CN115093017B - 双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法及其应用 - Google Patents

双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明适用于污水处理技术领域，提供了双酶‑无机杂化纳米花微球的制备方法及其应用，本发明制备的简称HRP/GOD纳米花微球不仅能保持良好的活性，而且具有较好的稳定性和环境耐受性，在储存60天以及重复降解吖啶10次后均保留较高的催化活性；本发明的操作方法简单、成本低、绿色环保，且对吖啶的降解效果明显，具有很好的经济前景和实用价值；HRP/GOD纳米花微球生物催化剂相较于单独使用HRP/GOD双酶‑无机杂化纳米花或者共固定化HRP/GOD双酶的微球表现出更大的比表面积，更高的机械强度，更好的催化活性，更强的稳定性、重复使用性和储存稳定性，具有较高的实际应用价值。

Description

双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于污水处理技术领域，尤其涉及双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法及其应用。
背景技术
吖啶属于含氮杂环化合物，广泛存在于各类工业废水中，具有致癌、致畸、致突变的性质，且吖啶浓度高、毒性强、在自然条件下难以降解，对人体和环境都有潜在的危害。由于吖啶的难降解性，目前对其降解的方法鲜有报道。研究发现，辣根过氧化物酶(HRP)在氧化还原介质存在的情况下，能显著提高HRP作用的底物范围，使之广泛应用于芳香族和杂环类化合物的降解。
然而，由于HRP的价格昂贵、水溶性强、不易与底物和产物分离，且对所处环境十分敏感，所以将游离酶直接用于废水处理，不仅会造成极大的浪费，而且游离酶容易变性失活，这些问题都严重限制了酶的实际应用。固定化酶技术是解决这个问题最有效的方法，对酶进行固定化处理不仅可以保持酶特有的催化作用，提高其稳定性，而且能够将其进行回收处理和重复利用，因此，制备高效固定化酶对生物催化领域迅速发展具有重大意义。
随着酶催化技术和纳米科学的快速发展，嵌入酶的纳米材料因其特殊的功能和结构而被广泛用于酶固定化的载体。其中酶-无机杂化纳米花就是最典型的实例。纳米花的形成是基于蛋白分子、金属离子和磷酸盐的结合。与传统固定化酶相比，纳米花合成方法简单，且具有更高的活性和稳定性，这是因为它们具有更大的表面积，并且酶分子有效地限制在其内部。另外，铜离子与酶的配位作用也能将酶较好的固定在纳米花结构中。
鉴于许多多步反应或级联过程需要两种或两种以上酶的催化，所以双酶或多酶共嵌入纳米材料最近一直受到关注。将固定化HRP应用于工业存在的一大挑战是HRP必须在H2O2存在的条件下才能降解污染物，H2O2是一种难以处理和存储的腐蚀性试剂，过量的H2O2会导致HRP生物催化剂失活，从而导致催化效率显著降低。为解决这一问题本申请尝试使用双酶催化的级联反应。双酶共固定化的主要优点是，在一个反应容器中可以同时进行两个酶的催化反应，反应的过程中不需要对中间产物进行分离便可直接获得最终的目标产物，这不仅节省了资源、试剂和时间，而且避免了中间产物对反应的不利影响，促进反应的正向进行。与传统的单酶共固定化相比，双酶级联反应通过节省操作步骤和资源来提高合成效率降低生产成本。
然而，尽管与溶液中的游离酶相比，双酶-无机杂化纳米花生物催化剂表现出更好的活性和更强的稳定性，但是纳米花生物催化剂的致命缺点是机械强度差，可重复利用性差，这是因为其花状结构复杂，是由许多分层形状的花瓣组成，在回收过程的离心步骤中容易破碎；而且纳米花的尺寸太小，在重复使用过程中，容易收集不完全，或者在离心过程中造成损失等，这些严重限制了纳米花在工业上的应用。为了解决这些问题，制备一种具有较高机械强度，易于回收且可重复使用的新型纳米花生物催化剂是非常必要的。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法及其应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1：制备纤维素-壳聚糖复合微球：
