JPH01137988A - エステル交換脂の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、油脂と脂肪酸、油脂と油脂、油脂と脂肪酸エ
ステルとの間の連続エステル交換反応を生起せしめるこ
とにより、付加価値の高いエステル交換脂を効率的、且
つ、安価に製造−するエステル交換脂の製造方法に関す
る。

更に詳しくは、従来不可能であった極めて微量水分領域
での油脂と脂肪酸、油脂と油脂、油脂と脂肪酸エステル
との間の連続エステル交換反応を強く生起することの出
来るアルカリ性高分子量リパーゼを連続反応槽に充填し
、エステル交換反応を何等の脱水を行なうことなく連続
的に行なうことにより効率良くエステル交換脂を製造す
る方法に関する。

〔従来の技術〕

油脂のエステル交換反応は油脂の化学的組成、物理的性
質の転換を通じて油脂の改質に有効な手段である。

エステル交換反応には化学的方法と酵素的方法が知られ
ている。化学的エステル交換反応は、金属ナトリウム、
ナトリウムメチラート等の無機触媒を用いて高温下に反
応し、マーガリン、シＥ！−トニング等の加工油脂製造
に応用されている。

しかし化学的エステル交換反応は酵素反応に比べ反応条
件が苛酷な上、脂肪酸の結合位置に選択性がなくランダ
ムな交換反応しか起こさないため、製造出来るエステル
交換脂の品質、付加価値の向上には限界がある。これに
対して酵素法においてはマイルドな条件下での反応が可
能であり、位置選択性のあるリパーゼを用いることで位
置選択性を伴ったエステル交換反応を行なうことができ
、高付加価値油脂へと変換することが期待できる。

そのためこの方面の研究が数多く成されている。

特開昭５２−１０４５０６号（Ｕｎ　ｉ　１ｅｖｅｒ）
を初め従来報舎に見られる多くの方法はりゾープス属、
アスペルギルス属、ムコール属なとの低分子量の酸性乃
至中性リパーゼを用いた回分式反応であって、しかもこ
れら提案の多くはリパーゼ水溶液をセライト、活性炭の
ごとき多くの複雑な小孔を持つ支持体に溶液として集中
保持させる限りにおいてのみ活性化可能な方法が示され
ている。又、これらの提案においては実質的に関与する
反応系水分はそこに規定された基質溶液水分に止まらず
酵素支持体から水がもれ出て、実質的には大量の水が反
応系に供給されていると考えられ、しかもこのことが反
応バッチごとに新たに使用される大量の支持体に伴った
形で供給が繰返され、このことによって初めて反応が生
起しうろことを示したものであり、本発明の方法はこれ
ら提案とは本質的に異なるものである。一方、酵素によ
る連続的エステル交換反応に関する提案も、ＥＰＯ０１
４０５４２゜特開昭６１−２０２６８８号（ＮＯＶＯ社
）、ＥＰＯ’０１７０４３１、　ＥＰＯＯ，０６９５９
９（ＵＮＩＬＥＶＥＲ社）においてなされている。そし
て、これ等提案においては、ム′コール属、アスペルギ
ルス属、リゾープス属等の生産する酸性乃至中性の低分
子量リパーゼをセライト等の支持体に酵素水溶液として
保持させたり、或いは、吸着樹脂やイオン交換樹脂に吸
着固定化し、規定の含水率を持たせたリパーゼを用い、
本発明規定の基質水分領域とは異なる多量の水分下に連
続的にエステル交換を行なうことを特徴とする方法が示
されている。上記公知例の内、基質水分に関して特開昭
６１　”−２０２６８８号にのみ具体的な記載があり、
ここでは、基質出口含有水　　　　　　　−分のみが記
載されているが、反応初期出口水分３６００ｐｐｍ乃至
５０００ｐｐ’ｍ、　４００時間反応を継続した後には
基質出口水分が２８００ｐｐｍ乃至３１００ｐｐｍであ
ることが示されている。したがって本発明と上記公知例
とは次の点で明確に異なる。即ち、本発明規定の微量水
分領域でアルカリ性高分子量リパーゼは強いエステル交
換作用を発揮し、エステル交換を長期間連続して行なう
ことが出来るが、上記公知例に示される低分子量リパー
ゼはこの様な微水領域においてはほどんどエステル交換
作用を示し得ない。一方、上記公知例に規定された連続
反応の水分領域では低分子量リパーゼはエステル交換作
用を十分に発揮出来ても、アルカリ性高分子量りパーゼ
を用いた場合は水量が多すぎて効率的な満足すべき連続
エステル交換反応を行なうことが出来ない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは、先に、アルカリゲネス属、アクロモバク
タ−属、シュードモナス属等の生産するアルカリ性高分
子量リパーゼを用いて、含水有機溶媒の存在下に反応、
を開始し規定量のジグリセリドの蓄積後より徐々に脱水
して油脂と脂肪酸、若しくは脂肪酸エステルの間の効率
的なエステル交換反応を行なう方法を見出した（特願昭
６２−４５３０２号）、シかし、この方法は回分式によ
るエステル交換方法について示した物であって、連続的
エステル交換法を示した物ではない。

即ち、先願の特願昭６２−４５３０２号で提案の回分式
エステル交換反応を進めるためには、前記特願昭６２−
４５３０２号明細書に記載した如く、反応初期に加えた
水を反応の途中から脱水して除去する必要があるが、そ
のためには、例えば乾燥窒素を反応系に吹込む等の方法
が必要である。このような操作を工業規模で行なうには
機械的に解決しなければならない問題も多々あり、脱水
のための経済的な負担も大きい。何よりも装置の複雑化
と大規模化は避けられず、連続反応に比べ反応槽だけで
も約１００倍以上の大きさの設備を必要とすることが予
想され、余り経済的な方法ではなく、大量生産には必ず
しも向かない方法である。

又、回分式エステル交換反応は相対的に反応速度が遅い
欠点がある。この主な原因は、脱水を必要とする回分式
方法において反応で要求される水分量が比較的多い上、
機械的脱水速度がエステル交換反応の律速になることが
避けられず反応時間は長くなる。更に、回分式反応では
反応速度を高めるには単に酵素量だけでなく、攪拌量に
よって酵素と基質の接触密度を上げ名必要が有るが機械
的攪拌は一定の限界があって余り反応速度を上げること
は出来ない。その上、攪拌力によって固定化担体が徐々
に破壊され、担体自体の寿命にも問題がある。

そこで、本発明者等は、大量生産のエステル交換脂に適
した連続方式のエステル交換反応によるエステル交換脂
の製造方法を開発すべく鋭意研究を行った結果、驚くべ
きことに、先の回分式エステル交換反応に使用したと同
じアルカリ性高分子量リパーゼが連続式エステル交換反
応に非常に適する酵素であることを見出した。すなわち
、反応槽にアルカリ性高分子量リパーゼを充填し、そこ
に基質を連続的に流した場合、反応に必要な極微量の水
を基質と共に常時供給することで何らの脱水操作を必要
とせずに迅速なエステル交換反応を長時間連続的に生起
せしめ得ることを見出した。

この連続的エステル交換反応は先の回分式エステル交換
反応に比較して反応速度がはるかに速（、必要とする水
分量が極めて少なく、かつ、脱水操作の必要がなく、さ
らに撹拌の必要がないので固定化担体の破壊を生起しな
い等、種々の利点を有するものである。

以上のような新規な知見に基づき、本発明者等は、エス
テル交換の酵素として従来にない優れた特性を有する上
記アルカリ性高分子量リパーゼを固定化して用いること
によって、これまでより更に微水領域において連続的に
エステル交換を極めて効率的に行なう方法を開発し、本
発明を完成するに至った。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明はアルカリ性高分子量リパーゼを用いた脂肪酸と
油脂、油脂と油脂、脂肪酸エステルと油脂の間の微量水
分領域での連続エステル交換反応によりエステル交換能
を製造するに際し、同定化したアルカリ性高分子量リパ
ーゼの含水率を０％以上、５％以下にして連続反応槽（
リアクター）１．３位置特異性で分子量１０万以上、至
適ｐＨ８，０以上であって微生物由来のものが好適に用
いられる。アルカリ性高分子量リパーゼはそのままの形
又はイオン交換体に結合した固定化酵素として或いは蛋
白質、糖類、粘土鉱物で固定化した形で用い、イオン交
換体としては、メタクリレート系弱酸性イオン交換樹脂
が好適に用いられる。アルカリ性高分子量リパーゼの含
水率を０〜５％に調整する手段としては、凍結乾燥法が
好適に用い明細書の浄書（内容に変更なし） られ、また、エステル交換反応は通常、８０°Ｃ以下で
行われる。

また、反応生成物の分離精製は、好ましくは以下のよう
にして行われる。

連続エステル交換反応で得られるエステル交換能は反応
液より冷却沈澱法、蒸溜法、中和法、膜透過法、溶媒分
画法等の手段方法を組合わせる事で分離回収される。−
船釣な方法としては反応槽より取出した反応液はそのま
ま若しくは中和した後冷却して高融点の成分を沈澱し、
簡単な分別を行なう事ができる。この操作は必要に応し
て予め反応液に含まれる溶媒を蒸溜や膜透過により除去
し、脱溶媒油脂、もしくは、新たな溶媒に置換してから
行なっても差支えない。すなわち、エステル交換油脂反
応溶液を　　　　　、７．工　　　　冷却し、高融点成
分を沈澱して反応液より滲寵吠したり、エステル交換油
脂反応溶液を減圧蒸溜または膜濾過法により反応溶媒を
除去し、脱溶媒反応油分を回収する。この脱溶媒油分を
有機溶媒に再溶解してから冷却して油脂を分離精製する
ことかできる。又不純物として脂肪酸を含む場合におい
ては、エステル交換油脂反応溶液にアルカリ剤を加えて
脂肪酸を石鹸として除去したり、上記脱溶媒油分を蒸溜
し、脂肪酸と脱脂肪酸油脂に分離することが出来る。さ
らに、脱脂肪酸油脂を有機溶媒に溶解し、冷却、沈澱、
分画して精製することができる。こうして、沈澱側もし
くは溶液側のいずれかに分別したエステル交換能は必要
に応じ蒸溜もしくは溶媒分画により不純油脂成分を除き
好ま式に比べて、反応系で要求される水分量が更に少な
く、反応進行中の脱水調整の必要がないため、反応装置
として脱水制御機構を必要としないばかりか、反応速度
が速く、加水分解反応、ジグリセリドの副生等が起り難
い利点がある。又、酵素は一般に水分量に比例して活性
を低下するが、この連続反応法では酵素は極めて微量の
水の存在下に終始反応を進めることが出来るため、酵素
の寿命は長く安定に保つことが出来る。

そして、この方法は反応速度が速く、大型の装置が不必
要であり、経済的に極めて有利な方法である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明でエステル交換反応に用いる原料油脂グリセリド
としては、植物性、動物性の油脂もしく　。

は加工油脂、あるいはこれらの分別油、又は混合油があ
げられる。

その具体例として、例えば大豆油、綿実油、ナタネ油、
オリーブ油、コーン油、ヤシ油、サフラワーン由清茶花
油、パーム軟部油、パーム油、サル脂、イリッペ脂、コ
クム脂、シア脂、マウア脂、フルワラ脂、ポルネオタロ
ー、牛脂、ラード、乳脂、魚油、又は、これらの分別脂
及び硬化油脂なとの他、ジラウリン、シバルミチン、ジ
オレイン、ジステアリン、トリラウリン、トリバルミチ
ン、トリオレイン、トリステアリンなどを挙げることが
できる。そして対称型のエステル交換脂を目的とする反
応においては２位置の脂肪酸が同種脂肪酸である油脂を
多く含む油脂原料はど好ましい。

