KR101347205B1 - 맞춤형 효소고정 금-자성 실리카나노입자, 상기 입자의 제조방법 및 상기 입자를 이용한 연속식 바이오매스 가수분해방법 - Google Patents

맞춤형 효소고정 금-자성 실리카나노입자, 상기 입자의 제조방법 및 상기 입자를 이용한 연속식 바이오매스 가수분해방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고정화 효소 및 효소고정화 방법에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 효소고정시 효소 장착효율을 높이고 기질과 쉽게 분리 가능하며 재생이 용이한 새로운 구조의 효소고정 금-자성 실리카나노입자, 상기 입자의 제조방법 및 상기 입자를 이용한 연속식 바이오매스 가수분해방법에 관한 것이다.

Description

맞춤형 효소고정 금-자성 실리카나노입자, 상기 입자의 제조방법 및 상기 입자를 이용한 연속식 바이오매스 가수분해방법{Enzyme immobilized on Au-doped Magnetic silica nanoparticle, method for producing the same, and hydrolytic degradation method of biomass thereby}
본 발명은 고정화 효소 및 효소고정화 방법에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 효소고정시 효소 장착효율을 높이고 기질과 쉽게 분리 가능하며 재생이 용이한 새로운 구조의 효소고정 금-자성 실리카나노입자, 상기 입자의 제조방법 및 상기 입자를 이용한 연속식 바이오매스 가수분해방법에 관한 것이다.
바이오매스로부터 처리된 셀룰로오스를 포도당으로 전환하기 위해서 지금까지 효소를 많이 이용하지만 효소의 가격 하락에도 불구하고 국내 공정에 적용하기에는 높은 가격, 낮은 처리 속도 등의 단점을 가지고 있어 연속식 공정을 위한 새로운 인공 가수분해 효소 개발이 필요한 실정이다.
따라서, 효소고정화 기술은 바이오연료 생산의 경제성 확보를 위한 세 가지 방향의 연구개발 중에서도 특히 주목할 만한 흐름이라고 할 수 있다. 바이오연료 생산 촉매인 가수분해 효소제와 에탄올화를 위한 발효촉매의 개발이 주로 대사경로의 재설계를 중심으로 이루어진다면, 또 다른 방향의 연구개발은 투입되는 바이오매스의 최적화 형질전환 혹은 새로운 최적 바이오매스의 발굴이고, 마지막 방법이 효소고정화 기술이라고 할 수 있다.
효소고정화의 기본개념은 효소를 이용한 생물화학공정의 효소의 활용기술에 관한 분야로서 효소의 생물학적 활성을 개량하는 기술 분야와 그 활성을 안정화시키고 경제적으로 활용하는 기술 분야로 구분할 수 있는데 전자는 유전공학적인 방향으로 연구가 진행되는데 비하여 후자는 고정화법을 중심으로 발전되어 왔다.
효소를 고정화시키는 중요한 목적은 효소를 쉽게 회수하여 재이용할 수 있기 때문에 효소 반응공정의 경제성을 높여줄 수 있으며, 반응양식을 회분식 또는 연속식으로 다양하게 적용할 수 있다는 데 있다. 즉, 효소는 그 본질상 수용성이기 때문에 반복 사용이 곤란한 문제점이 있는데, 효소의 수용성을 제거할 수 있다면 부산물과의 혼합, 분리정제의 어려움, 약한 안정성과 같은 문제를 쉽게 해결할 수 있기 때문이다. 이러한 이유로 어떤 단백질 원료를 쓰는가에 따라 친수성, 소수성이 나타날 수 있고, 이러한 특성으로 인해 효소작용의 효율이 변화하게 된다. 또한 대개의 효소고정기술이나 인트랩먼트 기술의 경우 엔자임 구조의 변형을 가져와서 궁극적으로 수율에 영향을 미치게 된다.
따라서 자연 효소를 생물화학 공정에서 효과적으로 이용하기 위해서는 효소를 고정화 시켜야 하는데, 일반적인 효소의 고정화 방법은 물리적 흡착방법 또는 화학적 방법이다. 상기 물리적 흡착방법은 주로 이온 교환(ion-exchange) 방법을 이용하는데, 상기 이온 교환 방법은 비독성이라는 장점이 있으나 그 결합력이 약하다는 문제점이 있다. 또한, 상기 화학적 방법은 화학 반응에 의해 공유결합을 형성시켜 효소를 고정시키기 위하여 시약을 사용하는 것으로, 상기 방법은 가교 결합력이 강하기는 하지만 상기 효소의 고정화를 위해 사용하는 시약이 독성이 있기 때문에 식품 또는 의약 관련 산업에는 사용하기가 힘들다는 단점이 있다.
유기 혹은 무기담체에 효소를 결합시켜서 효소를 고정화하여 재사용과 연속처리를 하는 효소고정화는 잘 알려져 있다. 유기물(예 셀룰로스, 나일론, 폴리아크릴아미드)은 담체로서 불리한데, 왜냐하면 기계적 안정성이 좋지 않으며, 용매에 의한 부식, pH와 이온 강도에 따르는 변화와 미생물에 의한 침해로 인하여 효소와의 결합이 파괴될 수 있기 때문이다. 따라서 효소가 흡착 혹은 공유적으로 흡착하는 무기물 담체가 제안되었는데, 결합형태는 효소의 사용조건과 형태 및 기질의 특성에 따른다. 즉, 기질이 강한 염농도이면, 흡착된 효소의 불착이 일어나기 때문에 흡착법은 적용될 수 없다. 따라서 효소의 공유결합이 우선한다. 담체의 표면은 효소의 결합을 유도하는 특이한 기능기를 포괄하여야 한다. 대부분 담체는 기능기를 포괄할 수 없기 때문에, 표면의 전처리가 필요하다.
