CN103343116A - 酶基磁性纳米粒及制备方法、应用和葡萄糖的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了酶基磁性纳米粒及制备方法、应用和葡萄糖的检测方法。该方法包括以下步骤：1）将Fe₃O₄磁性纳米粒、多巴胺以质量比（1:1）-（1:4）和水混合均匀，加入碱性缓冲体系，搅拌8-48小时，得聚多巴胺包裹的Fe₃O₄；2）辣根过氧化物酶溶液、葡萄糖氧化酶溶液、聚多巴胺包裹的Fe₃O₄和多巴胺混合均匀，得混合液B，反应5-25小时；混合液B总，辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、聚多巴胺包裹的Fe₃O₄和多巴胺的浓度分别为0.025-0.2mg/mL、0.025-0.2mg/mL、0.5-25mg/mL和1-5mg/mL。本发明的酶基磁性纳米粒能够检测葡萄糖，可以重复使用，废弃物可以通过燃烧或高温处理，达到零污染。

Description

酶基磁性纳米粒及制备方法、应用和葡萄糖的检测方法

技术领域

本发明涉及酶基磁性纳米粒及制备方法、应用和葡萄糖的检测方法。

背景技术

糖尿病是由代谢紊乱引起的社会健康问题。正常人体血液中葡萄糖的含量范围为4.4～6.6mmol/L（80～120mg/dL），血糖浓度过高会导致高血糖症或胰岛素不足，进而引起糖尿病。最近几年，现有技术中均是采用固化酶的方法检测葡萄糖。

葡萄糖酶可分为葡萄糖氧化酶（GOx）和葡萄糖脱氢酶（GDH），采用葡萄糖氧化酶测定葡萄糖浓度已成为一种广泛、有效的方法。目前，临床上最常用的葡萄糖检测方法是葡萄糖氧化酶分析法，它具有专一性好、反应速率快和抗尿酸、抗坏血酸干扰的特点。但该方法的缺点是：对于酶的消耗需求过大，且使用的阻断剂和酶直接排放到自然环境中，对环境造成生物污染。近期，相关发表文章公开了使用戊二醛交联法将葡萄糖氧化酶固定在功能化磁性纳米颗粒表面，用以检测葡萄糖。然而，戊二醛交联法中的交联剂戊二醛会对生物酶造成一定的毒害，导致生物酶失活。该方法效果并不佳。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中酶基磁性纳米粒对生物酶造成一定的损害，致使生物酶失活、效果不佳等缺陷，提供一种酶基磁性纳米粒及制备方法、应用和葡萄糖的检测方法，该酶基磁性纳米粒能够检测葡萄糖，并且可以重复使用，且废弃物可以通过燃烧或高温处理，达到零污染。

为了更精确高效地检测葡萄糖，实现更好的测量效果，申请人对酶基磁性纳米粒进行了深层次的研究，尝试将两种酶同时固定于纳米粒上，并且考虑到测量后的酶基磁性纳米粒的重复利用问题，最终制得了本发明的酶基磁性纳米粒。

本发明的目的之一是，提供一种酶基磁性纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

（1）将Fe₃O₄磁性纳米粒、多巴胺（DA）和水混合均匀得混合液A，加入碱性缓冲体系，得反应液，搅拌8-48小时，得聚多巴胺包裹的Fe₃O₄（PDAFe₃O₄）；其中Fe₃O₄磁性纳米粒：多巴胺的质量比为（1:1）-（1:4）；

（2）将辣根过氧化物酶（HRP）溶液、葡萄糖氧化酶（GOD）溶液、所述的聚多巴胺包裹的Fe₃O₄和多巴胺混合均匀，得混合液B，反应5-25小时，即可；其中，所述的混合液B中，所述的辣根过氧化物酶和所述的葡萄糖氧化酶的浓度均为0.025mg/mL-0.2mg/mL，所述的聚多巴胺包裹的Fe₃O₄的浓度为0.5mg/mL-25mg/mL，所述的多巴胺的浓度为1mg/mL-5mg/mL。

步骤（1）中，所述的Fe₃O₄磁性纳米粒为本领域常规的Fe₃O₄磁性纳米粒，较佳的，所述的Fe₃O₄磁性纳米粒的制备方法的参考文献为：《多巴胺的自聚-附着行为与膜表面功能化》；选自《膜科学与技术》，2005，3（3）：215-218；其制备方法为：取FeCl₃·6H₂O，无水醋酸钠，1.0g聚乙烯二醇置于乙二醇溶液中，剧烈搅拌30分钟后转入高压反应釜内，在200℃的烘箱中反应8小时，冷却至室温。最后将合成的产物用乙醇洗涤后，放于真空干燥箱中干燥6小时。

