CN102517348A - 表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法 - Google Patents
表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102517348A CN102517348A CN2011104176752A CN201110417675A CN102517348A CN 102517348 A CN102517348 A CN 102517348A CN 2011104176752 A CN2011104176752 A CN 2011104176752A CN 201110417675 A CN201110417675 A CN 201110417675A CN 102517348 A CN102517348 A CN 102517348A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- surface active
- stir
- immobilized lipase
- rpm
- triglyceride
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1,3-甘油二酯的方法，包括如下步骤：1)以二价和三价铁盐的混合物共沉淀制备超顺磁性Fe3O4纳米粒子，以硅烷偶联剂进行修饰，并在修饰后的微粒外表以戊二醛活化，从而得到表面活化的磁性纳米粒子；2)加入脂肪酶酶溶液，搅拌、洗涤、干燥得到固定化酶；3)采用该固定化酶催化甘油与脂肪酸的酯化反应，得到1,3-甘油二酯。本发明所涉及的固定化脂肪酶在1,3-甘油二酯的合成反应中，活力、操作稳定、区域选择性均显著提高，酶的回收利用操作极大简化，产品纯度高且不含有害溶剂。
Description
发明领域
本发明涉及结构特异性化合物的制备方法，尤其涉及一种表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法。
背景技术
1, 3-甘油二酯是天然食用油脂（甘油三酯）的结构类似物，其口感、外观均与前者一致，但在人体内的代谢吸收方式不同：甘油三酯经消化酶消化后生成单甘酯和游离脂肪酸，二者吸收进入血液后，很大部分重新合成甘油三酯而增加血脂或造成脂肪积累。而1, 3-甘油二酯经消化酶作用后生成甘油和游离脂肪酸，甘油经丙酮酸进入 TCA 循环，游离脂肪酸被运往肝脏进行 β-氧化。因此，食用含有1, 3-甘油二酯的油脂具有降低脂肪积累、防止体重增加的效果。
天然存在的 1, 3-甘油二酯很少，因而其人工合成尤显重要。鉴于 1, 3-甘油二酯主要用作健康食用油脂，其合成过程中必须尽量避免酸、碱、有机溶剂等有害成分的参与以及高温、高压等苛刻条件对产品口感、外观的不良影响，因而适宜利用脂肪酶的区域选择性在无溶剂条件下由甘油和高级脂肪酸直接酯化是来合成高纯度的 1, 3-甘油二酯。已有利用游离脂肪酶催化合成 1, 3-甘油二酯的报道 [ 孟祥河, 邹冬芽, 段作营等. 无锡轻工大学学报, 2005, 23(2): 31-35 ]。
但是无溶剂合成 1, 3-甘油二酯的反应为高黏度非均相体系，这造成了脂肪酶在应用中分散性差、选择性下降、稳定性差、回收重复利用困难的问题。纳米材料能大幅提高分散性；另外，本实验室曾采用表面活化的疏水硅藻土为载体采用多种方法对 Arthrobacter sp. 脂肪酶进行固定化，发现通过交联处理脂肪酶的选择性和稳定性有显著提高 [ Yang G, Wu J-P, Xu G, et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,
2008, 2009, 57(1-4): 96-103 ]。此外，磁性材料为酶在高黏度体系中的回收重复利用提供了方便，刘薇等以磁性基质固定化的脂肪酶，具有出很好的分离效果 [ 刘薇, 白姝, 孙彦. 过程工程学报, 2004, 4(4): 362-366.
