离心管中，加入10mL第三提取试剂A，6000rpm匀浆1min，得匀浆液；用5mL第三提取试剂B洗涤匀浆机刀头，将洗涤后所得液体与所述匀浆液合并，4000rpm离心10min，得上清液和沉淀物；取1mL所述上清液，加入10mg第二提取试剂，5000rpm漩涡震荡30s，磁力分离后弃去上清液，加入1mL甲醇，5000rpm漩涡震荡30s，磁力分离，取甲醇层，得净化样品制备液；
S3：不称取样品，其余操作同步骤S2，得到试样空白液。
取本实施例获得的净化样品制备液，进行杂环胺的测定，包括步骤：
S1：所述净化样品制备液过0.22μm的有机系微孔滤膜，然后进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定；色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；质谱条件：见表1；得第一色谱图。
S2：以甲醇为溶剂，配制六个不同质量体积浓度的11种杂环胺混合标准溶液，该六个标准溶液中杂环胺的质量体积浓度依次分别为：0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；将杂环胺系列混合标准溶液于附带三重四级杆质谱的高效液相色谱仪中测定；
色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；
质谱条件：见表1。得第二色谱图，由该第二色谱图得到的系列标准溶液中杂环胺在该色谱条件下的出峰时间和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制杂环胺标准溶液的工作曲线；根据测得的样品制备液的峰面积值，从表2绘制的系列杂环胺标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的杂环胺的含量，按下式计算待测固体样品中杂环胺的含量X：
式中：X表示试样（即烤牛肉）中的杂环胺含量，单位ng/g；C1表示测得的样品制备液的峰面积所对应的杂环胺的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中杂环胺的含量，单位ng/mL；m表示试样质量（即2.00g），单位g；V表示步骤2中第三提取试剂的体积（即15mL），单位mL；V1表示净化样品制备液的体积（即1mL），单位mL；V2表示上清液的体积（即1mL），单位mL。
本实施例测得的结果，见表4。
表4烤牛肉中杂环胺的含量
杂环胺 含量（ng/g）
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 0.45±0.03
2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 1.79±0.15
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 3.15±0.28
2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 34.33±3.04
2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 1.30±0.15
9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 21.39±2.24
1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 25.03±2.46
2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 0.27±0.02
2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 -
2-氨基-1,6-二甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 12.39±1.94
2-氨基-1,5,6-三甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 95.24±8.16
注：-未检测出
实施例3:
一种用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒，包括第一提取试剂和第二试剂，所述第一提取试剂包括：第一提取试剂由SDS和碳酸钠按质量比7:3组成；所述第二提取试剂为Fe3O4@PDA；
使用所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒净化固体样品的方法，包括步骤：
S1：称取10g第一提取试剂，溶于50mL超纯水中，得到第三提取试剂；
S2：称取2.00g烤牛肉于离心管中，加入10mL第三提取试剂A，6000rpm匀浆1min，得匀浆液；用5mL第三提取试剂B洗涤匀浆机刀头，将洗涤后所得液体与所述匀浆液合并，4000rpm离心10min，得上清液和沉淀物；取1mL所述上清液，加入10mg第二提取试剂，5000rpm漩涡震荡30s，磁力分离后弃去上清液，加入1mL甲醇，5000rpm漩涡震荡30s，磁力分离，取甲醇层，得净化样品制备液；
S3：不称取样品，其余操作同步骤S2，得到试样空白液。
取本实施例获得的净化样品制备液，进行杂环胺的测定，包括步骤：
S1：所述净化样品制备液过0.22μm的有机系微孔滤膜，然后进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定；色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；质谱条件：见表1；得第一色谱图。
S2：以甲醇为溶剂，配制六个不同质量体积浓度的11种杂环胺混合标准溶液，该六个标准溶液中杂环胺的质量体积浓度依次分别为：0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；将杂环胺系列混合标准溶液于附带三重四级杆质谱的高效液相色谱仪中测定；
色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；
质谱条件：见表1。得第二色谱图，由该第二色谱图得到的系列标准溶液中杂环胺在该色谱条件下的出峰时间和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制杂环胺标准溶液的工作曲线；根据测得的样品制备液的峰面积值，从表2绘制的系列杂环胺标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的杂环胺的含量，按下式计算待测固体样品中杂环胺的含量X：
