CN104480101A - 磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法及其产品和应用，属于纳米材料制备技术和生物催化技术领域。磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法包括以下步骤：制备四氧化三铁纳米颗粒；将四氧化三铁纳米颗粒超声分散后，在氮气保护下，与3-氨丙基三乙氧基硅烷反应，制备氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒；将氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒与氨基酰化酶溶液混合反应，得到磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶；制得的磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶用于拆分茶氨酸。与现有技术相比，本发明在确保酶活的前提下，大幅度提高氨基酰化酶的最适催化温度和重复利用效率，并且产物的回收方便，可以重复利用，适合于大规模工业生产。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料制备技术和生物催化技术领域，尤其是涉及一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法及其产品和应用。
背景技术
茶氨酸是一种非蛋白质氨基酸，属酰胺类小分子化合物，仅被发现存在于山茶科植物和一种蕈体内，是具有生物活性的次生代谢产物。研究表明，茶氨酸能够作为一种安全可靠的食品和保健品添加剂用以改善风味，降低血压，帮助缓解焦虑情绪并促进学习和记忆，保护神经系统及抗氧化等作用。
茶氨酸存在L型和D型两种对映体，自然界天然存在的茶氨酸多为L型。高效拆分茶氨酸对映体，是深入探讨L型和D型茶氨酸对人类健康影响的关键。在众多的氨基酸拆分技术中，由于酶法具有拆分效率高、立体选择性高、反应条件温和、专一性强、操作简单和有利于环保等优点，使得它在工业生产中具有很好的应用前景。氨基酰化酶法是同时得到两种构型氨基酸的最佳拆分方法，在日本已实现工业化生产。
氨基酰化酶(EC 3.5.1.14；aminoacylase)，也称N-酰基-L-氨基酸酰胺水解酶(N-acyl-L-amino-acid aminohydrolase)，它是生物技术领域应用最广泛的十种酶之一。该酶具有较强光学特异性，它将L-氨基酸酰化物水解成L-氨基酸，而未被水解的D-氨基酸酰化物和L-氨基酸分离后，经过一步水解就可以得到D-氨基酸，从而将L-氨基酸和D-氨基酸分离开来。由于使用游离酶拆分氨基酸时，酶的利用率低，生产成本较高，也不利于产品的分离纯化。因此，通过固定化酶拆分氨基酸是工业应用的趋势。
纳米磁性材料因具有超顺磁性、量子尺寸效应，表观磁性等一系列特殊性质，近年来成为研究热点。根据不同需要，纳米颗粒表面经过修饰后可以带上-NH2、-COOH、-CHO等活性基团，这些基团又可以再连接抗体、生物酶、蛋白等具有生物活性的大分子物质。在生物医学方面，纳米磁性材料可用于靶向药物、核磁共振成像、磁热疗等，具有广阔的应用前景。
在众多磁性纳米材料中，Fe3O4磁性纳米颗粒备受关注，它是反尖晶石结构铁氧体，具有制备工艺简单、无毒、性质稳定、生物相容性好等优点。磁性四氧化三铁纳米颗粒具有良好的表面活性和吸附性能，更具有超顺磁性，方便固定化酶在外加磁场的作用下快速回收，避免离心、筛板等耗能步骤。制备Fe3O4磁性纳米颗粒的常用方法有共沉淀法、溶胶凝胶法、微乳液法、水热法(溶剂热法)、模板合成法。
中国专利CN 101671664 A公布了一种固定化氨基酰化酶的制备方法，其包含下列步骤：在水中，60-90℃下将固定化材料(卡拉胶和明胶)溶解，降温至40-60℃，再加入氨基酰化酶，混合均匀，然后将此混合液流加到温度为20-35℃的有机溶剂中，搅拌，过滤得颗粒，将所得颗粒加入到KCL水溶液中固化，即可制得固定化氨基酰化酶，其中，所述的KCL水溶液中还含有戊二醛。该专利还公开了由其制得的固定化氨基酰化酶及其应用。其制备方法可有效降低固定化材料的凝固点，并且制得的固定化氨基酰化酶是颗粒状，流动性好，可以高效方便的拆分光学活性氨基酸。上述专利专注于酶的固定化，产品为固体颗粒，且需要过滤回收的固体颗粒，步骤繁琐。上述专利的产物的最适反应温度为37℃。但是在工业发酵生产过程中，发酵罐内温度很难达到37℃这样的低温，或者需要价格高昂的冷却设备才能达到，所以，上述专利的实用性较差。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法及其产品和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面提供一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备四氧化三铁纳米颗粒；
(2)将四氧化三铁纳米颗粒超声分散后，在氮气保护下，与3-氨丙基三乙氧基硅烷反应，制备氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒；