대개의 경우 효소고정화를 위해 3-6나노미터의 직경을 가지게 구경조절이 쉽고 표면적이 넓은 실리카가 주로 사용되었는데, 소형이 2나노미터, 중형이 2-50나노미터, 대형은 50나노 이상으로 맞춤형 생산이 가능하다. (리그노셀룰루스는 세포벽내에 포함되어 있는 분자들의 크기는 직경 0.2~~0.5나노미터의 크기를 가진다). 실리카의 장점은 비용이 적게 들고, 고정화가 수 초만에 완료되는 신속성, 입자형성을 위한 환경으로 실내온도와 중성산도가 가능하며 확산력이 상대적으로 높고, 매트릭스 설계가 가능하며, 유량흐름에 적합한 물리적 특성, 효소의 안정성이 입증되어 있고 실리카디포지션을 변경함으로써 구경조절이 가능하다는 장점을 가진다. 특히 실리카 솔-젤 인캡슐레이션의 경우 바이오분자의 고착용으로 사용되었는데, 주로 바이오센서에 적용되는 기술이기도 하다. 그러나 실리카젤-솔을 사용할 경우 효소가 빠져나가거나 혹은 효소를 장착시킬 수 있는 효율이 매우 낮다는 문제가 있다.
따라서, 효소를 장착효율을 높이고, 장기간 활성을 유지할 수 있으며, 더 안정되고 장기간에 걸쳐 사용 할 수 있으며, 기질과 쉽게 분리가 가능하고, 재생이 용이한 새로운 구조의 고정화 효소에 대한 개발 필요성이 대두되었다.
더 나아가, 바이오매스로부터 처리된 셀룰로오스를 포도당으로 전환하기 위해서 지금까지 효소를 많이 이용하지만 효소의 가격 하락에도 불구하고 국내 공정에 적용하기에는 높은 가격, 낮은 처리 속도 등의 단점을 가지고 있어 연속식 공정을 위한 새로운 인공 가수분해 효소 개발이 필요한 실정이다.
본 발명자들은 상술된 문제점을 해결하기 위해 연구 노력한 결과 효소고정시 효소 장착효율을 높이고 기질과 쉽게 분리 가능하며 재생이 용이한 새로운 구조의 고정화 효소를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 금 나노입자가 도포된 자성 실리카 나노입자에 화학결합을 통해 효소를 고정화함으로써 효소의 장착효율을 높이고, 외부 조건 변화에 대한 효소의 민감성을 감소시켜 장기간 활성을 유지할 수 있으며, 더 안정되고 장기간에 걸쳐 사용 할 수 있는 구조의 효소고정 금-자성 실리카나노입자 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 자석을 이용하여 효소반응이 종료된 후에 기질과 쉽게 분리가 가능하며, 불활성화된 효소를 간편하게 제거하고 신규 활성효소를 재결합시켜 재생이 용이한 구조의 효소고정 금-자성 실리카나노입자 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 연속 반응기에서도 이용이 가능하며, 특정 기질의 반응을 위해 다수개의 효소가 필요한 경우 필요한 다수개의 효소를 고정시켜 효소반응효율을 높일 수 있는 구조의 효소고정 금-자성 실리카나노입자 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전처리된 셀룰로오스계 바이오매스의 가수분해와 같이 기질의 처리양이 아주 많고 상기 기질의 처리를 위해 필요한 효소가 비싼 경우 보다 유용하게 이용될 수 있는 효소고정 금-자성 실리카나노입자 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 여러 번에 걸쳐 재활용함으로써 바이오매스로부터 에탄올 생산시 전체비용의 40% 내외를 차지하는 촉매사용에 따른 단위생산비용을 획기적으로 절감할 수 있는 연속식 바이오매스 가수분해방법가능성을 제공한다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 먼저, 본 발명은 자성 실리카 나노입자; 상기 자성 실리카나노입자의 표면에 도입되는 다수개의 -SH기; 상기 -SH기와 결합하여 상기 자성실리카나노입자 표면에 결합되는 하나 이상의 금나노입자; 및상기 금나노입자에 결합되는 하나 이상의 효소를 포함하는 효소고정 금-자성 실리카 나노입자를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 -SH기에 의해 시스테인 결합이 형성된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 자성 실리카 나노입자는 Fe3O4를 전구체로 하여 합성된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 자성 실리카 나노입자는 5 내지 50 nm의 직경을 갖는다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 금나노입자는 2 내지 10nm의 직경을 갖는 다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 효소의 활성이 90%이상을 유지하는 상태로 10회 이상 재사용 가능하다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 효소의 활성이 50%이상을 유지하는 상태로 20회 이상 재사용 가능하다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 효소의 활성이 50% 미만으로 떨어지면, 상기 금나노입자에 결합된 효소를 제거한 후 필요한 다른 효소를 상기 금나노입자에 결합시켜 재활용될 수 있다.