本发明中，所述的多巴胺（DA）是NA的前体物质，是下丘脑和脑垂体腺中的一种关键天然存在的儿茶酚胺类神经递质，具有很强的电化学活性。聚多巴胺是贝壳、蚌等生物分泌的粘性蛋白的主要成分，具有极强的粘附性，能稳定地固定在各种基质上。较佳的，所述的多巴胺的化学式为C₈H₁₁NO₂，市售可得。

步骤（1）中，较佳的，所述的Fe₃O₄磁性纳米颗粒与所述的多巴胺的质量比为1:2。

步骤（1）中，较佳的，所述的混合液A中所述的多巴胺的浓度为0.5-1.0mg/mL。

步骤（1）中，较佳的，所述的加入碱性缓冲体系的方法为下述方式的任一种：

方式一：加入缓冲液。所述的缓冲液为本领域常规的缓冲液，所述的缓冲液较佳的为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（Tris-HCl）；所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（Tris-HCl）的浓度较佳的为0.025-0.075mmol/L，所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（Tris-HCl）的pH值较佳的为7.0-9.5。

方式二：入三羟甲基氨基甲烷溶液，再加入HCl溶液调节pH至7.0-9.5。所述的三羟甲基氨基甲烷溶液的浓度较佳的为5mmol/L，所述的HCl溶液的浓度较佳的为0.1mol/L。

步骤（1）中，较佳的，所述的搅拌的时间为24小时。

步骤（1）中，较佳的，所述的搅拌之后进行冷却、洗涤和干燥，再进行下一步操作。所述的冷却的方法为本领域常规的方法；所述的冷却的温度较佳的为冷却至室温，所述的室温较佳的为10℃-40℃，更佳的为20℃-30℃。所述的洗涤的方法为本领域常规的方法；所述的洗涤较佳的为使用乙醇和/或水洗涤，其中，所述的水的用量较佳的为10mL-50mL，所述的乙醇的用量较佳的为10mL-30mL。所述的干燥的方法为本领域常规的方法；所述的干燥较佳的为在真空干燥箱中；所述的干燥的时间较佳的为3-12小时，更佳的为6小时。

步骤（2）中，所述的辣根过氧化物酶（HRP）与所述的葡萄糖氧化酶（GOD）的质量比较佳的为（1:2）-（2:1），更佳的为2:1。

步骤（2）中，较佳的，所述的混合时加入水混合。

步骤（2）中，所述的混合液B中，所述的辣根过氧化物酶溶液的浓度较佳的为5mg/mL-10mg/mL。

步骤（2）中，所述的混合液B中，所述的葡萄糖氧化酶溶液的浓度较佳的为5mg/mL-10mg/mL。

步骤（2）中，所述的反应的时间较佳的为10小时。

本发明优选可以同时满足以下条件的技术方案：

步骤（1）中，所述的反应液的体积为100mL；步骤（2）中，所述的聚多巴胺包裹的Fe₃O₄的添加量为1-50mg，较佳的为10mg；步骤（2）中，水的添加量为2mL；步骤（2）中，所述的三羟甲基氨基甲烷添加量为30-80mg，较佳的为60mg；步骤（2）中，所述的多巴胺的添加量为2-10mg，较佳的为5mg。

步骤（2）中，较佳的，所述的反应后，洗涤并分离。所述的洗涤的方法为本领域常规方法，所述的洗涤的方法较佳的为使用乙醇和/或超纯水、通过超声洗涤。所述的分离方法为本领域常规方法，所述的分离方法为本领域常规方法较佳的为使用外磁场分离酶基磁性纳米粒。

本发明中，所述的酶基磁性纳米粒的保存方法为本领域常规方法，较佳的，所述的保存的方法为以下方法中的任一种：

方式一：短期保存方法。将酶基磁性纳米粒与去离子水混合均匀，得酶基磁性纳米粒的混合液，该混合液在4℃条件下保存；

方式二：长期保存方法。将方法（一）中的酶基磁性纳米粒的混合液干燥，得到酶基磁性纳米粒，并在-20℃条件下保存。

本发明的目的之二是，提供上述酶基磁性纳米粒的制备方法制得的酶基磁性纳米粒。

本发明的目的之三是，提供上述酶基磁性纳米粒在葡萄糖的检测方法中的应用。

本发明的目的之四是，提供一种葡萄糖的检测方法，所述的检测方法为：将所述的酶基磁性纳米粒、待测葡萄糖溶液和显色剂混合均匀，反应，外磁场分离酶基磁性纳米粒，按标准曲线法测定，即可。