(3)将氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒与氨基酰化酶溶液混合反应，得到磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶。
步骤(1)中制备四氧化三铁纳米颗粒的方法通过化学共沉淀法完成，优选以下条件能够制备出磁性强、性质稳定的磁性四氧化三铁纳米颗粒：
用六水氯化铁和七水硫酸亚铁溶解于去离子水中，使铁离子和亚铁离子的摩尔比等于二比一。氮气除氧，边机械搅拌边逐滴加入5mol/L NaOH直至溶液pH为8-11，得到黑色的四氧化三铁纳米颗粒溶液，将此溶液放在55-65℃反应0.5-1min，得到的四氧化三铁纳米颗粒用去离子水和乙醇冲洗，重新分散在50％(v/v)的乙醇中。
步骤(2)中制备氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒的方法为：
将四氧化三铁纳米颗粒超声分散到乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，氮气保护，30-50℃机械搅拌18-36h，磁铁收集氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒，然后用去离子水和无水乙醇洗涤，50-70℃真空干燥，密封保存备用。
四氧化三铁纳米颗粒与3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为2∶1-4∶1。
步骤(3)中，制备磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的方法如下：
(1)将氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒溶于磷酸缓冲液，使其终浓度为2～8mg/ml，超声后，加入戊二醛，使戊二醛体积分数达到1.0％，25-40℃搅拌8-24h，磁铁收集，用相同的磷酸缓冲液洗涤纳米颗粒除去残留的戊二醛，得到中间纳米颗粒；
(2)将收集的中间纳米颗粒与氨基酰化酶溶液混合1-2.5h，磁铁收集后用相同的磷酸缓冲液洗涤以除去残留的游离酶，得到磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶。
所述的中间纳米颗粒与氨基酰化酶的摩尔比为2∶1-3∶1。
所述的磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH 6.5-7.0。
本发明第二方面提供一种由上述制备方法制得的磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶。
本发明第三方面提供一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的应用，所述的磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶用于拆分茶氨酸。所述的应用包括以下步骤：
将茶氨酸加入到磷酸缓冲液的体系中42℃保温5min，然后加入磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶，振荡反应30min，立即沸水浴5min终止反应。
所述的茶氨酸在磷酸缓冲液中的浓度为0.02mol/L，磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶与茶氨酸的比为1.5U∶1μmol-3U∶1μmol，所述的磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L pH 6.5-7.0。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、本发明实现了利用表面氨基修饰的磁性四氧化三铁纳米颗粒制备固定化氨基酰化酶的方法，为磁性纳米粒子固化酶技术提供了新的应用方法。
2、本发明利用新方法，在确保酶活的前提下，大幅度提高氨基酰化酶的最适催化温度和重复利用效率。固定化酶的最适反应温度的提高是因为酶的构象变化受到限制，酶与底物的结合需要较高的活化能。高温会降低底物的传质阻力，因此提高了固定化酶的活性。固定化酶比游离酶具有更高的酶活力，是由于共价键提高了固定化酶的稳定性，通过共价键的作用，固定化酶的构型发生改变使得其对pH变化的稳定性得到提高。纳米粒子提供的纳米微环境也有一定的缓冲作用，从而提高固定化酶的稳定性。
3、相比于现有技术需要37℃的条件，本发明中的固定化方法可以将氨基酰化酶的最适反应温度大幅度提升至52℃，更适用于工业生产。同时本发明中使用的磁性四氧化三铁颗粒具有磁性，在磁铁或磁场作用下可以轻松富集，相比于现有技术需要过滤回收固体颗粒，回收更容易，回收效率更高。因此本发明的工艺简单，整个制备系统容易构建，操作简便，条件易控，成本低廉，产物的回收方便，可以重复利用，适合于大规模工业生产。
4、使用纳米颗粒作为载体，磁性四氧化三铁纳米颗粒比表面积大，能够结合更多的酶，提高固定化酶的结合率；其特点为磁性纳米颗粒外周结合酶分子，相比其他固定化酶的方法，酶的空间位阻更小，反应过程更接近游离酶，更易结合反应底物，固定化酶催化效率更高。
附图说明