]。
为了同时解决脂肪酶在高粘度非均相体系中的若干问题，我们尝试将纳米材料、表面活化交联处理及磁性基质结合起来，对脂肪酶进行固定化。目前，尚无将疏水性表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶应用于无溶剂体系中 1, 3-甘油二酯合成的尝试的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法。
表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法的步骤如下：
1) 向200 mL无氧水中加入0.20~0.30 mol三价铁盐和0.10~0.15 mol二价铁盐，以盐酸调整至pH = 1.5~1.7，超声处理 20~30
min；升温至 65~90 ℃，在 1 300~ 1 500 rpm 搅拌下，N2 鼓泡 20~30 min，加入7.5~10 mL 质量百分数 25~28%的氨水或 10 ~15mL 10 mol/L NaOH，使溶液 pH = 9~10，15~30 min 后，磁分离，无氧水洗涤 5~10 次，再以 0.010~0.015 mol/L 乙醇水溶液洗涤 2~3 次；
2) 加入80~100 mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，4~8 mL硅烷交联剂，50~60 ℃、180~220 rpm搅拌 5~6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3~5次；
3) 加入16~20 mL pH = 7的磷酸缓冲液及16~20 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液，180~220 rpm搅拌2~3 h，磁分离，用pH = 7 的磷酸缓冲液洗涤3~5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；
4) 将含有10~50 mg 脂肪酶、pH = 5~10的水溶液与 10~50 mg 表面活化的磁性纳米粒子微球载体混合，0~4 ℃、180~220 rpm搅拌 12~24 h，加入5~25 μL 质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12~24 h，磁分离，冻干 8~12 h，得到磁性纳米固定化脂肪酶；
5) 将40~100
mg甘油和200~500 mg脂肪酸与 10~35 mg 4 Å 分子筛、10~50 mg脂肪酶混合，在 30~40 ℃、180~220 rpm 搅拌下反应 7~24 h，得到 1, 3-甘油二酯。
所述的二价铁盐为FeSO4·7H2O 或 FeCl2·4H2O。所述的三价铁盐为FeCl3·6H2O 或Fe2(SO4)3·7H2O。所述的硅烷交联剂为氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷。所述的脂肪酶为 Mucor javanicus、Rhizopus chinentis 或 Candia antarctica 脂肪酶。所述的脂肪酸为油酸或油酸与月桂酸、棕榈酸、硬脂酸中一种或几种的混合物。
本发明将磁性固定化脂肪酶应用于在无溶剂体系中合成 1, 3-甘油二酯的反应中，选择性、活力及操作稳定性均有显著提高，并且大大方便酶的回收和重复利用，产品纯度高、不含有毒溶剂，具有极大的应用价值。
附图说明
图 1 固定化脂肪酶与游离酶重复利用情况比较；
图 2 表面活化的磁性纳米粒子微球载体固定化酶扫描电子显微镜照片；
图 3 表面活化的磁性纳米粒子微球载体固定化酶透射电子显微镜照片；
图 4表面活化的磁性纳米粒子微球载体固定化酶 X 射线晶体衍射图谱。
具体实施方式
表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法的步骤如下：
1) 向200 mL无氧水中加入0.20~0.30 mol三价铁盐和0.10~0.15 mol二价铁盐，以盐酸调整至pH = 1.5~1.7，超声处理 20~30
min；升温至 65~90 ℃，在 1 300~ 1 500 rpm 搅拌下，N2 鼓泡 20~30 min，加入7.5~10 mL 质量百分数 25~28%的氨水或 10 ~15mL 10 mol/L NaOH，使溶液 pH = 9~10，15~30 min 后，磁分离，无氧水洗涤 5~10 次，再以 0.010~0.015 mol/L 乙醇水溶液洗涤 2~3 次；
2) 加入80~100 mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，4~8 mL硅烷交联剂，50~60 ℃、180~220 rpm搅拌 5~6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3~5次；
3) 加入16~20 mL pH = 7的磷酸缓冲液及16~20 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液，180~220 rpm搅拌2~3 h，磁分离，用pH = 7 的磷酸缓冲液洗涤3~5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；
4) 将含有10~50 mg 脂肪酶、pH = 5~10的水溶液与 10~50 mg 表面活化的磁性纳米粒子微球载体混合，0~4 ℃、180~220 rpm搅拌 12~24 h，加入5~25 μL 质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12~24 h，磁分离，冻干 8~12 h，得到磁性纳米固定化脂肪酶；
5) 将40~100
mg甘油和200~500 mg脂肪酸与 10~35 mg 4 Å 分子筛、10~50 mg脂肪酶混合，在 30~40 ℃、180~220 rpm 搅拌下反应 7~24 h，得到 1, 3-甘油二酯。
所述的二价铁盐为FeSO4·7H2O 或 FeCl2·4H2O。所述的三价铁盐为FeCl3·6H2O 或Fe2(SO4)3·7H2O。所述的硅烷交联剂为氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷。所述的脂肪酶为 Mucor javanicus、Rhizopus chinentis 或 Candia antarctica 脂肪酶。所述的脂肪酸为油酸或油酸与月桂酸、棕榈酸、硬脂酸中一种或几种的混合物。
实施例 1