本发明中，所述的标准曲线法测定为本领域常规测定的方法。较佳的，所述的标准曲线法测定的方法为：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，分别测定吸光度，用吸光度对样品浓度绘制标准曲线，再根据待测葡萄糖溶液的吸光度计算待测葡萄糖溶液的浓度。

较佳的，所述的标准曲线法测定的方法为：取十份浓度为C1-C10的葡萄糖溶液作为标准样品，将其与酶基磁性纳米粒混合均匀，反应后用外磁场分离酶基磁性纳米粒，取上清液，测定其吸光度，记作A1-A10；根据C1-C10和A1-A10绘制标准曲线。

所述的吸光度的测定方法使用紫外分光光度计进行。所述的吸光度的测定波长较佳的为390-600nm，更佳的为418nm。

本发明的酶基磁性纳米粒可以测定任意浓度的葡萄糖溶液。一般而言，当葡萄糖溶液的浓度的范围为0.6667-5mmol/L时，检测反应的时间为10分钟左右。

本发明中，所述的显色剂为本领域常规的显色剂。所述的显色剂较佳的为2,2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐（ABTs）；所述的2,2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐（ABTs）的添加量为每克酶基磁性纳米粒添加15μmol的2,2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐（ABTs），所述的2,2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐（ABTs）的浓度较佳的为0.1mmol/L。

本发明中，根据本领域常规，在测量葡萄糖时，为了保证酶的活性，需要调节待测葡萄糖溶液的pH值和温度。

所述的待测葡萄糖溶液的pH值为本领域常规pH值。所述的待测葡萄糖溶液的pH值较佳的为pH=3-6，更佳的为pH=5。

所述的待测葡萄糖溶液的温度为本领域常规的温度。所述的待测葡萄糖溶液的温度较佳的为10-60℃，更佳的为40℃。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

（1）本发明的酶基磁性纳米粒在进行葡萄糖的检测时，用外磁场分离得到的酶基磁性纳米粒，经过洗涤，可重复循环使用十次以上。

（2）本发明的酶基磁性纳米粒多次使用后，用强磁铁收集，600℃处理1小时，得到的磁性颗粒可以重复循环使用。

（3）本发明的酶基磁性纳米粒在-20℃的条件下可以保存1个月，活性没有变化。

附图说明

图1为实施例1制得的Fe₃O₄磁性纳米粒的电镜照片。

图2为实施例1制得的聚多巴胺包裹的Fe₃O₄的透视电镜照片。

图3为实施例1制得酶基磁性纳米颗粒的透射电镜照片。

图4为酶基磁性纳米粒检测葡萄糖溶液浓度的标准曲线。

图5为酶基磁性纳米粒重复五次测定葡萄糖溶液的吸光度的变化曲线。

图6为辣根过氧化物酶（HRP）：葡萄糖氧化酶（GOD）的质量比为1:1条件下得的酶基磁性纳米粒测定葡萄糖溶液浓度的吸光度结果图。

图7为辣根过氧化物酶（HRP）：葡萄糖氧化酶（GOD）的质量比为1:2条件下制得的酶基磁性纳米粒测定葡萄糖溶液浓度的吸光度结果图。

图8为辣根过氧化物酶（HRP）：葡萄糖氧化酶（GOD）的质量比为2:1条件下制得的酶基磁性纳米粒测定葡萄糖溶液浓度的吸光度结果图。

图9为不同温度条件下酶基磁性纳米粒检测葡萄糖溶液浓度的吸光度变化曲线。

图10为重复回收的酶基磁性纳米粒测量葡萄糖溶液浓度的吸光度变化曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

酶基磁性纳米粒的制备方法，其步骤包括：

（1）Fe₃O₄磁性纳米粒的制备：取FeCl₃·6H₂O，无水醋酸钠，1.0g聚乙烯二醇置于乙二醇溶液中，剧烈搅拌30分钟后转入高压反应釜内，在200℃的烘箱中反应8小时，冷却至室温；将合成的产物用乙醇洗涤后，放于真空干燥箱中干燥6小时，得Fe₃O₄磁性纳米粒；

（2）聚多巴胺（PDA）包裹Fe₃O₄的制备：将50mg上述Fe₃O₄磁性纳米粒和100mg的多巴胺溶于100mL的水中，加入60mg的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（Tris-HCl缓冲液，浓度0.05mg/l、pH8.5），搅拌24小时，室温下用50mL的水洗涤，干燥6小时，得聚多巴胺包裹的Fe₃O₄（PDAFe₃O₄）；