图1为表面氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒的扫描电镜图；
图2为温度对固定化酶与游离酶活性的影响；
图3为pH对固定化酶与游离酶活性的影响；
图4为固定化酶与游离酶的热稳定性曲线
图5为固定化酶的重复使用稳定性曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
表面氨基修饰的磁性四氧化三铁纳米颗粒制备
(1)称取6.76g六水氯化铁和3.48g七水硫酸亚铁溶解于100ml去离子水中，使铁离子和亚铁离子的摩尔比等于二比一。氮气除氧，边机械搅拌边逐滴加入5mol/L NaOH直至溶液pH＝10，得到黑色的四氧化三铁纳米颗粒溶液，将此溶液放在60℃反应30min，得到的四氧化三铁纳米颗粒用去离子水和乙醇冲洗3次，重新分散在50％(v/v)的乙醇中。
(2)将1.5g磁性四氧化三铁纳米颗粒超声分散到150ml 50％(v/v)的乙醇中，加入500μl 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，氮气保护，40℃机械搅拌24h，磁铁收集氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒，然后用去离子水和无水乙醇洗涤三次，60℃真空干燥，密封保存备用。
本实施例制得的表面氨基修饰的磁性四氧化三铁纳米颗粒扫描电镜图如图1所示，接枝后的四氧化三铁纳米颗粒粒径略大，为40nm左右，颗粒分布也更加均匀。
实施例2
将氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒与氨基酰化酶溶液混合反应，得到磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶。
(1)将一定量经过氨基修饰的磁性四氧化三铁纳米颗粒溶于0.1mol/L，pH 7.0磷酸缓冲液，使其终浓度为8mg/ml，超声15min，加入一定量戊二醛，使其终浓度达到1.0％，30℃搅拌1h，磁铁收集，用0.1mol/L，pH 7.0磷酸缓冲液洗涤纳米颗粒以除去残留的戊二醛。
(2)将收集的纳米颗粒与一定浓度的氨基酰化酶溶液混合1.5h，磁铁收集后用0.1mol/L，pH 7.0磷酸缓冲液洗涤以除去残留的游离酶。
实施例3
实施例2制得的磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶与游离酶的酶活性与酶反应温度的确定。
量取40mL 0.1mol/LpH7.0的磷酸缓冲液于250mL锥形瓶，加入5mL去离子水和5mL 0.2mol/L N-乙酰-DL-茶氨酸，分别在29℃、42℃、52℃、62℃、72℃保温5min，加入20mg游离氨基酰化酶或实施例2制得的磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶，振荡反应30min，立即沸水浴5min终止反应，冷却后稀释至一定浓度，取1mL待测样品进行茚三酮反应，充分摇匀，测定其OD570，对照标准曲线得到L-茶氨酸的产量。酶活力单位定义为：在pH7.0，42℃下，1h内酶催化反应生产1μmol L-茶氨酸为一个活力单位(U)。以最大酶活为100％，计算相对酶活。
其中温度对磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶或游离酶活性的影响如图2所示，由图2可知，游离酶的最适温度为42℃，而固定化酶的最适反应温度提高到52℃，大幅度提高了最适酶活。
实施例4
实施例2制得的磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶与游离酶的酶活性与酶反应pH的确定。
量取40mL 0.1mol/L，pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的磷酸缓冲液于250mL锥形瓶，加入5mL去离子水和5mL 0.2mol/L N-乙酰-DL-茶氨酸，在42℃保温5min，加入20mg游离氨基酰化酶或实施例2制得的磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶，振荡反应30min，立即沸水浴5min终止反应，冷却后稀释至一定浓度，取1mL待测样品进行茚三酮反应，充分摇匀，测定其OD570，对照标准曲线得到L-茶氨酸的产量。酶活力单位定义为：在pH7.0，42℃下，1h内酶催化反应生产1μmol L-茶氨酸为一个活力单位(U)。以最大酶活为100％，计算相对酶活，确定酶反应的最适pH。
其中pH对磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶或游离酶活性的影响如图3所示，由图3可知，当缓冲溶液pH低于7.0时，酶活随pH升高而增大，pH超过7.0后，酶活迅速下降。
实施例5
将等量游离酶和实施例2中得到的固定化酶分别置于29℃、42℃、52℃、62℃、72℃保温1h，取出后和底物在最适温度下反应，以初始酶活为对照，测定相对剩余酶活。