式中：X表示试样（即烤牛肉）中的杂环胺含量，单位ng/g；C1表示测得的样品制备液的峰面积所对应的杂环胺的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中杂环胺的含量，单位ng/mL；m表示试样质量（即2.00g），单位g；V表示步骤2中第三提取试剂的体积（即15mL），单位mL；V1表示净化样品制备液的体积（即1mL），单位mL；V2表示上清液的体积（即1mL），单位mL。
本实施例测得的结果，见表5。
表5烤牛肉中杂环胺的含量
杂环胺 含量（ng/g）
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 0.42±0.04
2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 1.80±0.23
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 2.99±0.31
2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 33.25±2.76
2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 1.29±0.13
9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 19.94±2.37
1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 21.57±2.46
2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 0.28±0.03
2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 -
2-氨基-1,6-二甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 10.16±1.48
2-氨基-1,5,6-三甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 97.15±4.74
注：-未检测出
实施例4：
一种用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒，包括第一提取试剂和第二试剂，所述第一提取试剂由氯化钠、SDS、碳酸钠、醋酸铅按质量比2:5:3:3组成；所述第二提取试剂为Fe3O4@PDA；
使用所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒净化固体样品的方法，包括步骤:
S1：称取13.00g第一提取试剂，溶于50mL超纯水中，得到第三提取试剂；
S2：称取2.00g烤牛肉于离心管中，加入10mL第三提取试剂A，6000rpm匀浆1min，得匀浆液；用5mL第三提取试剂B洗涤匀浆机刀头，将洗涤后所得液体与所述匀浆液合并，4000rpm离心10min，得上清液和沉淀物；取1mL所述上清液，加入10mg第二提取试剂，5000rpm漩涡震荡30s，磁力分离后弃去上清液，加入1mL甲醇，5000rpm漩涡震荡30s，磁力分离，取甲醇层，得净化样品制备液；
S3：不称取样品，其余操作同步骤S2，得到试样空白液。
取本实施例获得的净化样品制备液，进行杂环胺的测定，包括步骤：
S1：所述净化样品制备液过0.22μm的有机系微孔滤膜，然后进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定；色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；质谱条件：见表1；得第一色谱图。
S2：以甲醇为溶剂，配制六个不同质量体积浓度的11种杂环胺混合标准溶液，该六个标准溶液中杂环胺的质量体积浓度依次分别为：0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；将杂环胺系列混合标准溶液于附带三重四级杆质谱的高效液相色谱仪中测定；
色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；
质谱条件：见表1。得第二色谱图，由该第二色谱图得到的系列标准溶液中杂环胺在该色谱条件下的出峰时间和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制杂环胺标准溶液的工作曲线；根据测得的样品制备液的峰面积值，从表2绘制的系列杂环胺标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的杂环胺的含量，按下式计算待测固体样品中杂环胺的含量X：
式中：X表示试样（即烤牛肉）中的杂环胺含量，单位ng/g；C1表示测得的样品制备液的峰面积所对应的杂环胺的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中杂环胺的含量，单位ng/mL；m表示试样质量（即2.00g），单位g；V表示步骤2中第三提取试剂的体积（即15mL），单位mL；V1表示净化样品制备液的体积（即1mL），单位mL；V2表示上清液的体积（即1mL），单位mL。
本实施例测得的结果，见表6。
表6烤牛肉中杂环胺的含量
杂环胺 含量（ng/g）
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 0.47±0.05
2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 2.35±0.21
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 3.23±0.28
2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 32.18±3.03
2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 1.48±0.09
9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 19.56±1.82
1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 22.44±2.61
2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 0.32±0.03
2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 -
2-氨基-1,6-二甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 10.93±1.46
2-氨基-1,5,6-三甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 99.26±5.28
注：-未检测出
实施例5：