将 3.0 g FeSO4·7H2O、5.8 g FeCl3·6H2O 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均匀，升温至 85 ℃，在 1 300 rpm 搅拌下N2 鼓泡 30 min，快速加入 7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及 N2 反应 30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至 pH = 7，0.015 mol/L 乙醇水溶液洗涤 3 次；
2) 加入80 mL体积分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，50 ℃、200 rpm搅拌 5 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3次；
3) 加入20 mL pH = 7的磷酸缓冲液及16 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，200 rpm搅拌2 h，磁分离，用pH = 7 的磷酸缓冲液洗涤3次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子。
4 ℃下，将 10 mg Mucor javanicus 脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 5 磷酸缓冲液，漩涡振荡混合 90 s，4 ℃、12 000 rpm 离心 5 min，弃去沉淀，加入 10 mg 载体，在冰浴中 200 rpm 搅拌24 h，加入25 μL
质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌24 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。
400 mg 油酸、80 mg 甘油、10 mg 固定化酶与 10 mg 4 Å 分子筛加入 2 mL 离心管中漩涡震荡充分混合，在 37 ℃、200 rpm 搅拌下反应 12 h，转化率达到 89%，目标产物含量 80%（质量分数）。
采用气象色谱内标法计算产物生成量及底物消耗量，三月桂酸甘油酯为底物，位置异构体过量值re = (1, 3-甘油二酯)% − (1, 2-甘油二酯)%，以每分钟催化消耗 1 μmol
油酸所需的酶量（或固定化酶量）为一个酯化活力单位（UE，μmol·min−1），每克蛋白所具有的酯化活力即为酯化比活。游离酶，位置异构体过量值re = 70%，比活为
0.133 U·(g 蛋白)−1，在40 ℃以上迅速失活，固定化酶位置异构体过量值re = 85%，酯化比活为游离酶的11倍，固定化酶经磁性分离回收可重复使用5次以上，在80 ℃仍不失活。
实施例 2
1) 向200 mL无氧水中加入0.20 mol三价铁盐和0.10 mol二价铁盐，以盐酸调整至pH =
1.7，超声处理 20 min；升温至 65 ℃，在1 500 rpm 搅拌下，N2 鼓泡 20~30 min，加入10 mL 质量分数 28%的氨水，30 min 后，磁分离，无氧水洗涤 10 次，0.010 mol/L 乙醇水溶液洗涤 2 次；
2) 加100 mL体积分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，50~60 ℃、220 rpm搅拌6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3~5次；
3) 加入20 mL pH = 7的磷酸缓冲液及20 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，220 rpm搅拌3 h，磁分离，用pH = 7 的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体。
4 ℃下，将 50 mg Mucor javanicus 脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 10 磷酸缓冲液，漩涡振荡混合 90 s，4 ℃、12 000 rpm 离心 5 min，弃去沉淀，加入 50 mg 载体，在冰浴中 220 rpm 搅拌12 h，加入5 μL 质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。
500 mg 油酸、100 mg 甘油、10 mg 固定化酶与 10 mg 4 Å 分子筛加入 2 mL 离心管中漩涡震荡充分混合，在 37 ℃、200 rpm 搅拌下反应 12 h，转化率大于 80%，目标产物含量大于 70%（质量分数）。
实施例 3
1) 向200 mL无氧水中加入0.30 mol三价铁盐和0.15 mol二价铁盐，以盐酸调整至pH =
1.7，超声处理 20 min；升温至 90 ℃，在 1 500 rpm 搅拌下，N2
鼓泡 20~30 min，加入10 mL 质量分数 28%的氨水，15 min 后，磁分离，无氧水洗涤 10 次，0.010 mol/L 乙醇水溶液洗涤 2 次；
2) 加入80 mL体积分数为50%的乙醇水溶液，4 mL硅烷交联剂，60 ℃、180 rpm搅拌 6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次；
3) 加入16 mL pH = 7的磷酸缓冲液及16 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，180 rpm搅拌3 h，磁分离，用pH = 7 的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体。
4 ℃下，将 50 mg Mucor javanicus 脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 10 磷酸缓冲液，漩涡振荡混合 90 s，4 ℃、12 000 rpm 离心 5 min，弃去沉淀，加入 50 mg 载体，在冰浴中 220 rpm 搅拌12 h，加入5 μL 质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。
200 mg 油酸、80 mg 甘油、10 mg 固定化酶与 10 mg 4 Å 分子筛加入 2 mL 离心管中漩涡震荡充分混合，在 37 ℃、200 rpm 搅拌下反应12 h，转化率大于80%，目标产物含量大于70%（质量分数）。
实施例 4
