CN108285910B - 一种固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固定化脂肪酶生产1，3‑甘油二酯的方法，包括：将不饱和长链脂肪酸、甘油和固定化脂肪酶混合，在25～40℃下搅拌反应1～12h，经后处理后得到1，3‑甘油二酯；所述不饱和长链脂肪酸为油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸中的至少一种；不饱和长链脂肪酸与甘油的摩尔比为1～3∶1；以反应体系的体积为基准，固定化脂肪酶的质量体积浓度为4‰～1％；所述的固定化脂肪酶为固定化的米根霉脂肪酶、米赫根毛霉脂肪酶、Lipase RM‑IM脂肪酶、Palatase 20000L脂肪酶和Xhlip‑O脂肪酶中的至少一种。本发明的方法具有原料转化率高、酶催化效率高、产生杂质少、生产成本低、适合大规模工业化生产等特点。

Description

一种固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法
技术领域
本发明涉及生物化工领域，尤其涉及一种固定化脂肪酶生产1，3-甘油二酯的方法。
背景技术
甘油二酯是油脂中的天然成分，但相比较于甘油三酯含量而言是较少的，含量通常小于5％。在减肥烹调食用油脂中，有大约70％的甘油二酯是以1，3-甘油二酯的形式存在；而在普通油脂代谢中间产物中，则主要以 1，2(2，3)-甘油二酯形式存在。1，3-甘油二酯的代谢与甘油三酯和1，2-甘油二酯不同，它在以胰脂肪酶为主的消化酶的作用下水解成游离脂肪酸和 1(3)-甘油单酯，1(3)-甘油单酯再经β-氧化以能量形式释放出去，从而很少在体内储存，防止体内脂肪累积。因此食用含有1，3-甘油二酯的油脂具有降低脂肪积累、防止体重增加的效果。
从制备机理而言，1，3-甘油二酯的制备方法主要分为酶法和化学法合成，与酶法相比化学方法存在着很多缺点，如反应需要在高温条件下进行，对脂肪酸造成较大的破坏，会影响产品的质量；专一性不够强，副反应较多；设备投资大、成本高、能源消耗大。而酶法则克服了化学法反应的不足，并且是环境友好型，具有耗能少、无污染、可以合成特定的结构脂质等优点，因此酶法成为了制备1，3-甘油二酯的绿色合成工艺的主流方向，并越来越受到国内外学者的广泛研究。酶法合成1，3-甘油二酯的方法主要包括酶促直接酯化法、甘油解法、酯交换法。
甘油解法就是甘油和甘油三酯以一定比例混合，在1，3-特异性脂肪酶的催化作用下合成1，3-甘油二酯。如Gotog等选用大豆油、菜籽油和甘油在 Lipase3A催化作用下生产富含1，3-甘油二酯的油脂，其中1，3-甘油二酯含量达到40％以上(GotohN，WatanabeH，Nishide T，et al.General-purpose oils composition[P].United States Patent，6004611.1999-12-21)。Kahveci等采用Novozyme 435催化菜籽油和甘油合成甘油二酯，甘油二酯的含量达到 40％～50％(KahveciD，Guo Z，Ozcelik B，et al.Lipase-catalyzedglycerolysis in ionic liquids directed towards diglyceride synthesis[J].Process Biochemistry，2009,44(12)：1358-1365)。