又、本発明でエステル交換反応に用いる脂肪酸としては
、炭素数がＣ４〜Ｃ２２の飽和もしくは不飽和の脂肪酸
であって、この様な脂肪酸の具体例としては、例えば酪
酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸
、ミリスチン酸、バルミチン酸、ステアリン酸、オレイ
ン酸、リノール酸、ワシルイン酸、アラキドン酸、エイ
コサペンタエン酸などが挙げられる。又、これら脂肪酸
の代わりに、脂肪酸エステルを使用する場合にはそのエ
ステルを形成するアルコールの炭素数はＣ１〜Ｃ２０、
好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルコールであって、ぞの好ま
しい具体例としては、メタノール、エタノール、１−プ
ロパツール、１−ブタノールなどが挙げられる。

これらの原料は必要に応じて予め精製して使用しても良
いし、又、リアクターの前に原料精製のためのプレカラ
ムを置き、これにイオン交換樹脂、活性炭、活性白土、
酸性白土、アルミナのごとき油脂精製剤を詰め、このプ
レカラムを通過した油をリアクターに流すことで酵素の
寿命や反応率を向上させることができる。

上記のごとき原料油脂と脂肪酸及びそのエステル類が例
示できるが、本発明においては、その組合わせは自由で
あり、選択にも制限はない。

つぎに本発明で使用する酵素はアルカリ性高分きない。

因みに、上記従来のリパーゼでは極微量の水分量の下で
行う本発明の連続エステル交換反応に’ｌ−ない。本発
明におけるアルカリ性高分子量リパーゼとしては、１．
３位置特異性のあるアルカリ性高分子量リパーゼであっ
て微生物が生産する任意の酵素が好適に用いられる。そ
して、上記微生物としては、アルカリゲネス属、アクロ
モバクタ−属及びシュードモナス属が挙げられる。

上記の様なリパーゼの具体例としては、例えばアルカリ
ゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する名糖ＰＬ
　−２６６号（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ、　Ｐ　
Ｌ　−２６６）　（微工研菌寄第３１８７号）の生産す
るリパーゼ（特公昭５８−３６９５３号公報）（以下、
リパーゼＰＬ−２６６という）、同じくアルカリゲネス
属に属する名［ＰＬ−６７９号（ＡＩ−ｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ　ｓｐ、　　Ｐ　Ｌ−６７９）（微工研菌寄第３７
８３号）の生産するリパーゼ（特公昭６０−１５．３１
２号公報）（以下、リパーゼＰＬ−６７９という）、更
に、アクロモバクタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）
属に属する泡糊ＡＬ−８６５号（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃ
ｔｅｒ　ｓｐ、　Ａ　Ｌ　−８６５）　（微工研菌寄第
１２１３号）の生産する。！Ｊパーゼ（特公昭４！）−
３２’０８０号公＠）（以下、リパーゼＡＬという）、
更にシュードモナス・ニトロレデューセンス・バラエテ
ィ０サーモトレランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｎ１
ｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓｖａｒ、　ｔｈｅｒｍｏｔｏｌ
ｅｒａｎｓ）　（微工研菌寄第１３３８号）の生産する
リパーゼ（特公昭５６−２８５１６号公報）（以下、リ
パーゼＰＳという）等が特に従来提案のリパーゼでは丘
ステル交換反応を生起しえなかった微量水分領域におい
て位置選択性を持ってエステル交換に優れた有効なリパ
ーゼとして挙げることができる。尚、これらのリパーゼ
はいずれも菌体外リーパーゼである。

第１表は、公知方法において例示されたリバー具体例に
ついて、その分子量及び至適ｐＨを比較したもので、第
１表に示すリパーゼＰＬ−２６６、リパーゼＰＬ−６７
９、リパーゼＡＬ、リパーゼＰＳは、いずれも至適ｐＨ
８，０以上で分子量が１０万以上のアルカリ性高分子量
リパーゼである。

通常、酵素蛍白は単一酵素蛍白であれば、その分子量は
１万〜５万程度、大きくても１０万未満であり、１０万
を越える場合は数個のサブユニットを伴うか、サブユニ
ット以外にｍＷ白、脂質蛍白を結合していると考えられ
、このようなリノ′イーゼは細菌のリパーゼにしばしば
見受けられる。このような１０万以上の分子量からなる
リパーゼを本発明では高分子量リパーゼと呼び、エステ
ル交換反応での性質の違いから１０万未満のリパーゼを
低分子量リパーゼと呼び区別した。１分子量による区別
の結果、第１表に示した如く、高分子量リパーゼの至適
ｐＨはｐＨ８，０より上にあり、低分子量リパーゼのそ
れはそれより下にあることが判る。

（本頁以下余白） ここで高分子量リパーゼとは、標準蛋白として分子量６
８，０００の牛血清アルブミン、分子量１５８，０００
のウサギ筋肉アルドラーゼ。

分子量２４０．０００の牛肝臓カタラーゼを検量線に用
い。

セファデックスＧ２００（ファルマシア株式会社）によ
る分子量分画により求められるリパーゼ分子量が１０万
以上であるリパーゼを特に高分子！リパーゼとて区別し
た。

本発明において使用するアルカリ性高分子量リパーゼが
従来提案のリパーゼに比べ特に微水領域において優れた
エステル交換能を示す理由としては、恐らくこれらのア
ルカリ性高分子量リパーゼが上記した如く、サブユニッ
ト、その他の附随蛋白が活性基を保護するだけでなく、
分子内結合水を多く持ち活性中心に対して微水系での活
性発現になんらかの触媒的役割を果たしているものと推
測される。

次の実験例１において、高分子量、低分子量側リパーゼ
の微水系でのエステル生成能を示してその違いの一端を
示した。

実験例１ 微量含水溶媒中でのリパーゼのエステル生成活性発現能
の比較 リパーゼＰＬ−６７９（泡糊産業、比活性８．７万Ｕ／
ｇ）、リパーゼＰＬ−２６６（泡糊産業、比活性１．１
万Ｕ／ｇ）、リパーゼＡＬ　（泡糊産業、比活性１．５
万Ｕ／ｇ）、リパーゼＰＳ（サラポロビール、比活性１
．６万Ｕ／ｇ）、タリパーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅ
ｌｅｍａｒ）　、（田辺製薬、比活性１．０万Ｕ／ｇ）
、リパーゼＡ　Ｐ　（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇ
ｅｒ）（大野製薬、比活性３．７万Ｕ／ｇ）、ムコール
リパーゼＮｏｖａ　ｓｐ　２２５（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅ
ｈｅｉ）（ＮｏＶＯ社、公称２１万０／ｇ）のリパーゼ
粉末１００ｍｇを凍結乾燥し、各種溶媒５ｍｌの存在下
に、グリセリン０．１６３ｇとオレイン酸０．５ｇを加
え、脱水剤としてモレキュラシーブス３Ａ（和光純薬版
売）　０．５ｇを加えて脱水しつつ３７°Ｃで４８ｈｒ
振盪して反応させた。

尚、リパーゼ活性の測定は、リパーゼＰＬ−２６６とＰ
Ｌ−６７９については国生等の方法ＣＡｇｒｉｃ、Ｂｉ
ｏｌ。

Ｃｈｅｍ、４５（５）、１１５９．（１９８２））　、
リパーゼＡＬにツＣ）では国生等の方法〔油化学２３　
（２）　、第９８頁、　（１９７４）　）、リパーゼＰ
Ｓについては渡辺等の方法（Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、４１．１３５３（１９７７））
、ＮｏＶＯ社のＭｕｃｏｒＭｉｅｈｅｉリパーゼに就い
てはＮｏＶＯ社公称単位を、その他リパーゼに就いては
幅木等の方法（Ｊ、Ｇｅｎ。

Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、９．３５３　（１９６
３）　）で測定した。

添加脂肪酸の内、エステル合成に消費された量を、アル
カリ溶液で滴定することにより求め、反応前の脂肪酸に
対する脂肪酸の減少率の百分率を測定した。又、反応液
中含水率はカールフィッシャー（電量滴定法）による水
分測定装置（三菱化成工業社製ＣＡ−０５）を用いて調
べた。その結果を第２表に示す。

（本頁以下余白） 第２表から、アルカリ性高分子量リパーゼは微水領域に
おいて明らかに優れた活性発現を示すのに対して低分子
量リパーゼは全くもしくは、はとんど活性を発現しない
。

従って、本発明において例示した以外のアルカリ性高分
子量微生物リパーゼであっても、上記例示したごとく、
強いエステル生成能を示す分子量が１０万以上のアルカ
リ性高分子量リパーゼである限り、−任意のものが使用
でき、その起源や種類に制限はない。

本発明において、エステル交換反応に用いるアルカリ性
高分子量リパーゼは、精製酵素でも粗酵素−であっても
よく、その使用形態としては、酵素を固定化し、又は固
定し乾燥して利用できる。固定化担体として用いるイオ
ン交換樹脂としては基本構造がメタクリルレート系樹脂
より構成される弱酸性イオン交換樹脂であり、その様な
ものとしては例えば、ＤＥＡＥ−）ヨパール（Ｔｏｙｏ
ｐｅａｒｌ）　（東洋曹達社製）、セパビーズ（Ｓｅｐ
ａｂｅａｄｓ）　（三菱化成工業社製）等を挙げること
ができるが、その中でも特に好ましい樹脂としてはＤＥ
ＡＥ−トヨパール６５０（粒径：５０〜１５ｏ／４ａ’
）を挙げることができる。

固定化の方法としては、酵素培養液、粗酵素水溶液、又
は、溶媒分画、硫安塩析等による部分精製した酵素、さ
らにイオン交換処理、ゲル濾過、限外濾過（ＵＦ）等の
精製手段を用いて精製した酵素液に上記した担体を添加
し、酵素が吸着するのに十分な時間、攪拌してから遠心
、濾過操作を行ない酵素固定化担体を回収すればよい。

イオン吸着担体に固定化する場合には酵素液は必要に応
じてＵＦ等で脱塩し、用いる酵素の等電点に応じてｐＨ
を調整してから吸着固定すればよい。ちなみに前記例示
したアルカリ性高分子量リパーゼは例えばｐＨ６〜１１
で１０〜６０分程度攪拌すれば、１ｇの樹脂に最大１０
０，０００〜３００．０ＯＯＵ／ｇ（加水分解力単位）
を吸着し、少な（とも８０％〜９０％のリパーゼ活性が
樹脂に吸着しリパーゼ溶液から除かれる。

又、上記固定化以外に酵素自体、あるいは酵素以外の適
当な希釈剤や結着剤とともに固定した固明細書の浄書（
内容に変更なし） 定化リパーゼも用いることができる。その様な希釈剤や
結着剤としては、例えば乳アルブミン、大豆蛋白、小麦
蛋白の様な蛋白質、乳糖、蔗糖、澱粉、キトーザン、酢
酸セルロースの様な糖類、ヘントナイト、セライトの様
な粘土鉱物等を挙げることができる。固定化の方法とし
では、酵素粉末または希釈剤、結着剤の混合物に少量の
水、又は有機溶媒を加え混和し、整形すればよい。