将 3.0 g FeSO4·7H2O、5.8 g FeCl3·6H2O 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均匀，升温至 85 ℃，在 1 300 rpm 搅拌下N2 鼓泡 30 min，快速加入 7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及 N2 反应 30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至 pH = 7，0.015 mol/L 乙醇水溶液洗涤 3 次；
2) 加入80 mL体积分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，50 ℃、200 rpm搅拌 5 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3次；
3) 加入20 mL pH = 7的磷酸缓冲液及16 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，200 rpm搅拌2 h，磁分离，用pH = 7 的磷酸缓冲液洗涤3次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子。
4 ℃下，将 10 mg Rhizopus chinentis 脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 5 磷酸缓冲液，漩涡振荡混合 90 s，4 ℃、12 000 rpm 离心 5 min，弃去沉淀，加入 10 mg 载体，在冰浴中 200 rpm 搅拌24 h，加入25 μL
质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌24 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。
400 mg 油酸、80 mg 甘油、10 mg 固定化酶与 10 mg 4 Å 分子筛加入 2 mL 离心管中漩涡震荡充分混合，在 37 ℃、200 rpm 搅拌下反应 12 h，转化率达到 90%，目标产物含量高于 80%（质量分数）；
实施例 5
1) 向200 mL无氧水中加入0.20 mol三价铁盐和0.10 mol二价铁盐，以盐酸调整至pH =
1.7，超声处理 20 min；升温至 65 ℃，在1 500 rpm 搅拌下，N2 鼓泡 20~30 min，加入10 mL 质量分数 28%的氨水，30 min 后，磁分离，无氧水洗涤 10 次，0.010 mol/L 乙醇水溶液洗涤 2 次；
2) 加100 mL体积分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，50~60 ℃、220 rpm搅拌6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3~5次；
3) 加入20 mL pH = 7的磷酸缓冲液及20 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，220 rpm搅拌3 h，磁分离，用pH = 7 的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体。
4 ℃下，将 50 mg Rhizopus chinentis 脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 10 磷酸缓冲液，漩涡振荡混合 90 s，4 ℃、12 000 rpm 离心 5 min，弃去沉淀，加入 50 mg 载体，在冰浴中 220 rpm 搅拌12 h，加入5 μL 质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。
500 mg 油酸、100 mg 甘油、10 mg 固定化酶与 10 mg 4 Å 分子筛加入 2 mL 离心管中漩涡震荡充分混合，在 37 ℃、200 rpm 搅拌下反应 12 h，转化率85%，目标产物含量75%（质量分数）。
实施例 6
1) 向200 mL无氧水中加入0.30 mol三价铁盐和0.15 mol二价铁盐，以盐酸调整至pH =
1.7，超声处理 20 min；升温至 90 ℃，在 1 500 rpm 搅拌下，N2
鼓泡 20~30 min，加入10 mL 质量分数 28%的氨水，15 min 后，磁分离，无氧水洗涤 10 次，0.010 mol/L 乙醇水溶液洗涤 2 次；
2) 加入80 mL体积分数为50%的乙醇水溶液，4 mL硅烷交联剂，60 ℃、180 rpm搅拌 6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次；
3) 加入16 mL pH = 7的磷酸缓冲液及16 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，180 rpm搅拌3 h，磁分离，用pH = 7 的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体。
4 ℃下，将 50 mg Rhizopus chinentis 脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 10 磷酸缓冲液，漩涡振荡混合 90 s，4 ℃、12 000 rpm 离心 5 min，弃去沉淀，加入 50 mg 载体，在冰浴中 220 rpm 搅拌12 h，加入5 μL 质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。
200 mg 油酸、80 mg 甘油、10 mg 固定化酶与 10 mg 4 Å 分子筛加入 2 mL 离心管中漩涡震荡充分混合，在 37 ℃、200 rpm 搅拌下反应12 h，转化率大于80%，目标产物含量大于67%（质量分数）。
实施例 7
将 3.0 g FeSO4·7H2O、5.8 g FeCl3·6H2O 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均匀，升温至 85 ℃，在 1 300 rpm 搅拌下N2 鼓泡 30 min，快速加入 7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及 N2 反应 30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至 pH = 7，0.015 mol/L 乙醇水溶液洗涤 3 次；
2) 加入80 mL体积分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，50 ℃、200 rpm搅拌 5 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3次；