Valerio等以Novozyme 435作为催化剂，在乳化剂体系下催化甘油和橄榄油制备1，3-甘油二酯，在最优条件下 1，3-甘油二酯的含量为17％(Valerio A，Rovani S，Treichel H，et a1. Optimization of monoanddiacylglycerols production from enzymatic glycerolysis in solvent-freesystems[J].Bioprocess and Biosystems Engineering，2010，33(7)：805-812)。Yamane等用氢化牛油和甘油通过程序降温使目标产物固体不断析出的方法，耗时78h制备得到90％的甘油二酯(Yamane T，Kang S T，Katsuyoshi K，et al.High-yield diacylglycerolformation by solid-phase enzymatic glycerolysis of hydrogenated beef tallow[J].Journal of the American Oil Chemists Society，1994,71(3)：339-342)。由于甘油解法收率低，产品纯度低，收率低，导致生产成本偏高，不利于大规模制备1，3-甘油二酯。
酯交换法即以甘油三酯和甘油单酯(或脂肪酸甲酯)为原料，在1，3-特异性脂肪酶催化作用下发生酰基转移，从而使酰基重新分布而生成1，3-甘油二酯。Weber等研究了以Lipozyme RMIM作为催化剂催化菜籽油与甘油单酯之间的反应，并且优化了反应温度、底物摩尔比等单因素条件，可获得75％的甘油二酯(Weber N，Mukherjee K D.Solvent-freelipase-catalyzed preparation of diacylglycerols[J].Journal of Agriculturaland Food Chemistry，2004,52(17)：5347-5353)。Blasi等分两步合成1，3-甘油二酯，先将橄榄油溶解于96％(v/v)的乙醇中，利用Novozyme 435将其醇解为脂肪酸乙酯和甘油；然后再将1，3-特异性脂肪酶加入到体系中，利用其催化脂肪酸乙酯和甘油来重新合成1，3-甘油二酯，反应72h后体系中的 1，3-甘油二酯的含量达到60％(Blasi F，Cossignani L，Simonetti M S，et al. Biocatalysed synthesis of Sn-1，3-diacylglycerol oil fromextra virgin olive oil [J].Enzyme and Microbial Technology，2007,41(6-7)：727-732)。酯交换反应实质是甘油三酯的水解和酯化反应的复合反应，即甘油三酯先水解为甘油单酯或甘油和游离脂肪酸后，酰基与甘油单酯或甘油再酯化为甘油二酯。要在水解反应和酯化反应之间建立动态平衡才能优化酯交换反应，但是这种平衡是不容易实现的，并且以甘油单酯为原料制备甘油二酯，成本高，所以不适合生产1，3-甘油二酯。
酯化法就是以脂肪酸和甘油为原料，在1，3-特异性酶的催化作用下合成1，3-甘油二酯，反应过程中会有甘油单酯和甘油三酯等副产物产生。Rosu 等研究了利用固定化脂肪酶在无溶剂体系中催化甘油与低熔点脂肪酸合成甘油二酯，采用加入分子筛或真空泵、通入氮气来除去反应过程中产生的水分，在反应8h后，1，3-二乙酸甘油酯的含量可以达到84％(Rosu R， Yasui M，Iwasaki Y，et al.Enzymatic synthesis of symmetrical 1，3-diacylglycerols by direct esterification of glycerol in solvent-free system[J]. Journal of the American Oil Chemists Society，1999,76(7)：839-843)。Watanabe等研究了在真空度0.4KPa、反应温度50℃、脂肪酸与甘油的摩尔比2∶1、酶量5％的条件下，反应3h可获得1，3-甘油二酯的含量为70％ (Tecela