上記の如く、分離した固定化酵素、または固定した酵素
は好ましくは５％以下、特に好ましくは２％以下、最も
好ましくは約１％以下に乾燥して用いる。乾燥方法とし
ては、加熱風乾、乾燥有機溶媒による洗浄脱水、凍結乾
燥のいずれか又は組合わせにより行なうことができるが
、凍結乾燥法で行なうのが望ましい。

本発明において、酵素の含有水分を５％以下に規定した
からといって５％を越えるとエステル交換反応を生起し
なくなることを意味しない。実際に連続反応槽Ｑこリパ
ーゼを充填し基質を流し出すには、数ｋｇ〜士数ｋｇ　
／　ｃｒｙの圧力を必要とする。こ明細書の浄書（内容
に変更なし） の様な加圧条件下では例え多くの水分をリパーゼに含有
させたとしても物理的に水分は押出され直ぐに約１０％
程度に低下する。更に、本発明規定の微量水分の基質油
脂を流し始めると酵素作用により酵素中の余分な水は油
脂の加水分解反応によって消費され時間とともに酵素含
有水分は５％以下に低下し更に長期間基質を流し続ける
と、ついには約１〜２％附近で酵素は安定した平衡水分
に達する。含水率が特に０．１〜５．０％のＤＥＡＥ−
トヨパール固定化リパーゼを充填したカラムにｎ−ヘキ
サン溶解基質を連続的に流した時のカラム圧は１　ｋｇ
　／　ｃ這以下に保たれた。

また、酵素の初発水分が５％を越えた状態から反応を開
始すると平衡水分に到達するまでに時間が掛かり過ぎ、
この期間に起こる必要以上の加水分解反応により多量の
好ましくないジグリセリドの生成を招きエステル交換脂
の収率の低下を招くので好ましくない。この点に就いて
実施例２を示して説明する。

又、酵素含有水分が多いと反応槽での基質の流体抵抗が
大きくなり効率的な反応流速を取ることは難しいと言っ
た問題もある。

実眉捌↓ 凍結真空乾燥したＤＥＡＥ−１−ヨパール固定化リパー
ゼＰ　Ｌ−６７９（１，５万Ｕ／ｇ担体）２．５ｇに蒸
留水２５ｍ（固定化酵素の１％に相当）を吸収させ、ｎ
−ヘキサン５０ｍＮに＠濁し、内径１０ｍ、長さ１５０
ｎのジャケット付カラムに充填した。

次に上記固定化酵素２．５ｇに蒸留水５０ｍｇ　（固定
化酵素の２％に相当）あるいは蒸留水１００ｍｇ　（同
定化酵素の４％に相当）、蒸留水１３８ｍｇ　（固定化
酵素の５．５％に相当）、蒸留水２５０ｍｇ（固定化酵
素の１０％相当）を各々吸収させた上、５０ｍ／のｎ−
ヘキサンに悲濁し、内径１０鶴、長さ１５０Ｂのジャケ
ット付カラムに充填した。更に蒸留水を吸収させない固
定化酵素２．５ｇも同様にカラムに充填した。

パーム軟部油３５４．４ｇ、ステアリン酸２８３．６ｇ
をｎ−へキサン１６００ｇに溶解し、更に蒸留水０．４
ｍｌを溶解させた後、２ｇの蒸留水を吸収した粒状珪藻
±６ｇを充填した内径１０１１、長さ１５０ｆｌのジャ
ケット付カラムに通液し、含有水分７００ｐｐｍの基質
溶液を得た。

この基質溶液を上記の異なる水分を含む固定化酵素のカ
ラムに流速５．５　ｍｌ　／ｈｒでカラム下端から通液
した。反応系は４５°Ｃに保った。各固定化酵素カラム
出口において、反応溶液の含有水分及びトリグリセリド
の脂肪酸組成、グリセリド組成を後記実施例１の分析方
法に従って分析した。その結果を第３表に示した。

（来夏以下余白） 第３表固定化酵素への添加水分とエステル交換反応第３
表の結果から固定化酵素へ添加する水分が５％を越える
とトリグリセリドの割合が低下し、目的とする油脂の収
率が低（なることがわかる。

又、添加水分が１０％では固定化酵素が水分を保持でき
ず、反応溶液中へ過剰の水分が排出されることがわかる
。

本発明で使用する酵素は、微水領域での反応であること
もあって、特に有機溶媒に対して強い耐性を持ち、必要
に応じて反応系に有機溶媒を加えて行なうことが出来る
。

その様な溶媒としては、反応温度において液状をなし、
基質を良く溶解し、エステル交換反応を阻害しない限り
何でも良いが、例えば、ｎ−ヘキサン、イソオクタン、
ｎ−へブタン、ｎ−ペンタン、石油エーテル等の脂肪族
炭化水素類、第３級ブチルアルコール、アセトンなどを
例示出来るが、特に好ましい有機溶媒としてはｎ−ヘキ
サンなとの脂肪族炭化水素類が有効な溶媒となる。又、
溶媒は単独又は２種以上混合して使用してもよい。

本発明において、エステル交換反応を生起させる３ま ための態様は次の通りである。

即ち、本発明において基質となる油脂１モルに対する油
脂、脂肪酸又はそのエステルの混合モル比はそのエステ
ル交憧目的に応じ任意のモル比を選ぶことができ、特に
制限はない。又、必要に応じて油脂、脂肪酸やそのエス
テル類は数種混合して反応してもよい。

次に、固定化したアルカリ性高分子量リパーゼの比活性
は高い方が効率的な反応を行なう上で望いるのが好まし
い。

酵素の反応塔への充填方法としては反応溶媒や油脂に分
散させ気泡の入らない様に充填すればよい。連続エステ
ル交換反応においては充填酵素量に見合った基質量を流
せば良く充填量に特に制限はない。又、有機溶媒を使用
する場合の反応系への添加量としては１０％〜９０％（
Ｗ／Ｗ）　、好ましくは２０％〜８０％（Ｗ／Ｗ）程度
加えて反応させればよい。

次に連続反応槽の人口より供給する基質溶液の明細書の
浄書（内容に変更なし） 含水量は１１００ｐｐ以上、　１８００ｐｐｍ以下に、
調整して連続的に供給して反応を行なう必要があり、好
ましくは１１００ｐｐ以上、　１５００ｐｐｍ以下、更
に好ましくは、２００ｐｐｍ以上、　１１０００ｐｐ以
下の範囲を示すことができる。

基質含有水分の調整方法としては、基質溶液に必要な水
を加水するか、若しくは余分な水量を除湿することで調
整することができる。

加水方法としては例えば計算量の水を直接加えてもよい
が、添加量が極めて少ないので、水蒸気、加湿空気等を
基質に吹き込んだり、あるいは、予め水を保持させた吸
水性固体のプレカラムをｉｉ１通させる等により容易に
調整することができる。

又、除湿方法としては、例えば基質溶液に窒素等の乾燥
不活性ガスを吹込むとか、基質溶液の一部をモレキュラ
ーシーブスなとの脱水剤を充填したプレカラムを通過さ
せることでも調節できる。

又、基質溶液中に飽和しうる水量が低く過ぎて任意の含
水量が確保出来ない場合には、基質濃度を明細書の浄書
（内容に変更なし） 変化させたり、アセトン、メタノール、エタノール、ｔ
−ブタノールの様な親水性溶媒などを加え溶媒の組成を
変化させることで解決できる。いずれにせよ、本発明に
おいて用いる基質や溶媒にもともと含まれる水分は普通
は１０ｐｐｍ　ｏｒｄｅｒ〜１１００ｐｐ　ｏｒｄｅｒ
であり、特許請求の範囲の含水量に納まるようにすれば
よい。

次に、連続反応槽よりの出口基質含有水分はエステル交
換反応によって微量の水分が消費され入口水分よりは必
ず低下するが、出口基質含有水分は少なくとも５０ｐｐ
ｍ以上、多くとも８００ｐｐｍ以下の範囲で取りだせば
良い。流速によってもやや異なるが、求められるエステ
ル交換脂に合せて入口水分を決めれば、はぼ自動的に出
口水分は上記規定の水分範囲に納まり、エステル交換反
応を達成できる。これらのことを次の実験例３で示す。

実験±１ 凍結乾燥したＤＥＡＥ−１〜ヨバール固定化リパーゼＰ
　Ｌ−６７９（１０万Ｕ／ｇ担体）　２．５ｇを５０成
のｎ−ヘキサンに懸濁し、内径１０顛、長さ１５０　ｔ
ｍのカラムに充填した。

バーム軟部油３５４．４ｇ、ステアリン酸２８３．６ｇ
をｎ−ヘキサン１４４０　ｇ及びアセトン１９３ｇの混
合液に溶解した。本基質溶液は９０ｐｐｍの水分を含有
した。

本基質溶液を流速２７．５ｍ／ｈｒで上記固定化酵素カ
ラムの下端から通液した。固定化酵素カラム出口におい
て反応溶液の含有水分及びグリセリド組成、トリグリセ
リドの脂肪酸組成を各々カールフィッシャー水分測定装
置（三菱化成（：ＡＯ５型）、イアトロスキャン、ガス
クロマトグラフィー（後記実施例１の分析方法に準拠）
により分析した。反応系は４５℃に保った。

次に上記と同様の基質溶液に、 水分として２８０ｐｐｍの基質溶液を調整した。

これらの基質溶液を上記と同様に固定化酵素カラムに通
液した。

全ての場合に反応溶液の含有水分、グリセリド組成及び
トリグリセリドの脂肪酸組成を分析した。

その結果を第４表に示した。

Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ由来のリパーゼの懸
濁液（ベーリンガー社製、５万Ｕ／ｒｎ１）２ｍｌを蒸
留水に対して透析して塩分を除去し、蒸留水で１０ｍ１
に希釈した後珪藻土Ｌｏｇに吸収させた。この珪藻土を
凍結真空乾燥することにより水分を除去し、固定化酵素
を調製した。零間定化酵素１０ｇをｎ−ヘキサン５０−
に＠濁し、内径１０ｆｌ、長さ１５０ｆｉのカラムに充
填した。上記と同様に調製した含有水分７５０ｐｐｍあ
るいは２８００ｐｐｍの基質溶液を流速２７．５ｍ／／
ｈｒでカラム下端より送液し、カラム出口において反応
溶液の水分、グリセリド組成、トリグリセリド脂肪酸組
成を後記実施例の方法に従い分析し、その結果を第５表
に示した。

又、リパーゼ３　Ａ　（ＮＯＶＯ社製、デュオライト＄
７６１に固定化したＭｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ　ｓｐ　
２２５由来リパーゼ）２．５ｇを真空乾燥した後ｎ−ヘ
キサン５〇−に懸濁し、上記と同様にカラムに充填し基
質溶液（含有水分７５０ｐｐｍあるいは２８００ｐｐｍ
）をカラム下端より流速２７．５ｍ／／ｈｒで送液した
。カラム出口において反応溶液の水分、グリセリド組成
、トリグリセリド脂肪酸組成を上記と同様に分析し、そ
の結果を第５表に示した。