또한, 본 발명은 자성 나노입자를 준비하는 단계; 상기 자성 나노입자를 이용하여 자성 실리카 나노입자를 준비하는 단계; 상기 준비된 자성 실리카 나노입자의 표면에 다수개의 -SH기를 도입하는 단계; 상기 -SH기가 도입된 자성실리카나노입자에 금나노입자를 결합시켜 금-자성실리카나노입자를 제조하는 단계; 및 상기 금-자성 실리카 나노입자에 효소를 고정하는 단계를 포함한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 자성 나노입자를 준비하는 단계는 이염화철 수용액과 삼염화철수용액을 혼합하는 단계; 혼합 용액을 교반하면서 수산화암모늄용액을 첨가하여 반응시키는 단계; 및 반응에 의해 얻어진 검정색 생성물을 분리하는 단계를 포함한다. 이 때, 검정색 생성물을 분리하는 단계는 원심분리한 후 물과 에탄올로 세척한 다음 진공건조하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 자성 실리카 나노입자를 준비하는 단계는 상기 준비된 자성 나노입자를 용매에 넣고 초음파 분산시키는 단계; 상기 분산된 용액에 TEOS(tetrathyl orthosilicate)를 첨가한 후 교반하면서 수산화암모늄 용액을 가하여 pH를 10이상으로 유지하는 단계; 및 상기 단계를 거친 생성물을 환류시킨 후 세척하고 진공 건조하는 단계를 포함한다. 여기서 초음파 분산시 사용되는 용매는 알코올 용매일 수 있고, pH는 12 이상으로 유지하는 것이 바람직하며, 환류는 90℃ 이상에서 이루어질 수 있다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 다수개의 -SH기를 도입하는 단계는 -SH기를 포함하는 용액에 상기 자성 실리카 나노입자를 첨가한 후 환류시키는 단계; 및 상기 단계를 거친 생성물을 분리하여 세척하고 진공 건조하는 단계를 포함한다. 이 때 -SH기를 포함하는 용액은 -SH기를 포함하는 화합물을 유기용매에 용해시킨 것이면 제한되지 않으나, 바람직하게는 Mercaptopropyltriethoxysilane를 질소기류하에서 유기용매 특히 톨루엔에 용해시킨 것이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 금-자성실리카나노입자를 제조하는 단계는 금 나노입자용액을 준비하는 단계; 상기 금나노입자용액에 상기 -SH기가 도입된 자성 실리카 나노입자를 첨가한 후 반응시키는 단계; 및 상기 반응 생성물을 세척하여 진공 건조하는 단계를 포함한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 금-자성 실리카 나노입자에 효소를 고정하는 단계는 상기 금-자성 실리카 나노입자에 버퍼를 첨가한 후 초음파 분산하는 단계; 상기 분산된 결과물에 효소를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 상기 반응에 의해 얻어진 효소고정 금-자성 실리카 나노입자를 세척한 후 자석을 이용하여 분리하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 효소고정 금-자성 실리카 나노입자를 가수분해효소로 사용하는 것을 특징으로 하는 연속식 가수분해 방법을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 가수분해를 위한 효소반응이 종료된 후 상기 효소고정 금-자성 실리카 나노입자는 자석에 의해 분리된 후 세척되어 재사용된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 가수분해의 기질이 바이오매스인 경우 상기 효소고정 금-자성 실리카 나노입자는 endo-glucosidase, exo-glucosidase, β-glucanase가 결합되어 있다.
또한, 본 발명은 다수 사용되어 고정된 효소 활성이 저하된 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 효소고정 금-자성 실리카 나노입자로부터 고정된 효소를 제거하는 단계; 및 상기 효소가 제거된 금-자성 실리카 나노입자에 신규 효소를 고정하는 단계를 포함하는 효소고정 금-자성 실리카 나노입자 재활용방법을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 고정된 효소를 제거하는 단계는 90 내지 110℃에서 초음파처리 하는 단계를 포함한다.
본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 갖는다.
먼저, 본 발명에 의하면 금 나노입자가 도포된 자성 실리카 나노입자에 화학결합을 통해 효소를 고정화함으로써 효소의 장착효율을 높이고, 외부 조건 변화에 대한 효소의 민감성을 감소시켜 장기간 활성을 유지할 수 있으며, 더 안정되고 장기간에 걸쳐 사용 할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 자석을 이용하여 효소반응이 종료된 후에 기질과 쉽게 분리가 가능하며, 불활성화된 효소를 간편하게 제거하고 신규 활성효소를 재결합시켜 재생이 용이하다.
또한, 본 발명에 의하면 연속 반응기에서도 이용이 가능하며, 특정 기질의 반응을 위해 다수개의 효소가 필요한 경우 필요한 다수개의 효소를 고정시켜 효소반응효율을 높일 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 전처리된 셀룰로오스계 바이오매스의 가수분해와 같이 기질의 처리양이 아주 많고 상기 기질의 처리를 위해 필요한 효소가 비싼 경우 보다 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 여러 번에 걸쳐 재활용함으로써 바이오매스로부터 에탄올 생산시 전체비용의 40% 내외를 차지하는 촉매사용에 따른 단위생산비용을 획기적으로 절감할 수 있다.
도 1에서 (a)는 금 나노입자에 세 가지 셀룰라아제 효소를 동시 고정화 시키는 모식도이고, (b)는 금 나노입자가 도포된 자성 실리카 나노입자에 세 가지 셀룰라아제 효소를 동시 고정화 시키는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소고정 금-자성 실리카 나노입자를 가수분해 효소로 사용하는 연속식 가수분해 방법에 대한 모식도이다.
도 3은 금 나노입자와 금-자성 실리카 나노입자에 셀룰라아제 효소고정시 고정화 비율을 측정하여 도시한 결과그래프이다.
도 4는 pNPG 활성 테스트 방법을 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따른 효소고정 금-자성 실리카 나노입자에서 고정화 된 가수분해 효소의 pH 안정화 테스트결과 그래프이다.