Figure BDA0001510043460000031
o，C.，Rivera，I.，Sandoval，G.，Ferreira-Dias，S.，Carica papaya latex： A low-cost biocatalyst for humanmilk fat substitutes production.Eur.J.Lipid Sci.Technol.2012，114，266-276)。
直接酯化法具有反应时间较短，产物纯度高，反应可一步完成等优点，可以具体到合成某一种脂肪酸的1，3-甘油二酯，这是其他方法所不具有的优势，对于生产特定高纯度的1，3-甘油二酯而言是十分有利的。
然而，直接酯化法需要在线除去反应产生的水，推动反应朝正方向进行，同时需要解决脂肪酸与甘油的混合问题。现有的工艺在反应结束后，会剩余部分未反应的油酸以及在反应中产生的单甘酯，同时由于脂肪酶选择性的限制，很难得到高纯度的甘油二酯。从固定化酶方面考虑，传统的树脂固定化酶只适合在填充床中使用，而由于脂肪酸与甘油的不互溶性，导致该反应很难在填充床中进行。所以为使固定化酶在高强度的搅拌中不发生破裂，需寻找一种抗剪切力且容易回收的材料用于酶的固定化。
在酶方面，脂肪酶对甘油酯化的位置选择性可以分为无选择性、低选择性、较高选择性和高选择性。酶化法制备高纯度的1，3-甘油二酯的关键问题是获得一种合适的脂肪酶，要求该脂肪酶具有高度的位置选择性、高活力以及稳定性强，其中酶的位置选择性是影响甘油二酯合成中最关键的因素。
发明内容
本发明提供一种固定化脂肪酶生产1，3-甘油二酯的方法，该方法具有原料转化率高、酶催化效率高、产生杂质少、生产成本低、适合大规模工业化生产等特点。
本发明提供了如下技术方案：
一种固定化脂肪酶生产1，3-甘油二酯的方法，包括：
将不饱和长链脂肪酸、甘油和固定化脂肪酶混合，在25～40℃下搅拌反应1～12h，经后处理后得到1，3-甘油二酯；
所述不饱和长链脂肪酸为油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸中的至少一种；
不饱和长链脂肪酸与甘油的摩尔比为1～3∶1；
以反应体系的体积为基准，固定化脂肪酶的质量体积浓度为4‰～1％；
所述的固定化脂肪酶中，脂肪酶为米根霉脂肪酶、米赫根毛霉脂肪酶、Lipase RM-IM脂肪酶、Palatase 20000L脂肪酶和Xhlip-O脂肪酶中的至少一种。
米根霉脂肪酶、米赫根毛霉脂肪酶、Lipase RM-IM脂肪酶购自于 sigma-aldrich公司，Palatase 20000L脂肪酶购自于Novozyme公司，Xhlip-O 脂肪酶购自于杭州馨海生物科技有限公司。
优选的，脂肪酶为米根霉脂肪酶、米赫根毛霉脂肪酶或Lipase RM-IM 脂肪酶；最优选的，所述的脂肪酶为米根霉脂肪酶。
上述脂肪酶对甘油酯化具有较高的位置选择性，使甘油1，3位发生酯化反应，催化甘油酯化时，体系中生成的甘油单酯和1，2-甘油二酯含量极低，1，3-甘油二酯含量高，酯化产物纯度高。
优选的，所述的不饱和长链脂肪酸为油酸；不饱和长链脂肪酸与甘油的摩尔比为2～3∶1。