（来夏以下余白） ３つ 明細書の浄書（内容に変更なし） 第４表の結果から、ＤＥＡＥ＝トヨパール固定化リパー
ゼすＬ−６７９の場合、基質溶液の含有水分が約１１０
０ｐｐ以下、カラム出口の水分が５０ｐｐｍ以下ではト
リグリセリド中のステアリン酸の割合が小さいことから
れかる様にエステル交換反応は起こりにくかった。又、
基質溶液の含有水分がｌｏｏｐｐｍ以上、１８００ｐｐ
ｍ以下の程度で、出口での含有水分が５０ｐｐｍ以上、
８００ｐｐｍ以下程度であれば、エステル交換反応は円
滑に進行し、しかもトリグリセリドの収率も高かった。

基質溶液の含有水分が１８００ｐｐｍを超え、カラム出
口水分も８００ｐｐｍを超えるとトリグリセリドの収率
が低下した。一方、第５表の結果からＲｈ１ｚｏｐｕｓ
やＭｕｃｏｒに由来するリパーゼは２８００ｐｐｍ以下
の水分を含む基質溶液ですら十分なエステル交換反応を
起こさず、更に基質溶液の水分を多くしなければならな
いことがわかる。

次に反応温度としては、基質の種類、使用溶媒の沸点、
酵素の種類などを考慮し、適当な温度を選んで行なうこ
とが望ましいが、その様な温度としては、普通は８０°
Ｃ以下、特に好ましくは３０〜７０明細書の浄書（内容
に変更なし） °Ｃの範囲で反応を行なうことができる。あまり高い反
応温度は、反応途中で生成される１、２−ジグリセリド
の２−位置の脂肪酸の転移を誘発するのでむしろ好まし
くない。

次に、反応に必要な基質滞留時間はエステル交換率をど
こに求めるかによって異なるので特に限定することは出
来ないが、例えば、後記実施例５に示した様に、パーム
軟部油にステアリン酸を導入する場合、交換率６７％で
は約７分、９４％では約２６分の滞留時間で十分である
。本発明で用いられるアルカリ性高分子量リパーゼは、
長期間安定して効率のよいエステル交換反応を行なうこ
とが出来るので一旦反応塔に充填した酵素は長期間その
まま使用することが出来る。例えば、後記実施例５に示
した様に、基質水分７００ｐｐｍ、反応温度４５°Ｃ１
ＤＥＡＥ−）ヨパール固定化酵素を用いパーム軟部油と
ステアリン酸とのエステル交換反応を行なった時の半減
期は約１９０日であり、その間に処理出来る原料油脂の
量は反応率６７％として計算すると、約２０トン／　１
　ｋｇ固定化酵素である。

次に、本発明の連続式エステル交換反応と特願昭６２−
４５３０２号のハツチ式エステル交換反応の反応効率を
比較すると、実験例４の通りである。

実験例４ 凍結真空乾燥したＤＥＡ’Ｅ−）ヨパール固定化リパー
ゼＰ　Ｌ−６７９（２０，０ＯＯＵ／ｇ）２．５ｇを５
０ｍ１のｎ−ヘキサンに懸濁し、内径１０１１、長さ１
５０ｆｌのジャケット付カラムに充填した。粒状珪藻±
６ｇに蒸留水２−を吸収させ、内径１０ｎ＋、長さ１５
０ｆｌのジャソケット付カラムに充填し、基質含有水分
調整、用プレカラムとして使用した。

パーム軟部油３５４．４ｇ、ステアリン酸２８３．６ｇ
をｎ−ヘキサン１６００ｇに溶解した上で蒸留水５ｒｎ
ｌを加えて攪拌し、３０分間静置した後、上滑液を基質
溶液として用いた。この時の基質溶液の水分は２００ｐ
ｐｍであった。

次に、プレカラム下端より基質溶液をマイクロポンプに
より流速１７０　ｍ／／ｈｒ以下で送液し、プレカラム
通過後の基質溶液の水分を７００１）［１＋１１とし、
固定化酵素カラムの下端より、流速２４．０ｒｎｌ／ｈ
ｒ（３７℃）で１０日間連続して送液した。この間にカ
ラムを通過した反応液を後記実施例１と同様の方法で分
析した。この時のエステル交換率は９５％であり、この
間に一生成したエステル交換油脂は約６．４　ｋｇであ
った。

これに対して、先に回分式エステル交換反応を提案した
特願昭６２−４５３０２の実施例３において実施したエ
ステル交換反応（エステル交換率９５％）では、−１０
田間にエステル交換でできた油脂量は約０．６６に＋ｒ
であり、連続反応は回分式反応に比べて酵素単位当り、
約１．８倍高い反応効率を示した。

本発明において、連続反応槽を通過した反応液に含まれ
るエステル交換脂を回収する方法としては、反応液をそ
のまま、若しくはヘキサン、アセトン１．エタノール等
の溶媒を添加した後、回収しようとする油脂の融点以下
に冷却してそれらを沈澱し、これを遠心、濾過操作によ
り反応液より回収することができる。この方法は反応液
中の除去してしまいたい油脂や脂肪酸に就いても同様に
応用できる。又、反応液にアンモニア、苛性ソーダ明細
書の浄書（内容に変更なし） 一１水酸化カルシウム等のアルコール又は水溶液を添加
し、脂肪酸を石鹸として除去することも出来る。

又、上記方法は必要に応して反応液を予め蒸留、若しく
は膜濾過して反応溶媒を除去し、脱溶媒油脂を一旦回収
し、改めてｎ−ヘキサン、アセトン、エタノール、プロ
パツール、ｔ−ブタノール等の単独あるいは混合溶媒を
加えて溶解し上記したと同様の方法で目的油脂を精製回
収できる。又、単に脱溶媒油脂を蒸留して脂肪酸と脱脂
肪酸油脂に分離した後、油脂に改めて、アセトン、ｎ−
ヘキサン、エタノール等の溶媒を添加し上記と同様に溶
媒分画、沈澱するなどして更に精製する方法が利用でき
る。

こうして製造したエステル交換脂は食品、化粧品、医薬
品、農薬、塗料、印刷等の分野における用途がある。

［発明の効果〕 本発明の効果は、拵港横種櫓アルカリ性高分子量リパー
ゼ　　　　　　　　を直接上記した原料油脂と脂肪酸、
脂肪酸エステル又は油脂とを含有する微量含水溶液に連
続的に作用させることによって、迅速に高収率でエステ
ル交換脂が得られることにある。そして、この連続的な
エステル交換法は反応系で要求される水分量が極めて少
なく、反応進行中の脱水調整の必要がないため水分量の
制′ａ機構を必要としないばかりか、反応において、加
水分解反応が抑えられエステル交換脂の収率を低下せし
めるジグリセリドの副生等がほとんど起らない利点があ
る。又、反応において、脱水調整の必要がないことから
加水−脱水に伴う酵素の失活が避けられ酵素の寿命が長
く維持できる。更に、この方法は反応速度が速く、大型
の装置を必要としないため経済的に有利であって工業的
規模の生産に通した方法である。

か（して、本発明では、Ｎ単な反応条件によって安価な
油脂より付加価値の高い各種エステル交換脂を連続的に
容易にかつ経済的に製造することができる。例えば、安
価なパーム軟部油から高価なカカオバター代用脂や、各
種食用油脂の改良に利用できる。

次に、参考例として、本発明に使用する固定化リパーゼ
の調製法の例を示す。

参考例１　（固定化リパーゼの調製法−■）アルカリゲ
ネス属に属する名ＷＰＬ−６７９号を特１０分間遠心分
離し、その上清にベントナイト４５０ｇを添加し、冷却
下１時間攪拌した後遠心分離し、リパーゼＰＬ−６７９
を吸着したベントナイトを回収した。回収したベントナ
イトに１％ポリエチレングリコール４０００溶液１０ｆ
を加え、ベントナイトよりリパーゼＰＬ−６７９を溶出
し、遠心分離を行いベントナイトを除去しベントナイト
溶出リパーゼＰＬ−６７９溶液１０ｊ２を得た。

ＤＥＡＥ−トヨパール（東洋ソーダ社製）１００ｇ（乾
燥重量相当）をＩ　Ｎ　ＮａＯＨ水溶液５１に４時間浸
漬した後、１ｌｈｌ濾紙上で吸引濾過によりＤＥＡＥ−
）ヨパールを回収し、濾紙上でＤＥＡＥ−トヨパールを
蒸留水で濾液のｐＨが８．０になるまで洗浄し、活性化
ＤＥＡＥ−）ヨバールを得た。

上記ベントナイト溶出リパーゼＰＬ−６７９溶液１０β
に活性化ＤＥＡＥ−トヨバールを加え、４℃で１時間攪
拌しリパーゼＰＬ−６７９をＤＥＡＥ−）ヨパールに吸
着させ、水で洗浄しポリエチレングリコール４０００を
除去し、阻１濾紙上で吸引濾過によりＤＥＡＥ−）ヨパ
ール固定化リパーゼＰＬ−６７９を回収し、凍結乾燥機
で４８時間乾燥し、乾燥ＤＥＡＥ−）ヨパール固定化リ
パーゼＰＬ−６７９を得た。

これを以下の実施例で使用した。

尚、ＤＥＡＥ−）ヨパール固定化リパーゼＰＬ−６７９
の活性は１００．０ＯＯＵ／ｇ担体であった。又〜ＤＥ
ＡＥ−トヨパール５００ｇを用いる以外は上記と同様に
行い乾燥ＤＥＡＥ−）ヨパール固定化リパーゼＰ　Ｌ−
ｔ３７９（２０，０ＯＯＵ／ｇ担体）を調製した。

又、アルカリゲネス属に属する泡糊ＰＬ−２６６号を特
公昭５８−３６９５３号公報に示した方法に従い培養を
行い培養液１５βを得た。この培養液から上記したと同
様な方法によりＤＥＡＥ−）ヨパール同定化リパーゼＰ
Ｌ−２６６を得た。このＤＥＡＥ”）ヨパール固定化リ
パーゼＰＬ−２６６の活性は１０，０ＯＯＵ／ｇ担体で
あった。これを以下の実施例で使用した。

次にアクロモバクタ−属に属する名ＭＡＬ−８６５号を
特公昭４９−３２０８０号公報に示した方法に従い培養
を行い培養液１５βを得た。この培養液から上記したと
同様な方法によりＤＥＡＥ−トヨパール固定化リパーゼ
ＡＬを得た。このＤＥＡＥ−）ヨパール固定化リパーゼ
、ＡＬの活性は１０．’０ＯＯＵ／ｇ担体であった。こ
れを以下の実施例で使用した。

更に、リパーゼＰＳ粉末（サラポロビール社製１６．０
００Ｕ／ｇ）　５　ｇを５００ｍ１の水に溶解し、遠心
分離し上滑を得た。この上清にベントナイト１５ｇを加
え、以下上記した方法と同様な操作を１７３０のスケー
ルで行い、ＤＥＡＥ−トヨパール固定化ＩＪ　ハーゼＰ
Ｓを得た。このＤＥＡＥ−）ヨパール固定化すバー披Ｐ
Ｓの活性は１０．０ＯＯＵ／ｇ担体であった。

これを以下の実施例で使用した。

参考例２（固定化リパーゼの調製法−ｍ）アルカリゲネ
ス属に属する名ｍＰＬ−６７９号を特公昭６０−１５３
１２号公報に示した方法に従い培養を行い培養液１５ｊ
２を得た。この培養液１５１を参考例１に示したと同様
に行い、ベントナイト溶出リパーゼＰＬ−６７９溶液１
０！を得た。このベントナイト溶出リパーゼＰＬ−６７
９溶液１０βに０．ＯＩＭ　　ｐＨ’９．０リン酸緩衝
液で十分平衡化したＤＥＡＥ−セルロース３１を加え、
リパーゼＰＬ−６７９を吸着させ、同緩衝液で洗浄し、
ポリエチレングリコール４０００を除いた後、０．２Ｍ
のＮａＣ１溶液５ｊ２を加えリパーゼＰＬ−６７９を溶
出した。限外濾過膜により１０倍に濃縮した後、加水し
つつ塩濃度が１％以下なるまで脱塩し、精製リパーゼＰ
Ｌ−６７９溶液５００ｍＺを得た。