도 5는 CMC 활성 테스트 방법을 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따른 효소고정 금-자성 실리카 나노입자에서 고정화 된 가수분해 효소의 pH 안정화 테스트결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소고정 금-자성 실리카 나노입자에서 Filter paper 활성 테스트를 이용하여 고정화 된 셀룰라아제 효소의 pH 영향을 테스트한 결과그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소고정 금-자성 실리카 나노입자에서 고정화 된 셀룰라아제 효소의 열적 안정성을 조사한 결과그래프이다.
도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따라 효소고정 금-자성 실리카 나노입자를 가수분해효소 사용하는 경우 재사용성 테스트 결과그래프이다.
도 9는 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 불활성화된 효소를 제거 후 새로운 활성 효소를 재결합시킨 후 재활용 특성 테스트를 조사한 결과그래프이다.
도 10은 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 금-자성 실리카 나노입자 표면에서 셀룰라아제들을 제거 전 후의 결과를 TEM(투과 전자 현미경) 및 EDX(Energy Dispersive X-ray Spectroscopy)를 통하여 확인 한 결과이다.
도 11은 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 가수분해가 수행된 후 필터페이퍼 형태 변화를 보여주는 전자현미경 사진이다.
도 12는 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 자일라나제가 고정된 효소고정 금-자성 실리카 나노입자에서 고정화된 자일라나제의 활성테스트 결과그래프이다.
도 13은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 자일라나제가 고정된 효소고정 금-자성 실리카 나노입자의 재사용 테스트 결과 그래프이다.
본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.
이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.
그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
본 발명의 기술적 특징은 효소고정시 효소 장착효율을 높이고 기질과 쉽게 분리 가능하며 재생이 용이한 새로운 구조의 고정화 효소에 있다.
즉, 자성 실리카 입자에 -SH기를 도입하여 금 나노입자가 결합된 금-자성 실리카 나노입자에 화학결합을 통해 효소를 고정화함으로써 효소의 장착효율을 높이고, 외부 조건 변화에 대한 효소의 민감성을 감소시켜 장기간 활성을 유지할 수 있으며, 자석을 이용하여 효소반응이 종료된 후에 기질과 쉽게 분리가 가능하며, 불활성화된 효소를 간편하게 제거하고 신규 활성효소를 재결합시켜 재생이 용이하기 때문이다.
따라서, 본 발명의 효소고정 금-자성 실리카 나노입자는 도 1의 (b)에 도시된 모식도와 같이 자성실리카나노입자; 상기 자성실리카나노입자의 표면에 도입되는 다수개의 -SH기; 상기 -SH기와 결합하여 상기 자성실리카나노입자 표면에 결합되는 하나 이상의 금나노입자; 및 상기 금나노입자에 결합되는 하나 이상의 효소를 포함한다.
자성 실리카 나노입자는 Fe3O4를 전구체로 하여 합성되는 것이 바람직하며, 5 내지 50 nm의 직경을 갖는 것이 바람직한데, 자성 실리카 나노입자의 크기가 5nm보다 작으면 형성도 어렵고 자성이 작아서 기질과의 분리가 어려울 수 있고, 크기가 50nm보다 크게 되면 기질과의 접촉 면적이 작아질 수 있기 때문이다.
자성 실리카 나노입자의 표면에 도입된 다수개의 -SH기에 의해 시스테인 결합이 형성되며, -SH기에 의해 효소장착 효율이 높아질 뿐만 아니라 효소의 활성까지도 향상시킬 수 있다.
금나노입자는 자성 실리카 나노입자의 표면에 하나 이상 결합된 후 효소와 결합하는 역할을 하므로 2 내지 10nm의 직경을 갖는 것이 바람직하다.
상술된 구조로 인해 본 발명의 효소고정 금-자성 실리카 나노입자는 고정된 효소의 활성이 90%이상을 유지하는 상태로 10회 이상 재사용 가능하며, 효소의 활성이 50%이상을 유지하는 상태로는 20회 이상 재사용 가능하다.
또한, 고정된 효소의 활성이 50% 미만으로 떨어지면, 금나노입자에 결합된 효소를 열처리 또는 초음파 처리하여 간편하게 제거한 후 필요한 다른 효소를 금나노입자에 결합시켜 용이하게 재생할 수 있다.
본 발명의 효소고정 금-자성 실리카 나노입자를 가수분해효소로 사용하게 되면 연속식 가수분해를 용이하게 수행할 수 있는데, 효소반응이 종료된 후에 효소고정 금-자성 실리카 나노입자는 자석에 의해 기질과 분리된 후 세척되어 재사용 가능하며 특정 기질의 반응을 위해 다수개의 효소가 필요한 경우 필요한 다수개의 효소를 고정시켜 효소반응효율을 높일 수 있기 때문이다.
따라서, 가수분해의 기질이 바이오매스인 경우 도 2에 도시된 바와 같이 endo-glucosidase, exo- glucosidase, β-glucanase가 결합되어 있는 본 발명의 효소고정 금-자성 실리카 나노입자를 사용하게 되면, 여러 번에 걸쳐 효소고정 금-자성 실리카 나노입자를 재활용하는 것이 가능하므로 바이오매스로부터 에탄올 생산시 전체비용의 40% 내외를 차지하는 촉매사용에 따른 단위생산비용을 획기적으로 절감할 수 있다.
