CN110656104B - 一种GA@GOx杂化纳米花及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种GA@GOx杂化纳米花及其制备方法和应用。本发明将GOx、GA两种酶顺序固定化到杂化纳米花中，首先将CuSO4溶液和含有GOx的磷酸缓冲溶液在一定温度下孵育制备得到GOx杂化纳米花，再将GOx杂化纳米花和含GA的去离子水一同孵育制备GA@GOx杂化纳米花；并将得到的杂化纳米花用于降解可溶性淀粉转化为葡萄糖酸，GOx、GA被固定化成多酶纳米花后催化活性得到了明显的提升，以及在不同条件下的稳定性也得到了明显的改善。

Description

一种GA@GOx杂化纳米花及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种GA@GOx杂化纳米花及其制备方法和应用。
背景技术
葡萄糖酸作为一种有机酸，具有优异的物理化学特性，目前已被广泛的应用于制药、食品、皮革、纺织品中。葡萄糖酸的生产方法主要有金属催化法、光催化法和液态发酵。但是这些传统生产葡萄糖酸方法通常牵涉到强酸降解、大量副产物生成和耗时的过程。而酶降解法具有对环境友好、反应选择性和催化活性高等特点，且不需使用腐蚀性化学物。淀粉是自然界中普遍存在且含量丰富的多糖物质，是一种理想生产葡萄糖酸的原料。在可溶性淀粉转化为葡萄糖酸过程中，葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，简写为GOx）和葡糖淀粉酶（GA）可通过级联反应实现淀粉向葡萄糖酸的一步转化。首先，GA裂解淀粉的α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖基键以产生β-D-葡萄糖，在第二步中，GOx催化β-D-葡萄糖的C1上的醛基氧化成羧基生成β-D-葡糖酸。由于级联反应中不需要分离中间物，所以没有间断的步骤，容易获得高效的底物转化率，从而降低生产成本。然而仅使用游离酶进行一步转化淀粉为葡萄糖酸存在降解条件苛刻、催化剂回收难、不易于进行工业化连续生产等诸多问题，因此，酶的固定化研究迫在眉睫。
近年，酶固定化研究成为一大热点。与游离酶相比，固定化酶的催化活性、稳定性和重复使用性因其高比表面积和高度生物相容性而得到大幅提升。目前研究的固定化酶集中在单酶固定化，同时缺少关于共固定化多酶并一步降解可溶性淀粉为葡萄酸的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服目前游离酶活性较低，合成的固定化多酶重复利用性、酶在不同的条件下对底物的催化能力不稳定等不足之一，而提供一种GA@GOx杂化纳米花及其制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
本发明首先提供一种GA@GOx杂化纳米花，所述杂化纳米花具有特定的酶的空间分布，其中GOx分布在杂化纳米花的内部，而GA分布在杂化纳米花的外层，总体呈类似于花的形状，通过GA@GOx杂化纳米花催化产生的级联反应实现高效率的一步转化淀粉为葡萄糖酸。
本发明还提供所述的GA@GOx杂化纳米花的制备方法，包括步骤如下：
（1）GOx杂化纳米花的制备
将CuSO4水溶液加入到含有一定浓度GOx的磷酸缓冲溶液中，使得混合溶液中Cu2+为一定的浓度，接着在一定温度下孵育一段时间，并在孵育完成后，进行离心分离GOx杂化纳米花，并用去离子水洗涤数次以除去未固定的GOx。
其中所述磷酸缓冲液中GOx含量为0.15-0.35 mg/mL；
所述混合溶液中的Cu2+含量为6-12 mM；
所述磷酸缓冲液的pH值为6.5-8.5；