一种用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒，包括第一提取试剂和第二试剂，所述第一提取试剂是氯化钠；所述第二提取试剂为Fe3O4@PDA；
使用所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒净化固体样品的方法，包括步骤:
S1：称取3.00g第一提取试剂，溶于50mL超纯水中，得到第三提取试剂；
S2：称取2.00g烤鲫鱼于离心管中，加入10mL第三提取试剂A，6000rpm匀浆1min，得匀浆液；用5mL第三提取试剂B洗涤匀浆机刀头，将洗涤后所得液体与所述匀浆液合并，4000rpm离心10min，得上清液和沉淀物；取1mL所述上清液，加入10mg第二提取试剂，5000rpm漩涡震荡30s，磁力分离后弃去上清液，加入1mL甲醇，5000rpm漩涡震荡30s，磁力分离，取甲醇层，得净化样品制备液；
S3：不称取样品，其余操作同步骤S2，得到试样空白液。
取本实施例获得的净化样品制备液，进行杂环胺的测定，包括步骤：
S1：所述净化样品制备液过0.22μm的有机系微孔滤膜，然后进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定；色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；质谱条件：见表1；得第一色谱图。
S2：以甲醇为溶剂，配制六个不同质量体积浓度的11种杂环胺混合标准溶液，该六个标准溶液中杂环胺的质量体积浓度依次分别为：0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；将杂环胺系列混合标准溶液于附带三重四级杆质谱的高效液相色谱仪中测定；
色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；
质谱条件：见表1。得第二色谱图，由该第二色谱图得到的系列标准溶液中杂环胺在该色谱条件下的出峰时间和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制杂环胺标准溶液的工作曲线；根据测得的样品制备液的峰面积值，从表2绘制的系列杂环胺标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的杂环胺的含量，按下式计算待测固体样品中杂环胺的含量X：
式中：X表示试样（即烤鲫鱼）中的杂环胺含量，单位ng/g；C1表示测得的样品制备液的峰面积所对应的杂环胺的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中杂环胺的含量，单位ng/mL；m表示试样质量（即2.00g），单位g；V表示步骤2中第三提取试剂的体积（即15mL），单位mL；V1表示净化样品制备液的体积（即1mL），单位mL；V2表示上清液的体积（即1mL），单位mL。
本实施例测得的结果，见表7。
表7烤鲫鱼中杂环胺的含量
杂环胺 含量（ng/g）
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 0.35±0.03
2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 0.27±0.03
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 2.93±0.13
2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 1.08±0.05
2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 0.74±0.07
9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 -
1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 -
2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 -
2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 -
2-氨基-1,6-二甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 0.23±0.01
2-氨基-1,5,6-三甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 -
注：-未检测出
实施例6：
一种用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒，包括第一提取试剂和第二试剂，所述第一提取试剂是氯化钠；所述第二提取试剂为Fe3O4@PDA；
使用所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒净化固体样品的方法，包括步骤:
S1：称取3.00g第一提取试剂，溶于50mL超纯水中，得到第三提取试剂；
S2：称取2.00g烤鸡肉于离心管中，加入10mL第三提取试剂A，6000rpm匀浆1min，得匀浆液；用5mL第三提取试剂B洗涤匀浆机刀头，将洗涤后所得液体与所述匀浆液合并，4000rpm离心10min，得上清液和沉淀物；取1mL所述上清液，加入10mg第二提取试剂，5000rpm漩涡震荡30s，磁力分离后弃去上清液，加入1mL甲醇，5000rpm漩涡震荡30s，磁力分离，取甲醇层，得净化样品制备液；
S3：不称取样品，其余操作同步骤S2，得到试样空白液。
取本实施例获得的净化样品制备液，进行杂环胺的测定，包括步骤：
S1：所述净化样品制备液过0.22μm的有机系微孔滤膜，然后进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定；色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；质谱条件：见表1；得第一色谱图。
S2：以甲醇为溶剂，配制六个不同质量体积浓度的11种杂环胺混合标准溶液，该六个标准溶液中杂环胺的质量体积浓度依次分别为：0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；将杂环胺系列混合标准溶液于附带三重四级杆质谱的高效液相色谱仪中测定；
色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；
质谱条件：见表1。得第二色谱图，由该第二色谱图得到的系列标准溶液中杂环胺在该色谱条件下的出峰时间和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制杂环胺标准溶液的工作曲线；根据测得的样品制备液的峰面积值，从表2绘制的系列杂环胺标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的杂环胺的含量，按下式计算待测固体样品中杂环胺的含量X：