将10mL离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐置于三口瓶中，加入0.2-0.4g纤维素和0.2-0.4g壳聚糖，剧烈搅拌后加热，直至纤维素和壳聚糖完全溶解，停止加热，获得澄清胶状溶液，溶液冷却至室温后，用含有25-30号针头的蠕动泵逐滴加入蒸馏水中，得到纤维素-壳聚糖复合微球，静置0.5-2h使之硬化，并以蒸馏水洗涤2-3次，去除多余离子液体；
步骤S2：制备多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球：
在锥形瓶中依次加入1g纤维素-壳聚糖复合微球和10-20mg多巴胺，再加入10mLTris-Hcl缓冲溶液，放置于恒温空气振荡器中反应2-3h，过滤分离微球并用去离子水洗涤2-3次，得到多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球；
步骤S3：制备多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球共固定化HRP/GOD双酶-无机杂化纳米花生物催化剂：
在锥形瓶中加入1g多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球和10mL的0.1MCuSO4溶液，放置于恒温空气振荡器中反应8-12h，过滤分离微球并用蒸馏水洗涤2-3次，除去微球表面未吸附的Cu2+；
将1g吸附有Cu2+的多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球置于锥形瓶中，再加入5-7mgHRP，3-5mgGOD和10mLPBS缓冲溶液，摇晃均匀后，放置于0-5℃的温度下静置72h，过滤分离微球并用PBS缓冲溶液洗涤2-3次，得到多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球共固定化HRP/GOD双酶-无机杂化纳米花生物催化剂，记为HRP/GOD双酶-无机杂化纳米花微球生物催化剂，简称HRP/GOD纳米花微球。
进一步的，所述步骤S1中，搅拌速度为800-1000r/min，加热至80-100℃，反应2-3h，直至纤维素和壳聚糖完全溶解，停止加热，获得4-8wt％的澄清胶状溶液。
进一步的，所述步骤S2中，Tris-Hcl缓冲溶液的浓度为0.01-0.02M，pH为8.0-9.0。
进一步的，所述步骤S3中，PBS缓冲溶液的浓度为0.1-0.2M，pH为7.4。
进一步的，所述恒温空气振荡器的温度为20-30℃，转速为150-200r/min。
进一步的，所述三口瓶和锥形瓶的容量均为25-50mL。
进一步的，测定所述生物催化剂降解吖啶效率的具体操作为：
配制5-15mg/L，pH为7.0的吖啶模拟废水，取10mL模拟废水加入到25mL的三角瓶中，向三角瓶中加入一定量的葡萄糖和1-羟基苯并三唑，在20-30℃，150-200r/min的反应条件下，用1gHRP/GOD纳米花微球降解吖啶，直至用高效液相色谱检测到剩余吖啶含量几乎为零，过滤分离生物催化剂HRP/GOD纳米花微球。
进一步的，所述检测条件为：流动相甲醇：水＝8：2；检测波长为250nm；流速为1-2mL/min；进样量为10-20μL。
进一步的，所述吖啶的降解率计算公式如下：
D(％)＝[(C0-Ct)/C0]×100
其中，C0为吖啶的初始浓度，Ct为降解后吖啶的浓度。
双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法制备的双酶-无机杂化纳米花微球在污水处理中的应用。
进一步的，
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明采用多巴胺改性的纤维素-壳聚糖复合微球作为载体，通过在微球表面浓缩吸附Cu2+，形成纳米花生长所必需的成核位点，诱导双酶-磷酸铜杂化纳米花原位生长在微球表面，形成HRP/GOD-Cu3(PO4)2杂化纳米花微球(简称HRP/GOD纳米花微球)；该微球不仅能保持良好的活性，而且具有较好的稳定性和环境耐受性，在广泛的酸碱、温度范围内表现出最佳活性；该微球通过简单的过滤就可以回收使用，在十次循环使用后，其催化活性依然保持在一个较高的水平；此外，该催化剂可以应用于废水中吖啶的高效降解，在废水处理领域表现出潜在的应用价值。
2、本发明的操作方法简单、成本低、绿色环保，且对吖啶的降解效果明显，具有很好的经济前景和实用价值。
附图说明