3) 加入20 mL pH = 7的磷酸缓冲液及16 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，200 rpm搅拌2 h，磁分离，用pH = 7 的磷酸缓冲液洗涤3次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子。
4 ℃下，将 10 mg Candida antarctica
脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 5 磷酸缓冲液，漩涡振荡混合 90 s，4 ℃、12 000 rpm 离心 5 min，弃去沉淀，加入 10 mg 载体，在冰浴中 200 rpm 搅拌24 h，加入25 μL
质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌24 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。
400 mg 油酸、80 mg 甘油、10 mg 固定化酶与 10 mg 4 Å 分子筛加入 2 mL 离心管中漩涡震荡充分混合，在 37 ℃、200 rpm 搅拌下反应 12 h，转化率达到 90%，目标产物含量 70%（质量分数）；
实施例 8
1) 向200 mL无氧水中加入0.20 mol三价铁盐和0.10 mol二价铁盐，以盐酸调整至pH =
1.7，超声处理 20 min；升温至 65 ℃，在1 500 rpm 搅拌下，N2 鼓泡 20~30 min，加入10 mL 质量分数 28%的氨水，30 min 后，磁分离，无氧水洗涤 10 次，0.010 mol/L 乙醇水溶液洗涤 2 次；
2) 加100 mL体积分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，50~60 ℃、220 rpm搅拌6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3~5次；
3) 加入20 mL pH = 7的磷酸缓冲液及20 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，220 rpm搅拌3 h，磁分离，用pH = 7 的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体。
4 ℃下，将 50 mg Candida antarctica
脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 10 磷酸缓冲液，漩涡振荡混合 90 s，4 ℃、12 000 rpm 离心 5 min，弃去沉淀，加入 50 mg 载体，在冰浴中 220 rpm 搅拌12 h，加入5 μL 质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。
500 mg 油酸、100 mg 甘油、10 mg 固定化酶与 10 mg 4 Å 分子筛加入 2 mL 离心管中漩涡震荡充分混合，在 37 ℃、200 rpm 搅拌下反应 12 h，转化率大于 80%，目标产物含量大于 70%（质量分数）。
实施例 9
1) 向200 mL无氧水中加入0.30 mol三价铁盐和0.15 mol二价铁盐，以盐酸调整至pH =
1.7，超声处理 20 min；升温至 90 ℃，在 1 500 rpm 搅拌下，N2
鼓泡 20~30 min，加入10 mL 质量分数 28%的氨水，15 min 后，磁分离，无氧水洗涤 10 次，0.010 mol/L 乙醇水溶液洗涤 2 次；
2) 加入80 mL体积分数为50%的乙醇水溶液，4 mL硅烷交联剂，60 ℃、180 rpm搅拌 6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次；
3) 加入16 mL pH = 7的磷酸缓冲液及16 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，180 rpm搅拌3 h，磁分离，用pH = 7 的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体。
4 ℃下，将 50 mg Candida antarctica
脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 10 磷酸缓冲液，漩涡振荡混合 90 s，4 ℃、12 000 rpm 离心 5 min，弃去沉淀，加入 50 mg 载体，在冰浴中 220 rpm 搅拌12 h，加入5 μL 质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。
200 mg 油酸、80 mg 甘油、10 mg 固定化酶与 10 mg 4 Å 分子筛加入 2 mL 离心管中漩涡震荡充分混合，在 37 ℃、200 rpm 搅拌下反应12 h，转化率大于80%，目标产物含量大于67%（质量分数）。
Claims (6)
1.一种表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法，其特征在于它的步骤如下：
1) 向200 mL无氧水中加入0.20~0.30
mol三价铁盐和0.10~0.15
mol二价铁盐，以盐酸调整至pH
= 1.5~1.7，超声处理 20~30
min；升温至 65~90 ℃，在 1 300~ 1 500 rpm 搅拌下，N2 鼓泡 20~30 min，加入7.5~10 mL 质量百分数 25~28%的氨水或 10 ~15mL 10 mol/L NaOH，使溶液 pH = 9~10，15~30 min 后，磁分离，无氧水洗涤 5~10 次，再以 0.010~0.015 mol/L 乙醇水溶液洗涤 2~3 次；
2) 加入80~100 mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，4~8 mL硅烷交联剂，50~60 ℃、180~220 rpm搅拌 5~6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3~5次；
3) 加入16~20 mL pH = 7的磷酸缓冲液及16~20 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液，180~220
rpm搅拌2~3 h，磁分离，用pH = 7 的磷酸缓冲液洗涤3~5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；