式中：X表示试样（即烤鸡肉）中的杂环胺含量，单位ng/g；C1表示测得的样品制备液的峰面积所对应的杂环胺的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中杂环胺的含量，单位ng/mL；m表示试样质量（即2.00g），单位g；V表示步骤2中第三提取试剂的体积（即15mL），单位mL；V1表示净化样品制备液的体积（即1mL），单位mL；V2表示上清液的体积（即1mL），单位mL。
本实施例测得的结果，见表8。
表8烤鸡肉中杂环胺的含量
杂环胺 含量（ng/g）
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 0.33±0.03
2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 0.27±0.04
2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 2.69±0.22
2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 1.51±0.13
2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 0.70±0.04
9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 8.71±0.73
1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 -
2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 -
2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 -
2-氨基-1,6-二甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 0.20±0.01
2-氨基-1,5,6-三甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 -
注：-未检测出
对比例1
参照现有的文献公开的方法对样品进行净化，所述样品是2.00g烤牛肉，得净化样品制备液；
所述文献为：
Yan Y, Zhang S, Tao G, et al. Acetonitrile extraction coupled withUHPLC-MS/MS for the accurate quantification of 17 heterocyclic aromaticamines in meat products.[J]. Journal of Chromatography B, 2017: 173-179.
取本对比例获得的净化样品制备液，进行杂环胺的测定，包括步骤：
S1：所述净化样品制备液过0.22μm的有机系微孔滤膜，然后进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定；色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；质谱条件：见表1；得第一色谱图。
S2：以甲醇为溶剂，配制六个不同质量体积浓度的11种杂环胺混合标准溶液，该六个标准溶液中杂环胺的质量体积浓度依次分别为：0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；将杂环胺系列混合标准溶液于附带三重四级杆质谱的高效液相色谱仪中测定；
色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；
质谱条件：见表1。得第二色谱图，由该第二色谱图得到的系列标准溶液中杂环胺在该色谱条件下的出峰时间和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制杂环胺标准溶液的工作曲线；根据测得的样品制备液的峰面积值，从表2绘制的系列杂环胺标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的杂环胺的含量，按下式计算待测固体样品中杂环胺的含量X：
式中：X表示试样（即烤牛肉）中的杂环胺含量，单位ng/g；C1表示测得的样品制备液的峰面积所对应的杂环胺的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中杂环胺的含量，单位ng/mL；m表示试样质量（即2.00g），单位g；V表示净化样品制备液的体积（即0.6mL），单位mL。
本对比例的结果为在烤牛肉中未检测出杂环胺。
本发明提供了一种用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒，由第一提取试剂和第二提取试剂组成，第一提取试剂为消泡剂,第二提取试剂为Fe3O4@PDA。
第一提取试剂为消泡剂。在提取过程中，在固体样品中加入消泡剂，能够增大杂环胺的提取效率，让提取更充分。第二提取试剂为Fe3O4@PDA。Fe3O4@PDA不仅能够吸附样品中的杂环胺，而且具有磁性的吸附剂有利于实现与样品之间的快速分离。
通过本发明实施例使用用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒净化固体样品的方法与GB5009.243-2016和现有的文献公开的净化方法进行比较，突出所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒的优越性：
1)准确性对比：
国标GB5990.243-2016规定的方法的回收率为79.0~105.8%，现有的文献公开的方法的回收率为68.69~101.81%和71.8~119.1%。而本发明实施例1~6所述使用所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒净化固体样品的方法，回收率为71.06~108.49%。回收率在70~120%之间，表明方法具有良好的准确性。
所述文献为：
Yao Y, Peng Z Q, Wan K H, et al. Determination of heterocyclic aminesin braised sauce beef[J]. Food Chemistry, 2013, 141(3): 1847-1853.
Lee K, Lee G, Kim H, et al. Determination of Heterocyclic Amines andAcrylamide in Agricultural Products with Liquid Chromatography-Tandem MassSpectrometry[J]. Toxicological research, 2015, 31(3): 255-264.