图1为本发明中Cu3(PO4)2晶体和HRP/GODNFS的红外吸收光谱(FT-IR)图。
图2为本发明中Cu3(PO4)2晶体和HRP/GODNFS的X-射线粉末衍射(XRD)图。
图3为本发明中不同浓度酶形成纳米花的扫描电镜(SEM)图。
图4为本发明中不同时间形成纳米花的扫描电镜(SEM)图。
图5为本发明中HRP/GOD纳米花微球的扫描电镜(SEM)图和透射电镜(TEM)图。
图6为本发明中HRP/GOD纳米花微球的能谱(EDX)分析图。
图7为本发明中HRP/GOD纳米花微球的热重(TGA)分析图。
图8为本发明中不同温度下HRP/GOD纳米花微球(a)、游离HRP/GOD(b)对吖啶的降解率结果图。
图9为本发明中不同催化剂降解吖啶的重复使用性对比图。
图10为本发明中不同催化剂降解吖啶的储存稳定性对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
本发明一个实施例提供的双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1：制备纤维素-壳聚糖复合微球：
将10mL离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐([Emim][OAc])置于25-50mL三口瓶中，加入0.2-0.4g纤维素和0.2-0.4g壳聚糖，以800-1000r/min的转速剧烈搅拌后，于80-100℃反应2-3h，直至纤维素、壳聚糖完全溶解，停止加热，获得4-8wt％的澄清胶状溶液，溶液冷却至室温后，用含有25-30号针头的蠕动泵逐滴加入蒸馏水中，得到纤维素-壳聚糖复合微球，静置0.5-2h使之硬化，并以蒸馏水洗涤2-3次，去除多余离子液体；
步骤S2：制备多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球：
在25-50mL锥形瓶中依次加入1g纤维素-壳聚糖复合微球(湿重)和10-20mg多巴胺，再加入10mLTris-Hcl缓冲溶液，Tris-Hcl缓冲溶液的浓度为0.01-0.02M，pH为8.0-9.0，放置于温度为20-30℃，转速为150-200r/min的恒温空气振荡器中反应2-3h，过滤分离微球并用去离子水洗涤2-3次，得到多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球；
步骤S3：制备多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球共固定化HRP/GOD双酶-无机杂化纳米花生物催化剂：
在25-50mL锥形瓶中加入1g多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球(湿重)和10mL浓度为0.1M的CuSO4溶液，放置于温度为20-30℃，转速为150-200r/min的恒温空气振荡器中反应8-12h，过滤分离微球并用蒸馏水洗涤2-3次，除去微球表面未吸附的Cu2+；
将1g吸附有Cu2+的多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球(湿重)置于25-50mL锥形瓶中，再加入5-7mgHRP，3-5mgGOD和10mLPBS缓冲溶液，PBS缓冲溶液的浓度为0.1-0.2M，pH为7.4，摇晃均匀后，放置于0-5℃的温度下静置72h，过滤分离微球并用pH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤2-3次，得到多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球共固定化HRP/GOD双酶-无机杂化纳米花生物催化剂，记为HRP/GOD双酶-无机杂化纳米花微球生物催化剂，简称HRP/GOD纳米花微球(HRP/GODNFSbeads)。
作为对比，将0.05-0.1mL，浓度为100-120mM的CuSO4溶液缓慢滴加到含有5-7mgHRP，3-5mgGOD和10mLPBS缓冲溶液，PBS缓冲溶液的浓度为0.1-0.2M，pH为7.4，摇晃均匀后，放置于0-5℃的温度下静置72h，以8000-10000r/min的转速离心5-8min后分离沉淀，并用pH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤2-3次，再次高速离心后冷冻干燥，得到HRP/GOD双酶-无机杂化纳米花蓝色粉末，记为HRP/GOD双酶-无机杂化纳米花生物催化剂，简称HRP/GOD纳米花(HRP/GODNFS)。