所述孵育温度为2-6 °C；孵育时间为12-36 h。
（2）GA@GOx杂化纳米花的制备
将GOx杂化纳米花加入到含有一定浓度GA的去离子水中，孵育一段时间。孵育完成后，通过离心获得GA@GOx杂化纳米花，并用去离子水洗涤数次以除去未固定的GA。
其中所述GOx杂化纳米花和含有一定浓度的GA的去离子水的用量为0.8mg:1mL，其中去离子水中GA含量为0.15-0.35 mg/mL；
所述孵育温度为2-6 °C；孵育时间为12-36 h。
本发明还提供一种GA@GOx杂化纳米花降解可溶性淀粉转化为葡萄糖酸的用途。
将GA@GOx杂化纳米花加入含有可溶性淀粉的溶液中或直接加入可溶性淀粉中，然后在温度35-60°C 、pH值为3-7的条件下反应降解可溶性淀粉；优选的所述温度为45°C、pH值为5。
本发明的有益效果如下：
（1）本发明将GOx、GA两种酶顺序固定化到杂化纳米花中，本发明中GOx和GA在纳米花中具有特定的空间分布结构，其中GOx分布在杂化纳米花的内部，而GA分布在杂化纳米花的外层，符合淀粉依次由GA、GOx催化的顺序，从而使得杂化纳米花能够实现高效率的一步转化淀粉为葡萄糖酸。同时纳米花本身所包含的铜离子能够和固定化在杂化纳米花上的GOx、GA产生协同效应，从而提升酶的催化活性，在不同条件下的稳定性也得到了明显的改善。合成的具有花状形态的GA@GOx杂化纳米微粒，自身的高表面积体积和多孔结构，能够显著提升酶与底物的接触面积，从而提高酶活。
（2）本发明进一步验证了形成GA@GOx杂化纳米花的一系列因素，在最佳条件下生成的GA@GOx杂化纳米花的酶活比游离酶体系提高到了150 %。
（3）本发明制备的GA@GOx杂化纳米花在重复利用4次后仍有80 %的相对酶活，其重复利用能力有着很大的提升。在贮藏60天后，游离的多酶体系的相对酶活为56.25 %，而GA@GOx杂化纳米花的相对酶活高达80.77%。此外GA@GOx杂化纳米花相对于游离的多酶体系，其温度、pH稳定性都有很大的提升。
（4）本发明利用级联反应中存在顺序催化的原理，依次在杂化纳米花中固定化两种不同的酶，使两种酶分布于杂化纳米花的不同空间层次，将GA@GOx杂化纳米花应用到一步降解可溶性淀粉为葡萄糖酸中，存于杂化纳米花外层的GA首先将淀粉水解为中间产物葡萄糖，然后中间产物葡萄糖在分布于杂化纳米花内部的GOx作用下被氧化成目标产物葡萄糖酸，从而减少中间产物的生成，提升目标产物的生成效率：GA@GOx杂化纳米花能在80分钟内降解超过92.12%的可溶性淀粉为葡萄糖酸，性能远优于一般的游离酶。
附图说明
图1为GA@GOx杂化纳米花扫描电子显微镜图（a）、透射电子显微镜图（b），其中图b插图中标尺大小为50nm。
图2为GA@GOx杂化纳米花的X射线光电子能谱图，其中a为总谱图，
b为Cu 2p分谱图，c为 P 2p分谱图，d为 O 1s分谱图，e为 C 1s分谱图和f为 N 1s分谱图。
图3为Cu3(PO4)2（a）和GA@GOx杂化纳米花（b）的粉末X射线衍射图。
图4为GA@GOx杂化纳米花（a）、GOx（b）、GA（c）和Cu3(PO4)2（d）傅立叶变换红外光谱图。
图5为GA@GOx杂化纳米花热重分析曲线。
图6为Cu3(PO4)2（a）、GOx杂化纳米花（b）和GA@GOx杂化纳米花（c）粒径分布图。
图7为GA@GOx杂化纳米花的BET比表面积测试图。
图8为不同GA和GOx浓度下GA@GOx杂化纳米花的SEM图；图中a
为0.25 mg/mL GOx和0.15 mg/mL GA，b为0.25 mg/mL GOx和 0.25 mg/mL GA，c为0.25 mg/mL GOx和0.35 mg/mL GA，d为0.45 mg/mL GOx和0.15 mg/mL GA，e为0.45 mg/mLGOx和0.25 mg/mL GA，f为0.45 mg/mL GOx和0.35 mg/mL GA。