실시예 1
셀룰라제 고정 금-자성 실리카 나노입자 제조
(1) 자성 나노입자 준비
2M FeCl2·4H2O(이염화철) 수용액 80 mL와 과 1 M의 FeCl3·6H2O(삼염화철) 수용액 320 mL를 함께 섞는다. 혼합된 용액을 빠르게 교반하면서 0.7 M NH4OH (수산화암모늄) 용액 4L를 한방울씩 떨어뜨린다. 반응 후 생긴 검정색의 생성물을 원심 분리한다. 물과 에탄올로 세척한 다음 진공 건조시켜 자성나노입자를 수득하였다.
(2) 자성 실리카 나노입자 준비
준비된 자성 나노입자를 에탄올에 넣고 초음파 분산기로 30분 정도 분산 시킨다. 여기에 20 mM의 테트라에틸올쏘실리케이트(TEOS, tetrathyl orthosilicate)를 첨가하여 교반하면서, 0.7 M 수산화암모늄 용액을 천천히 가하여 pH를 12로 유지 한다. 100℃에서 24시간 동안 환류 시킨 후 에탄올로 3번 정도 세척 후 진공 건조 시켜 자성 실리카 나노입자를 수득하였다.
(3) -SH기가 표면에 도입된 자성 실리카 나노입자 준비
금 나노입자 표면에 도입하기 위하여 자성 실리카 나노입자에 Mercapto propyltriethoxysilane을 이용하여 -SH 그룹을 도입하였다. 먼저 mercapto propyltriethoxysilane 125 mg을 질소 기류하에서 톨루엔 5 mL에 녹인다. 준비된 자성 실리카 나노입자 40mg을 첨가하고 24시간 동안 100℃에서 환류시킨다. 생성물을 감압 필터를 이용하여 분리하고 THF로 2-3번 세척한 후 진공 건조하여 -SH기가 도입된 자성실리카나노입자를 수득하였다.
(4) 금 나노입자용액 준비
먼저 seed solution을 만들기 위하여 2.5 × 10-4 M HAuCl4과 2.5 × 10-4 M trisodium citrate 용액 각각 20 mL를 제조한다. 여기에 0.6 mL의 0.1 M NaBH4 천천히 가한다. 적갈색으로 변하는 금 나노입자를 얻을 수 있다. TEM을 이용하여 입자의 평균 사이즈를 측정한다. 만들어진 seed 금 나노입자에 9.0 mL의 2.5 × 10-4 M HAuCl4과 0.10M CTAB 용액을 첨가한다. 여기에 0.10 M ascorbic acid를 50μL 첨가하고 저어준다. 원심 분리를 통하여 진한 금 나노입자 용액을 수득하였다.
(5) 금-자성 실리카 나노입자 제조
준비된 자성 실리카 나노입자 0.5 g 에 금 나노입자 용액 10 mL를 첨가하고 24시간 동안 실온에서 잘 저어준다. 생성물을 증류수를 이용하여 세 번 세척하고 진공 건조함으로써 금-자성 실리카 나노입자를 제조하였다.
(6) 효소고정 금-자성 실리카 나노입자 제조
금-자성 실리카 나노입자 10 mg을 phosphate 버퍼 용액(PBS/NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4, 200μL)에 첨가한 후 초음파 분산기로 30분 정도 분산 시킨다. 여기에 3가지 종류의 셀룰라아제 즉 endo-glucanase(EGIVCBDII), exo-glucanase (CBHII), BglB(β-glucosidase) 50 mg을 첨가하고 4℃에서 1-2일 정도 잘 저어준다. 셀룰라아제가 고정된 금-자성 나노입자를 DW(distilled water)를 이용하여 세척하고 자성을 이용 분리하여 셀룰라아제고정 금-자성 실리카 나노입자를 제조하였다. 도면에서, 셀룰라아제고정 금-자성 실리카 나노입자는 MSNP@Au@Cellulases, Cellulases@Au-MSNP 또는 Au-MSNP@Cellulases로 표시되었다.
실시예 2
셀룰로오스 기질로 필터 페이퍼, pNPG, 및 CMC 용액을 준비하고, 준비된 셀룰로오스 기질을 각각 pH 4.5-5.0의 버퍼용액에 첨가하였다. 그 후 기질이 첨가된 버퍼용액에 실시예1에서 제조된 셀룰라아제 고정 금-자성 실리카 나노입자를 첨가하고 각 기질에 따른 최적의 반응 온도인 50℃ 혹은 80℃에서 30분에서 1시간 정도 반응 시켜 도 2에 도시된 바와 같이 연속식 가수분해를 수행하였다.
가수분해반응 후 자성을 이용하여 셀룰라아제 고정 금-자성 실리카 나노입자를 분리하고 cellobiose 및 glucose의 양을 측정하였다. 이 때, 자석에 의해 분리된 셀룰라아제 고정 금-자성 실리카 나노입자는 DW(distilled water)를 이용하여 세척하고 다시 재사용할 수 있다.
실시예 3
셀룰라아제 대신 자일라나제(Xylanase)제를 첨가한 것을 제외하면 실시예1과 동일한 방법으로 자일라나제고정 금-자성 실리카 나노입자를 제조하였다. 도면에서 자일라나제고정 금-자성 실리카 나노입자는 Au-MSNP@xylanase로 표시되었다.
실시예 4
효소고정 금-자성 실리카 나노입자의 재활용방법
실시예2에서 수행된 연속식 가수분해반응에 다수 재사용되어 활성이 거의 없는 고정화된 셀룰라아제를 셀룰라아제 고정 금-자성 실리카 나노입자의 표면에서 제거하기 위해 100℃에서 1시간 정도 sonication 하였다.