作为本发明的一种优选实施例，测定所述生物催化剂降解吖啶效率的具体操作为：
配制5-15mg/L，pH为7.0的吖啶模拟废水，取10mL模拟废水加入到25mL的三角瓶中，向三角瓶中加入一定量的葡萄糖(Glu)和1-羟基苯并三唑(HBT)，在20-30℃，150-200r/min的反应条件下，用1gHRP/GOD纳米花微球(湿重)降解吖啶，直至用高效液相色谱检测到剩余吖啶含量几乎为零，过滤分离生物催化剂HRP/GOD纳米花微球。(在注入色谱柱之前，样品用0.45μm注射器过滤器过滤)
作为本发明的一种优选实施例，所述检测条件为：流动相甲醇：水＝8：2；检测波长为250nm；流速为1-2mL/min；进样量为10-20μL。
作为本发明的一种优选实施例，所述吖啶的降解率计算公式如下：
D(％)＝[(C0-Ct)/C0]×100
其中，C0为吖啶的初始浓度，Ct为降解后吖啶的浓度。
作为本发明的一种优选实施例，双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法制备的双酶-无机杂化纳米花微球在污水处理中的应用。
结果与分析
从图1中可以看出，HRP/GODNFS主要由Cu3(PO4)2晶体和HRP/GOD双酶组成。如图所示，在波数为562cm-1、628cm-1和862cm-1处为磷酸基团中的O＝P-O峰，在1050cm-1处和1305cm-1处是由P-O和P＝O的振动造成的，这表明Cu3(PO4)2晶体和HRP/GODNFS中都有磷酸基团的存在。与Cu3(PO4)2的图谱相比，在HRP/GODNFS的图谱中观察到了HRP/GOD酶蛋白的典型波段，即在1400-1600cm-1处的-CONH，以及在2800-3000cm-1处的CH2和-CH3。此外，在HRP/GODNFS的图谱中未出现新的吸收峰和明显的峰偏移，表明HRP/GOD双酶主要是通过自组装作用形成纳米花。
从图2中可以看出，Cu3(PO4)2和HRP/GODNFS的所有衍射峰的位置都与JCPDScard(00-022-0548)所展示的衍射峰相一致，表明了本实验制备的HRP/GODNFS主要由Cu3(PO4)2晶体组成，同时证明了HRP/GODNFS的制备过程未对Cu3(PO4)2的晶型造成明显影响。其中，Cu3(PO4)2图谱中所有的峰都低于NFS图谱中对应的峰，这表明，加入HRP/GOD双酶后HRP/GODNFS的结晶度更高。
从图3中可以看出，在不添加酶的情况下(0mg/mL)观察到无定形的片状磷酸铜晶体结构，没有组装成完整的纳米花；当添加双酶后(0.2mg/mL)出现初级花状结构，此时形成的花状结构较少，并且由于空间结构比较充足所以形成的类似花瓣的片状结构伸展较为完全，比表面积较大，表现为整体形状较大，结构蓬松，晶片结构较大并且较薄；随着双酶浓度不断增加(0.4-0.8mg/mL)，纳米花的成核位点增多，导致形成的纳米花数量逐渐增多，而且纳米花结构越来越致密；当酶浓度增加到1.0mg/mL以上时，纳米花花瓣开始变厚且结构变得致密，比表面积减小；当酶浓度增加到1.4mg/mL后形成了类似球形的花状结构，花瓣伸展程度较小，此时双酶的负载率和纳米花的比表面积都大大缩小。
从图4中可以看出，在早期生长阶段(24h)，只有少量的酶参与组装，并且较短的固定化时间会使纳米花不稳定，所以此阶段主要形成大量Cu3(PO4)2的初生晶体和少量的不完整的纳米花形态。随着生长时间增加(36h)，双酶主链中酰胺基团与Cu2+配位形成复合物，这些配合物为初生晶体的成核提供了位置，所以无定形的晶体物质消失，形成了比较明显的纳米花结构，此时因为纳米花形成不完全，所以虽然有团聚现象，但花型不规整，花瓣分布比较松散。当生长时间增加到48h时，有更多的酶参与组装，双酶-Cu2+配合物提供更多的成核位点，使得Cu3(PO4)2·3H2O晶体组装形成花状结构。此时依然由于纳米花形成不完全，所以花型虽然规整，但花瓣比较破碎。随着培养时间继续增加(60h)，逐渐形成了较为密集完整的花瓣。当培养时间达到72h时，纳米花的自组装过程基本完成，各向异性生长导致完全形成花状球形结构，此时花状球形结构，花瓣伸展完全，可以明显地观察到多层花状结构。当培养时间达到84h时，花状结构越来越致密，表现出类似球形的纳米花形貌，此时，纳米花的表面积大大减小。