不饱和长链脂肪酸与甘油的摩尔比高于理论反应摩尔比，有利于酯化反应向正反应方向进行，使甘油完全反应，再通过后处理除去过量的油酸，提高反应产物中1，3-甘油二酯的含量。
优选的，在真空条件下进行反应，反应体系的真空度为100～800pa。
反应在真空条件下进行，可以有效除去反应体系中生成的水，使酯化反应向正反应方向进行，使反应更彻底。
进一步优选的，反应体系的真空度为100～500pa。真空度较高时无法有效除水，降低酯化反应的程度。
本发明的方法中，不需要添加溶剂来溶解反应底物，以纯底物进行反应，脂肪酶的添加量少。但是为了增加不饱和脂肪酸和甘油的分散性，需要将反应体系进行强搅拌，搅拌速度影响反应底物的分散性，进而影响反应效率。优选的，反应时，搅拌速度为200～1000rpm；进一步优选的，搅拌速度为400～800rpm。
搅拌速度较低时，反应底物分散性不好，影响反应效果；当搅拌速度大于800rpm后，搅拌速度对反应效果几乎没有影响。
优选的，反应时间为4～8h。
优选的，以反应体系的体积为基准，固定化脂肪酶的质量体积浓度为 8‰～1％；再优选的，固定化脂肪酶的质量体积浓度为0.5～1％。
优选的，所述的后处理为：将反应产物溶解于乙酸乙酯中，加入碱溶液进行液相萃取，取乙酸乙酯相，出去乙酸乙酯得到纯化的1，3-甘油二酯。
反应产物中剩余的不饱和脂肪酸与碱反应，生成溶于水相的不饱和脂肪酸盐，通过萃取除去反应剩余的不饱和脂肪酸，纯化1，3-甘油二酯。
所述的碱为氢氧化钠或碳酸钠。
优选的，固定化脂肪酶的制备方法包括以下步骤：
(1)采用水热法合成纳米四氧化三铁，采用硅烷偶联剂及戊二醛对所述纳米四氧化三铁进行修饰；
(2)将脂肪酶和界面激活剂溶解于缓冲溶液中得到固定化溶液，将修饰后的纳米四氧化三铁作为载体加入到固定化溶液中进行固定化反应；
所述界面激活剂包括吐温、蔗糖酯、正己醇、正己烷、曲拉通X-100 和十二烷基硫酸钠中的至少一种；
(3)固定化反应结束后，向固定化溶液加入戊二醛进行交联，交联结束后分离、洗涤、干燥，得到固定化脂肪酶。
以纳米四氧化三铁为载体，通过添加界面激活剂实现对脂肪酶的定向固定化，提高脂肪酶的水解活力；另外，载体为具有磁性的四氧化三铁，容易从反应体系中回收；本发明的反应体系需要通过强搅拌增加反应底物的分散性从而提高反应速度，采用四氧化三铁固定化的脂肪酶克服了树脂等固定化酶在该体系中容易被搅拌打碎从而不易回收的缺点。
优选的，步骤(1)包括：
(1-1)将二价铁盐和三价铁盐溶解于去离子水中并加热至60～100℃，在惰性气体保护下加入氨水使铁盐水溶液的pH至10～11，保温反应，得到纳米四氧化三铁；
(1-2)将纳米四氧化三铁加入到乙醇水溶液中，再向乙醇水溶液中加入硅烷偶联剂对纳米四氧化三铁进行修饰，得到氨基化的纳米四氧化三铁；
所述的硅烷偶联剂为3-氨丙基-三乙氧基硅烷，纳米四氧化三铁与3- 氨丙基-三乙氧基硅烷的质量比为1∶1～4；
修饰温度为20～30℃；
(1-3)采用戊二醛水溶液对氨基化的纳米四氧化三铁进行修饰，得到表面带有醛基纳米四氧化三铁；
所述戊二醛水溶液中，戊二醛的体积百分比浓度为1～5％。
步骤(2)中：
优选的，脂肪酶的量以有效成分脂肪酶蛋白的质量计，固定化溶液中，脂肪酶的浓度为1～12mg/ml。
固定化脂肪酶的相对活力随酶浓度的增加先升高后降低，酶浓度为 3～8mg/ml时，酶相对活力较高，酶浓度为6mg/ml时酶相对活力达到最高。而蛋白回收率则随酶浓度的增加而逐渐降低。
进一步优选的，脂肪酶的浓度为3～8mg/ml；再优选的，脂肪酶的浓度为5～6mg/ml。
界面激活剂可以打开脂肪酶的“盖子”并保持其打开的状态，脂肪酶可以以这种“盖子”打开的状态被固定化，使固定化脂肪酶的活性增加。