图9为不同GA和GOx浓度下GA@GOx杂化纳米花的相对酶活和包封率；
图中a为0.25 mg/mL GOx和0.15 mg/mL GA，b为0.25 mg/mL GOx和 0.25 mg/mLGA，c为0.25 mg/mL GOx和0.35 mg/mL GA，d为0.45 mg/mL GOx和0.15 mg/mL GA，e为0.45mg/mL GOx和0.25 mg/mL GA，f为0.45 mg/mL GOx和0.35 mg/mL GA。
图10为不同孵育时间条件下得到的GA@GOx杂化纳米的SEM图。
图11为不同孵育时间条件下得到的GA@GOx杂化纳米的相对酶活和包封率。
图12为不同Cu2+浓度下得到的GA@GOx杂化纳米的SEM图。
图13为不同Cu2+浓度下得到的GA@GOx杂化纳米的相对酶活和包封率。
图14为 pH值对游离多酶体系和GA@GOx杂化纳米花酶活的影响。
图15为温度对游离多酶体系和GA@GOx杂化纳米花酶活的影响。
图16为游离多酶体系和GA@GOx杂化纳米花的温度稳定性验证结果。
图17为游离多酶体系和GA@GOx杂化纳米花的pH稳定性验证结果。
图18为游离多酶体系和GA@GOx杂化纳米花的贮藏稳定性验证结果。
图19为GA@GOx杂化纳米花的循环利用能力验证结果。
图20为GA@GOx、GA@GOx、GA-GOx三种不同多酶杂化纳米花及其对
应的游离多酶体系的整体酶活。
图21为GA@GOx杂化纳米花对可溶性淀粉的降解效率。
图22为GA@GOx杂化纳米花拟一级动力学曲线。
图23为GA@GOx杂化纳米花降解可溶性淀粉反应（a）前、（b）后的扫描电子显微镜图。
具体实施方式：
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：GA@GOx杂化纳米花的制备
（1）GOx杂化纳米花的制备
将30µL的CuSO4水溶液加入到1mL含有0.15 mg/mL GOx的磷酸缓冲溶液（pH 6.5）中，使得最终溶液中Cu2+含量为6 mM。接着在2°C孵育12 h，并在孵育完成后，进行离心分离杂化GOx有机-无机杂化纳米花，并用去离子水洗涤数次以除去未固定的GOx。
（2）GA@GOx杂化纳米花的制备
将0.8mgGOx杂化纳米花加入到1 mL含有0.15 mg/mL GA的去离子水中，在2°C孵育12 h。并在孵育完成后，通过离心获得GA@GOx杂化纳米花，并用去离子水洗涤数次以除去未固定的GA。
实施例2：GA@GOx杂化纳米花的制备
（1）GOx杂化纳米花的制备
将30µL的CuSO4水溶液加入到1mL含有0.35 mg/mL GOx的磷酸缓冲溶液（pH 8.5）中，使得最终溶液中Cu2+含量为12 mM。接着在6°C孵育36 h，并在孵育完成后，进行离心分离杂化GOx有机-无机杂化纳米花，并用去离子水洗涤数次以除去未固定的GOx。
（2）GA@GOx杂化纳米花的制备
将0.8mgGOx杂化纳米花加入到1 mL含有0.35 mg/mL GA的去离子水中，在6°C孵育36 h。并在孵育完成后，通过离心获得GA@GOx杂化纳米花，并用去离子水洗涤数次以除去未固定的GA。
实施例3：GA@GOx杂化纳米花的制备
（1）GOx杂化纳米花的制备
将30µL的CuSO4水溶液加入到1mL含有0.25 mg/mL GOx的磷酸缓冲溶液（pH 7.5）中，使得最终溶液中Cu2+含量为9 mM。接着在4°C孵育24 h，并在孵育完成后，进行离心分离杂化GOx有机-无机杂化纳米花，并用去离子水洗涤数次以除去未固定的GOx。
