CN103525805B

CN103525805B - 一种可再生的磁性固定化酶载体及其制备方法

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Publication number: CN103525805B
Application number: CN201310544114.8A
Authority: CN
Inventors: 蔡林君; 陈雷; 赵冰
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2013-11-05
Filing date: 2013-11-05
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2033-11-05
Also published as: CN103525805A

Abstract

一种可再生的磁性固定化酶载体及其制备方法，属于固定化酶技术领域。包括合成磁性Fe₃O₄纳米颗粒；制备核壳结构的Fe₃O₄@TiO₂磁性纳米复合物；制备锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物，对该纳米复合物表面进行功能化修饰从而得到Fe₃O₄@TiO₂固定化酶载体等步骤。本发明制备的固定化酶载体综合了磁性材料、纳米材料、TiO₂及表面功能基团修饰的优点，具有磁响应性、可再生利用、高生物相容性、与目标酶分子共价链接、酶荷载量高及稳定性好等优点。此外，本方法工艺简单，反应条件易控制。本发明可为酶提供性能优异的固定化载体，能有效降低酶大规模工业化应用的成本，在固定化酶领域具有巨大的应用潜力。

Description

一种可再生的磁性固定化酶载体及其制备方法

技术领域

本发明属于固定化酶技术领域，具体涉及一种可再生的磁性固定化酶载体及其制备方法。

背景技术

酶是一类生物催化剂，绝大多数酶的化学本质是蛋白质。与化学催化剂相比，酶具有专一性强、催化效率高、反应条件温和、活性可控等优点。但是酶不稳定，极易受外部坏环境影响而失去催化活性。另外，大多数酶为水溶性，导致其在催化反应后不易与底物和产物分离，不仅影响产物的纯度同时也使酶不能重复利用，这增加了酶在工农业应用中的成本。

固定化酶技术的出现为克服酶的上述缺点和为酶的大规模应用提供了有效途径，是酶工程最为活跃的研究领域之一。固定化酶技术是酶工程的一个重要分支，是指通过物理或/和化学方法，将水溶性酶固定在特定的载体上或将酶限制在一定的空间范围内从而限制酶分子的运动，但仍然允许酶发挥其催化功能且反应后酶可重复使用的一种技术。与游离酶相比，固定化酶在保留水溶性酶优点的同时，获得了可重复利用、稳定性好、活性提高、工艺简单、可规模化应用等优点。

固定化酶载体及酶与载体的固定化工艺是固定化酶的两个关键技术。载体材料的结构和性能对固定化酶的性能有着巨大的影响。设计和开发性能优异、符合特定需求的载体材料是目前固定化酶研究领域的一个重点和热点。随着材料科学和酶固定化技术的发展，固定化酶载体材料已从起初的天然高分子材料向无机材料、合成高分子材料及复合材料等方向发展。近年来，磁性纳米材料由于其自身的优点，在生物医学、环境科学、催化等领域的应用潜力越来越受到人们的关注。作为固定化酶载体，磁性纳米材料不仅具有纳米材料所特有的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应而且还具有磁响应性，使固定化酶在外部磁场的作用下易从反应体系中分离和回收；另外，也可以通过外磁场控制固定化酶在反应体系中的运动方向，这可以用来提高酶的催化效率。目前，已有文献和专利报道了磁性纳米颗粒用作固定化酶的载体。相关酶包括乙醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶、氯过氧化物酶等。酶与磁性纳米粒子组装构建的固定化酶实现了反应后，在外部磁场下酶从反应体系中的快速分离，以及酶的循环利用。此外，相对于微米级的酶载体，纳米材料由于其比表面积的增加具有更高的酶负载能力，从而有利于催化效率的提高。另一方面，以物理吸附方式固定化的酶，亲和性不高，容易导致催化反应或者循环催化过程中酶从载体上脱离，这样就大大降低了酶的循环利用次数。另外，将酶通过共价方式直接与磁性纳米粒子连接，容易导致酶的活性和稳定性降低，同时在这种情况下磁性纳米粒子之间很容易聚集，分散性差。