其中游离酶与固定化酶的热稳定性曲线如图4所示，当温度低于50℃时，固定化酶酶活基本不损失，游离酶酶活损失也不大。随着温度的升高，酶活力迅速减少，在72℃保温1h后，游离酶仅剩14％的酶活力，而固定化酶还剩下39％的酶活，说明酶经过固定化后，热稳定性能得到提高，这在实际工业化拆分中具有重要意义。
实施例6
最适温度下(52℃)进行实施例3的酶活实验，回收每次催化反应后的固定化酶，用0.1mol/L，pH 7.0磷酸缓冲液清洗后重新加入新鲜配制的反应溶液中，测定其活性，连续测定6次，考察固定化酶的剩余活性随着使用次数的变化情况。
固定化酶的重复使用稳定性曲线如图5所示，重复使用3次后，磁性四氧化三铁纳米颗粒固定的氨基酰化酶具有76％的活性，而使用6次后，固定化酶仍具有40％的活力。
实施例7
一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过化学共沉淀法制备四氧化三铁纳米颗粒：
用六水氯化铁和七水硫酸亚铁溶解于去离子水中，使铁离子和亚铁离子的摩尔比等于二比一。氮气除氧，边机械搅拌边逐滴加入5mol/LNaOH直至溶液pH为8，得到黑色的四氧化三铁纳米颗粒溶液，将此溶液放在55℃反应1min，得到的四氧化三铁纳米颗粒用去离子水和乙醇冲洗，重新分散在50％(v/v)的乙醇中，制备出磁性强、性质稳定的磁性四氧化三铁纳米颗粒；
(2)将四氧化三铁纳米颗粒超声分散到乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，四氧化三铁纳米颗粒与3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为2∶1，氮气保护，30℃机械搅拌36h，磁铁收集氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒，然后用去离子水和无水乙醇洗涤，50℃真空干燥，密封保存备用；
(3)将氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒溶于磷酸缓冲液，使其终浓度为2mg/ml，超声后，加入戊二醛，使戊二醛体积分数达到1.0％，25℃搅拌24h，磁铁收集，用相同的磷酸缓冲液洗涤纳米颗粒除去残留的戊二醛，得到中间纳米颗粒；
将收集的中间纳米颗粒与氨基酰化酶溶液混合1h，中间纳米颗粒与氨基酰化酶的摩尔比为2∶1。磁铁收集后用相同的磷酸缓冲液洗涤以除去残留的游离酶，得到磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶
磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶用于拆分茶氨酸，包括以下步骤：
将茶氨酸加入到磷酸缓冲液的体系中42℃保温5min，然后加入磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶，振荡反应30min，立即沸水浴5min终止反应。
茶氨酸在浓度为0.1mol/L pH 6.5的磷酸缓冲液中的浓度为0.02mol/L，磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶与茶氨酸的比为1.5U∶1μmol。
实施例8
一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过化学共沉淀法制备四氧化三铁纳米颗粒：
用六水氯化铁和七水硫酸亚铁溶解于去离子水中，使铁离子和亚铁离子的摩尔比等于二比一。氮气除氧，边机械搅拌边逐滴加入5mol/L NaOH直至溶液pH为11，得到黑色的四氧化三铁纳米颗粒溶液，将此溶液放在65℃反应0.5min，得到的四氧化三铁纳米颗粒用去离子水和乙醇冲洗，重新分散在50％(v/v)的乙醇中，制备出磁性强、性质稳定的磁性四氧化三铁纳米颗粒；
(2)将四氧化三铁纳米颗粒超声分散到乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，四氧化三铁纳米颗粒与3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为4∶1，氮气保护，50℃机械搅拌18h，磁铁收集氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒，然后用去离子水和无水乙醇洗涤，70℃真空干燥，密封保存备用；
(3)将氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒溶于磷酸缓冲液，使其终浓度为8mg/ml，超声后，加入戊二醛，使戊二醛体积分数达到1.0％，40℃搅拌8h，磁铁收集，用相同的磷酸缓冲液洗涤纳米颗粒除去残留的戊二醛，得到中间纳米颗粒；
将收集的中间纳米颗粒与氨基酰化酶溶液混合2.5h，中间纳米颗粒与氨基酰化酶的摩尔比为3∶1。磁铁收集后用相同的磷酸缓冲液洗涤以除去残留的游离酶，得到磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶
磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶用于拆分茶氨酸，包括以下步骤：