（2）GA@GOx杂化纳米花的制备
将0.8mgGOx杂化纳米花加入到1 mL含有0.25 mg/mL GA的去离子水中，在4°C孵育一段时间。并在孵育完成后，通过离心获得GA@GOx杂化纳米花，并用去离子水洗涤数次以除去未固定的GA。
对制备得到的产品GA@GOx杂化纳米花进行了表征，具体结果如下所述：
图1展示了具有花状的GA@GOx杂化纳米花扫描电子显微镜图（a）、透射电子显微镜图（b）。图1a表明GA@GOx杂化纳米花均匀分布，直径约15μm。图1b展示了GA@GOx杂化纳米花的透射电子显微镜图，图中可见杂化纳米花是由数百个纳米花瓣组成。同时图1b中的右上方插入的图像的表明酶分布在GA@GOx杂化纳米花的内部和外部。
图2是GA@GOx杂化纳米花的X射线光电子能谱图。图中可知，Cu、P、O、C、N、Na和Cl的化学元素均出现在了GA@GOx杂化纳米花的总谱图中。其中Na和K化学元素是磷酸盐缓冲溶液（Na2HPO4和KH2PO4）的必要组分，Cl是形成杂化纳米花的必要化学元素。图2b是Cu 2p的分谱图，图中结果表明Cu2+是杂化纳米花的中Cu的主要价态。此外，图2c中P 2p分谱图在133.2eV结合能和图2d中O 1s分谱图在531.32 eV结合能表明了GA@GOx杂化纳米花主要成分是PO4 3-，这证明了磷酸铜的存在。同时，图2e中C1s分谱图在284.73、286.11和287.91 eV的结合能分别表明了CH、CN和C = O化学键的存在。图2f中N 1s的分谱图在399.99eV的结合能表明了N-C = O化学键的存在。这些分析的结果表明，本发明成功合成了GA@GOx杂化纳米花。
图3是Cu3(PO4)2和GA@GOx杂化纳米花的粉末X射线衍射图。图中可见，Cu3(PO4)2的所有衍射峰均符合从JCPDS卡（00-022-0548）获得的那些峰。GA@GOx杂化纳米花的粉末X射线衍射图显示制备的杂化纳米花主要由Cu3(PO4)2晶体组成。这些结果表明，本发明所获得的GA@GOx杂化纳米花的结晶结构没有因为合成过程而发生变化。
图4是GA@GOx杂化纳米花傅立叶变换红外光谱图。该图直接证明了GA和GOx成功的固定在了GA@GOx纳米花中。如图所示，1050和1142cm-1处的两个峰对应于PO和P = O伸缩振动，而560和627cm-1处的峰归因于O = PO振动，这表明了磷酸基团的存在。1610和1652cm-1处的峰分别对应于AG和GOx的N-H基团，而GA@GOx杂化纳米花的光谱在1643cm-1处显示了N-H基团的存在。在2800-3000cm-1处观察到的峰归因于-CH2和-CH3化学键的振动。最后，在GA@GOx杂化纳米花光谱图并没有出现新的吸附峰，因此表明了GA和GOx酶是通过自组装方法形成了GA@GOx杂化纳米花。
图5是GA@GOx杂化纳米花热重分析曲线。根据图中信息可知，在第一阶段过程中，GA@GOx杂化纳米花的分解是从25°C开始并在150°C左右分解结束，这主要是由于GA@GOx杂化纳米花表面上水分子的去除引起的。在第二阶段中，分解开始于大约150°C并在600°C结束，这是由于GA、GOx损失引起的，这个结果表明固定化到GA@GOx杂化纳米花中酶的总重量约为21％。由此，这个结果也证明了磷酸铜与酶的高度杂化。