通过磁性纳米粒子表面功能化修饰或构建磁性纳米复合材料(如具有半导体外壳的复合磁性纳米颗粒、各种功能基团修饰的纳米复合微球等)可以提高固定化酶在溶液中的分散性，同时有效提高共价固定化酶的稳定性。Xin Gao等制备了二氧化硅包被的磁性纳米粒子，共价连接β-内酰胺酶后，发现其稳定性有了很大提高(Chem.Commun.,2003,24,2998-2999)；Wen Wang等合成了具有高分子外壳的磁性纳米粒子作为过氧化物酶的载体，这种磁性酶载体在酶的活性和多次循环利用方面都有很大的优越性(J.Am.Chem.Soc.,2009,131,12892–12893)。于洪巍等发明了一种磁性共价固定化酶载体的制备方法(专利号：201110201473)，通过对磁性纳米粒子表面的修饰，实现了载体与酶分子间的共价偶氮连接。

以上磁性纳米复合材料载体具有显著的优点，但其不足也十分明显，如这些载体的生物相容性有待进一步提高，而载体的生物相容性与固定化酶的活性直接相关；另一方面，当荷载的酶经过多次循环催化反应后活性会逐渐降低甚至失活，最终导致这些载体的弃用，而新载体的合成必然提高生产成本。

二氧化钛(TiO₂)是一种无毒、坏境友好的生物相容性材料，在生物医学领域具有广泛的应用前景。2012年，Wan Fu Ma等人利用磁性TiO₂纳米颗粒(Fe₃O₄@TiO₂NPs)的TiO₂能和磷酸化多肽的磷酸根基团非共价作用的特性，从生物样本中富集和分离磷酸化多肽(ACSNano,2012,6,3179-3188.)。另外，TiO₂因具有优异的光催化活性，被广泛用于有机污染物和微生物的光降解(Chemical Reviews,1995,95,735-758.)。因光催化引起的自清洁特性为TiO₂载体材料的再生利用提供了一条非常简单而有效的途径。

本专利结合了磁性纳米材料和TiO₂的优点，构建了表面功能化的具核壳结构的Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物，该复合物载体具有磁响应性、分散效果好、可再生利用、生物相同性好、及与酶共价连接、对酶荷载能力强等优点，是一种理想的固定化酶载体，在固定化酶领域具有巨大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种可再生的磁性固定化酶载体及其制备方法。本发明通过合成锐钛矿型磁性Fe₃O₄@TiO₂纳米材料并对其进行功能化修饰，从而使该固定化酶载体具有磁响应性、分散效果好、可再生性利用、高生物相容性、与酶共价连接、对酶荷载量高、稳定性好等优点，是一种理想的固定化酶载体，在固定化酶领域具有巨大的应用潜力。

为了实现上述发明目标，本发明采取以下技术方案：

(a)制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄NPs)：

Fe₃O₄磁性纳米颗粒通过溶剂热或水热方法合成。

溶剂热方法：将FeCl₃·6H₂O或Fe(NO₃)₃·9H₂O和乙酸钠按摩尔比1:9～1:11混合后分散于乙二醇中，FeCl₃·6H₂O或Fe(NO₃)₃·9H₂O在乙二醇溶液中的浓度范围为0.1～0.15mol/L；然后将得到的黄色溶液在200～220℃条件下反应8～12h；

水热方法：向0.1～0.2mol/L的FeCl₃·6H₂O或Fe(NO₃)₃·9H₂O的水溶液缓慢加入NaOH溶液，将溶液的pH值调至7.0～8.0，加热至60～80℃，过滤分离得到Fe(OH)₃凝胶，凝胶经洗涤后重新分散于水中，再用NaOH溶液将pH值调至10.0～11.0，然后将得到的溶液在200～220℃条件下水热反应6～8h；

上面步骤中所述在溶剂中分散的方法为磁力搅拌、机械搅拌或超声波方法。

将溶剂热方法或水热方法得到的溶液转移到玻璃容器中，用外磁场分离收集得到黑色磁性颗粒；将磁性颗粒用无水乙醇清洗3～5次，再利用外磁场分离收集并放置在20～60℃条件下挥发完全，从而得到Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄NPs)。

(b)制备核壳结构的Fe₃O₄@TiO₂磁性胶体纳米粒子(Fe₃O₄@TiO₂NPs)：

将步骤(a)制备的100～200mg Fe₃O₄NPs采用机械搅拌或超声波方法分散到200～300mL的乙醇、乙腈和NH₃·H₂O的混合溶液中，乙醇、乙腈和NH₃·H₂O的体积比160～200:40:1，再加入2～3mL钛酸四丁酯并搅拌1～2h；然后用外磁场分离收集得到磁性的Fe₃O₄@TiO₂胶体纳米粒子，将胶体纳米粒子用无水乙醇清洗3～5次，再利用外磁场分离收集并放置在20～60℃条件下挥发完全，从而得到核壳结构的Fe₃O₄@TiO₂磁性胶体纳米粒子(Fe₃O₄@TiO₂NPs)；

(c)制备锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物：

将步骤(b)制得的100mg Fe₃O₄@TiO₂NPs采用机械搅拌或超声波方法分散于100～200mL、60～70％(v/v)乙醇的水溶液中，然后加入2～3mL的NH₃·H₂O，然后将得到的悬浮液在160～180℃条件下水热反应18～24h，棕色的反应产物用外磁场分离收集后用无水乙醇清洗3～5次，再用外磁场分离收集并放置在20～60℃条件下挥发完全，从而制备得到锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物；

(d)制备Fe₃O₄@TiO₂固定化酶载体：

将步骤(c)制备的锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物采用机械搅拌或超声波方法分散于1～2％(w/w)的3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)水溶液中，并搅拌2～5h；利用外磁场分离收集得到APTMS-功能化的Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物，然后将其再分散于含2～3％(v/v)戊二醛的水溶液中，经室温孵育1～3h后获得本发明所述的乙醛化的Fe₃O₄@TiO₂固定化酶载体，乙醛化的Fe₃O₄@TiO₂固定化酶载体可直接用于酶的固定化。

载体对酶的荷载及荷载量的计算：

将需固定化的酶配制成溶液，并与载体按一定比例充分混合；酶与载体的固定化反应介质为pH＝7.2～7.4的磷酸盐缓冲液，反应条件为室温下1～2h或4℃下18～24h。

载体对酶的荷载量按下述方法计算：将步骤(d)制备获得的固定化酶载体加入到一定浓度的酶溶液中，在室温下孵育4～6h；每隔30～60min用紫外分光光度法或考马斯亮蓝法测酶蛋白浓度，根据加入固定化酶载体后酶蛋白溶液浓度的改变值计算出载体对酶的荷载量。

固定化酶活力的检测：

采用游离酶常规活力检测方法，测定各种固定化酶的活力。

载体的再生方法：

固定化酶经过多轮催化反应后，酶的活性必然会下降或丧失。荷载低活性或无活性固定化酶的Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物在紫外灯下照射3～5h；然后利用外磁场分离、收集，并用乙醇清洗，将残留的乙醇在20～60℃条件下挥发完全后可再次用于酶的固定化。

载体及固定化酶的保存方法：

空载体贮存在在4℃，含30～40％(v/v)的乙醇溶液中；使用前用pH＝7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗3～5次，每次利用外磁场分离收集，最后以pH＝7.2～7.4的磷酸盐缓冲液置换原来的保存液。

与载体相连的固定化酶贮存在4℃，含0.05％～0.1％(w/v)NaN₃、pH＝7.2～7.4磷酸盐缓冲液中；使用pH＝7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗3～5次，每次利用外磁场分离收集，最后以pH＝7.2～7.4的磷酸盐缓冲液置换原来的保存液。