从图5中可以看出，图5a表明纳米花微球呈较规则球形，微球的直径约为2mm，这有利于操作过程中与反应体系的分离；图5b表明纳米花微球表面附着生长着大量的纳米花，这大大增加了纳米花微球的表面积和体积，使其能负载更多的双酶分子；图5c可以观察到微球表面HRP/GODNFS是由许多的纳米花瓣组成，同时在图5d中可以清楚地观察到凸起的层状晶体。
从图6中可以看出，纳米花微球中包含C、N、O、P、Cu、Fe、Ca七种元素，其中C、N、Fe元素为HRP提供，C、N、Ca元素为GOD提供，C、N、O元素为纤维素-壳聚糖复合微球提供，而Cu、P、O为磷酸铜提供，这表明纳米花微球是由分散在HRP/GOD双酶组分中的非晶态Cu3(PO4)2晶体的聚集体负载微球表面形成。同时从图中可以看出，各元素在纳米花微球表面分布均匀。
从图7中可以看出，随着温度不断上升，HRP/GOD纳米花微球的相对重量先小幅度升高，然后不断地减少，在200℃时的失重率约为1％，这个过程主要是由HRP/GOD纳米花微球中自由水的损失引起的。随着温度不断地上升，HRP/GOD纳米花微球在650℃时达到了恒定的重量，这个阶段的相对重量的减少是由酶的损失引起的。因此HRP/GOD纳米花微球中酶的质量比约为20wt％，这也证明了纤维素-壳聚糖复合微球、Cu3(PO4)2与HRP/GOD双酶的高度杂化。
从图8中可以看出，如图8(A)所示，曲线a、b对应的曲线分别为不同温度下HRP/GOD纳米花微球、游离HRP/GOD对吖啶的降解率。如图8(B)所示，曲线a、b对应的曲线分别为不同pH下HRP/GOD纳米花微球、游离HRP/GOD对吖啶的降解率。从图中可以看出，相较于游离HRP/GOD，HRP/GOD纳米花微球具有较好的耐温度、耐酸碱稳定性。这是由于HRP/GOD纳米花微球的结构对于双酶有一定的构象限制和保护作用，这一定程度上减少了双酶的变性以及自溶现象，使其具有较好的稳定性。
从图9中可以看出，相较于其他两种催化剂，HRP/GOD纳米花微球具有较好的重复使用性。其中，纳米花在进行4次重复降解实验之后其降解率可以维持在初始降解率的60％以上，但是在进行10次重复降解实验之后其降解率几乎消失。这是因为HRP/GOD纳米花具有较大比表面积，且双酶与纳米花的刚性结合减少了酶在重复使用过程中的构象变化，因而初期HRP/GOD纳米花具有良好的重复使用性能。然而由于纳米花的尺寸太小，导致离心过程中酶容易流失脱落，且部分纳米花在与底物的反应中发生变形和失活，这都使后期HRP/GOD纳米花的重复使用性能大大降低。相较于HRP/GOD纳米花，HRP/GOD固定化微球的重复使用性有所提高，这是由于微球容易从反应体系中分离出来，且HRP/GOD双酶通过共价结合稳固的连接在微球表面。然而，相较于HRP/GOD固定化微球，HRP/GOD纳米花微球具有更好的重复使用性，在进行10次重复降解实验之后其降解率可以维持在初始降解率的69％以上，这是因为纳米花微球不仅具有纳米花比表面积大，刚性结合酶的优势，而且具有微球机械强度好，易于分离等优势。
从图10中可以看出，相较于其他三种催化剂，HRP/GOD纳米花微球具有较好的储存稳定性，在储存60天后其对吖啶的降解率可以维持在初始降解率的94％以上。这是由于纳米花微球的结构对于酶的构象限制和保护作用，减少了酶的变性以及自溶现象，而且以微球为载体支撑可避免纳米花颗粒的团聚现象，微球的三维结构还可以为酶与底物的接触提供了更多的空间和活性位点，这些都可以有效提高酶的储存稳定性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (10)

1.双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：制备纤维素-壳聚糖复合微球：
将10mL离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐置于三口瓶中，加入0.2-0.4g纤维素和0.2-0.4g壳聚糖，剧烈搅拌后加热，直至纤维素和壳聚糖完全溶解，停止加热，获得澄清胶状溶液，溶液冷却至室温后，用含有25-30号针头的蠕动泵逐滴加入蒸馏水中，得到纤维素-壳聚糖复合微球，静置0.5-2h使之硬化，并以蒸馏水洗涤2-3次，去除多余离子液体；