精製リパーゼＰＬ−６７９溶液５０ｍ１にプロラクト（
乳アルブミン、東洋醸造社製）５０ｇを加え、４℃で１
時間攪拌した後、凍結乾燥機で４８時間乾燥し、乾燥ブ
ロラクＨ１定化リパーゼＰ　Ｌ−６７９５０ｇを得た。

このプロラクト同定化リパーゼＰ’Ｌ−６７９の活性は
１０．０００１１／ｇであった。これを以下の実施例で
使用した。

又、精製リパーゼＰＬ−６７９溶液５０ｍ／にキト−サ
ン５０ｇを加え４℃で１時間攪拌した後、凍結乾燥機で
４８時間乾燥し、乾燥キト−サン同定化リパーゼＰ　Ｌ
−６７９５０ｇを得た。このキト−サン固定化リパーゼ
ＰＬ−６７９の活性は１０．０ＯＯＵ／ｇであった。こ
、れを以下の実施例で使用した。

さらに、酢酸セルロース９ｇを１００−のアセトンに溶
解し、リパーゼＰＬ−６７９粉末１ｇを加え攪拌した後
、減圧下でアセトンを除去し、酢酸セルロース固定化リ
パーゼＰＬ−６７９を調製した。この酢酸セルロース固
定化リパーゼＰＬ−６７９を１ｆｌ角に切って以下の実
施例で使用した。尚、活性は１０゜０００Ｕ／ｇであっ
た。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこの実施例に
限定されるものではないことは言うまでもない。

実施例１ 乾燥したＤＥＡＥ−トヨパール固定化リパーゼＰ　Ｌ−
６７９（１０万Ｌｌ／ｇ担体、水分０．１％含有）２．
５ｇを５０ｍ１のｎ−ヘキサンに懸濁し、内径１０ｔ１
、長さ１５０ｆｉのジャケット付カラムに充填した。

粒状珪藻±６ｇに蒸留水２ｒｎｌを吸収させた上向径１
０　ｘｘ、長さ１５０　ｔｘのジャケット付カラムに充
填し、基質含有水分調整用プレカラムとして使用した。

バーム軟部油３５４．４ｇ、ステアリン酸２８３．６ｇ
をｎ−ヘキサン１　、６００ｇに溶解した上で蒸留水５
ｍ／を加えて攪拌し、３０分間静置した後上清液を基質
溶液として用いた。基質溶液の水分は２００ｐｐｍであ
った。

プレカラム下端より基質溶液をマイクロポンプにより流
速１７０ｍ（／ｈｒ以下で送液すると、プレカラム通過
後の基質溶液の水分は７００ｐｐｍとなった。゛プレカ
ラムを通過した基質溶液をＤＥＡＥ−トヨパール固定化
リパーゼＰＬ−６７９カラムの下端より流速２７．５ｍ
／／ｈｒ　（ＳＶ＝２．３ｈｒ−’）で送液した。尚反
応系の温度は４５℃に保った。３５日間ｗＥ続してカラ
ムに送液し、２４時間毎に反応溶液を採取してトリグリ
−セリド（Ｔ、Ｇ）中のステアリン酸（Ｃ＋ｓ＋ｏ）の
割合、ＴＧの２位置のオレイン酸（Ｃ＋ａ＋＋）の割合
、グリセリド中のＴＧの割合、エステル交換率及びカラ
ム出口水分を求め第６表と第１図に示した。、　　　　
　　　７　　　　−−尚、ＴＧ中の０１８．。の割合は
以下の方法により求めた。反応溶液を同容の塩化メチレ
ンで希釈した上で５０μｌをＩｎ厚螢光剤人シリカゲル
プレート（メルク社製）に帯状に塗布し、石油エーテル
・エーテル・酢酸（７０：　３０　：　１．Ｖ／Ｖ）混
液で１０ａｎ展開し、波長２５４ｎｍＵＶ照射下にＴＧ
のスポットを検出し、本スポットを共栓付試験管にかき
取った。

ＴＧの脂肪酸組成は基準油脂分析法（日本油化学協会編
）２．４．２０．２−７７脂肪酸メチルエステル調製方
法（三フフ化ホウ素・メタノール法）、２．４．２１−
７１脂肪酸組成（ガスクロマトグラフ法）に準拠して分
析した。又ＴＧの２位置脂肪酸組成は以下の通りに分析
した。前記ＴＧの分離方法を５倍のスケールで行ない、
ＴＧのスポットをかき取り、５０ｍ／のクロロホルム−
メタノール混液（２：１．Ｖ／Ｖ）でかき取ったシリカ
ゲルよりＴＧを抽出乾固し、０．１％コール酸ナトリウ
ム水溶液１．５−１２．２％塩化カルシリム水溶液０．
６　Ｊ、リパーゼＰ　Ｌ−６７９５０単位を含むＩＭＩ
−リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）６−を加え４０℃にて
３分間振トウ反応をし、６Ｎ塩酸２ｍｌで反応を停止し
た後２Ｔｎｌエタノール及び１０ｒｎ１石油エーテルで
油分を抽出した。抽出した油分を前記シリカゲルプレー
トによりモノグリセリド（ＭＧ）を分離し、共栓付試験
管にかき取った。ＭＧの脂肪酸組成は前記ＴＧの脂肪酸
組成の分析と同様に行った。更に反応溶液のグリセリド
組成は、イアトロスキャンにより求めた。即ち２倍容の
塩化メチレンで希釈した反応溶液をクロマロッドＳ■に
０．２μβ塗布し、ベンゼン・クロロホルム・酢酸（５
０：　２０　：　１．Ｖ／Ｖ）混液により１０ａｎ展開
し、イアトロスキャンＴＨＩＯにより各ピークの面積比
を求めた。基質溶液及びカラム出口反応溶液の水分はカ
ールフィッシャー水分測定装置により測定した。

リパーゼによるエステル交換率は次の様に算出した。パ
ーム軟部油のＴＧの脂肪酸組成と２位置脂肪酸組成から
式−１に従ってＴＧの１．３位置の脂肪酸組成を算出し
た。

（ＴＧ脂肪酸）Ｘ３−２位置脂肪酸 １．３位置脂肪酸＝□ （式−１） バーム軟部油ＴＧの平均分子量をその脂肪酸組成から約
８４０として１．３位置の脂肪酸のモル組成を算出し、
バーム軟部油に混合したＣ１８．。とのモル比から反応
平衡時のＴＧの１，３位置の脂肪酸組成を算出した。尚
リパーゼＰＬ−６７９は１．３位置特異性が高く、エス
テル交換反応はＴＧの１．３位置のみに起っている。

パーム軟部油ＴＧの１，３位置脂肪酸組成はパルミチン
酸（ＣＩ’ｂ　＋　ｏ）オレイン酸（Ｃ＋ｓ＋１）　　
リノール酸（Ｃ＋＋＋＋□）の和が９４．６重量％であ
り、反応平衡時には４２．７％に減少する。エステル交
換率を式−２により算出した。

エステル交換率（％）＝ （Ｃ＋ａ：ｏ＋ｃ＋ｓ；＋＋Ｃ＋８＋ｚ）基質−（Ｃ１
０：Ｏ＋ＣＩ８＋Ｉ＋ＣＩ８：２）反応後（Ｃ＋６＋ｏ
＋Ｃ＋ａ＋＋＋Ｃ＋８：ｚ）基質−（Ｃ＋ａ＋ｏ＋Ｃ＋
ａ：＋＋Ｃ＋ｓ＋ｚ）平衡時（式−２） （来夏以下余白） 第６表及び第１図の結果からＤＥＡ’Ｅ−）ヨパール固
定化リパーゼＰＬ−６７９はエステル交換脂を得るため
連続して反応できる。又ＤＥＡ、Ｅ−トヨパール固定化
リパーゼＰＬ−６７９の半減期は式−３により算出する
と約１９０日となった。

半減期（日）＝Ａｎ２／ｋｄ　　　（式−３）を 更に固定化酵素の活性が半減する迄の２倍の期間に処理
できるパーム軟部油は、エステル交換率９４％の場合、
固定化酵素１　ｋｇ当り約５．７ｔと計算される。

実施例２ 実施例１によりＤＥＡＥ−）ヨパール固定化すパーゼＰ
Ｌ−６７９カラムより溶出した反応液（０〜８０時間通
液）２．５　ｆｆｉを２０℃に１２時間静置し、５，０
００×ｇの遠心分離により上滑液２．２４２を得た。沈
澱を０．５ｊ！のｎ−ヘキサンに懸濁し上記遠心分離に
より上清液０．４１を得た。雨上清液を合せ５℃に１２
時間静置し上記遠心分離操作により上清液２．４１を得
た。本上清液に２５％アンモニア水０．５２及びエタノ
ール２βを分液ロート中で十分に混和した後１時間静置
し、下層のエタノール層を排出し、上層へ蒸溜水０．５
ｊ２及びエタノール２ｅを十分に混和し１時間静置汲上
層のｎ−ヘキサン層を回収した。本ｎ−ヘキサン層をロ
ータリーエバポレーターで２０ｍＩＩＩＨｇ減圧下に４
０℃で濃縮し、次いで６０℃で１時間５　ｍｍＨｇ減圧
下にｎ−ヘキサンを溜去し、油分２４９ｇを得た。本油
分をアセトン５６０　ｍｌに溶解した後５℃に２４時間
静置し、生成した沈澱をＧ４労ラスフィルター上で吸引
濾過により回収した。

本沈澱１９４ｇをアセトン４８０−に溶解した後５°Ｃ
に２４時間静置し生成した沈澱を０４ガラスフイルター
上で吸引濾過により回収した。本沈澱１２７ｇをアセト
ン３００−に溶解後５°Ｃに２４時間静置し生成した沈
澱を０４ガラスフイルター上で吸引濾過により回収した
。本沈澱を５　ｍｍ’Ｈｇに２４時間減圧してアセトン
を溜去し、１０６ｇの油脂を得た。本油脂１００■を塩
化メチレン０．１　ｍ／に溶解し、高速液体クロマドグ
ラフィーにより分析した。カラムはＯＤＳカラム（ＹＭ
ＣパックＡ３１２．　６　Ｘ１５０ｍｍ、　　山村化学
研究所型）を使用し、溶出液にアセトニトリル・テトラ
ヒドロフラン・塩化メチレン（２０：　８　：１．Ｖ／
Ｖ）混液を使い流速２　ｍｌ　／ｍｉｎ　′７：Ｒ１検
出器（ウォーターズ社Ｒ４０１）により各油脂成分ピー
クを検出した。同様にして市販カカオ脂の分析を行なっ
た。