图6是Cu3(PO4)2晶体（a）、GOx杂化纳米花（b）和GA@GOx杂化纳米花（c）粒径分布图。图中可见，Cu3(PO4)2晶体的平均粒径为12μm，而GOx杂化纳米花的平均粒径为15.9μm。这是由于GOx可以与Cu2 +结合以提供Cu3(PO4)2晶体的成核位点，最后GOx杂化纳米花形成了比Cu3(PO4)2晶体更密集的纳米花，所以导致GOx杂化纳米花比Cu3(PO4)2晶体更大的粒径。然而，在GOx杂化纳米花表面吸附了GA后，GA@GOx杂化纳米花的平均粒径为16.2μm，这略高于GOx杂化纳米花。GA@GOx杂化纳米花的平均粒度大于GOx杂化纳米花，可能是因为GA吸附在GOx杂化纳米花的边缘和内部，这与透射电镜图所展示的结果一致。因此，粒径分布的结果也表明本发明成功的制备了GA@GOx杂化纳米花。
图7是GA@GOx杂化纳米花的BET比表面积测试图。图中可见，GA@GOx杂化纳米花的表面积、孔体积和平均孔径分别为62.85m2 g-1，0.34cm3 g-1，21.84nm。这些数据表明GA@GOx杂化纳米花具有高比表面积和多孔结构，从而使其在反应溶液中可与反应底物充分接触。
实施例4：GA@GOx杂化纳米花制备过程技术条件的筛选
（1）GA和GOx浓度对GA@GOx杂化纳米花合成的影响
如图8a-8c所示，当GOx为0.25 mg/mL时，改变GA浓度为0.15、0.25、0.35 mg/mL，在不同的GA浓度下，GA@GOx杂化纳米花呈现出类似的花状的形态，这是因为GA在去离子水中是吸附在GOx杂化纳米花上，并没有形成Cu3(PO4)2纳米花瓣，因此在形态上没有显示出明显的差异。
当GOx为0.45 mg/mL时，改变GA浓度为0.15、0.25、0.35 mg/mL，结果如图8d-f所示，GA@GOx杂化纳米花的呈现出了相似形态。但是，当GOx浓度为0.45mg/mL时，GA@GOx杂化纳米花的纳米花瓣分布比GOx浓度为0.25mg/mL时更密集。
同时，本实施例考察了GA和GOx浓度发生变化时，可溶性淀粉水解体系中葡萄糖酸浓度的变化情况，结果如图9所示，当GOx和GA的浓度分别为0.25mg / mL和0.25mg / mL时，产生的葡萄糖酸达到最大值，此时酶的包封率为51.91 %。因此，本发明选择GOx的适合浓度为0.15-0.35mg/mL，GA的适合浓度为0.15-0.35mg/mL，优选的，GOx的最佳浓度为0.25mg/mL，GA的最佳浓度为0.25mg/mL。
（2）两次孵育时间对GA@GOx杂化纳米花合成的影响
本实施例中考察了不同孵育时间对杂化纳米花合成的影响，本发明中两个步骤中涉及到的孵育时间相同，同时调整两个步骤中孵育时间相同，故本发明同时考察两个步骤的孵育时间。
结果如图10所示，在孵育时间从6到36 h变化过程中，形成的GA@GOx杂化纳米花结构存在着明显的差异。当孵育时间为6 h时，纳米花瓣的分布密度较小。随着孵育时间增加到18h，Cu3(PO4)2团聚体不断结合到纳米花的成核位点上孵育时间为24 h时，Cu3(PO4)2纳米晶体进一步生长，最后GA@GOx杂化纳米花形成完成。当孵育时间从24 h增加到36 h时，GA@GOx杂化纳米花的形态呈现出了分布更密集的纳米花瓣。
此外，也考察了不同孵育时间下制备的杂化纳米化对整体酶活性的影响情况，结果如图11所示，当孵育时间从6小时增加到36小时时，可溶性淀粉降解反应溶液中产生的葡萄糖酸浓度呈现的是先是稳定增加然后不断降低的趋势。当GA@GOx杂化纳米花孵育时间为24 h时，葡萄糖酸的浓度达到最大值，这可能是因为较短的孵育时间导致多酶杂化纳米花结构在反应溶液中不稳定，而较长的孵育时间导致纳米花中过密的纳米花瓣从而阻碍了底物和酶的接触。因此，本发明选择6-36h为合适的孵育时间，优选的，选择12-36h，更优选的，最佳孵育时间为24h，此时包封效率达到了51.06 %。
（3）Cu2+浓度对GA@GOx杂化纳米花形成的影响
