CN106011206A - 用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法 - Google Patents

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王秀明
李淑琴
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Abstract

本发明公开了一种用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法，包括如下步骤：1)制备Fe3O4磁性纳米颗粒；2)配制壳聚糖溶液和多聚磷酸钠溶液并混合，得到复合载体溶液，加入Fe3O4磁性纳米颗粒，搅拌，磁分离，水洗涤，干燥，得复合载体磁性纳米颗粒；3)配制碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶混合溶液，加入复合载体磁性纳米颗粒，搅拌，滴加戊二醛水溶液，交联‑吸附，得复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶；4)配制植源性蛋白溶液，加入固定化双酶，制得活性肽；本发明环保、价廉，还充分发挥了两种蛋白酶复合的优势，提高了活性肽制备的得率以及抗氧化活性。本发明制得的复合载体磁性纳米颗粒固定化酶粒径小，具有超顺磁性。

Description

用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法
技术领域
本发明属制备固定化酶技术领域，涉及一种用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法。
背景技术
固定化酶技术是从均相到多相催化作用的一个范围转变，原理是通过化学或物理方法，用载体束缚住酶，或将酶限制在一定区域内，使酶在特定区域内实现催化酶解。固定化后的酶可以回收和重复使用，并使酶在流动系统中的应用成为可能。固定化酶通常都会显示出对pH和温度较高的稳定性，并且在酶解反应后，可以将酶和反应液分开，实现酶的回收并使产物得到分离和纯化。
磁性载体材料属于固定化酶技术中载体的新型材料，磁性粒子可以通过磁性倾析与反应液分离，因此其具有稳定性高、易回收、可重复利用等优点。相较于磁性粒子，磁性纳米颗粒(1～100nm)因其具有独特的超顺磁性、较大的表面积以及表面体积比，并能更好的进行扩散，而得到更加广泛的关注和研究。利用磁性纳米颗粒的超顺磁性，还可以在酶反应过程将磁场稳定的流动床作为反应器，实现连续性规模化生产。
米糠蛋白、红豆蛋白和玉米醇溶蛋白等蛋白，经蛋白酶水解后可降解为小分子量的活性肽，其具有抗氧化、降血压和免疫调节等多种生物活性并较于合成药物具有毒副作用小或无毒副作用的优点，因此制备植源性活性肽为研究的热点。现有技术多采用游离蛋白酶或者单一载体固定化单一酶对上述蛋白进行水解，游离蛋白酶在酶解反应后需高温灭活，高温条件可能会使蛋白或制备的活性肽失活，且游离蛋白酶难以回收，增加了产物后续纯化的难度，并不适宜工业化生产；单一载体固定化单一酶结合方式单一，吸附不牢固，不够稳定，酶解过程中也会出现水解不够充分等问题，因此此项技术也不够完善。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法.