将茶氨酸加入到磷酸缓冲液的体系中42℃保温5min，然后加入磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶，振荡反应30min，立即沸水浴5min终止反应。
茶氨酸在浓度为0.1mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液中的浓度为0.02mol/L，磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶与茶氨酸的比为3U∶1μmol。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备四氧化三铁纳米颗粒；
(2)将四氧化三铁纳米颗粒超声分散后，在氮气保护下，与3-氨丙基三乙氧基硅烷反应，制备氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒；
(3)将氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒与氨基酰化酶溶液混合反应，得到磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶。
2.根据权利要求1所述的一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中制备氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒的方法为：
将四氧化三铁纳米颗粒超声分散到乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，氮气保护，30-50℃机械搅拌18-36h，磁铁收集氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒，然后用去离子水和无水乙醇洗涤，50-70℃真空干燥，密封保存备用。
3.根据权利要求2所述的一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法，其特征在于，四氧化三铁纳米颗粒与3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为2∶1-4∶1。
4.根据权利要求1所述的一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，制备磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的方法如下：
(1)将氨基修饰的四氧化三铁纳米颗粒溶于磷酸缓冲液，使其终浓度为2～8mg/ml，超声后，加入戊二醛，使戊二醛体积分数达到1.0％，25-40℃搅拌8-24h，磁铁收集，用相同的磷酸缓冲液洗涤纳米颗粒除去残留的戊二醛，得到中间纳米颗粒；
(2)将收集的中间纳米颗粒与氨基酰化酶溶液混合1-2.5h，磁铁收集后用相同的磷酸缓冲液洗涤以除去残留的游离酶，得到磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶。
5.根据权利要求4所述的一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法，其特征在于，所述的中间纳米颗粒与氨基酰化酶的摩尔比为2∶1-3∶1。
6.根据权利要求4所述的一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备方法，其特征在于，所述的磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为6.5-7.0。
7.一种由权利要求1所述的制备方法制得的磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶。
8.一种如权利要求7所述的磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的应用，其特征在于，所述的磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶用于拆分茶氨酸。
9.根据权利要求8所述的一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：
将茶氨酸加入到磷酸缓冲液的体系中42℃保温5min，然后加入磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶，振荡反应30min，立即沸水浴5min终止反应。
10.根据权利要求9所述的一种磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的应用，其特征在于，所述的茶氨酸在磷酸缓冲液中的浓度为0.02mol/L，磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶与茶氨酸的比为1.5U∶1μmol-3U∶1μmol，所述的磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为6.5-7.0。
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