2）试剂消耗量对比：
国标GB5009.243-2016规定的方法消耗试剂量为29.5mL（1g样品），现有的文献公开的方法消耗试剂量为99.5mL（2g样品）、115.5mL（5g样品）、119.5mL（4g样品）。而本发明实施例1~6所述使用所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒净化固体样品的方法，消耗试剂量为16mL（2g样品）。
所述文献为：
Yao Y, Peng Z Q, Wan K H, et al. Determination of heterocyclic aminesin braised sauce beef[J]. Food Chemistry, 2013, 141(3): 1847-1853.
Lee K, Lee G, Kim H, et al. Determination of Heterocyclic Amines andAcrylamide in Agricultural Products with Liquid Chromatography-Tandem MassSpectrometry[J]. Toxicological research, 2015, 31(3): 255-264.
3）实验耗时对比：
国标GB5009.243-2016规定的方法和现有的文献公开的方法中对杂环胺的样品前处理的提取过程都需要经过预处理小柱等一系列的操作，操作耗时25~40min。而用本发明实施例1~6所述使用所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒净化固体样品的方法，耗时13min。
所述文献为：
Yao Y, Peng Z Q, Wan K H, et al. Determination of heterocyclic aminesin braised sauce beef[J]. Food Chemistry, 2013, 141(3): 1847-1853.
Lee K, Lee G, Kim H, et al. Determination of Heterocyclic Amines andAcrylamide in Agricultural Products with Liquid Chromatography-Tandem MassSpectrometry[J]. Toxicological research, 2015, 31(3): 255-264.
4）操作过程对比：
国标GB5009.243-2016规定的方法和现有的文献公开的方法中都需要使用预处理小柱对样品进行分离净化，预处理小柱需要活化、平衡、上样、淋洗、洗脱等一系列操作，操作过程复杂繁琐。而本发明所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒采用磁性吸附材料对样品进行吸附，通过磁力进行材料与样品的分离，操作简单快速。
所述文献为：
Yao Y, Peng Z Q, Wan K H, et al. Determination of heterocyclic aminesin braised sauce beef[J]. Food Chemistry, 2013, 141(3): 1847-1853.
Lee K, Lee G, Kim H, et al. Determination of Heterocyclic Amines andAcrylamide in Agricultural Products with Liquid Chromatography-Tandem MassSpectrometry[J]. Toxicological research, 2015, 31(3): 255-264.
5）净化效果比较
对比例1使用现有的文献公开的方法测定烤牛肉中杂环胺，未检测到杂环胺。而使用本发明所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒净化固体样品的方法检测烤牛肉中杂环胺，能检测到十种杂环胺。因此，本发明所述用于杂环胺分析的固体样品快速净化试剂盒净化效果良好。
所述文献为：
Yan Y, Zhang S, Tao G, et al. Acetonitrile extraction coupled withUHPLC-MS/MS for the accurate quantification of 17 heterocyclic aromaticamines in meat products.[J]. Journal of Chromatography B, 2017: 173-179.
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于检测固体样品中杂环胺的方法，其特征在于，准备固体样品快速净化试剂盒，所述试剂盒包括第一提取试剂和第二提取试剂，所述第一提取试剂由氯化钠、SDS、碳酸钠、醋酸铅中的一种或多种组成；所述第二提取试剂为Fe3O4@PDA；
所述Fe3O4@PDA的制备方法，包括步骤：
Sa1：取三羟甲基氨基甲烷，溶于超纯水中，用盐酸调至pH为8.5，得到Tris-HCl溶液；所述三羟甲基氨基甲烷和超纯水的质量体积比是（1~10）:2g/L；
Sa2：取多巴胺，溶于步骤Sa1所述Tris-HCl溶液中，得到PDA-Tris-HCl溶液；所述多巴胺与Tris-HCl溶液的质量体积比是（1~10）:2g/L；
Sa3：取四氧化三铁，置于PDA-Tris-HCl溶液中，超声使四氧化三铁在溶液中分散均匀，得到Fe3O4@PDA制备液，震荡；所述四氧化三铁与PDA-Tris-HCl溶液的质量体积比是（1~10）:2g/L；所述震荡参数为：100~300rpm，室温震荡2~12h；