（3）将200μL的辣根过氧化物酶（HRP）溶液（5mg/mL），100μL的葡萄糖氧化酶（GOD）溶液（5mg/mL）、10mg上述合成的聚多巴胺（PDA）包裹Fe₃O₄和5mg巴胺单体混合均匀得混合液，反应10h后，分别用50mL超纯水超声清洗，外磁场分离酶基磁性纳米粒，即可；加入3mL去离子水，放入4℃的冰箱中保存。

其中，步骤（1）中制得的Fe₃O₄磁性纳米粒的电镜照片如图1所示。步骤（2）中制得的聚多巴胺包裹的Fe₃O₄的透视电镜照片如图2所示。制得酶基磁性纳米颗粒的透射电镜照片如图3所示。

实施例2

（1）Fe₃O₄磁性纳米粒的制备：取FeCl₃·6H₂O，无水醋酸钠，1.0g聚乙烯二醇置于乙二醇溶液中，剧烈搅拌30分钟后转入高压反应釜内，在200℃的烘箱中反应8小时，冷却至室温。最后将合成的产物用乙醇洗涤后，放于真空干燥箱中干燥6小时；

（2）聚多巴胺（PDA）包裹Fe₃O₄的制备：将Fe₃O₄磁性纳米粒和多巴胺（DA）溶于水中得混合液，混合液中多巴胺的浓度为0.5mg/mL，所述百分比为多巴胺的质量与水的体积比；将60mg三羟甲基氨基甲烷固体溶于100mL的H₂O中得5mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液，将其加入到混合溶液中，再以0.1mol/L的HCl溶液调节混合液pH值至7.0；搅拌8小时，室温下用10mL的水洗涤，真空干燥箱中干燥3小时，得聚多巴胺包裹的Fe₃O₄（PDAFe₃O₄）；其中Fe₃O₄：多巴胺的质量比为1:1；

（3）将10mg/mL的辣根过氧化物酶（HRP）溶液、5mg/mL的葡萄糖氧化酶（GOD）溶液、50mg上述聚多巴胺包裹的Fe₃O₄、10mg的多巴胺和适量的水混合均匀，反应5小时，超纯水、超声洗涤，外磁场分离酶基磁性纳米粒，即可；混合后，辣根过氧化物酶的浓度为0.025mg/mL，葡萄糖氧化酶的浓度为0.05mg/mL，聚多巴胺包裹的Fe₃O₄的浓度为25mg/mL，多巴胺的浓度为5mg/mL，所述的浓度为溶质质量与溶剂体积的比。

实施例3

（1）Fe₃O₄磁性纳米粒的制备：取FeCl₃·6H₂O，无水醋酸钠，1.0g聚乙烯二醇置于乙二醇溶液中，剧烈搅拌30分钟后转入高压反应釜内，在200℃的烘箱中反应8小时，冷却至室温。最后将合成的产物用乙醇洗涤后，放于真空干燥箱中干燥6小时；

（2）聚多巴胺（PDA）包裹Fe₃O₄的制备：将Fe₃O₄磁性纳米粒和多巴胺（DA）溶于水中得混合液，混合液中多巴胺的浓度为1.0mg/mL，所述百分比为多巴胺的质量与水的体积比；将60mg三羟甲基氨基甲烷固体溶于100mL的H₂O中得5mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液，将其加入到混合溶液中，再以0.1mol/L的HCl溶液调节混合液pH值至8.0；搅拌24小时，室温下用10-30mL的乙醇洗涤，真空干燥箱中干燥12小时，得聚多巴胺包裹的Fe₃O₄（PDAFe₃O₄）；其中Fe₃O₄：多巴胺的质量比为1:4；

（3）将8mg/mL的辣根过氧化物酶（HRP）溶液、8mg/mL的葡萄糖氧化酶（GOD）溶液、25mg的上述聚多巴胺包裹的Fe₃O₄、5mg的多巴胺和适量的水混合均匀，反应10小时，乙醇超声洗涤，外磁场分离酶基磁性纳米粒，即可；混合后，辣根过氧化物酶的浓度为0.1mg/mL，葡萄糖氧化酶的浓度为0.2mg/mL，聚多巴胺包裹的Fe₃O₄的浓度为10mg/mL，多巴胺的浓度为2mg/mL，所述的浓度为溶质质量与溶剂体积的比。