4) 将含有10~50 mg 脂肪酶、pH = 5~10的水溶液与 10~50 mg 表面活化的磁性纳米粒子微球载体混合，0~4 ℃、180~220 rpm搅拌 12~24 h，加入5~25 μL 质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12~24
h，磁分离，冻干 8~12 h，得到磁性纳米固定化脂肪酶；
5) 将40~100 mg甘油和200~500 mg脂肪酸与 10~35 mg 4 Å 分子筛、10~50 mg脂肪酶混合，在 30~40 ℃、180~220 rpm 搅拌下反应 7~24 h，得到 1, 3-甘油二酯。
2.根据权利要求 1 所述的一种表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法，其特征在于所述的二价铁盐为FeSO4·7H2O 或 FeCl2·4H2O。
3.根据权利要求 1 所述的一种表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法，其特征在于所述的三价铁盐为FeCl3·6H2O 或Fe2(SO4)3·7H2O。
4.根据权利要求 1 所述的一种表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法，其特征在于所述的硅烷交联剂为氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷。
5.根据权利要求 1 所述的一种表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法，其特征在于所述的脂肪酶为 Mucor
javanicus、Rhizopus
chinentis 或
Candia antarctica 脂肪酶。
6.根据权利要求 1 所述的一种表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法，其特征在于所述的脂肪酸为油酸或油酸与月桂酸、棕榈酸、硬脂酸中一种或几种的混合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011104176752A CN102517348A (zh) | 2011-12-14 | 2011-12-14 | 表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011104176752A CN102517348A (zh) | 2011-12-14 | 2011-12-14 | 表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102517348A true CN102517348A (zh) | 2012-06-27 |
Family
ID=46288414
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011104176752A Pending CN102517348A (zh) | 2011-12-14 | 2011-12-14 | 表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102517348A (zh) |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102994491A (zh) * | 2012-07-12 | 2013-03-27 | 浙江大学 | 一种Thermus脂肪酶的固定化方法 |
| CN103355419A (zh) * | 2013-08-08 | 2013-10-23 | 陈昊然 | 一种富含1,3-甘油二酯的奶油及其制备方法 |
| CN103525805A (zh) * | 2013-11-05 | 2014-01-22 | 吉林大学 | 一种可再生的磁性固定化酶载体及其制备方法 |
| CN104178530A (zh) * | 2014-08-13 | 2014-12-03 | 暨南大学 | 一种利用鼓泡式反应器制备甘油二酯的方法 |
| CN104468600A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-03-25 | 北京奇虎科技有限公司 | 数据收集方法及客户端 |
| CN107326022A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-11-07 | 东北林业大学 | 一种硅烷化磁性纤维素微球固定脂肪酶的方法 |
| CN107937387A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-04-20 | 浙江大学 | 一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法 |
| CN108285910A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-07-17 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法 |
| CN109735526A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-05-10 | 浙江工业大学 | 一种磁性固定化脂肪酶及其在制备(r)-(+)-n-乙酰基-甲基苄胺中的应用 |
| CN110407331A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-11-05 | 李辉 | 一种绿色缓释阻垢剂的制备方法 |
| CN112592908A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-02 | 华南理工大学 | 一种磁性核-壳结构载脂肪酶的光酶催化剂及其制备方法和应用 |
| CN113881661A (zh) * | 2021-09-29 | 2022-01-04 | 淮阴工学院 | 基于羧甲基淀粉修饰的磁性纳米粒子固定化酶的方法 |
| CN115786290A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-03-14 | 郑州尼采生物科技有限公司 | 利用磁性纳米固定化酶将s腺苷甲硫氨酸转化合成acc方法 |
| GB2617451A (en) * | 2022-02-18 | 2023-10-11 | Shandong Acad Of Agricultural Sciences | Method for obtaining 1,3-diglyceride from high oleic sunflower oil |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0307154B1 (en) * | 1987-09-09 | 1993-08-04 | Kao Corporation | Preparation of diglycerides |