本发明的技术方法概述如下：
用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法，包括如下步骤：
1)将三价铁盐和二价铁盐加入水，使二价铁的摩尔浓度为0.1～1.5M，升温至75～95℃，在1200～1500rpm搅拌条件下，滴加氨水，使pH为9～11，磁分离，水洗涤，干燥，得Fe3O4磁性纳米颗粒；Fe2+和Fe3+的摩尔比为1:2；
2)称取脱乙酰度≧90％的壳聚糖，溶解于加热的体积浓度为0.5～2％的冰醋酸水溶液，配制1～3mg/mL壳聚糖溶液；称取多聚磷酸钠，溶解于去离子水，配制1～2mg/mL多聚磷酸钠溶液；按壳聚糖和多聚磷酸钠的质量比1～4:1将壳聚糖溶液和多聚磷酸钠溶液混合，得到复合载体溶液，加入所述Fe3O4磁性纳米颗粒，1200～1500rpm搅拌20～40min，磁分离，水洗涤，干燥，得复合载体磁性纳米颗粒；所述Fe3O4磁性纳米颗粒质量与复合载体溶液中壳聚糖和多聚磷酸钠的总质量的比为10:1～5；
3)配制2～10mg/mL碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶混合溶液，加入所述复合载体磁性纳米颗粒，在1200～1500rpm搅拌条件下，滴加0.05～1体积倍的体积浓度为1％～5％戊二醛水溶液，滴加完毕后，在搅拌下交联-吸附2～10h，磁分离，水洗涤，干燥，得复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶；所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶的质量比为0.5～4:1；所述复合载体磁性纳米颗粒质量与碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶混合溶液中的碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶的总质量的比为1～8:1。
4)配制植源性蛋白溶液，调节pH为8～9，加入所述复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶，在50～55℃条件下反应1～2h，制得活性肽；所述复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶与植源性蛋白的质量比为1:4～25。
三价铁盐优选为FeCl3·6H2O、Fe2(SO4)3·9H2O或Fe(NO3)3·9H2O。
二价铁盐优选为FeSO4·7H2O、FeCl2·4H2O或Fe(NO3)2·6H2O。
植源性蛋白溶液为5mg/mL的米糠蛋白水溶液、5mg/mL的红豆蛋白水溶液或以体积浓度为95％乙醇水溶液为溶剂的5mg/mL的玉米醇溶蛋白溶液，也可以用其它浓度的蛋白水溶液。
本发明的优点：
本发明采用壳聚糖与多聚磷酸钠进行复合，并同时固定化碱性蛋白酶和胰蛋白酶，不仅发挥了天然产物安全、环保和易得价廉的优势，还充分发挥了两种蛋白酶复合的优势，提高了活性肽制备的得率以及抗氧化活性。本发明制得的复合载体磁性纳米颗粒固定化酶粒径小，具有超顺磁性，重复利用酶解米糠蛋白10次酶活仍达60％以上。
附图说明
图1为复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶在有、无外加磁场下的照片。(a)没有外加磁场；(b)有外加磁场
图2为复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶的磁滞回线。
图3为复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶的场发射透射电子显微镜图。
图4为复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶的重复利用稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明提供的一种用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法进行详细说明。
本发明所用的植源性蛋白是以米糠蛋白、红豆蛋白和玉米醇溶蛋白为例，但并不对其进行限定，实验证明，用其它的植源性蛋白为原料，也可以制备出活性肽。
实施例1
一种用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法，包括如下步骤：
1)将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O加入水，使FeSO4·7H2O的摩尔浓度为0.1M，FeCl3·6H2O的摩尔浓度为0.2M，升温至80℃，在1200rpm搅拌条件下，滴加体积浓度为25％的氨水，使pH为10，磁分离，水洗涤，干燥，得Fe3O4磁性纳米颗粒；