その結果を第７表に示した。

第７表 第７表の結果からエステル交換処理し、冷却゛・アンモ
ニア脱酸処理後分別して得られる油脂は力６０　″ カオ脂に非常によく似たＴＧ分子種組成であった。

尚、ＤＧはジグリセリド、Ｐはバルミチン酸、０はオレ
イン酸、Ｓはステアリン酸を示す。

実施例３ 実施例１によりＤＥＡＥ−）ヨバール固定化すパーゼＰ
Ｌ−６７９カラムから溶出した反応液５０ｍ／をロータ
リーエバポレーターにより５０ｍｍ）ＩｇＪ圧下に６０
℃で１時間ｎ−ヘキサンを溜去し、油分９ｇを得た。本
油分８．５ｇを２０ｍ１蒸留用フラスコに採取し減圧蒸
留装置により遊離脂肪酸を溜去した。蒸留は２４０℃の
油浴により油分を加熱し、微量のＮ２ガスを油分に吹き
込みつつ３　ｍｍＨｇに真空ポンプで減圧しつつ２０分
間行なった。直ちに残留物を水冷し油分４．３ｇを得た
。本油分のグリセリド組成及びＴＧの脂肪酸組成、ＴＧ
の２位置脂肪酸組成を実施例１に示したと同様の方法に
より分析した。その結果を第８表に示した。

（来夏以下余白） 第８表の結果から脂肪酸の入れ替えが殆んど無く蒸留に
よる脱酸が可能であった。尚ＦＦＡは遊離脂肪酸を示す
。

次に前記と同様に蒸留して得られた油分４０ｇをアセト
ン９０ｒｎｌに溶解した後５℃に２４時間静置し、生成
した沈澱をＧ４ガラスフィルターで回収し再びアセトン
９０ｒｎｌ−に？容解した。同様の操作を計３回繰り返
した後得られた沈澱を５　ｍｍ）１ｇ減圧下に室温でア
セトンを溜去し、油脂１５．５　ｇを得た。本油脂を実
施例２に示したと同様にして高速液体クロマトグラフィ
ーにより分析した。その結果を第９表に示した。

第９表の結果から蒸留脱酸したエステル交換脂を分別す
ることによりカカオ脂と非常に似た分子種組成の油脂が
得られた。

実施例４ 実施例１と同様に連続反応を３日間行ない得られた反応
溶液２１に水酸化カルシウム１４．８　ｇ及び蒸留水４
００ｄを加え、４０℃で１２時間攪拌した。１゜０００
Ｘｇの遠心分離により生成した間型物を除去した上清液
を同様に９回処理し脂肪酸を除去した。

上清液をロータリーエバポレーターで濃縮し、更に５　
ｍｍ）１ｇ減圧下に２４時間乾固し、油分１７８ｇを得
た。

本油分を４０℃に加温したアセトン４００−に溶解した
後３０°Ｃに２４時間保ち生成した沈澱を０４ガラスフ
イルターで除去した。濾液を５℃に２４時間保ち生成し
た沈澱を０４ガラスフイルターで回収し・再びアセトン
４００　ｍ／に溶解した後、５℃に２４時間保ち生成し
た沈澱を０４ガラスフイルターで回収し、更に同フィル
ター上でアセトン１００艷で洗浄した。回収した沈澱を
５　ｍｍＨｇ減圧下にアセトンを溜去し精製エステル交
換脂５４ｇを得た。実施例２と同様に、高速液体クロマ
トグラフィーにより精製エステル交換脂を分析し、その
結果を第１０表に示した。

（来夏以下余白） 比較例１ リパーゼ３　Ａ　（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ由来のリ
パーゼ５ｐ２２５をデュオライ）Ｓ７６１に固定化、ノ
ボ社製）２．５ｇを５０−のｎ−ヘキサンに懸濁し、内
径１０−１、長さ１５０ｆｌのジャケット付カラムに充
填した。

粒状珪藻土６ｇに蒸留水２ｍｌを吸収させ、内径Ｉｏｎ
、長さ１５０ｆｌのジャケット付カラムに充填し基質含
有水分調整用プレカラムとして使用した。

以後実施例１と同様の基質溶液を流速４９．５ｒｎｌ／
ｈｒでカラム下端より送液した。尚反応系温度を４５°
Ｃに保った。反応溶液は実施例１の方法と同様にＴＧの
脂肪酸組成及びグリセリド組成を分析した。

その結果を第１１表に示した。

第１１表　リパーゼ３Ａによるエステル交換第１１表の
結果から、ＤＥＡＥ−）ヨパール固定化リパーゼＰＬ−
６７９を用いる条件で、リパーゼ３Ａの連続反応を行な
うと、ＴＧ中のＣＩ　Ｂ　！。の増加で示される活性は
急速に失われ、連続的にエステル交換脂を得られなかっ
た。

実施例５ 基質溶液の流速を４０．９ｒｎｌ／ｈｒ　（ＳＶ＝３．
５ｈｒ−’）。

５５．２ｍｊ／ｈｒ　（ＳＶ＝４．７ｈｒ−’）、　　
９７．２ｒｎｌ／ｈｒ　（ＳＶ＝８．３ｈｒ−’）、　
１５０．５＋ｎ／／ｈｒ（ＳＶ＝１２．８ｈｒ−’）に
変える以外は実施例１と同様に行なった。その結果を第
１２表に示した。なお、固定化酵素カラム出口に於ける
反応溶液の含有水分はいずれの流速でも２００ｐｐｆｆ
ｌであった。

（来夏以下余白） 第１２表の結果から、流速を変えることによりエステル
交換率を任意蟲４択、きお。よがゎヵ、お。

又、各流速に於けるエステル交換活性の半減期はいずれ
も約１９０日であった。目的とするエステル交換率を９
０．８４．６７、５７％及び実施例１に示した９４％に
設定した場合に固定化酵素の活性の２半減期の間（３８
０日）に固定化酵素１　ｋｇで処理されるパーム軟部油
を計算し、第１３表に示した。

＊但し、固定化酵素はＤＥＡＥ−トヨパール同定化リパ
ーゼＰ　Ｌ−６７９１０万Ｕ／ｇ担体である。

実施例６ 反応系の温度を５０°Ｃに保つ以外は実施例１と同様に
行なった。その結果を第１４表に示した。

尚、カラム出口の水分は３１０ｐｐｍで一定であった。

第１４表の結果から、反応系の温度は実施例１で行なっ
た４５℃と同様５０℃でも良好なエステル交換反応が起
こった。

実施例７ 乾燥したＤＥＡＥ−）ヨバール固定化リパーゼＰ　Ｌ−
６７９（１０万Ｕ／ｇ担体）２．５ｇを５０ｍ１のｎ−
ヘキサンに＠濁し、内径１０ｆｉ、長さ１５０ｆｌのジ
ャケット付カラムに充填した。トリオレイン２７２．２
ｇ、　　トリラウリン２００ｇをｎ−ヘキサン６６０ｇ
に溶解した上で蒸留水１．５９ｇを加え攪拌した。基質
溶液の水分は１４００ｐｐｍであった。基質溶液をＤＥ
ＡＥ−）ヨパール固定化すパーゼＰＬ−６７９カラムの
下端より流速１７．５ｒｎｌ／ｈｒで送液した。尚反応
系の温度は４５℃に保った。９日間継続してカラムへ送
液し、２４時間毎に反応溶液を採取し、実施例２に示し
たと同様−の方法によりＴＧの分子種を高速液体クロマ
トグラフィーにより分析した。その結果を第１５表に示
した。

尚、カラム出口水分は４５０ｐｐｍで一定であった。

但し、Ｌはラウリン酸、○はオレイン酸を、その他はジ
グリセリド、遊離脂肪酸等を表わす。

第１５表の結果から、トリオレインとトリラウリンの様
なトリグリセリド間のエステル交換も連続的に非常に良
く起きた。

実施例８ 実施例１と同様な方法により調製したＤＥＡＥ−トヨパ
ール固定化リパーゼＰＬ−６７９カラムと基質含有水分
調整用プレカラムを用いた。

バーム軟部油１７７．２ｇ（５，６四／Ｖχ）、ステア
リン酸１４１．８ｇ　（ステアリン酸／バーム軟部油＝
０．８−八）をｎ−ヘキサン１　、８５０ｇに溶解した
上で蒸留水５ｍ！を加えて攪拌し、３０分間静置した後
上清液を基質溶液として用いた。プレカラムを通過し水
分を約７００’　ｐｐｍに調整した基質溶液を固定化酵
素カラムの下端より流速２７．５ｒｎｌ／ｈｒで９日間
継続して送液し、以後実施例１と同様に行い、エステル
交換率を求めた。反応温度は４５℃とした。その結果を
第１６表に示した（Ｒｕｎ　Ｔｈ１）。

次にバーム軟部油２６５．８ｇ（８，４ｗ／ｖχ）、ス
テアリン酸２１２．７ｇをｎ−ヘキサンＬ７３５ｇに溶
解して上記と同様に反応を行ないエステル交換率を求め
た。

その結果を第１６表に示した（Ｒｕｎ　１１ｋＬ２）。

更にパーム軟部油４４３ｇ（１４，０ｗ／ｖχ）、ステ
アリン酸３５４．５ｇをｎ−ヘキサンＬ５００ｇに溶解
して上記と同様に反応を行ないエステル交換率を求めた
。

その結果を第１６表に示した（Ｒｕｎ　Ｔｈ４）。

又パーム軟部油３５４．４ｇ、ステアリン酸２１２．７
ｇ（ステアリン酸／パーム軟部油＝０．６Ｗ八）、ｎ　
−ヘキサン１，６７０ｇを用いて上記と同様に行ないニ
ス−チル交換率を求めた。その結果を第１６表に示した
（Ｒｕｒ＋患−５）。

更に又パーム軟部油３５４．４ｇ、ステアリン酸１４１
．８ｇ　（ステアリン酸／パーム軟部油＝　０．４　Ｗ
／Ｗ）、ｎ−ヘキサンＬ７２０ｇを用いて上記と同様に
行ないエステル交換率を求めた。その結果を第１６表に
示した（Ｒｕｎｔｋ６）。尚、カラム出口の水分はすべ
て２００ｐｐｍで一定であった。

（来夏以下余白） 第１６表の結果からパーム軟部油の濃度と、ステアリン
酸とパーム軟部油との比を変化させてもエステル交換率
は殆んど変わらず連続してエステル交換が非常に良く起
こることがわかる。

実施例９ セパビーズＦ　Ｐ　−ＤＡＯ５（三菱化成工業社製）５
０ｇを０、ｌＮ−ＮａＯＨ水溶液５００ｄに６時間浸漬
した後阻１濾祇上で吸引しつつ蒸留水２βで洗浄し活性
化セパビーズＦＰ−Ｄ＾０５を得た。

リパーゼＰＬ−６７９粉末の５％水溶液ＩＩ！に上記活
性化セパビーズ５０ｇを加え４°Ｃにて４時間攪拌した
後磁１濾紙上で吸引しつつ蒸留水２１で洗浄し、更に凍
結真空乾燥により水分を除去し、乾燥セパビーズＦ　Ｐ
−ＤＡＯ５固定化リパーゼＰ　Ｌ　−６７９４０ｇを得
尼本固定化酵素の活性は１４，０６０Ｕ／ｇ担体であっ
た。

乾−燥したセパビーズＦ　Ｐ−ＤＡＯ５固定化リパーゼ
Ｐ　Ｌ−６７９（１４，０ＯＯＵ／ｇ担体）１０ｇをｎ
−ヘキサン１００ｍ１に懸濁し、内径２０鶴、長さ１５
０　ｎのカラムに充填した。