优选的，固定化溶液中，界面激活剂的浓度为O.5～10％。
固定化脂肪酶的活力随着界面激活剂浓度的增大而升高，但是当界面激活剂的添加量过大时，界面激活剂在固定化溶液中不能完全溶解，严重影响固定化过程，且固定化脂肪酶的活力随着界面激活剂添加量的增加而趋于平稳，因此，进一步优选的，界面激活剂的浓度为2～5％；最优选的，界面激活剂的浓度为3％。
当界面激活剂为固态时，界面激活剂的浓度是指质量体积分数；当界面激活剂为液态时，界面激活剂的浓度是指体积分数。
优选的，所述的界面激活剂为吐温和/或蔗糖酯；
所述的吐温为吐温20、吐温60和吐温80中的至少一种；所述的蔗糖酯为蔗糖酯SE-11和/或蔗糖酯SE-15。
进一步优选的，所述的界面激活剂为蔗糖酯SE-11。蔗糖酯SE-11对固定化脂肪酶活力的提升最大。
优选的，所述的缓冲溶液的pH为4～8.5。
固定化脂肪酶的活性随着固定化过程中固定化溶液的pH值的增加而增加，pH达到一定值后，固定化脂肪酶的活性反而随着固定化溶液的pH 值的增加而降低，因此，进一步优选的，缓冲溶液的pH为5～7；最优选的，缓冲溶液的pH为6.5。
优选的，固定化时间为1～12h。
在固定化过程中，脂肪酶蛋白与载体共价结合的速度很快，随着固化时间的增加，载体上交联的脂肪酶蛋白越来越多。
进一步优选的，固定化时间为1～6h。固定化1h后，载体上脂肪酶的交联速率下降，固定化6h时，载体上的脂肪酶基本饱和。
在固定化时，脂肪酶的量以有效成分脂肪酶蛋白的质量计，固定化溶液中，脂肪酶与载体的质量比为1∶10～50。
优选的，固定化脂肪酶的制备方法包括以下步骤：
(1)采用水热法合成纳米四氧化三铁，采用硅烷偶联剂及戊二醛对所述纳米四氧化三铁进行修饰；
(2)将脂肪酶和界面激活剂溶解于pH值为5～7的缓冲溶液中，得到固定化溶液，将修饰后的纳米四氧化三铁作为载体加入到固定化溶液中进行固定化反应1～6h；
脂肪酶的量以有效成分脂肪酶蛋白的质量计，固定化溶液中，脂肪酶的浓度为5～6mg/ml；脂肪酶的量以有效成分脂肪酶蛋白的质量计，固定化溶液中，脂肪酶与载体的质量比为1∶10～50；
所述界面激活剂为吐温和/或蔗糖酯；所述的吐温为吐温20、吐温60 和吐温80中的至少一种；所述的蔗糖酯为蔗糖酯SE-11和/或蔗糖酯SE-15；
界面激活剂的浓度为2～5％；
所述的脂肪酶为米根霉脂肪酶、米赫根毛霉脂肪酶或Lipase RM-IM 脂肪酶；
(3)固定化反应结束后，向固定化溶液加入戊二醛进行交联，交联结束后分离、洗涤、干燥，得到固定化脂肪酶。
该优选方案的固定化方法固定化效率较高，制备的固定化脂肪酶的水解活力较好。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)产物中1，3-甘油二酯的纯度高：本发明所使用的脂肪酶选择性高，反应过程中基本不产生1，2-甘油二酯和甘油三酯，同时可大幅降低副产物甘油单酯的比例，提高产物中1，3-甘油二酯的纯度；
(2)转化效率高：本发明的方法中不用添加其他有机溶剂来溶解底物，以纯底物反应，酶的加入量少，转化效率高；
(3)纯化效率高：本发明提供的纯化方法简单快速有效，并且能够确保1，3-甘油二酯不发生酰基迁移；
(4)酶利用率高：本发明的固定化脂肪酶稳定性好，回收简单，每批反应酶丢失少，可重复利用次数多，从而酶的利用率高；
(5)分离纯化简单：四氧化三铁固定化脂肪酶具有稳定强烈的磁性，可以使用磁铁快速分离，省去了过滤及离心分离等步骤，提高了生产效率，降低了生产成本。
附图说明
图1为纳米四氧化三铁的扫描电镜图，其中：(a)为修饰前的四氧化三铁的扫描电镜图，(b)为修饰后的四氧化三铁的扫描电镜图；