本发明由于采取了以上技术方案，使制备的固定化酶载体具有以下显著的优点：

步骤(a)所述述技术合成的Fe₃O₄纳米颗粒核心为载体提供了磁性，为后续的分离、纯化、收集提供了极大的便利。

步骤(b)所述技术合成的TiO₂外壳为载体提供了高生物相容性以及可再生性。

步骤(c)所述技术合成的锐钛矿型TiO₂多孔外壳结构为载体提供了更大的比表面积，从而可有效提高载体荷载酶的能力。

步骤(d)所述技术可实现酶与载体的共价链接，从而获得稳定的固定化酶；提高了载体对酶的荷载能力；也是实现载体再生的前提。

步骤(g)所述技术可实现载体的再生利用。

附图说明

图1：实施例1制备的磁性Fe₃O₄纳米粒子的透射电镜图。如图所示，所制备的Fe₃O₄为球形，纳米粒子平均直径大约200nm。

图2：实施例1制备的磁性Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物的透射电镜图。如图所示，球状Fe₃O₄纳米粒子被多孔状的外壳包围，外壳与磁性核之间连接紧密而且连续。

图3：实施例5制备的磁性Fe₃O₄纳米粒子的透射电镜图。如图所示，所制备的Fe₃O₄为球形，纳米粒子平均直径大约170nm。

图4：实施例5制备的磁性Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物的透射电镜图。如图所示，球状Fe₃O₄纳米粒子被多孔状的外壳包围，外壳与磁性核之间连接紧密而且连续。

图5：实施例1制备的磁性Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物的拉曼光谱。如图所示，在633nm激发线下，锐钛矿型TiO₂的三个特征振动模式清晰可见，表明多孔外壳是锐钛矿型的TiO₂。

图6：实施例1制备的磁性Fe₃O₄@TiO₂固定化辣根过氧化物酶的拉曼光谱。如图所示，在413nm激发线下，出现了辣根过氧化物酶的特征拉曼谱线，证明该酶已经成功负载到Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物上。

具体实施方式

实施例1：一种可再生磁性固定化酶载体的制备方法，

(a)制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄NPs)：

Fe₃O₄磁性纳米颗粒通过以下溶剂热方法合成。在机械搅拌下将3.24g FeCl₃·6H₂O、10.44g乙酸钠、溶解在120mL乙二醇溶液中；将得到的黄色溶液转移到有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，在200℃反应12h；利用外磁场分离收集黑色的磁性颗粒；分离产物用无水乙醇清洗4次后再分离收集，并放置在60℃条件下挥发完全以备用。

(b)制备核壳结构Fe₃O₄@TiO₂磁性胶体纳米粒子(Fe₃O₄@TiO₂NPs)：

将200mg步骤(a)制备的Fe₃O₄NPs加入到含180mL乙醇、40mL乙腈和1mL NH₃·H₂O的混合溶液中；通过超声处理将Fe₃O₄NPs在上述溶液中充分分散；加入2mL钛酸四丁酯并机械搅拌2h；用外磁场分离收集出磁性的合成产物Fe₃O₄@TiO₂NPs胶体纳米粒子；Fe₃O₄@TiO₂NPs用无水乙醇清洗4次后再分离收集并放置在60℃条件下挥发完全以备用。

(c)制备锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物：

锐钛矿型TiO₂外壳是通过一种水热方法合成。将200mg步骤(b)制备获得的Fe₃O₄@TiO₂NPs纳米复合物通过超声的方法分散在含67％(v/v)乙醇的水溶液中，然后加入2mLNH₃·H₂O；将上述悬浮液转移到有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，在160℃反应24h；然后将得到的棕色反应产物(锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂)用外磁场收集；锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂用无水乙醇清洗4次后再分离收集，并放置在60℃条件下挥发完全以备用。

(d)制备Fe₃O₄@TiO₂固定化酶载体：

将步骤(c)制备的100mg锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂复合物用超声的方法分散在200mL、1％(w/w)的3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)水溶液中，并机械搅拌2h；利用外磁场分离收集APTMS-功能化的Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物；将APTMS-功能化的Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物分散在1mL、2.5％(v/v)戊二醛的水溶液中，并在室温孵育1h后获得乙醛化的Fe₃O₄@TiO₂固定化酶载体。