实施例4

（1）Fe₃O₄磁性纳米粒的制备：取FeCl₃·6H₂O，无水醋酸钠，1.0g聚乙烯二醇置于乙二醇溶液中，剧烈搅拌30分钟后转入高压反应釜内，在200℃的烘箱中反应8小时，冷却至室温。最后将合成的产物用乙醇洗涤后，放于真空干燥箱中干燥6小时；

（2）聚多巴胺（PDA）包裹Fe₃O₄的制备：将Fe₃O₄磁性纳米粒和多巴胺（DA）溶于水中得混合液，混合液中多巴胺的浓度为0.5-1.0mg/mL，所述百分比为多巴胺的质量与水的体积比；将60mg三羟甲基氨基甲烷固体溶于100mL的H₂O中得5mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液，将其加入到混合溶液中，再以0.1mol/L的HCl溶液调节混合液pH值至9.5；搅拌8小时，得聚多巴胺包裹的Fe₃O₄（PDAFe₃O₄）；其中Fe₃O₄：多巴胺的质量比为1:2；

（3）将5mg/mL的辣根过氧化物酶（HRP）溶液、10mg/mL的葡萄糖氧化酶（GOD）溶液、10mg上述聚多巴胺包裹的Fe₃O₄、5mg的多巴胺和适量的水混合均匀，反应10小时，即可；混合后，辣根过氧化物酶的浓度为0.2mg/mL，葡萄糖氧化酶的浓度为0.1mg/mL，聚多巴胺包裹的Fe₃O₄的浓度为10mg/mL，多巴胺的浓度为5mg/mL，所述的浓度为溶质质量与溶剂体积的比。

实施例5

（1）Fe₃O₄磁性纳米粒的制备：取FeCl₃·6H₂O，无水醋酸钠，1.0g聚乙烯二醇置于乙二醇溶液中，剧烈搅拌30分钟后转入高压反应釜内，在200℃的烘箱中反应8小时，冷却至室温。最后将合成的产物用乙醇洗涤后，放于真空干燥箱中干燥6小时；

（2）聚多巴胺（PDA）包裹Fe₃O₄的制备：将Fe₃O₄磁性纳米粒和多巴胺（DA）溶于水中得混合液，混合液中多巴胺的浓度为0.8mg/mL，所述百分比为多巴胺的质量与水的体积比；将60mg三羟甲基氨基甲烷固体溶于100mL的H₂O中得5mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液，将其加入到混合溶液中，再以0.1mol/L的HCl溶液调节混合液pH值至7.0；搅拌24小时，室温下用10-30mL的乙醇洗涤，真空干燥箱中干燥12小时，得聚多巴胺包裹的Fe₃O₄（PDAFe₃O₄）；其中Fe₃O₄：多巴胺的质量比为1:2；

（3）将5mg/mL的辣根过氧化物酶（HRP）溶液、10mg/mL的葡萄糖氧化酶（GOD）溶液、1mg上述聚多巴胺包裹的Fe₃O₄、2mg的多巴胺和适量的水混合均匀，反应10小时，超纯水超声洗涤，外磁场分离酶基磁性纳米粒，即可；混合后，辣根过氧化物酶的浓度为0.05mg/mL，葡萄糖氧化酶（GOD）的浓度为0.1mg/mL，聚多巴胺包裹的Fe₃O₄的浓度为2.5mg/mL，多巴胺的浓度为5mg/mL，所述的浓度为溶质质量与溶剂体积的比。

实施例6

（1）Fe₃O₄磁性纳米粒的制备：取FeCl₃·6H₂O，无水醋酸钠，1.0g聚乙烯二醇置于乙二醇溶液中，剧烈搅拌30分钟后转入高压反应釜内，在200℃的烘箱中反应8小时，冷却至室温。最后将合成的产物用乙醇洗涤后，放于真空干燥箱中干燥6小时；

（2）聚多巴胺（PDA）包裹Fe₃O₄的制备：将Fe₃O₄磁性纳米粒和多巴胺（DA）溶于水中得混合液，混合液中多巴胺的浓度为0.5mg/mL，所述百分比为多巴胺的质量与水的体积比；将60mg三羟甲基氨基甲烷固体溶于100mL的H₂O中得5mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液，将其加入到混合溶液中，再以0.1mol/L的HCl溶液调节混合液pH值至7.0；搅拌48小时，室温下用10-50mL的水洗涤，真空干燥箱中干燥3小时，得聚多巴胺包裹的Fe₃O₄（PDAFe₃O₄）；其中Fe₃O₄：多巴胺的质量比为1:2；