图2固定化脂肪酶的重复稳定性测定结果图；
图3油酸与甘油摩尔比对酯化反应的影响；
图4反应温度对酯化反应的影响；
图5固定化脂肪酶添加量对酯化反应的影响；
图6为不同除水方式对酯化反应的影响；
图7为反应真空度对酯化反应的影响；
图8为搅拌速度对酯化反应的影响；
图9为反应时间对酯化反应的影响。
具体实施方式
实施例1纳米Fe3O4的合成
将11.75g FeCl3·6H2O、5.97g FeSO4·7H2O溶解在250ml去离子水中，加热至80℃，在快速搅拌下迅速加入14ml氨水，在氮气保护下保持2h。将沉淀用去离子水清洗至水溶液至中性，得到Fe3O4。其透射电镜如图1 (a)所示。
将得到的Fe3O4加入500ml 80％的乙醇，在30℃下缓慢加入20ml APTES(3-氨丙基-三乙氧基硅烷)，室温下反应12h，分别用去离子水和乙醇清洗三次得到氨基化的Fe3O4。将氨基化的Fe3O4加入到100ml 2％的戊二醛溶液中，在30℃下反应2h，清洗并冻干可得到约5g表面带有醛基的Fe3O4。其透射电镜如图1(b)所示。
由图1(a)和图1(b)可知，四氧化三铁磁性颗粒在经过APTES包覆后，粒径并没有明显增大，但是呈现出了更好的分散性，这是由于粒子表面形成了一层很薄的SiO2薄层。
实施例2脂肪酶的筛选
称取0.115g甘油(1.25mM)，0.76g油酸(2.5mM)，10mg待筛选脂肪酶(液体酶的加入量为10μl)，置于2ml的平底离心管中，加入约0.23g (油酸完全反应产生的水的质量的5倍)活化的4A分子筛和1颗2×5mm 的枣型磁子。
通过恒温水浴控制反应温度为30℃，磁力搅拌反应12h。反应结束后离心，取50μl上层样品，通过液相色谱分析，筛选得到在无溶剂体系中具有催化活力且对甘油1，3位羟基具有最高的选择性的脂肪酶。
筛选结果如下：
表1不同脂肪酶的催化性能
Figure BDA0001510043460000101
由表1可知，上述脂肪酶的油酸转化率较高，为70％以上；对甘油 1，3位羟基的选择性也较高，达到了80％以上，特别是米赫根毛霉脂肪酶 (Lipase fromRhizomucormiehei)、米根霉脂肪酶(Lipase from Rhizopusoryzae)和Lipase RM-IM，其对甘油1，3位羟基的选择性达到了90％以上。
实施例3固定化脂肪酶
取1g米根霉脂肪酶酶粉(蛋白含量约为10.5％)溶于30ml pH 6.5的磷酸盐缓冲液(100mM)中，加入0.3g吐温80，搅拌使酶粉溶解，再加入2g活化的四氧化三铁，在20℃下搅拌反应4h，磁分离得到的固定化酶，并用缓冲液清洗多次，洗去未结合的蛋白及吐温80。
实施例4固定化脂肪酶
取1g米根霉脂肪酶酶粉(蛋白含量约为10.5％)溶于30ml pH 6.5的磷酸盐缓冲液(100mM)中，加入0.3g蔗糖酯SE-11，搅拌使酶粉溶解，再加入2g活化的四氧化三铁，在20℃下搅拌反应4h，加入终浓度为1％ (v/v)的戊二醛，继续反应2h。磁分离得到的固定化酶，并用缓冲液清洗多次，洗去未结合的蛋白及蔗糖酯SE-11。
实施例5固定化脂肪酶
取1g米根霉脂肪酶酶粉(蛋白含量约为10.5％)溶于30ml pH 6.5的磷酸盐缓冲液(100mM)中，加入0.3ml正己烷，搅拌使酶粉溶解，再加入2g活化的四氧化三铁，在20℃下搅拌反应4h，磁分离得到的固定化酶，并用缓冲液清洗多次，洗去未结合的蛋白及正己烷。
实施例6固定化脂肪酶