(e)载体对辣根过氧化物酶的荷载：

将80mg乙醛化的Fe₃O₄@TiO₂固定化酶载体与5mL、2mg/mL辣根过氧化物酶(EC1.11.1.7，Sigma)溶液充分混匀，室温孵育4h；每隔30min用紫外分光光度法测定不同时间点溶液的辣根过氧化物酶浓度，根据加入固定化酶载体后溶液酶蛋白浓度随时间的变化曲线，计算载体对酶的最大荷载量，结果发现室温孵育1.5h，载体对酶的荷载量达到最大值，装载量为21±5mg/g，保留了93±6％游离酶的活性。

(f)载体的再生方法：

荷载辣根过氧化物酶的Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物在紫外灯下照射4h；然后利用外磁场分离、收集，并用乙醇清洗，将残留的乙醇在60℃下挥发完全；随后的拉曼光谱和酶活力检测显示紫外线照射处理能有效的去除载体表面的辣根过氧化物酶；将紫外线处理后的载体再次进行步骤(d)和步骤(e)，载体对酶的荷载量和酶的活力没有显著改变；对载体连续进行了10次的再生处理，载体对对酶的荷载量和酶的活力没有显著改变。

(g)载体和固定化酶的保存：

将空载体在30％的乙醇溶液中，4℃条件下贮存12个月后载体对酶的荷载量没有显著改变，保留了99％以上的荷载效率；将固定化酶在含0.05％(w/v)NaN₃的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，4℃条件下贮存6个月，固定化酶的活性没有显著改变，保留了96％以上的酶活力。

实施例2：一种可再生磁性固定化酶载体的制备方法，

如同实例1的各步骤操作，不同的是实施例1的步骤(e)是将制备的载体与辣根过氧化物酶相连来检测载体对酶的荷载量和对酶活力的影响，而实施例2是将按实施例1步骤(a)～(d)制备的载体与漆酶相连来检测载体对漆酶(EC1.10.3.2，Fluka)的荷载量和对酶活力的影响。结果显示Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物载体对漆酶的装载量为98±9mg/g，保留了96±4％游离酶的活性。

实施例3：一种可再生磁性固定化酶载体的制备方法，

如同实例1的各步骤操作，不同的是实施例1的步骤(e)是将制备的载体与辣根过氧化物酶相连来检测载体对酶的荷载量和对酶活力的影响，而实施例3是将按实施例1步骤(a)～(d)制备的载体与乙醇脱氢酶(EC 1.1.1.1，Sigma)相连来检测载体对乙醇脱氢酶的荷载量和对酶活力的影响。结果显示Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物载体对乙醇脱氢酶的装载量为105±6mg/g，保留了93±5％游离酶的活性。

实施例4：一种可再生磁性固定化酶载体的制备方法，

如同实例1的各步骤操作，不同的是实施例1的步骤(e)是将制备的载体与辣根过氧化物酶相连来检测载体对辣根过氧化物酶的荷载量和对酶活力的影响，而实施例4是将按实施例1步骤(a)～(d)制备的载体与β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21，Sigma)相连来检测载体对β-葡萄糖苷酶的荷载量和对酶活力的影响。结果显示Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物载体对β-葡萄糖苷酶的装载量为125±10mg/g，保留了92±7％游离酶的活性。

实施例5：一种可再生磁性固定化酶载体的制备方法，

(a)制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄NPs)：

Fe₃O₄磁性纳米颗粒通过水热方法合成。向0.15mol/L Fe(NO₃)₃·9H₂O的水溶液缓慢加入NaOH溶液，将溶液的pH值调至8.0，加热至70℃，经过滤分离得到Fe(OH)₃凝胶，经洗涤后采用机械搅拌的方法重新充分分散于水溶液中，再用NaOH溶液将pH值调至11.0，然后将以上溶液转移到有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，在200℃反应6h；将反应完成后的溶液转移到玻璃容器中，利用外磁场收集黑色的磁性颗粒；分离产物用无水乙醇清洗5次后再分离收集，并放置在60℃条件下挥发完全以备用。