그 후, 실시예 1의 (6) 효소고정 금-자성 실리카 나노입자 제조 단계를 다시 수행하여 재활용 셀룰라아제 고정 금-자성 실리카 나노입자를 제조하였다.
비교예 1
실시예1에서 준비된 금 나노입자 용액에 phosphate 버퍼 용액(PBS/NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4, 200μL)을 첨가한 후 초음파 분산기로 30분 정도 분산 시킨다. 여기에 3가지 종류의 셀룰라아제 50 mg을 첨가하고 4℃에서 1-2일 정도 잘 저어준다. 셀룰라아제가 고정된 금 나노입자를 DW(distilled water)를 이용하여 세척하고 분리하여 셀룰라아제고정 금나노입자를 제조하였다. 도면에서, 셀룰라아제고정 금나노입자는 Au@Cellulases, Cellulases@AuNP 또는 AuNP@Cellulases로 표시되었다.
비교예 2
효소고정 금 나노입자를 사용한 것을 제외하면 실시예2와 동일한 방법으로 연속식 가수분해반응에 다수 재사용되어 활성이 거의 없는 고정화된 셀룰라아제를 셀룰라아제 고정 금 나노입자의 표면에서 제거하기 위해 100℃에서 1시간 정도 sonication 하였다. 그 후, 비교예 1과 동일한 방법으로 재활용 셀룰라아제 고정 금 나노입자를 제조하였다.
비교예 3
셀룰라아제가 아니라 자일라나제를 사용한 것을 제외하면 비교예1과 동일한 방법을 수행하여 자일라나제고정 금나노입자를 제조하였다. 도면에서, 자일라나제고정 금나노입자는 AuNP@xylanase로 표시되었다.
실험예 1
실시예1과 같이 금-자성 실리카 나노입자에 셀룰라아제 효소고정시 효소고정화 비율 및 비교예1과 같이 금 나노입자에 셀룰라아제 효소고정시 고정화 비율 즉 셀룰라아제의 결합 효율에 대해 측정하기 위해, 금-자성 실리카 나노입자 2mg 및 금나노입자 2ml에 각각 셀룰라아제의 양을 증가시키면서 첨가하여 고정화 시키고 나노입자에 결합 하지 않고 남은 셀룰라아제의 양을 brad-ford법을 이용해 측정하고 각각의 고정화 비율을 측정하였다. 그 결과는 도 3에 도시되었다.
도 3으로부터, 효소고정화 효율이 금-자성 실리카 나노입자가 금 나노입자보다 우수한 것을 알 수 있다.
실험예 2
실시예1에 따른 셀룰라아제 고정 금-자성 실리카 나노입자와 비교예1에 따른 셀룰라아제고정 금 나노입자에 각각 고정된 세 개의 주요 셀룰라아제 효소 즉 endo-glucanase (EGIVCBDII), exo-glucanase (CBHII), BglB(β-glucosidase)의 pH 영향을 알아보기 위해 각각의 pH(3.0-7.0)에서 pNPG 활성을 이용하여 조사하였고, 그 결과를 도 4에 도시하였다. 이 때 온도 조건은 80℃로 고정시켰다.
그 결과 도 4에 도시된 바와 같이 양자 모두에서 그 활성이 pH 4.5에서 최적이었으며, 고정화되지 않은 셀룰라아제 혼합물(Free cellulase) 및 셀룰라아제 고정 금 나노입자(AuNP@cellulases)보다 셀룰라아제 고정 금-자성 실리카 나노입자(Au-MSNP@Cellulases)가 각 pH에서 더 안정함을 알 수 있었다.
실험예 3
CMC 활성 테스트를 이용하고, 온도 조건을 50℃로 고정한 것을 제외하면 실험예2와 동일한 방법으로 고정화된 셀룰라아제 효소의 pH 영향을 조사하였고 그 결과를 도 5에 도시하였다.
도 5로부터 pH 5.0에서 최적이었으며, pNPG로 활성 조사한 결과와 마찬가지로 셀룰라아제 고정 금-자성 실리카 나노입자(Au-MSNP@Cellulases)가 고정화되지 않은 셀룰라아제 혼합물(Free cellulase) 및 셀룰라아제 고정 금 나노입자(AuNP@cellulases)보다 각 pH에서 더 안정함을 알 수 있었다.
실험예 4
Filter paper 활성 테스트를 이용하고, 온도 조건을 50℃로 고정한 것을 제외하면 실험예2와 동일한 방법으로 고정화된 셀룰라아제 효소의 pH 영향을 조사하였고 그 결과를 도 6에 도시하였다.
그 결과 도 6에 도시된 바와 같이 pH 4.0에서 최적이었으며, 도4, 도5의 결과와 마찬가지로 셀룰라아제 고정 금-자성 실리카 나노입자(Au-MSNP@Cellulases)가 가장 각각의 pH에서 안정함을 알 수 있었다.
실험예 5
실시예1에 따른 셀룰라아제 고정 금-자성 실리카 나노입자와 비교예1에 따른 셀룰라아제 고정 금 나노입자에 각각 고정된 셀룰라아제 효소의 열적안정성을 조사하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 열적안정성은 pH 4.5, 80도 조건에서 48시간까지 조사하였다.