取1g米根霉脂肪酶酶粉(蛋白含量约为10.5％)溶于30ml pH 6.5的磷酸盐缓冲液(100mM)中，加入0.3g十二烷基硫酸钠(SDS)，搅拌使酶粉溶解，再加入2g活化的四氧化三铁，在20℃下搅拌反应4h，磁分离得到的固定化酶，并用缓冲液清洗多次，洗去未结合的蛋白及十二烷基硫酸钠。
实施例7固定化脂肪酶
取1g米根霉脂肪酶酶粉(蛋白含量约为10.5％)溶于30ml pH 6.5的磷酸盐缓冲液(100mM)中，加入2g曲拉通X-100，搅拌使酶粉溶解，再加入2g活化的四氧化三铁，在20℃下搅拌反应4h，磁分离得到的固定化酶，并用缓冲液清洗多次，洗去未结合的蛋白及曲拉通X-100。
对比例
取1g米根霉脂肪酶酶粉(蛋白含量约为10.5％)溶于30ml pH 6.5的磷酸盐缓冲液(100mM)中，搅拌使酶粉溶解，再加入2g活化的四氧化三铁，在20℃下搅拌反应4h，磁分离得到的固定化酶，并用缓冲液清洗多次，洗去未结合的蛋白。
分别测定游离酶、对比例和实施例3～7制备得到的固定化脂肪酶的性能，结果如表2所示。
表2固定化脂肪酶的性能
Figure BDA0001510043460000121
注：p-NPP为对硝基苯酚标榈酸酯，p-NPB为对硝基苯酚丁酸酯。
由表2中的数据可知，经过固定化，酶活力得到大幅度提高。
实施例8
在1L的反应器中加入46g甘油、423g油酸和实施例3制备的固定化脂肪酶，油酸和甘油的摩尔比为3∶1，以总反应体系的体积为基准，固定化脂肪酶的添加量为1％(w/v)。
以400rpm的速度机械搅拌，通过夹套控制反应温度在30℃，通过真空泵抽真空控制反应体系的真空度小于500Pa，反应8h结束。
反应结束后，加入5倍体积的乙酸乙酯溶解，加入与游离脂肪酸等摩尔量的10％的氢氧化钠，在25℃下磁力搅拌5min后离心，取乙酸乙酯相， 40℃下旋蒸得到纯化的1，3-甘油二酯(Sn1，3-二油酰基甘油酯)。
用高效液相色谱分析纯化前后样品的组成，对比结果如表3所示。
HPLC分析方法为：
液相色谱仪：ThermoFisher scientific ultimate 3000；色谱柱型号：C18 柱；流动相∶乙腈∶二氯甲烷∶三氟乙酸＝85∶15∶0.1；流速：0.8mL/min；柱温：40℃。
表3酯化产物的纯化结果
Figure BDA0001510043460000131
注：表中个物质的含量均为质量含量。
反应结束后，用超强磁铁分离固定化脂肪酶，并重新投入底物，以上述反应条件进行重复反应。采用高效液相色谱检测油酸的转化和甘油二酯的合成情况，结果如图2所示。
由图2可知，固定化脂肪酶重复催化反应55次后，酶活力损失只有约30％，固定化脂肪酶的操作稳定性优异。
实施例9～16
实施例9～16中油酸和甘油的摩尔比分别为1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.4、 2.6和2.8，其他反应条件和参数同实施例8。
采用高效液相色谱检测油酸的转化和甘油二酯的合成情况，结果如图 3所示。
实施例17～19
实施例17～19中反应温度分别为25、35、40℃，其他反应条件和参数同实施例8。
采用高效液相色谱检测油酸的转化和甘油二酯的合成情况，结果如图 4所示。
实施例20～22
实施例20～22中固定化脂肪酶的添加量分别为4‰、6‰、8‰、1％，其他反应条件和参数同实施例7。
采用高效液相色谱检测油酸的转化和甘油二酯的合成情况，结果如图 5所示。
实施例23～25
实施例23～25中分别不除水、采用分子筛除水、采用氮气鼓风除水，其他反应条件和参数同实施例8。
采用高效液相色谱检测油酸的转化和甘油二酯的合成情况，结果如图 6所示。
实施例26～30
实施例26～30中真空度分别为100、200、300、400和800pa，其他反应条件和参数同实施例8。