（3）将10mg/mL的辣根过氧化物酶（HRP）溶液、10mg/mL的葡萄糖氧化酶（GOD）溶液、50mg上述聚多巴胺包裹的Fe₃O₄、5mg的多巴胺和适量的水混合均匀，反应10小时，乙醇超声洗涤，外磁场分离酶基磁性纳米粒，即可；混合后，辣根过氧化物酶的浓度为0.2mg/mL，葡萄糖氧化酶的浓度为0.1mg/mL，聚多巴胺包裹的Fe₃O₄的浓度为25mg/mL，多巴胺的浓度为5mg/mL，所述的浓度为溶质质量与溶剂体积的比。

实施例7

（1）Fe₃O₄磁性纳米粒的制备：取FeCl₃·6H₂O，无水醋酸钠，1.0g聚乙烯二醇置于乙二醇溶液中，剧烈搅拌30分钟后转入高压反应釜内，在200℃的烘箱中反应8小时，冷却至室温。最后将合成的产物用乙醇洗涤后，放于真空干燥箱中干燥6小时；

（2）聚多巴胺（PDA）包裹Fe₃O₄的制备：将Fe₃O₄磁性纳米粒和多巴胺（DA）溶于水中得混合液，混合液中多巴胺的浓度为0.5mg/mL，所述百分比为多巴胺的质量与水的体积比；将60mg三羟甲基氨基甲烷固体溶于100mL的H₂O中得5mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液，将其加入到混合溶液中，再以0.1mol/L的HCl溶液调节混合液pH值至7.0；搅拌48小时，室温下用10-50mL的水洗涤，真空干燥箱中干燥3小时，得聚多巴胺包裹的Fe₃O₄（PDAFe₃O₄）；

（3）将10mg/mL的辣根过氧化物酶（HRP）溶液、10mg/mL的葡萄糖氧化酶（GOD）溶液、50mg上述聚多巴胺包裹的Fe₃O₄、5mg的多巴胺和适量的水混合均匀，反应10小时，乙醇超声洗涤，外磁场分离酶基磁性纳米粒，即可；混合后，辣根过氧化物酶的浓度为0.2mg/mL，葡萄糖氧化酶的浓度为0.1mg/mL，聚多巴胺包裹的Fe₃O₄的浓度为25mg/mL，多巴胺的浓度为5mg/mL，所述的浓度为溶质质量与溶剂体积的比。

实施例8

葡萄糖溶液的检测方法，其步骤包括：

（1）标准曲线的制备：

①取十份已知浓度的葡萄糖溶液（浓度为C1-C10）作为标准样品，将其与50μL的酶基磁性纳米粒溶液（其中含酶基磁性纳米粒0.1667mg）混合均匀，加入2,2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐（ABTs），利用3mL的pH5.0缓冲溶液调节pH，40℃条件下反应十分钟；C1-C10的浓度分别为0.6667mmol/L、1mmol/L、1.3333mmol/L、1.6667mmol/L、2mmol/L、2.3333mmol/L、2.6667mmol/L、3.3333mmol/L、4mmol/L和5mmol/L；

②用外磁场分离酶基磁性纳米粒，取上清液，用紫外分光光度计在418nm处测定其吸光度，分别记作A1-A10；A1-A10的值分别为：0.226、0.382、0.543、0.712、0.892、1.036、1.138、1.371、1.654和2.011；

③根据C1-C10和A1-A10绘制标准曲线；

标准曲线的测定结果如图4所示，其标准曲线方程为：

Y=0.01151+0.41041X；（标准偏差R=0.9967）

（2）葡萄糖溶液的测定：

①将酶基磁性纳米粒与待测葡萄糖混合均匀，加入2,2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐（ABTs），利用3mL的pH5.0缓冲溶液调节pH，40℃条件下反应十分钟；其中，酶基磁性纳米粒溶液的体积为50μL（其中含酶基磁性纳米粒0.167mg）；2,2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐（ABTs）的浓度为0.05mol/L，体积为50μL；