粒状珪藻土７ｇに蒸留水２．５−を吸収させ内径１（ｂ
−１長さ１５０ｎのカラムに充填し、基質溶液含有水分
調整用のプレカラムとした。実施例１と同様の基質溶液
を流速２７．５ｍ／でプレカラムに通液した後、同じ流
速で固定化酵素カラム下端より送液した。固定化酵素カ
ラム入口で基質溶液の含を水分は７００ｐｐｍ１出口で
は２００ｐｐｍであった。反応系は４５℃に保ち９日間
継続して反応を行なった。１日目、４日目、７日目、９
日目に反応液のグリセリ第１７表 化リパーゼＰＬ−６７９によるエステル交換が可能なこ
とがわかる。

実施例１０ デュオライトＳ　７６１１５ｇ　Ｇ　Ｉ　Ｎ−ＮａＯＨ
水溶液５０〇−に４時間浸漬した後患１濾祇上で吸引濾
過により樹脂を回収した。同濾紙上で樹脂を１１の蒸留
水で濾液のｐＨが６．０になる迄洗浄し、吸引濾過によ
り樹脂の余剰の水分を除いｋ。本樹脂にリパーゼＰＬ−
６７９粉末１％水溶液３００　ｍｌ（３０万Ｕの活性を
含む）を加え４°Ｃで１時間攪拌し更に１２時間静置し
た。上清液中のリパーゼ活性の減少から樹脂に固定化さ
れたリパーゼ活性を求めたところ乾燥樹脂１ｇ当り１，
９４０Ｕであった。

デュオライトＡ３８７について上記方法に従いリパーゼ
Ｆ’Ｌ＝６７９を固定化すると乾燥樹脂１ｇ当り１．７
１００が固定化された。

リパーゼＰＬ−６７９を固定化したデュオライト５７６
１あるいはデュオライトＡ３８７を各々２．５ｇを実施
例１のＤＥＡＥ−トヨパール固定化リパーゼＰＬ−６７
９に替えて使用する以外は実施例１と同様に反応を行な
い、エステル交換率を求めた。この結果を第１８表に示
した。

又、リパーゼＰＬ−６７９粉末２４０■とセライト２ｇ
を均一に混合固定し、実施例１のＤＥＡＥ−１−ヨバー
ル圃定化リパーゼＰ　’Ｌ−６７９に替えて使用し、流
速を３．０　ｍ／ｈｒ　（ＳＶ＝０．５２ｈｒ−’）と
する以外は実施例１と同様に反応を行ない、エステル交
換率を求めた。又参考例２の方法により調製したキト−
サン固定化リパーゼＰＬ−６７９、プロラクト固定化リ
パーゼＰＬ−６７９、又は酢酸セルロース固定化リパー
ゼＰ　Ｌ　−６７９２，５ｇを実施例１のＤＥＡＥ−）
ヨバール固定化リパーゼＰＬ−６７９に替えて使用し、
流速を３．０　ｍｌ／ｈｒ　（ＳＶ＝０．５２ｈｒ−’
）　’とする以外は実施例１と同様に反応を行ないエス
テル交換率を求めた。更にリパーゼＰＬ−６７９粉末を
そのまま１ｇ使用し上記と同様に反応を行ないエステル
交換率を求めた。これらの結果を第１８表に示した。

（来夏以下余白） 第１８表の結果からセライト、キト−サン、プロラクト
、酢酸セルロースに固定化したリパーゼＰＬ−６７９と
リパーゼＰＬ−６７９粉末も良好なエステル交換反応が
起こることがわかる。

実施例１１ 実施例１で用いたＤＥＡＥ−）ヨパール固定化リパーゼ
ＰＬ−６７９の代わりに各々ＤＥＡＥ−）ヨパール固定
化リパーゼＰ　Ｌ　−２６６（１万１１／ｇ担体）、Ｄ
ＥＡＥ−）ヨパール固定化リパーゼＡＬ　（１万Ｕ／ｇ
担体）　、ＤＥＡＥ−）ヨパール固定化リパーゼＰＳ　
（１万Ｕ／ｇ担体）を用いて実施例１と同様に行ない、
エステル交換率を求めた。ＤＥＡＥ−トヨバール固定化
リパーゼＰ　Ｌ　−６７９（１０万Ｕ／ｇ担体）も実施
例１と同様に行ない、エステル交換率を求めた。これら
の結果を第１９表に示した。尚、４種類の固定化酵素に
ついて、全て流速を３．０艷／ｈｒとした。尚カラム出
口の水分は全て２１０ｐｐｍで一定であった。

第　　１９　　　表 第１９表の結果から、ＤＥＡＥ−）ヨパールに固定化し
たリパーゼＰＬ−２６６、リパーゼＡＬ及びリパーゼＰ
Ｓはいずれも連続してエステル交換を行なうために使用
できる。

実施例１２ ＤＥＡＥ−）ヨパール固定化リパーゼＰＬ−６７９（１
０万Ｕ／ｇ担体）２．５ｇを５０ｍ１のオリーブ油に懸
濁し内径Ｉｏｎ、長さ１５０ｆｌのジャケット付カラム
として用いた。反応系を４０°Ｃに保ち、マイクロポン
プにより流速４．１　ｍ／／ｈｒで固定化酵素カラム下
端より基質溶液を送液した。２４時間毎に反応液を採取
し、実施例２の高速液体クロマトグラフィーと同様の方
法によりＴＧ分子種の分析を行なった。

その結果を第２０表に示した。尚カラム出口の水分は４
７０ｐｐｍで一定であった。

尚Ｏはオレイン酸を、Ｃはカプリン酸を、基質はオリー
ブ油を示す。

第２０表の結果から、ＤＥＡＥ−トヨパール固定化リパ
ーゼＰＬ−６７９は有機溶媒を使用しなくてもエステル
交換反応に使用できる。

実施例１３ 実施例１と同様な方法により調製したＤＥＡＥ−トヨバ
ール固定化リパーゼＰＬ−６７９カラムと基質含有水分
調整用プレカラムを用いた。

パーム軟部油３５４−．４ｇ、ステアリン酸メチル２９
７．６ｇをｎ−ヘキサン１６００ｇに溶解した上で蒸留
水５−を加えて攪拌し、３０分間静置した後上滑液を基
質溶液として用いた。プレカラムを通過し水分を約７０
０ｐｐｍに調整した基質溶液を固定化酵素カラ人の下端
より流速２７．５ｍＺ／ｈｒで９日間継続して送液し、
以後実施例１と同様に行い、エステル交換率を求めた。

反応温度は４５℃とした。その結果を第２１表に示した
。

又、ステアリン酸メチル２９７．６ｇの代りにステアリ
ン酸エチル３１１．５ｇを用いて上記と同様に行い、エ
ステル交換率を求めた。その結果を第２１表に示した。

゛ さらにステアリン酸メチル２９７．６ｇの代りにステア
リン酸ブチル３３９．６ｇを用いて上記と同様に行いエ
ステル交換率を求めた。その結果を第２１表に示した。

尚カラム出口の水分はすべて２６０ｐｐｍで一定であっ
た。

第２１表の結果から、ＤＥＡＥ−）ヨパール固定化リパ
ーゼＰＬ−６７９はステアリン酸メチル、ステアリン酸
エチル、ステアリン酸ブチルのような脂肪酸エステルと
バーム軟部油で連続して良好なエステル交換反応が起こ
ることがわかる。

実施例１４ 実施例１と同様な方法により調製したＤＥＡＥ−トヨパ
ール固定化リパーゼＰＬ−６７９カラムと基質水分調整
用プレカラムを用いた。

オリーブ油３５０ｇ、ヤシ油３５０ｇをｎ−ヘキサン１
６００ｇに溶解した上で蒸留水５ｒｎｌを加えて攪拌し
、３０分間静置した後上滑液を基質溶液として用いた。

基質溶液の水分は２００ｐｐｍであった。プレカラムを
通過後の基質溶液の水分は５５０ｐｐｍとなった。

プレカラムを通過した基質溶液をＤＥＡＥ−）ヨパール
固定化すパーゼＰＬ−６７９カラムの下端より流速２７
．５ｍ／／ｈｒ（ＳＶ＝２．３ｈｒ−’）で送液した。

尚、反応系の温度は４５℃に保った。７日間継続してカ
ラムに送液し、反応液４．６１を得た。

この反応液のＴＧの分子種を実施例２の高速液体クロマ
トグラフィーと同様な方法により分析した。その結果を
第２２表に示した。尚カラム出口の水分は１３０ｐｐｍ
で一定であった。

第２２表　エステル交換脂のＴＧの分子種第２２表の結
果から、ＤＥＡＥ−トヨパール固定化リパーゼＰＬ−６
７９は、オリーブ油とヤシ油のエステル交換脂を得るた
め連続して反応できる。

実施例１５ 実施例１と同様な方法により調製したＤＥＡＥ−トヨパ
ール固定化リパーすＰＬ−６７９カラムと基質水分調整
用プレカラムを用いた。

パーム油５６０ｇ、大豆油８４０ｇをｎ−ヘキサン３２
００ｇに溶解した上で蒸留水１０ｍ／を加えて攪拌し、
３０分間静置した後上滑液を基質溶液として用いた。

基質溶液をプレカラムに通液した後の水分は５００ｐｐ
ｍであった０ 以後、実施例１４と同様に７日間４Ｉ続して送液し反応
液４．６１を得た。この時の反応液の水分は１５０ｐｐ
ｍであった。この反応液をロータリーエバポレーターで
２ＱｍｍＨｇ減圧下にｎ−ヘキサンを情夫し、エステル
交換脂１０００　ｇを得た。このエステル交換脂を５°
Ｃまで４８時間かけて徐々に冷却し、析出した結晶を同
温度で濾別した。液体油歩留は８５％で液体油を０℃氷
水中で冷却試験をしたところ２４時間後までくもりを生
じず耐冷却性を備えたエステル交換脂を製造できた。

又、パーム油５６０ｇと菜種油８４０ｇをｎ−ヘキサン
３２００　ｇに溶解し、蒸留水１０ｍ／を加えた上滑液
を基質溶液として用いる以外は上記したと同様に行いエ
ステル交換脂１０００　ｇを得た。尚、カラム入口での
水分は５００ｐｐｍであり、又出口での水分は１５０ｐ
ｐｍであった。このエステル交換脂を５℃まで４８時間
かけて徐々に冷却し、析出した結晶を同温度で濾別した
。液体油歩留は８８％で液体油の耐冷却性は２４時間で
あって、耐冷却性を十分備えたエステル交換脂を製造で
きた。

さ−らに、牛脂７００ｇとオリーブ油７００ｇをｎ−ヘ
キサン３２００　ｇに溶解し、蒸留水１０Ｉｎｌを加え
た上清液を基質溶液として用いる以外は上記したと同様
に”行いエステル交換脂１０００　ｇを得た。尚、この
場合も入口水分は５００ｐｐｍ、出口水分は１５０ｐｐ
ｍであった。

このエステル交換脂の融点を示差走査熱量計（メトラー
社製）で測定したところ２３〜２７℃となり、牛脂（融
点４０〜５０℃）とオリーブ油（融点−６℃）から新し
いエステル交換脂を製造することができた。

次にシアオレイン（シア脂分別油）　１４００　ｇ　’
ｃ　ｎ−ヘキサン３２００　ｇに溶解し、蒸留水１０ｍ
１を加えた上滑液を基質溶液として用いる以外は上記し
たと同様に行い、エステル交換脂１０００　ｇを得た。