采用高效液相色谱检测油酸的转化和甘油二酯的合成情况，结果如图 7所示。
实施例31～34
实施例31～34中搅拌速度分别为200、600、800和1000rpm，其他反应条件和参数同实施例8。
采用高效液相色谱检测油酸的转化和甘油二酯的合成情况，结果如图 8所示。
实施例35～38
实施例35～38中的反应时间为1、2、4和6h，其他反应条件和参数同
实施例8。
采用高效液相色谱检测油酸的转化和甘油二酯的合成情况，结果如图 9所示。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法，其特征在于，包括：
将不饱和长链脂肪酸、甘油和固定化脂肪酶混合，在25~40℃下搅拌反应1~12h，经后处理后得到1,3-甘油二酯；反应过程中采用氮气鼓风除水或采用抽真空除水；采用抽真空除水时，反应体系的真空度为100~800pa；
所述不饱和长链脂肪酸为油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸中的至少一种；
不饱和长链脂肪酸与甘油的摩尔比为1~3:1；
以反应体系的体积为基准，固定化脂肪酶的质量体积浓度为4‰~1%；
所述的固定化脂肪酶为固定化的米根霉脂肪酶；
固定化脂肪酶的制备方法包括以下步骤：
（1）采用水热法合成纳米四氧化三铁，采用硅烷偶联剂及戊二醛对所述纳米四氧化三铁进行修饰；
（2）将脂肪酶和界面激活剂溶解于磷酸盐缓冲溶液中得到固定化溶液，将修饰后的纳米四氧化三铁作为载体加入到固定化溶液中进行固定化反应；
所述界面激活剂为蔗糖酯SE-11；
（3）固定化反应结束后，向固定化溶液加入戊二醛进行交联，交联结束后分离、洗涤、干燥，得到固定化脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法，其特征在于，所述的不饱和长链脂肪酸为油酸；不饱和长链脂肪酸与甘油的摩尔比为2~3:1。
3.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法，其特征在于，反应时，搅拌速度为200~1000rpm。
4.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法，其特征在于，以反应体系的体积为基准，固定化脂肪酶的质量体积浓度为8‰~1%。
5.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法，其特征在于，步骤（1）包括：
（1-1）将二价铁盐和三价铁盐溶解于去离子水中并加热至60~100℃，在惰性气体保护下加入氨水使铁盐水溶液的pH至10~11，保温反应，得到纳米四氧化三铁；
（1-2）将纳米四氧化三铁加入到乙醇水溶液中，再向乙醇水溶液中加入硅烷偶联剂对纳米四氧化三铁进行修饰，得到氨基化的纳米四氧化三铁；
（1-3）采用戊二醛水溶液对氨基化的纳米四氧化三铁进行修饰，得到表面带有醛基纳米四氧化三铁。
6.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法，其特征在于，步骤（2）中，脂肪酶的量以有效成分脂肪酶蛋白的质量计，固定化溶液中，脂肪酶的浓度为1~12mg/ml。
7.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶生产1,3-甘油二酯的方法，其特征在于，固定化溶液中，界面激活剂的浓度为0.5~10%。
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