本实施例考察了不同Cu2+浓度对GA@GOx杂化纳米花形成的影响，结果如图12所示，在不同Cu2+浓度（4.5、6、7.5、9、10.5和12mM）时孵育的GA@GOx杂化纳米花的扫描电子显微镜图，图中可见当Cu2+浓度从4.5mM增加到9 mM时，GA@GOx杂化纳米花的层状花结构逐渐变得清晰，纳米花瓣分布表现的更密集。随着Cu2+浓度从9mM增加到12mM时，GA@GOx杂化纳米花结构没有展现出显着的区别。当Cu2+浓度逐渐增加时，GA@GOx杂化纳米花的直径在不断变大，这是因为低Cu2+浓度限制了Cu3(PO4)2聚集体的形成数量。
此外，也考察了在不同Cu2+浓度下合成的GA@GOx杂化纳米花的整体酶活性，结果如图13所示，当Cu2+浓度从4.5mM增加到9mM时，反应溶液中葡萄糖酸浓度的表现是逐渐增加。但是随着Cu2+浓度进一步从9 mM增加到12mM时，葡萄糖酸浓度的表现是略有下降。
因此，本发明选择合成过程中Cu2+浓度4.5-12mM，优选的，选择6-12mM，进一步优选的，最佳的Cu2+浓度为9mM，此时的酶的包封率高达50.44 %。
实施例5：GA@GOx杂化纳米花酶学性质的研究
（1）pH值对杂化纳米花酶活的影响
通过研究在不同反应pH值下的GA@GOx杂化纳米花相对活性，本实施例中以未经固定化过程而呈游离状态的GA、GOx两种酶组成的系统，即游离多酶系统为对照，和GA@GOx杂化纳米花的最佳反应pH值进行比较。结果如图14所示，制备的GA@GOx杂化纳米花在pH 5.0下表现出最大的相对活性，这与游离多酶系统最适反应pH值相同。实验结果还表明GA@GOx杂化纳米花在广泛的pH范围内表现出了比游离多酶系统更好的pH稳定性，这是由于杂化纳米花结构对酶的保护功能，这也表明了制备的GA@GOx杂化纳米花的多层花状结构具有明显的优势。因此，GA@GOx杂化纳米花在pH值为3-7时候具有较高的相对活性，在pH值为 5.0的时候，GA@GOx杂化纳米花呈现最佳的活性。
（2）GA@GOx杂化纳米花降解可溶性淀粉时，体系温度对GA@GOx杂化纳米花酶活的影响
本实施例探讨了反应温度35-60°C对游离多酶系统和GA@GOx杂化纳米花的相对活性的影响情况，结果如图15所示。GA@GOx杂化纳米花的最适温度为40°C，这要稍微低于游离多酶系统45°C。GA@GOx杂化纳米花在35至40°C的温度下表现出比游离多酶系统更好的相对活性，表明在纳米花中掺入酶可以增加酶的稳定性以避免催化活性结构的破坏。因此，选择35-60°C作为GA@GOx杂化纳米花作用底物可溶性淀粉的反应温度，优选的，选择40°C的作为GA@GOx杂化纳米花作用底物可溶性淀粉最适的反应温度。
（3）GA@GOx杂化纳米花温度稳定性
将游离多酶系统和制备的GA@GOx杂化纳米花在40°C下储存5 h，并每间隔1 h的检测杂化纳米花的相对活性。结果如图16所示，在40°C下储存5h后，GA@GOx杂化纳米花的相对活性仍然拥有其初始活性的68.01 %。游离多酶系统经过5 h在40°C下的储存后活性仅有其初始活性的50.72 %，远要低于GA@GOx杂化纳米花。最终结果表明，制备的GA@GOx杂化纳米花比游离多酶系统表现出更好的热稳定性。
（4）GA@GOx杂化纳米花pH稳定性
通过将游离多酶系统和制备的GA@GOx杂化纳米花储存在磷酸缓冲溶液（pH值为8）中5 h来评估它们的pH稳定性。结果如图17所示，在储存5h后，GA@GOx杂化纳米花和游离多酶系统的相对活性分别为94.3 %和75.97 %。与游离多酶系统相比，GA@GOx杂化纳米花的pH稳定性增加是由于多层花状结构保护下碱性环境对酶活性结构的影响很小，这了表明GA@GOx杂化纳米花具有理想的pH稳定性。
（5）GA@GOx杂化纳米花贮藏稳定性