(b)制备核壳结构Fe₃O₄@TiO₂磁性胶体纳米粒子(Fe₃O₄@TiO₂)：

将200mg步骤(a)制备的Fe₃O₄NPs加入到含180mL乙醇、40mL乙腈和1mL NH₃·3H₂O的混合溶液中；通过超声处理将Fe₃O₄NPs在上述溶液中充分分散；加入2mL钛酸四丁酯并机械搅拌2h；用外磁场分离出磁性的合成产物Fe₃O₄@TiO₂胶体纳米粒子；Fe₃O₄@TiO₂NPs用无水乙醇清洗5次后再分离收集，并放置在60℃条件下挥发完全以备用。

(c)制备锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物：

锐钛矿型TiO₂外壳是通过一种水热方法合成。将200mg步骤(b)制备获得的Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物通过超声的方法分散在含60％(v/v)乙醇的水溶液中，然后加入2mL NH₃·H₂O；将上述悬浮液转移到有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，在160℃反应24h；然后棕色的反应产物(锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂)用外磁场收集；锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂用无水乙醇清洗5次后再分离收集，并放置在60℃条件下挥发完全以备用。

(d)制备Fe₃O₄@TiO₂固定化酶载体：：

将步骤(c)制备的100mg锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂复合物用超声的方法分散在200mL、1％(w/w)3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)水溶液中，并机械搅拌2h；利用外磁场分离、收集APTMS-功能化的Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物；将APTMS-功能化的Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物分散在1mL、2.5％(v/v)戊二醛的水溶液中，并在室温孵育1h后获得乙醛化的固定化酶载体。

(e)载体对辣根过氧化物酶的荷载：

将70mg乙醛化Fe₃O₄@TiO₂固定化酶载体与5mL的2mg/mL辣根过氧化物酶(EC1.11.1.7，Sigma)溶液充分混匀，室温孵育4h；每隔30min用紫外分光光度法测定不同时间点溶液的辣根过氧化物酶浓度，根据加入固定化酶载体后溶液酶蛋白浓度随时间的变化曲线，计算载体对酶的最大荷载量，结果发现室温孵育1.5h，载体对酶的荷载量达到最大值，装载量为22±4mg/g，保留了94±5％游离酶的活性。

(f)载体的再生方法：

荷载辣根过氧化物酶的Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物在紫外灯下照射5h；然后利用外磁场分离、收集，并用乙醇清洗，将残留的乙醇在室温下挥发完全；随后的拉曼光谱和酶活力检测显示紫外线照射处理能有效的去除载体表面的辣根过氧化物酶；将紫外线处理后的载体再次进行步骤(d)和步骤(e)，载体对酶的荷载量和酶的活力没有显著改变；对载体连续进行了10次的再生处理，载体对对酶的荷载量和酶的活力没有显著改变。

(g)载体和固定化酶的保存：

将空载体在30％(v/v)的乙醇溶液中，4℃条件下贮存10个月后载体对酶的荷载量没有显著改变，保留了97％以上的荷载效率；将固定化酶在含0.1％(w/v)NaN₃的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，4℃条件下贮存6个月，固定化酶的活性没有显著改变，保留了96％以上的酶活力。

实施例6：一种可再生磁性固定化酶载体的制备方法，

如同实例5的各步骤操作，不同的是实施例5的步骤(e)是将制备的载体与辣根过氧化物酶相连来检测载体对酶的荷载量和对酶活力的影响，而实施例6是将按实施例1步骤(a)～(d)制备的载体与漆酶(EC1.10.3.2，Fluka)相连来检测载体对酶的荷载量和对酶活力的影响。结果显示Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物载体对漆酶的装载量为87±6mg/g，保留了95±7％游离酶的活性。

实施例7：一种可再生磁性固定化酶载体的制备方法，

如同实例5的各步骤操作，不同的是实施例5的步骤(e)是将制备的载体与辣根过氧化物酶相连来检测载体对酶的荷载量和对酶活力的影响，而实施例7是将按实施例1步骤(a)～(d)制备的载体与β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21，Sigma)相连来检测载体对酶的荷载量和对酶活力的影响。结果显示Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物载体对β-葡萄糖苷酶的装载量为141±9mg/g，保留了90±5％游离酶的活性。