2)称取脱乙酰度90％的壳聚糖，溶解于加热至60℃的体积浓度为1％的冰醋酸水溶液，配制2mg/mL壳聚糖溶液；称取多聚磷酸钠，溶解于去离子水，配制1.5mg/mL多聚磷酸钠溶液；按壳聚糖和多聚磷酸钠的质量比4:1将壳聚糖溶液和多聚磷酸钠溶液混合，得到复合载体溶液，加入Fe3O4磁性纳米颗粒，1500rpm搅拌30min，磁分离，水洗涤，干燥，得复合载体磁性纳米颗粒；Fe3O4磁性纳米颗粒质量与复合载体溶液中壳聚糖和多聚磷酸钠的总质量的比为4:1；
3)配制6mg/mL碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶混合溶液，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶总质量的4质量倍的所述复合载体磁性纳米颗粒，在1500rpm搅拌条件下，滴加0.1体积倍的体积浓度为3％戊二醛水溶液，滴加完毕后，在搅拌下交联-吸附6h，磁分离，水洗涤，干燥，得复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶，测定酶活回收率为79.17％；所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶的质量比为3:1；
4)分别配制浓度为5mg/mL的米糠蛋白溶液、红豆蛋白溶液和玉米醇溶蛋白溶液，其中米糠蛋白溶液的溶剂和红豆蛋白溶液的溶剂为去离子水；玉米醇溶蛋白溶液的溶剂是体积浓度为95％乙醇水溶液；调节pH分别为9.0、8.0和8.5，分别加入蛋白质量0.25倍的所述复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶，在温度分别为50℃、50℃和55℃条件下，分别反应2h、1h和2h，制得米糠肽、红豆肽和玉米肽，三种活性肽的得率分别为58.78％、73.31％和49.7％，DPPH自由基清除率(0.17mg/mL)分别为12.26％、31.03％和21.39％。
经本发明制得的复合载体磁性纳米颗粒固定化酶成均匀球形，粒径在10～14nm之间，并具有超顺磁性，见图1、2、3。
实施例2
一种用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法，包括如下步骤：
1)将Fe2(SO4)3·9H2O和FeCl2·4H2O加入水，使FeCl2·4H2O的摩尔浓度为0.5M，Fe2(SO4)3·9H2O的摩尔浓度为1M，升温至95℃，在1500rpm搅拌条件下，滴加体积浓度为20％的氨水，使pH为11，磁分离，水洗涤，干燥，得Fe3O4磁性纳米颗粒；
2)称取脱乙酰度95％的壳聚糖，溶解于加热至62℃的体积浓度为2％的冰醋酸水溶液，配制3mg/mL壳聚糖溶液；称取多聚磷酸钠，溶解于去离子水，配制2mg/mL多聚磷酸钠溶液；按壳聚糖和多聚磷酸钠的质量比3:1将壳聚糖溶液和多聚磷酸钠溶液混合，得到复合载体溶液，加入Fe3O4磁性纳米颗粒，1200rpm搅拌40min，磁分离，水洗涤，干燥，得复合载体磁性纳米颗粒；所述Fe3O4磁性纳米颗粒质量与复合载体溶液中壳聚糖和多聚磷酸钠的总质量的比为10:1；
3)配制4mg/mL碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶混合溶液，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶总质量的1质量倍的所述复合载体磁性纳米颗粒，在1300rpm搅拌条件下，滴加0.05体积倍的体积浓度为5％戊二醛水溶液，滴加完毕后，在搅拌下交联-吸附2h，磁分离，水洗涤，干燥，得复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶，测定酶活回收率为75.70％；所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶的质量比为4:1；
4)分别配制浓度为5mg/mL的米糠蛋白溶液、红豆蛋白溶液和玉米醇溶蛋白溶液，其中米糠蛋白溶液的溶剂和红豆蛋白溶液的溶剂为去离子水；玉米醇溶蛋白溶液的溶剂是体积浓度为95％乙醇水溶液；调节pH分别为9.0、8.0和8.5，分别加入蛋白质量0.04倍的所述复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶，在温度分别为50℃、50℃和55℃，分别反应2h、1h和2h，制得米糠肽、红豆肽和玉米肽，三种活性肽的得率分别为54.23％、72.31％和51.42％，DPPH自由基清除率(0.17mg/mL)分别为11.29％、30.59％和24.53％。
实施例3
一种用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法，包括如下步骤：