도 7에 도시된 바와 같이 셀룰라아제고정 금-자성 실리카 나노입자(Au-MSNP@Cellulases)는 36시간 이상에서도 활성이 유지 되었으나, 고정화하지 않은 셀룰라아제 혼합물(Free cellulase) 및 셀룰라아제고정 금 나노입자(AuNP@cellulases)는 36시간부터 떨어지기 시작하였다. 이 결과로부터 금-자성 실리카 나노입자에 고정화된 셀룰라아제는 다른 경우보다 더 열에 안정함을 알 수 있었다.
실험예 6
실시예1에 따른 셀룰라아제고정 금-자성 실리카 나노입자와 비교예1에 따른 셀룰라아제고정 금 나노입자에 고정된 셀룰라아제의 재사용성을 실시예2와 같이 연속식 가수분해실험의 반복적 수행을 통해 실험하고 그 결과를 도8에 도시하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, 셀룰라아제고정 금 나노입자는 3번째 재사용 시부터 활성이 80%로 떨어지기 시작하면서 7번째 사용 시에는 거의 첫 번째보다 60% 정도 활성이 감소함을 알 수 있었다. 반면, 셀룰라아제고정 금-자성 실리카 나노입자는 7번째 재사용시에도 약 90% 활성이 유지 되고 있음을 알 수 있었다. 이 결과로부터 금-자성 실리카 나노입자에 효소를 고정하게 되면 금 나노입자에 효소를 고정한 것보다 재사용성이 매우 우수한 것을 알 수 있었다.
실험예 7
실시예4에 따라 재활용된 셀룰라아제고정 금-자성 실리카 나노입자와 비교예2에 따라 재활용된 셀룰라아제고정 금 나노입자에 고정된 셀룰라아제의 재사용성을 실시예2와 같이 연속식 가수분해실험의 반복적 수행을 통해 실험하고 그 결과를 각각 도9의 (a) 및 (b)에 도시하였다. 또한 재고정화된 셀룰라아제의 재사용성도 반복 조사하였다. (1st : 1번째 재활용, 2nd : 2번째 재활용, 3rd : 3번째 재활용, 4th: 4번째 재활용)
도 9에 도시된 바와 같이, 금 나노입자에 고정화된 경우에는 두 번째 재활용시부터 셀룰라아제들의 활성이 떨어지는 것을 알 수 있다. 하지만 금-자성 실리카 나노입자에 고정된 경우에는 4번을 재활용하여도 셀룰라아제 효소의 활성을 잘 유지 하고 있음을 알 수 있었다. 또한, 재고정화된 셀룰라아제들도 7번째까지 금-자성 실리카 나노입자에서는 그 활성이 약 90% 이상 잘 유지 되고 있음을 알 수 있었다.
실험예 8
실시예1에서 얻어진 셀룰라아제고정 금-자성 실리카 나노입자를 다수 사용하여 고정된 효소의 활성이 거의 없어진 경우, 나노입자 표면에서 활성이 거의 없어진 셀룰라아제들을 제거하기 전(Before Rinsing)과 실시예4에 기재된 방식으로 활성이 거의 없어진 셀룰라아제들을 제거한 후(After Rinsing)의 결과를 TEM(투과 전자 현미경) 및 EDX(Energy Dispersive X-ray Spectroscopy)를 통하여 확인하고, 도 10에 나타내었다.
도 10에 도시된 바와 같이, 투과 전자 현미경 관찰결과 rinsing 후 금-자성 실리카 나노입자 표면에서 셀룰라아제들이 잘 제거되었음을 알 수 있었고, EDX 결과에서도 같은 결과를 보였다. rinsing 전에는 셀룰라아제로부터 얻어진 탄소, 산소, 질소 원소들이 보였으나, 제거 후에는 거의 나타나지 않음으로 보아 금-자성 실리카 나노입자 표면에서 셀룰라아제들이 잘 제거되었음을 확인 할 수 있었다.
실험예 9
고정화하지 않은 셀룰라아제 혼합물(Free cellulase)과 실시예1에서 제조된 금-자성 실리카 나노입자에 고정화 된 셀룰라아제들을 filter paper를 이용하여 가수 분해 한 후 filter paper의 표면을 SEM(주사형 전자현미경)을 이용하여 확인하여 관찰하고, 그 결과를 도 11에 도시하였다. (a)는 셀룰라아제를 처리하기 전이며 (b)는 고정화되지 않은 셀룰라아제를 혼합하여 처리한 경우이고, (c)는 금-자성 실리카 나노입자에 고정화 된 셀룰라아제로 처리한 결과이다.
도 11로부터, 효소고정 금-자성 실리카 나노입자 즉 금-자성 실리카 나노입자에 고정화 된 셀룰라아제로 처리한 경우 셀룰로오스들의 직경이 가장 적은 것으로 보아 고정화되지 않은 경우보다 효과적으로 분해되었음을 알 수 있었다.
실험예 10
공지된 Xylanase 활성 테스트 방법을 이용하여 실시예3에서 얻어진 자일라나제고정 금-자성 실리카 나노입자(Au-MSNP@xylanase)에 고정화 된 자일라나제의 활성 테스트하고 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12로부터 금-자성 실리카 나노입자에 고정화된 자일라나제는 다른 경우보다 활성이 우수함을 알 수 있었다.
실험예 11
실시예3에서 얻어진 셀룰라아제고정 금-자성 실리카 나노입자와 비교예3에서 얻어진 자일라나제고정 금 나노입자에 고정된 자일라나제의 재사용성을 공지된 Xylanase 활성 테스트 방법의 반복적 수행을 통해 실험하고 그 결과를 도13에 도시하였다.