| CN101269844A (zh) * | 2007-03-23 | 2008-09-24 | 中国科学院上海应用物理研究所 | 氨基修饰的磁性纳米粒子及免疫磁性纳米分离试剂的制备方法 |
| CN101367895A (zh) * | 2008-09-05 | 2009-02-18 | 浙江大学 | 用于磁性纳米粒子仿生表面修饰的表面改性剂及制备和使用方法 |
| CN101503683A (zh) * | 2009-03-13 | 2009-08-12 | 华东理工大学 | 磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶、制备方法和用途 |
-
2011
- 2011-12-14 CN CN2011104176752A patent/CN102517348A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0307154B1 (en) * | 1987-09-09 | 1993-08-04 | Kao Corporation | Preparation of diglycerides |
| CN101269844A (zh) * | 2007-03-23 | 2008-09-24 | 中国科学院上海应用物理研究所 | 氨基修饰的磁性纳米粒子及免疫磁性纳米分离试剂的制备方法 |
| CN101367895A (zh) * | 2008-09-05 | 2009-02-18 | 浙江大学 | 用于磁性纳米粒子仿生表面修饰的表面改性剂及制备和使用方法 |
| CN101503683A (zh) * | 2009-03-13 | 2009-08-12 | 华东理工大学 | 磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶、制备方法和用途 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| GUANG YANG等: "Enhancement of the activity and enantioselectivity of lipase in organic systems by immobilization onto low-cost support", 《JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B: ENZYMATIC》 * |
| XIANQIAO LIU等: "Immobilization of lipase onto micron-size magnetic beads", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B》 * |
| 刘薇等: "磁性纳米粒子的制备及脂肪酶的固定化", 《过程工程学报》 * |
| 孙培龙等: "壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺及应用性质研究", 《中国粮油学报》 * |
| 孟祥河等: "无溶剂体系合成1 ,3-甘油二酯用脂肪酶的筛选及其酯化性质", 《无锡轻工大学学报》 * |
| 杨勇: "功能化磁性载体的制备及其固定化脂肪酶研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库，工程科技1辑》 * |
| 芮英宇等: "表面处理剂对磁性纳米粒子表面修饰效果的影响", 《宁波化工》 * |
| 陶维红等: "磁性多孔微粒对脂肪酶的固定化", 《化工进展》 * |
Cited By (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102994491A (zh) * | 2012-07-12 | 2013-03-27 | 浙江大学 | 一种Thermus脂肪酶的固定化方法 |
| CN103355419A (zh) * | 2013-08-08 | 2013-10-23 | 陈昊然 | 一种富含1,3-甘油二酯的奶油及其制备方法 |
| CN103355419B (zh) * | 2013-08-08 | 2015-01-21 | 陈昊然 | 一种富含1,3-甘油二酯的奶油及其制备方法 |
| CN103525805A (zh) * | 2013-11-05 | 2014-01-22 | 吉林大学 | 一种可再生的磁性固定化酶载体及其制备方法 |
| CN103525805B (zh) * | 2013-11-05 | 2016-08-17 | 吉林大学 | 一种可再生的磁性固定化酶载体及其制备方法 |
| US10138501B2 (en) | 2014-08-13 | 2018-11-27 | Jinan University | Method for preparing diglyceride using bubble column reactor |
| CN104178530A (zh) * | 2014-08-13 | 2014-12-03 | 暨南大学 | 一种利用鼓泡式反应器制备甘油二酯的方法 |
| WO2016023413A1 (zh) * | 2014-08-13 | 2016-02-18 | 暨南大学 | 一种利用鼓泡式反应器制备甘油二酯的方法 |
| CN104178530B (zh) * | 2014-08-13 | 2016-05-25 | 暨南大学 | 一种利用鼓泡式反应器制备甘油二酯的方法 |
| CN104468600A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-03-25 | 北京奇虎科技有限公司 | 数据收集方法及客户端 |
| CN107326022A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-11-07 | 东北林业大学 | 一种硅烷化磁性纤维素微球固定脂肪酶的方法 |
| CN107937387A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-04-20 | 浙江大学 | 一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法 |
| CN108285910A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-07-17 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法 |