此外还研究了GA@GOx杂化纳米花的储存稳定性。将GA@GOx杂化纳米花和游离多酶系统在4°C条件下储存60天。如图18所示，GA@GOx杂化纳米花的相对活性在储存60天后要高于游离多酶系统，其中GA@GOx杂化纳米花和游离多酶系统的相对酶活分别是80.77%和56.25 %，这表明制备的GA@GOx杂化纳米花在实际操作当中的应用潜力。
（6）GA@GOx杂化纳米花重复利用能力
称取质量为0.2mg的GA@GOx杂化纳米花溶解于1mL含有1mg/mL的可溶性淀粉中，然后在温度45°C、pH值为5的条件下反应30分钟，反应结束之后进行离心分离杂化纳米花，并对上清液中生成的葡萄糖酸浓度进行高效液相检测，而离心后分离得到的杂化纳米花继续用于降解可溶性淀粉实验。经过四次连续操作后，GA@GOx杂化纳米花在每个循环中的相对酶活性分别为100 %，95.45 %，93.64 %和80 %，结果如图19所示，良好的重复利用性证明了GA@GOx杂化纳米花较好的操作稳定性，能够实现反复高效的将可溶性淀粉转化为葡萄糖酸。
实施例6：GA、GOx不同固定顺序对多酶纳米花整体酶活性影响
本发明还同时制备了GOx @ GA杂化纳米花，这里是先合成GA杂化纳米花，再固定GOx，其他的制备条件保持跟GA@GOx杂化纳米花相同，得到的GOx @ GA杂化纳米花的空间分布跟GA@GOx刚好相反。
另外，本发明还制备了GA-GOx杂化纳米花，是同时将GA、GOx一起放到磷酸缓冲溶液中同时进行固定，最终生成的是酶随机空间分布的杂化纳米花。具体的，是将30µLCuSO4与1mL同时含有GA和GOx的磷酸缓冲溶液（pH为7.5）反应，使得最后溶液中含有9mM的Cu2+，然后在4°C孵育一段时间，从而制备出GA-GOx杂化纳米花。
本实施例检测了三种不同多酶纳米花（GA@GOx杂化纳米花、GOx @ GA杂化纳米花、GA-GOx杂化纳米花）在总酶量相同的情况下的整体酶活。其中以1mg/mL可溶性淀粉作为底物并在最适反应条件下进行可溶性淀粉的转化，在30 min反应完成后测试最终反应体系中的葡萄糖酸浓度。此外，将三种不同多酶纳米花跟GA、GOx组成的游离多酶系统进行对比，其中三种多酶纳米花和游离多酶系统中的酶的总量是相同的，同时需控制游离多酶系统跟对应的多酶纳米花中的GA和GOx比例一样。
整体酶活是以产生的葡萄糖酸的量来衡量的，产生的量越多说明整体酶活越高。结果如图20所示，结果表明，与游离多酶系统相比，三种不同的多酶杂化纳米花均增强了的总酶活性（110-150％）。与游离多酶系统相比，三种不同的多酶杂化纳米花的纳米级机构稳定，同时具有高的比表面积，能够有效减少中间产物的传输距离同时增强底物对酶的接触性；三种不同的多酶杂化纳米花中的二价铜离子与掺入的GA和GOx之间的协同作用可以改善总体酶活性。
其中，GA@GOx杂化纳米花具有最佳性能。与相应的游离多酶系统相比，GA@GOx杂化纳米花显示出了150％的总酶活性，表明GA和GOx在多酶杂化纳米花中的特定分布可以极大地影响总体酶活性。与GOx@GA和GA-GOx杂化纳米花相比，GA@GOx杂化纳米花的总酶活性最高的原因是GA和GOx在杂化纳米花中的分布顺序符合级联反应的催化顺序，其中GA在GA@GOx杂化纳米花的外部空间，GOx位于GA@GOx杂化纳米花的内部空间。
实施例7：GA@GOx杂化纳米花降解可溶性淀粉
经过验证，以下条件为GA@GOx杂化纳米花的最佳反应条件：称取质量为0.2mg的GA@GOx杂化纳米花溶解于1mL含有1mg/mL的可溶性淀粉中，然后在温度45°C、pH值为5的条件下反应一段时间，每隔一段时间就对反应溶液中生成的葡萄糖酸浓度进行检测。