1)将Fe(NO3)3·9H2O和Fe(NO3)2·6H2O加入水，使Fe(NO3)2·6H2O的摩尔浓度为1M，Fe(NO3)3·9H2O的摩尔浓度为2M，升温至75℃，在1300rpm搅拌条件下，滴加体积浓度为30％的氨水，使pH为9，磁分离，水洗涤，干燥，得Fe3O4磁性纳米颗粒；
2)称取脱乙酰度95％的壳聚糖，溶解于加热至63℃的体积浓度为0.5％的冰醋酸水溶液，配制1mg/mL壳聚糖溶液；称取多聚磷酸钠，溶解于去离子水，配制1mg/mL多聚磷酸钠溶液；按壳聚糖和多聚磷酸钠的质量比2:1将壳聚糖溶液和多聚磷酸钠溶液混合，得到复合载体溶液，加入Fe3O4磁性纳米颗粒，1300rpm搅拌40min，磁分离，水洗涤，干燥，得复合载体磁性纳米颗粒；所述Fe3O4磁性纳米颗粒质量与复合载体溶液中壳聚糖和多聚磷酸钠的总质量的比为2:1；
3)配制10mg/mL碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶混合溶液，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶总质量的8质量倍的所述复合载体磁性纳米颗粒，在1200rpm搅拌条件下，滴加0.5体积倍的体积浓度为2％戊二醛水溶液，滴加完毕后，在搅拌下交联-吸附8h，磁分离，水洗涤，干燥，得复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶，测定酶活回收率为73.30％；所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶的质量比为1:2；
4)分别配制浓度为5mg/mL的米糠蛋白溶液、红豆蛋白溶液和玉米醇溶蛋白溶液，其中米糠蛋白溶液的溶剂和红豆蛋白溶液的溶剂为去离子水；玉米醇溶蛋白溶液的溶剂是体积浓度为95％乙醇水溶液；调节pH分别为9.0、8.0和8.5，分别加入蛋白质量0.1倍的所述复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶，在温度分别为50℃、50℃和55℃，分别反应2h、1h和2h，制得米糠肽、红豆肽和玉米肽，三种活性肽的得率分别为57.46％、72.83％和54.45％，DPPH自由基清除率(0.17mg/mL)分别为13.74％、29.29％和25.09％。
实施例4
一种用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法，包括如下步骤：
1)将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O加入水，使FeSO4·7H2O的摩尔浓度为1.5M，FeCl3·6H2O的摩尔浓度为3M，升温至85℃，在1200rpm搅拌条件下，滴加体积浓度为50％的氨水，使pH为11，磁分离，水洗涤，干燥，得Fe3O4磁性纳米颗粒；
2)称取脱乙酰度95％的壳聚糖，溶解于加热至65℃的体积浓度为1％的冰醋酸水溶液，配制2mg/mL壳聚糖溶液；称取多聚磷酸钠，溶解于去离子水，配制1.5mg/mL多聚磷酸钠溶液；按壳聚糖和多聚磷酸钠的质量比1:1将壳聚糖溶液和多聚磷酸钠溶液混合，得到复合载体溶液，加入Fe3O4磁性纳米颗粒，1500rpm搅拌20min，磁分离，水洗涤，干燥，得复合载体磁性纳米颗粒；所述Fe3O4磁性纳米颗粒质量与复合载体溶液中壳聚糖和多聚磷酸钠的总质量的比为5:2；
3)配制2mg/mL碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶混合溶液，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶总质量的5质量倍的所述复合载体磁性纳米颗粒，在1500rpm搅拌条件下，滴加1体积倍的体积浓度为1％戊二醛水溶液，滴加完毕后，在搅拌下交联-吸附10h，磁分离，水洗涤，干燥，得复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶，测定酶活回收率为76.19％；所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶的质量比为2:1；
4)分别配制浓度为5mg/mL的配制米糠蛋白溶液、红豆蛋白溶液和玉米醇溶蛋白溶液浓度为5mg/mL，其中米糠蛋白溶液的溶剂和红豆蛋白溶液的溶剂为去离子水；玉米醇溶蛋白溶液的溶剂是体积浓度为95％乙醇水溶液；调节pH分别为9.0、8.0和8.5，分别加入蛋白质量0.05倍的所述复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶，在温度分别为50℃、50℃和55℃，分别反应2h、1h和2h，制得米糠肽、红豆肽和玉米肽，三种活性肽的得率分别为55.66％、76.53％和49.49％，DPPH自由基清除率(0.17mg/mL)分别为12.53％、32.19％、22.57％。