②用外磁场分离酶基磁性纳米粒，取上清液，用紫外分光光度计在418nm处测定吸光度；

③根据测定的吸光度，利用标准曲线，计算其浓度。

本实施例中，测得的吸光度为0.43，计算得到的葡萄糖溶液的浓度为1.02mmol/L。

对比例1

步骤（3）中，不加入多巴胺，其余步骤同实施例1。

用该方法制得的酶基磁性纳米粒检测葡萄糖溶液，没有显色反应。

该实施例中，磁性酶没有被包埋固定，因此无法制得酶基磁性纳米粒，也无法检测出葡萄糖。

对比例2

步骤（3）中，反应时间为0.5小时，其余步骤同实施例1。

用该方法制得的酶基磁性纳米粒检测葡萄糖溶液，没有显色反应。

该实施例中，磁性酶没有被稳定的固定。反应时间短多巴胺没有发生聚合，即没有实现对酶的包埋固定。

效果实施例1

葡萄糖溶液浓度测量的再现性的研究

平行取五份50μL的酶基磁性纳米粒溶液（其中含酶基磁性纳米粒0.167mg）加入到3mL的pH5.0的磷酸盐缓冲溶液中，再分别加入50μL的0.1mol/L的葡萄糖，和50μL的0.05mol/L的2,2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐（ABTs）混合均匀，20℃条件下反应10分钟后，分离提取上清液，在418nm处测定其吸光度，用以评价体系的精密度。

测量结果如图5所示，标准偏差为0.000134，相对标准偏差0.0003258，实验结果表明该体系有良好的重现性。

效果实施例2

辣根过氧化物酶（HRP）和葡萄糖氧化酶（GOD）的质量比研究

按照辣根过氧化物酶（HRP）：葡萄糖氧化酶（GOD）的质量比1:1、1:2和2:1分别制备酶基磁性纳米粒，与葡萄糖溶液混合，加入显色剂（2,2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐），反应，并测定吸光度，其中，测定条件为：葡萄糖浓度为1mmol/L，ABTs浓度为0.1mmol/L，反应温度为20℃，pH为5.0，反应时间20分钟。

测量结果如图6-8所示，其中，图6为辣根过氧化物酶（HRP）：葡萄糖氧化酶（GOD）的质量比为1:1条件下的测量结果；图7为辣根过氧化物酶（HRP）：葡萄糖氧化酶（GOD）的质量比为1:2条件下的测量结果；图8为辣根过氧化物酶（HRP）：葡萄糖氧化酶（GOD）的质量比为2:1条件下的测量结果；由图6-8可知，辣根过氧化物酶（HRP）：葡萄糖氧化酶（GOD）的质量比在本发明限定的范围内，都能很好的测定葡萄糖溶液的吸光度。

效果实施例3

葡萄糖溶液浓度测量的温度研究

分别取50μL的酶基磁性纳米粒溶液（其中含酶基磁性纳米粒0.167mg）中加入恒定浓度葡萄糖溶液和恒定过量浓度ABTs溶液，测量条件如下所示：HRP:GOD=2:1，葡萄糖浓度为1mmol/L，ABTs浓度0.1mmol/L，pH为5.0；反应10分钟，测量不同温度（10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃）对测量结果的影响。

测量结果如图9所示，在温度为10-40℃范围内，本发明的酶基磁性纳米粒均能够精确测量葡萄糖溶液的浓度。

效果实施例4

酶基磁性纳米粒的重复使用

将50μL的酶基磁性纳米粒溶液（其中含酶基磁性纳米粒0.167mg）与50μL的0.1mol/L的葡萄糖混合，在pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入50μL的0.05mol/L的2,2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐（ABTs），20℃条件反应10分钟，测量体系的吸光度，外磁场分离酶基磁性纳米粒，3mL的水洗涤酶基磁性纳米粒，重复上述操作过程。

重复回收的酶基磁性纳米粒测量葡萄糖溶液的结果如图10所示：酶基磁性纳米粒重复使用十次后，仍有很好的测量效果，本发明的酶基磁性纳米粒能够重复使用，至少十次以上。

效果实施例5

酶基磁性纳米粒的保存

本发明的酶基磁性纳米粒的保存方法近似于固体粉末酶的保存方法，在冰箱的冷冻柜（-20℃）中保存1个月，其活性没有显著改变。

效果实施例6

多次使用的酶基磁性纳米粒的再处理和重复使用

多次使用的酶基磁性纳米粒用强磁铁收集后置于坩埚中，在马弗炉中于600℃处理1小时，得到的磁性颗粒可以重复使用。

Claims (10)

1.一种酶基磁性纳米粒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：

（1）将Fe₃O₄磁性纳米粒、多巴胺和水混合均匀得混合液A，加入碱性缓冲体系，得反应液，搅拌8-48小时，得聚多巴胺包裹的Fe₃O₄；其中Fe₃O₄磁性纳米粒：多巴胺的质量比为（1:1）-（1:4）；