Sa4:用磁铁将震荡后的Fe3O4@PDA制备液中的固液分离，弃去液体；依次加入醇和去离子水多次清洗固体，磁力分离，弃去液体；干燥，得到Fe3O4@PDA；所述醇是甲醇或乙醇；
按如下步骤应用：
Sb1：取第一提取试剂，溶于超纯水中，得到第三提取试剂；所述第一提取试剂和超纯水的质量体积比是（2~20）:50g/mL；
Sb2：取待净化样品，加入第三提取试剂A，匀浆，得匀浆液；用第三提取试剂B洗涤匀浆机刀头，将洗涤后所得液体与所述匀浆液混合，离心取上清液；取所述上清液，加入第二提取试剂，漩涡震荡，磁力分离取固体后弃去上清液，将所得固体加入甲醇，漩涡震荡，磁力分离固体，取甲醇层，得净化样品制备液；
其中，所述待净化样品是固体样品；所述待净化样品和所述第三提取试剂A的质量体积比为（1~5）:10g/mL；所述上清液和所述第二提取试剂的体积质量比为（0.5~5）:（5~100）mL/mg；所述甲醇的添加量为0.5~5mL；
Sb3：不取待净化取样品，其余操作同步骤Sb2，得到试样空白液；
此后，按下述方法，以试样空白液为对照，对净化样品制备液中的杂环胺进行测定，再通过公式计算待净化样品中的杂环胺含量：
Sc1：所述净化样品制备液过0.22μm的有机系微孔滤膜，然后进行高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定；色谱条件：色谱柱：C8 2.1×100mm分析柱；流动相A：10mM乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0~0.1min：10%B，0.1~18min：10%~30%B，18~20min：30%~100%B，20~21min：100%~10%B，21~25min：10%B；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL；得到第一色谱图；所述杂环胺的质谱条件如下：
测定物质 定量离子对（m/z） 去簇电压（V） 碰撞电压（V） 2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 199.2/184.1 156 35 2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉 213.0/198.1 109 33 2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 200.0/185.0 138 35 2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 214.0/199.0 172 36 2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉 227.9/213.1 167 33 9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 170.0/116.0 132 45 1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚 182.8/115.0 136 42 2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 184.1/167.1 191 30 2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚 198.1/181.0 194 28 2-氨基-1,6-二甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 163.1/148.0 165 32 2-氨基-1,5,6-三甲基咪唑[4,5-b]-吡啶 176.9/162.0 128 32
Sc2：以甲醇为溶剂，配制六个不同质量体积浓度的杂环胺混合标准溶液，该六个标准溶液中杂环胺的质量体积浓度依次分别为：0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、50.00ng/mL、250.00ng/mL、1000.00ng/mL；将杂环胺系列混合标准溶液于附带三重四级杆质谱的高效液相色谱仪中测定，得第二色谱图，由第二色谱图得到系列标准溶液中杂环胺在该色谱条件下的出峰时间和不同浓度的峰面积；并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制杂环胺标准溶液的工作曲线；
Sc3：根据步骤Sc1测得的净化样品制备液的峰面积值，从步骤Sc2绘制的系列杂环胺标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的杂环胺的含量，按下式计算待测固体样品中杂环胺的含量X：
式中：X表示试样，即待净化样品中的杂环胺含量，单位ng/g；C1表示步骤Sc1测得的样品制备液的峰面积所对应的杂环胺的含量，单位ng/mL；C0表示试样空白液中杂环胺的含量，单位ng/mL；m表示试样质量，即所述待净化样品的质量，单位g；V表示第三提取试剂的体积，即第三提取试剂A和第三提取试剂B的体积之和，单位mL；V1表示净化样品制备液的体积，单位mL；V2表示上清液的体积，单位mL；
其中，所述待净化样品为牛肉、鸡肉或鲫鱼。
2.根据权利要求1所述用于检测固体样品中杂环胺的方法，其特征在于，步骤Sb2所述匀浆的参数为：4000~8000rpm匀浆1~3min。
3.根据权利要求1所述用于检测固体样品中杂环胺的方法，其特征在于，步骤Sb2所述离心的转速为3000~10000rpm、时间5~20min。
4.据权利要求1所述用于检测固体样品中杂环胺的方法，其特征在于，步骤Sb2所述第三提取试剂B和第三提取试剂A的体积比是（0.2~1）:1。
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