由各实施例结果可以看出，本发明制得的复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶具有良好的应用特性，制得的米糠肽、红豆肽和玉米肽的得率和抗氧化活性较游离酶制得的活性肽高。实施例5
按照实施例1中步骤4)所述条件用游离蛋白酶分别对米糠蛋白、红豆蛋白和玉米醇溶蛋白进行酶解：
配制5g/100mL米糠蛋白水溶液、红豆蛋白水溶液和玉米醇溶蛋白溶液(溶剂是体积浓度为95％乙醇水溶液)各20mL，加入45mg碱性蛋白酶和15mg胰蛋白酶，分别在50℃、50℃和55℃，反应pH分别为9.0、8.0和8.5的条件下，分别反应2h、1h和2h，制得米糠肽、红豆肽和玉米肽，三种活性肽的得率分别为50.23％、64.10％和44.30％，DPPH自由基清除率(0.17mg/mL)分别为9.10％、23.00％和20.01％。
本发明人对实施例1步骤3)所制得的复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶的重复利用性进行了研究，采用实施例中酶解条件，对米糠蛋白进行酶解，在相同的酶解条件下，本发明制得的复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶重复酶解米糠蛋白10次后，酶活仍达60％以上，见图4。
DPPH·自由基清除活性的测定：在100μL 5mg/mL所述三种活性肽溶液(空白用100μL蒸馏水代替，其他试剂依次同下)中，加入2.9mL的20μM DPPH·乙醇溶液，充分混匀，在37℃水浴条件下反应30min，(样品最终体系浓度为0.17mg/mL)，反应液于517nm测定吸光度值。DPPH·自由基清除率的计算公式如下：
I％＝[(A空-A样)/A空]×100
A空为空白对照的吸光度，A样为样品的吸光度。

Claims (4)

1.用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法，其特征是包括如下步骤：
1)将三价铁盐和二价铁盐加入水，使二价铁的摩尔浓度为0.1～1.5M，升温至75～95℃，在1200～1500rpm搅拌条件下，滴加氨水，使pH为9～11，磁分离，水洗涤，干燥，得Fe3O4磁性纳米颗粒；Fe2+和Fe3+的摩尔比为1:2；
2)称取脱乙酰度≧90％的壳聚糖，溶解于加热的体积浓度为0.5～2％的冰醋酸水溶液，配制1～3mg/mL壳聚糖溶液；称取多聚磷酸钠，溶解于去离子水，配制1～2mg/mL多聚磷酸钠溶液；按壳聚糖和多聚磷酸钠的质量比1～4:1将壳聚糖溶液和多聚磷酸钠溶液混合，得到复合载体溶液，加入所述Fe3O4磁性纳米颗粒，1200～1500rpm搅拌20～40min，磁分离，水洗涤，干燥，得复合载体磁性纳米颗粒；所述Fe3O4磁性纳米颗粒质量与复合载体溶液中壳聚糖和多聚磷酸钠的总质量的比为10:1～5；
3)配制2～10mg/mL碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶混合溶液，加入所述复合载体磁性纳米颗粒，在1200～1500rpm搅拌条件下，滴加0.05～1体积倍的体积浓度为1％～5％戊二醛水溶液，滴加完毕后，在搅拌下交联-吸附2～10h，磁分离，水洗涤，干燥，得复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶；所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶的质量比为0.5～4:1；所述复合载体磁性纳米颗粒质量与碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶混合溶液中的碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶的总质量的比为1～8:1。
4)配制植源性蛋白溶液，调节pH为8～9，加入所述复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶，在50～55℃条件下反应1～2h，制得活性肽；所述复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶与植源性蛋白的质量比为1:4～25。
2.根据权利要求1的方法，其特征是所述三价铁盐为FeCl3·6H2O、Fe2(SO4)3·9H2O或Fe(NO3)3·9H2O。
3.根据权利要求1的方法，其特征是所述二价铁盐为FeSO4·7H2O、FeCl2·4H2O或Fe(NO3)2·6H2O。
4.根据权利要求1的方法，其特征是步骤4)中所述植源性蛋白溶液为5mg/mL的米糠蛋白水溶液、5mg/mL的红豆蛋白水溶液或以体积浓度为95％乙醇水溶液为溶剂的5mg/mL的玉米醇溶蛋白溶液。
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