Claims

1.一种可再生的磁性固定化酶载体的制备方法，其步骤如下：

(a)制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒Fe₃O₄NPs；

溶剂热方法合成，是将FeCl₃·6H₂O或Fe(NO₃)₃·9H₂O和乙酸钠按摩尔比1:9～1:11混合后分散于乙二醇中，FeCl₃·6H₂O或Fe(NO₃)₃·9H₂O在乙二醇溶液中的浓度范围为0.1～0.15mol/L；然后将得到的黄色溶液在200～220℃条件下反应8～12h，再将得到的溶液转移到玻璃容器中，用外磁场分离收集得到黑色磁性颗粒；将磁性颗粒用无水乙醇清洗3～5次，再利用外磁场分离收集并放置在20～60℃条件下挥发完全，从而得到Fe₃O₄磁性纳米颗粒Fe₃O₄NPs；

或水热方法合成，是向0.1～0.2mol/L的FeCl₃·6H₂O或Fe(NO₃)₃·9H₂O的水溶液缓慢加入NaOH溶液，将溶液的pH值调至7.0～8.0，加热至60～80℃，过滤分离得到Fe(OH)₃凝胶，凝胶经洗涤后重新分散于水中，再用NaOH溶液将pH值调至10.0～11.0，然后将得到的溶液在200～220℃条件下水热反应6～8h；再将得到的溶液转移到玻璃容器中，用外磁场分离收集得到黑色磁性颗粒；将磁性颗粒用无水乙醇清洗3～5次，再利用外磁场分离收集并放置在20～60℃条件下挥发完全，从而得到Fe₃O₄磁性纳米颗粒Fe₃O₄NPs；

(b)制备核壳结构的Fe₃O₄@TiO₂磁性胶体纳米粒子Fe₃O₄@TiO₂NPs：将步骤(a)制备的100～200mg Fe₃O₄NPs分散于200～300mL的乙醇、乙腈和NH₃·H₂O的混合溶液中，乙醇、乙腈和NH₃·H₂O的体积比160～200:40:1，再加入2～3mL钛酸四丁酯并搅拌1～2h；然后用外磁场分离收集得到磁性的Fe₃O₄@TiO₂胶体纳米粒子，将胶体纳米粒子用无水乙醇清洗3～5次，再利用外磁场分离收集并放置在20～60℃条件下挥发完全，从而得到核壳结构的Fe₃O₄@TiO₂磁性胶体纳米粒子Fe₃O₄@TiO₂NPs；

(c)制备锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物：

将步骤(b)制得的100mg Fe₃O₄@TiO₂NPs分散于100～200mL、60～70％(v/v)乙醇的水溶液中，加入2～3mL的NH₃·H₂O，然后将得到的悬浮液在160～180℃条件下水热反应18～24h，棕色的反应产物用外磁场分离收集后用无水乙醇清洗3～5次，再用外磁场分离收集并放置在20～60℃条件下挥发完全，从而制备得到锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物；

(d)制备Fe₃O₄@TiO₂固定化酶载体：

将步骤(c)制备的锐钛矿型Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物分散于1～2％(w/w)的3-氨基丙基-三甲氧基硅烷APTMS水溶液中，并搅拌2～5h；利用外磁场分离收集得到APTMS-功能化的Fe₃O₄@TiO₂纳米复合物，然后将其再分散于含2～3％(v/v)戊二醛的水溶液中，经室温孵育1～3h后获得Fe₃O₄@TiO₂可再生磁性固定化酶载体。

2.如权利要求1所述的一种可再生的磁性固定化酶载体的制备方法，其特征在于：步骤(a)中的分散方法为磁力搅拌、超声波方法或机械搅拌分散。

3.如权利要求1所述的一种可再生的磁性固定化酶载体的制备方法，其特征在于：步骤(b)、(c)、(d)中的分散方法为机械搅拌或超声波方法。

4.一种可再生的磁性固定化酶载体，其特征在于：由权利要求1、2或3任一项所述的方法制备得到。