（2）将辣根过氧化物酶溶液、葡萄糖氧化酶溶液、所述的聚多巴胺包裹的Fe₃O₄和多巴胺混合均匀，得混合液B，反应5-25小时，即可；其中，所述的混合液B中，所述的辣根过氧化物酶和所述的葡萄糖氧化酶的浓度均为0.025mg/mL-0.2mg/mL，所述的聚多巴胺包裹的Fe₃O₄的浓度为0.5mg/mL-25mg/mL，所述的多巴胺的浓度为1mg/mL-5mg/mL。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的Fe₃O₄磁性纳米颗粒与所述的多巴胺的质量比为1:2；

步骤（1）中，所述的混合液A中所述的多巴胺的浓度为0.5-1.0mg/mL；

步骤（1）中，所述的加入碱性缓冲体系的方法为下述方式的任一种：

方式一：加入缓冲液，所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液；所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.025-0.075mmol/L，所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的pH值较佳的为7.0-9.5；

方式二：加入三羟甲基氨基甲烷溶液，再加入HCl溶液调节pH至7.0-9.5；所述的三羟甲基氨基甲烷溶液的浓度较佳的为5mmol/L，所述的HCl溶液的浓度较佳的为0.1mol/L；

步骤（1）中，所述的搅拌的时间为24小时；

步骤（1）中，所述的搅拌之后进行冷却、洗涤和干燥，再进行下一步操作；所述的冷却的温度较佳的为10℃-40℃，更佳的为20℃-30℃；所述的洗涤较佳的为使用乙醇和/或水洗涤，其中，所述的水的用量较佳的为10mL-50mL，所述的乙醇的用量较佳的为10mL-30mL；所述的干燥较佳的为在真空干燥箱中，所述的干燥的时间较佳的为3-12小时，更佳的为6小时。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的辣根过氧化物酶与所述的葡萄糖氧化酶的质量比为（1:2）-（2:1），较佳的为2:1；

步骤（2）中，所述的混合时加入水混合；

步骤（2）中，所述的混合液B中，所述的辣根过氧化物酶溶液的浓度为5mg/mL-10mg/mL；

步骤（2）中，所述的混合液B中，所述的葡萄糖氧化酶溶液的浓度为5mg/mL-10mg/mL；

步骤（2）中，所述的反应的时间为10小时。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的反应液的体积为100mL；步骤（2）中，所述的聚多巴胺包裹的Fe₃O₄的添加量为1-50mg，较佳的为10mg；步骤（2）中，水的添加量为2mL；步骤（2）中，所述的三羟甲基氨基甲烷添加量为30-80mg，较佳的为60mg；步骤（2）中，所述的多巴胺的添加量为2-10mg，较佳的为5mg。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的反应后，洗涤并分离；其中，所述的洗涤的方法的较佳的为使用乙醇和/或超纯水、通过超声洗涤；所述的分离方法较佳的为使用外磁场分离酶基磁性纳米粒；

所述的酶基磁性纳米粒的保存方法为以下方式中的任一种：

方式一：短期保存方法；将酶基磁性纳米粒与去离子水混合均匀，得酶基磁性纳米粒的混合液，该混合液在4℃条件下保存；

方式二：长期保存方法；将方法（1）中的酶基磁性纳米粒的混合液干燥，得到酶基磁性纳米粒，并在-20℃条件下保存。

6.如权利要求1-5中任一项所述的制备方法制得的酶基磁性纳米粒。

7.如权利要求6所述的酶基磁性纳米粒在葡萄糖的检测方法中的应用。

8.一种葡萄糖的检测方法，其特征在于：所述的检测方法为：将如权利要求6所述的酶基磁性纳米粒、待测葡萄糖溶液和显色剂混合均匀，反应，外磁场分离酶基磁性纳米粒，按标准曲线法测定，即可。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述的标准曲线法测定的方法为：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，分别测定吸光度，用吸光度对样品浓度绘制标准曲线，再根据待测葡萄糖溶液的吸光度计算待测葡萄糖溶液的浓度；

所述的吸光度的测定方法使用紫外分光光度计进行；所述的吸光度的测定波长较佳的为390-600nm，更佳的为418nm。

10.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述的葡萄糖溶液的浓度的范围为0.6667-5mmol/L；

所述的显色剂为2,2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐；所述的2,2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐的添加量较佳的为每克酶基磁性纳米粒添加15μmol的2,2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐，所述的2,2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐的浓度较佳的为0.1mmol/L；

所述的待测葡萄糖溶液的pH值为pH=3-6，较佳的为pH=5；

所述的待测葡萄糖溶液的温度为10-60℃，较佳的为40℃。

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