步骤S2：制备多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球：
在锥形瓶中依次加入1g纤维素-壳聚糖复合微球和10-20mg多巴胺，再加入10mLTris-Hcl缓冲溶液，放置于恒温空气振荡器中反应2-3h，过滤分离微球并用去离子水洗涤2-3次，得到多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球；
步骤S3：制备多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球共固定化HRP/GOD双酶-无机杂化纳米花生物催化剂：
在锥形瓶中加入1g多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球和10mL的0.1M CuSO4溶液，放置于恒温空气振荡器中反应8-12h，过滤分离微球并用蒸馏水洗涤2-3次，除去微球表面未吸附的Cu2+；
将1g吸附有Cu2+的多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球置于锥形瓶中，再加入5-7mgHRP，3-5mgGOD和10mLPBS缓冲溶液，摇晃均匀后，放置于0-5℃的温度下静置72h，过滤分离微球并用PBS缓冲溶液洗涤2-3次，得到多巴胺改性纤维素-壳聚糖复合微球共固定化HRP/GOD双酶-无机杂化纳米花生物催化剂，记为HRP/GOD双酶-无机杂化纳米花微球生物催化剂，简称HRP/GOD纳米花微球。
2.根据权利要求1所述的双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，搅拌速度为800-1000r/min，加热至80-100℃，反应2-3h，直至纤维素和壳聚糖完全溶解，停止加热，获得4-8wt％的澄清胶状溶液。
3.根据权利要求1所述的双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，Tris-Hcl缓冲溶液的浓度为0.01-0.02M，pH为8.0-9.0。
4.根据权利要求1所述的双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，PBS缓冲溶液的浓度为0.1-0.2M，pH为7.4。
5.根据权利要求1所述的双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法，其特征在于，所述恒温空气振荡器的温度为20-30℃，转速为150-200r/min。
6.根据权利要求1所述的双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法，其特征在于，所述三口瓶和锥形瓶的容量均为25-50mL。
7.根据权利要求1所述的双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法，其特征在于，测定所述生物催化剂降解吖啶效率的具体操作为：
配制5-15mg/L，pH为7.0的吖啶模拟废水，取10mL模拟废水加入到25mL的三角瓶中，向三角瓶中加入一定量的葡萄糖和1-羟基苯并三唑，在20-30℃，150-200r/min的反应条件下，用1gHRP/GOD纳米花微球降解吖啶，直至用高效液相色谱检测到剩余吖啶含量几乎为零，过滤分离生物催化剂HRP/GOD纳米花微球。
8.根据权利要求7所述的双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法，其特征在于，所述检测条件为：流动相甲醇：水＝8：2；检测波长为250nm；流速为1-2mL/min；进样量为10-20μL。
9.根据权利要求7所述的双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法，其特征在于，所述吖啶的降解率计算公式如下：
D(％)＝[(C0-Ct)/C0]×100
其中，C0为吖啶的初始浓度，Ct为降解后吖啶的浓度。
10.根据权利要求1-9任一所述的双酶-无机杂化纳米花微球的制备方法制备的双酶-无机杂化纳米花微球在污水处理中的应用。
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