在上述最佳反应条件下，GA@GOx杂化纳米花和游离多酶体系的分别催化作用下，考察两个不同的体系将可溶性淀粉转化为葡萄糖酸的转化效率。结果如图21所示，可溶性淀粉的转化效率随着反应时间从0到80 min在逐渐增加，然后随着反应时间进一步增加而趋于饱和状态。在80 min时，GA@GOx杂化纳米花实现了将92.12%的可溶性淀粉转化为葡萄糖酸。然而对于游离多酶系统，80 min反应后仅有65％的可溶性淀粉转化为了葡萄糖酸。显然，GA@GOx杂化纳米花在将淀粉转化为葡萄糖酸方面具有更高的转化率。
图22中呈现了-LnIsub与时间的近似线性关系，证明了GA@GOx杂化纳米对底物催化的展示出了拟一级动力学的关系，因为图中-LnIsub与时间呈现近似线性关系。基于这个线性关系，GA@GOx杂化纳米花和游离多酶系统的平均反应速率常数（k）计算结果为0.0647min-1和0.0470min-1，从而得出GA、GOx固定化形成杂化纳米后对底物的亲和力相对于游离多酶体系增强了。图23还表明可溶性淀粉的水解过程对GA@GOx杂化纳米花的花形结构没有显着的影响，这也是GA@GOx杂化纳米花的总体酶活性优于的游离多酶系统的主要原因。

Claims (8)

1.一种GA@GOx杂化纳米花的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备GOx杂化纳米花：
将CuSO4水溶液加入到含有一定浓度的GOx的磷酸缓冲溶液中混合，使得混合溶液中Cu2 +为一定的浓度，然后在一定温度下孵育，孵育完成后离心分离GOx杂化纳米花；所述磷酸缓冲液中GOx含量为0.15-0.35 mg/mL；所述混合溶液中的Cu2+含量为6-12 mM；
（2）制备GA@GOx杂化纳米花：
将GOx杂化纳米花加入到含有一定浓度GA的去离子水中，在一定温度下孵育，在孵育完成后离心获得GA@GOx杂化纳米花；GOx杂化纳米花和含有一定浓度的GA的去离子水的用量为0.8mg:1mL，其中去离子水中GA含量为0.15-0.35 mg/mL；
所述GOx为葡萄糖氧化酶；GA为葡糖淀粉酶。
2.根据权利要求1所述GA@GOx杂化纳米花的制备方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的pH值为6.5-8.5。
3.根据权利要求1所述GA@GOx杂化纳米花的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述孵育温度为2-6 ℃，孵育时间为12-36 h。
4.根据权利要求1所述GA@GOx杂化纳米花的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述孵育温度为2-6℃；孵育时间为12-36 h。
5.权利要求1~4任一项所述方法制备的GA@GOx杂化纳米花，其特征在于，所述杂化纳米花具有特定的酶的空间分布，其中GOx分布在杂化纳米花的内部，而GA分布在杂化纳米花的外层，所述GA@GOx杂化纳米花呈类似于花的形状。
6.权利要求5所述的GA@GOx杂化纳米花降解可溶性淀粉转化为葡萄糖酸的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，将GA@GOx杂化纳米花加入含有可溶性淀粉的溶液中或直接加入可溶性淀粉中，然后在温度35-60°C 、pH值为3-7的条件下反应降解可溶性淀粉。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述温度为45℃、pH值为5。
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