도 13으로부터 자일라나제고정 금 나노입자는 2번째 재사용 시부터 활성이 60%로 떨어지기 시작하면서 3번째 사용 시에는 거의 첫 번째보다 60% 이상 활성이 감소함을 알 수 있었다. 반면, 자일라나제고정 금-자성 실리카 나노입자는 5번째 재사용시에도 약 50% 이상의 활성이 유지 되고 있음을 알 수 있었다. 이 결과로부터 금-자성 실리카 나노입자에 자일라나제를 고정하더라도 금 나노입자에 자일라나제를 고정한 것보다 재사용성이 매우 우수한 것을 알 수 있었다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims (19)

  1. 자성 실리카 나노입자; 상기 자성 실리카나노입자의 표면에 도입되는 다수개의 -SH기; 상기 -SH기와 결합하여 상기 자성실리카나노입자 표면에 결합되는 하나 이상의 금나노입자; 및 상기 금나노입자에 결합되는 하나 이상의 효소를 포함하는데,
    상기 자성 실리카 나노입자는 Fe3O4를 전구체로 하여 합성되고 직경은 5 내지 50 nm이며,
    상기 효소의 활성이 50% 미만으로 떨어지면, 상기 금나노입자에 결합된 효소를 제거한 후 필요한 다른 효소를 상기 금나노입자에 결합시켜 재활용되는 것을 특징으로 하는 효소고정 금-자성 실리카 나노입자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 -SH기에 의해 시스테인 결합이 형성되는 것을 특징으로 하는 효소고정 금-자성 실리카 나노입자.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 금나노입자는 2 내지 10nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 효소고정 금-자성 실리카 나노입자.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 효소의 활성이 90%이상을 유지하는 상태로 10회 이상 재사용 가능한 것을 특징으로 하는 효소고정 금-자성 실리카 나노입자.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 효소의 활성이 50%이상을 유지하는 상태로 20회 이상 재사용 가능한 것을 특징으로 하는 효소고정 금-자성 실리카 나노입자.
  8. 삭제
  9. 자성 나노입자를 준비하는 단계; 상기 자성 나노입자를 이용하여 자성 실리카 나노입자를 준비하는 단계; 상기 준비된 자성 실리카 나노입자의 표면에 다수개의 -SH기를 도입하는 단계; 상기 -SH기가 도입된 자성실리카나노입자에 금나노입자를 결합시켜 금-자성실리카나노입자를 제조하는 단계; 및 상기 금-자성 실리카 나노입자에 효소를 고정하는 단계를 포함하는데,
    상기 자성 나노입자를 준비하는 단계는 이염화철 수용액과 삼염화철수용액을 혼합하는 단계; 혼합 용액을 교반하면서 수산화암모늄용액을 첨가하여 반응시키는 단계; 및 반응에 의해 얻어진 검정색 생성물을 분리하는 단계를 포함하고,
    상기 자성 실리카 나노입자를 준비하는 단계는 상기 준비된 자성 나노입자를 용매에 넣고 초음파 분산시키는 단계; 상기 분산된 용액에 TEOS(tetrathyl orthosilicate)를 첨가한 후 교반하면서 수산화암모늄 용액을 가하여 pH를 10이상으로 유지하는 단계; 및 상기 단계를 거친 생성물을 환류시킨 후 세척하고 진공 건조하는 단계를 포함하며,
    상기 금-자성 실리카 나노입자에 효소를 고정하는 단계는 상기 금-자성 실리카 나노입자에 버퍼를 첨가한 후 초음파 분산하는 단계; 상기 분산된 결과물에 효소를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 상기 반응에 의해 얻어진 효소고정 금-자성 실리카 나노입자를 세척한 후 자석을 이용하여 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소고정 금-자성 실리카 나노입자 제조방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 다수개의 -SH기를 도입하는 단계는
    -SH기를 포함하는 용액에 상기 자성 실리카 나노입자를 첨가한 후 환류시키는 단계; 및
    상기 단계를 거친 생성물을 분리하여 세척하고 진공 건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소고정 금-자성 실리카 나노입자 제조방법.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 금-자성실리카나노입자를 제조하는 단계는
    금 나노입자용액을 준비하는 단계;
    상기 금나노입자용액에 상기 -SH기가 도입된 자성 실리카 나노입자를 첨가한 후 반응시키는 단계; 및
    상기 반응 생성물을 세척하여 진공 건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소고정 금-자성 실리카 나노입자 제조방법.
  14. 삭제
  15. 제 1 항, 제 2 항, 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 효소고정 금-자성 실리카 나노입자를 가수분해효소로 사용하는 것을 특징으로 하는 연속식 가수분해 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 가수분해를 위한 효소반응이 종료된 후 상기 효소고정 금-자성 실리카 나노입자는 자석에 의해 분리된 후 세척되어 재사용되는 것을 특징으로 하는 연속식 가수분해 방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 가수분해의 기질이 바이오매스인 경우 상기 효소고정 금-자성 실리카 나노입자는 endo-glucosidase, exo-glucosidase, β-glucanase가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 연속식 가수분해 방법.
  18. 다수 사용되어 고정된 효소 활성이 저하된 제 1 항, 제 2 항, 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 효소고정 금-자성 실리카 나노입자로부터 고정된 효소를 제거하는 단계; 및
    상기 효소가 제거된 금-자성 실리카 나노입자에 신규 효소를 고정하는 단계를 포함하는 효소고정 금-자성 실리카 나노입자 재활용방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 고정된 효소를 제거하는 단계는 90 내지 110℃에서 초음파처리 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소고정 금-자성 실리카 나노입자 재활용방법.
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