| CN108285910B (zh) * | 2017-12-15 | 2022-02-08 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法 |
| CN109735526A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-05-10 | 浙江工业大学 | 一种磁性固定化脂肪酶及其在制备(r)-(+)-n-乙酰基-甲基苄胺中的应用 |
| CN110407331A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-11-05 | 李辉 | 一种绿色缓释阻垢剂的制备方法 |
| CN112592908A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-02 | 华南理工大学 | 一种磁性核-壳结构载脂肪酶的光酶催化剂及其制备方法和应用 |
| CN112592908B (zh) * | 2020-12-31 | 2023-07-25 | 华南理工大学 | 一种磁性核-壳结构载脂肪酶的光酶催化剂及其制备方法和应用 |
| CN113881661A (zh) * | 2021-09-29 | 2022-01-04 | 淮阴工学院 | 基于羧甲基淀粉修饰的磁性纳米粒子固定化酶的方法 |
| GB2617451A (en) * | 2022-02-18 | 2023-10-11 | Shandong Acad Of Agricultural Sciences | Method for obtaining 1,3-diglyceride from high oleic sunflower oil |
| GB2617451B (en) * | 2022-02-18 | 2024-06-19 | Shandong Acad Of Agricultural Sciences | Method for obtaining 1,3-diglyceride from high oleic sunflower oil |
| CN115786290A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-03-14 | 郑州尼采生物科技有限公司 | 利用磁性纳米固定化酶将s腺苷甲硫氨酸转化合成acc方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102517348A (zh) | 表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法 | |
| Mendes et al. | Properties and biotechnological applications of porcine pancreatic lipase | |
| JP5443997B2 (ja) | 改善及び安定化された活性の固定化界面酵素 | |
| Mehde et al. | Lipase-based on starch material as a development matrix with magnetite cross-linked enzyme aggregates and its application | |
| Aghabeigi et al. | Immobilization of lipase on the graphene oxides magnetized with NiFe2O4 nanoparticles for biodiesel production from microalgae lipids | |
| CN102304552A (zh) | 一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法 | |
| CN112029756A (zh) | 一种磁性固定化脂肪酶催化合成植物甾醇酯类化合物的方法 | |
| CN108285910B (zh) | 一种固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法 | |
| JP4043605B2 (ja) | カプサイシン類縁体の製造法 | |
| Wu et al. | Preparation and characterization of tannase immobilized onto carboxyl-functionalized superparamagnetic ferroferric oxide nanoparticles | |
| CN107164358A (zh) | 一种多巴胺及其衍生物快速交联表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法及其应用 | |
| KR100944071B1 (ko) | 디글리세라이드의 제조방법 | |
| CN104911222B (zh) | 一种离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法 | |
| Jiang et al. | Synthesis of phytosterol esters catalyzed by immobilized lipase in organic media | |
| WO2009130880A1 (ja) | 固定化酵素の製造方法 | |
| JP4931368B2 (ja) | 官能基交換反応用リパーゼ含有組成物、その製造方法及びその使用 | |
| US10870869B2 (en) | Enzymatic method for preparing glyceryl butyrate | |
| CN113174384B (zh) | 一种固定化酶及其制备方法与在opo制备中的应用 | |
| CN108690842A (zh) | 海洋微生物脂肪酶ys2071的固定化方法 | |
| CN111647593A (zh) | 生物矿化型固定脂肪酶的制备方法及其在催化合成opo中的应用 | |
| JP3813585B2 (ja) | ジグリセリドの製造方法 | |
| JP3929890B2 (ja) | ジグリセリドの製造方法 | |
| JP3813584B2 (ja) | ジグリセリドの製造方法 | |
| JP4012117B2 (ja) | 固定化酵素の製造方法 | |
| CN117737146B (zh) | 甘油酯型脂肪酸羟基脂肪酸酯及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120627 |