尚、この場合も入口水分は５００ｐｐｍ、出口水分は１
５０ｐｐｍであった。このエステル交換脂のＴＧの分子
種を実施例２の高速液体クロマトグラフィーと同様な方
法により分析した。その結果を第２３表に示した。

第２３表　ＴＧの分子種 尚Ｓはステアリン酸、Ｏはオレイン酸、Ｌ’ｎはリノー
ル酸を示す。第２３表の結果から、シアオレインの分子
内エステル交換反応が連続的に起きた。

実施例１６ 実施例１と同様な方法により調製したＤＥＡＥ−トヨバ
ール固定化リパーゼＰＬ−６７９カラムと基質含有水分
調整用プレカラムを用いた。

オリーブ油３５４．４ｇ、パルミチン酸２０４．８ｇを
ｎ−ヘキサン１６００　ｇに溶解した上で蒸留水５−を
加えて攪拌し、３０分間静置した後、上清液を基質溶液
として用いた。プレカラムを通過し水分を７００ｐｐｍ
に調整した基質溶液を固定化酵素カラムの下端より流速
２７．５＋ｎ／／ｈｒで送液した。２４時間毎に反応液
を採取し、実施例２の高速液体クロマトグラフィーと同
様な方法によりＴＧ分子種の分析を行った。

その結果を第２４表に示した。尚カラム出口の水分は２
００ｐｐｍで一定であった。

折を行った。その結果を第２５表に示した。尚カラム出
口の水分は２００ｐｐｍで一定であった。

尚、０はオレイン酸、Ｐはパルミチン酸を、基質はオリ
ーブ油を示す。

第２５表 尚、０はオレイン酸、Ｌはラウリン酸を、基質はオリー
ブ油を示す。

第２４．２５表の結果からＤＥＡＥ−）ヨパール固定化
リパーゼＰＬ−６７９は、オリーブ油とパルミチン酸、
オリーブ油とラウリン酸で連続して、良好なエステル交
換反応を起す。

実施例１７ ヤシ油３０．２ｇ　、オレイン酸１４．９ｇを１４４ｇ
のｎ−ヘキサンに溶解し、蒸溜水０１ｒｎｌを加え良く
攪拌し、６００ｐｐｍの水分を含む基質溶液を調製した
。

実施例１と同様な固定化酵素カラムの下端より上記基質
溶液を流速２０ｍ／ｈｒで送液した。反応は４０℃で５
日間連続して行なった。反応液全体から０．１−を採取
したＮ２気流下に乾固した後、ＴＭＳＩ−Ｈ（ガスクロ
工業製）０．２ｒｎｌを加え６０°Ｃに１５分間加熱し
てトリメチルシリル化しガスクロマトグラフィーにより
分析を行なった。即ち、ＪＸＲ−シリコーン３％の充填
剤（担体クロモゾルブＷＩＶ、ＤＭＣ３，ガスクロ工業
製）を充填した内径３ｆｌ長さ１ｍのカラムを使用し、
”カラム温度３５０℃、キャリアーガス（Ｎｚ）４０ｒ
ｎｌ／ｌｌｌ１ｎで各成分を分離し、各成分を水素炎イ
オン化検出器で検出した。第２６表にその結果を示した
。

（来夏以下余白） 実施例１８ 牛脂４２．２ｇ、アラキドン酸６．４ｇをｎ−へキサン
２１１ｇに溶解し基質溶液として使用した。

上記基質溶液を実施例１と同様にプレカラムを通過させ
た後、実施例１と同様な固定化酵素カラムの下端より流
速１５ｍ／／ｈｒで送液した。反応は４０℃で３日間行
なった。反応液１−を２４時間毎に採取し、実施例１と
同様にガスクロマトグラフィーによりトリグリセリドの
脂肪酸組成を分析した。その結果を第２７表に示した。

第２７表から油脂へ高度不飽和酸を導入することが可能
なことがわかる。

実施例１９ ヤシ油３０２．４ｇ、カプリル酸１４４．２ｇ及びカプ
ロン酸８６、１ｇを４０７ｇのｎ−ヘキサンに溶解し、
更に蒸溜水０．５５ｍ１を溶解し、含有水分６００ｐｐ
ｍの基質溶液を調製した。

実施例１と同様な固定化酵素カラムの下端より上記基質
溶液を１０ｍ／／ｈｒの流速で送液した。反応は４０℃
で３日間行なった。反応液全体から０．１　ｍｌを採取
し、実施例１７と同様に分析を行なった。この結果を第
２８表に示した。

（木頁以下余白） 実施例　２０ ＤＥＡＥ−Ｔ−Ｅパール固定化リパーゼＰＬ−６７９（
ｉｏ万ｕ／ｇ担体、水分０．５Ｘ含有）４０ｇをｎ−ヘ
キサンに懸濁し、内径＋５ｍｍ　、長さ５００１Ｉ１ｍ
のジャケット付きカラムに実施例１と同様の方法により
充填した。

パーム軟部油１１４０ｇ、ステアリン酸９１１ｇをｎ−
ヘキサン７．８００ｍ１に溶解し、基質溶液としな。尚
、本基質溶液は１２０ｐｐｌＩの水分を含んでいた。

基質溶液の一部をプレカラム下端よりマイクロポンプを
使用して１５５ｍ１／ｈｒ反応液を２４時間毎に採取し
、実施例１と同様の方法でエステル交換率を求めた。

最初の３日間は基質溶液の流速を２９０ｍ１／ｈｒとし
て反応しこの間のエステル交換率の平均は９８％であっ
た。３日日以降は流速を２９０１ｎｌ／ｈｒから２０６
Ｉｌｌｌ／ｈｒに向けてゆっくりと減速して９０日間反
応し、この間のエステル交換率を又、第２図に本実施例
でのフローチャートを示した。

”ｉ’Ｒ１Ａは基質溶液タンク、Ｂ、Ｃは送液用ポンプ
ＬＤは基質溶液水分調整用プレカラム、Ｅはラインミキ
サ、Ｆは固定化リパーゼを充填した連続反応槽カラム、
Ｇは製品タンクを示す。又、送液ポンプＢは鼻水量の異
なる基質溶液を混合して任意の水分の基質溶液を調整す
る際に使用する。

実施例　２１ ［ＩＥＡＥ−）ヨパール固定化リパーゼＰＬ−６７９（
１０万ｕ／ｇ担体）１０ｇを１００ｍ　ｌのオリーブ油
に懸濁し、内径１５ｍｍ長さ２００１ｍのカラムに充填
した。

オリーブ油１５０ｇにステアリン酸１２０ｇ及び蒸溜水
０．１８ｇを７５′Ｃで溶解し、９７０ｐｐｍ　　の水
分を含む基質溶液を得た。　基質を＋２！］／ｈｒの流
速で固定化酵素カラム上端より送液し２反応系全体を７
５″′Ｃに保った。

２４時間毎に反応液を採取し、実施例２の高速液体クロ
マトグラフィーと同様の方法によりトリグリセリド分子
種の分析を行ない、その結果を第３０表に示した。尚、
カラム出口の水分は１８０ｐｐＩｌｌで一定であった。

第３０表 １θ０

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例１における、エステル交換率
を示す図である。 第２図は、本発明の実施に好適な連続反応槽のフローシ
ートの例である。 （命令）手続主甫正書（方式） １．事件の表示 昭和６３年　特許願第１６２９３０号 ２、発明の名称 アルカリ性高分子量リパーゼを用いた連続エステル交換
法によるエステル交換脂の製造法３、補正をする者　　
　　　′ 事件との関係　特許出願人 住　所　東京都中央区日本橋小伝馬町１７番１７号峰澤
金物ビル４階 名　称　食品産業バイオリアクターシステム技術研究組
合 ４、代理人 住　所　東京都立川市柴崎町２−４−１１ＦＩＮＥビル
ｆｆｉ　　０４２５−２４−５４１１（（Ｑ７、補正の
対象 明細書及び図面 ８、補正の内容 タイプ印書した明細書第１３頁、第２７頁、第２８頁、
第３４頁、第３５頁、第４１頁、第４２頁、第４５頁、
及び適正な第１図を別紙の通り補充しまず。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アルカリ性高分子量リパーゼを用いた脂肪酸と油脂
   、油脂と油脂、又は脂肪酸エステルと油脂との間の連続
   エステル交換反応により、エステル交換脂を製造する方
   法において、用いるアルカリ性高分子量リパーゼの含水
   率を０％以上、５％以下にして連続反応槽に充填し、こ
   の連続反応槽の入口より供給する基質の含有水分を１０
   ０ｐｐｍ以上、１８００ｐｐｍ以下とし、前記連続反応
   槽出口での反応後基質含有水分を５０ｐｐｍ以上、８０
   ０ｐｐｍ以下とすることを特徴とするエステル交換脂の
   製造方法。 ２、脱水操作なしに反応を行う特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３、アルカリ性高分子量リパーゼがイオン交換体に結合
   させた固定化アルカリ性高分子量リパーゼであるか、添
   加物として蛋白質や、糖類や、粘土鉱物を混和した後乾
   燥して固定した固定化アルカリ性高分子量リパーゼであ
   るか、又はアルカリ性高分子量リパーゼ自体であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載のエステル交換
   脂の製造方法。 ４、アルカリ性高分子量リパーゼを固定化するイオン交
   換体の基本構造がメタクリレート系樹脂により構成され
   る弱酸性イオン交換樹脂であることを特徴とする特許請
   求の範囲第３項記載のエステル交換脂の製造方法。 ５、アルカリ性高分子量リパーゼが分子量１０万以上、
   至適ｐＨ８．０以上であって微生物の生産するアルカリ
   性高分子量リパーゼであることを特徴とする特許請求の
   範囲第１、２、３又は４項記載のエステル交換脂の製造
   方法。 ６、アルカリ性高分子量リパーゼが１，３位置特異性リ
   パーゼであることを特徴とする特許請求の範囲第１、２
   、３、４又は５項記載のエステル交換脂の製造方法。 ７、アルカリ性高分子量リパーゼがアルカリゲネス属、
   アクロモバクター属、シュードモナス属に属する微生物
   の生産するアルカリ性高分子量リパーゼであることを特
   徴とする特許請求の範囲第５又は６項記載のエステル交
   換脂の製造方法。 ８、連続エステル交換反応を８０℃以下の温度で行なう
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のエステル
   交換脂の製造方法。 ９、アルカリ性高分子量リパーゼの含水率の調整を凍結
   乾燥法により行なうことを特徴とする特許請求の範囲第
   １、２又は３項記載のエステル交換脂の製造方法。 １０、エステル交換油脂反応溶液を冷却し、高融点成分
   を沈殿して 反応液より 分離することを特徴とする特許請求の範囲 第１項記載のエステル交換脂の製造方法。 １１、エステル交換油脂反応溶液にアルカリ剤を加えて
   脂肪酸を石鹸として除去することを特徴とする特許請求
   の範囲第１０項記載のエステル交換脂の製造方法。 １２、エステル交換油脂反応溶液を減圧蒸留または膜濾
   過法により反応溶媒を除去し、脱溶媒反応油分を回収す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のエステ
   ル交換脂の製造方法。 １３、脱溶媒油分を有機溶媒に再溶解してから冷却して
   油脂を分離精製することを特徴とする特許請求の範囲第
   １０、１１又は１２項記載のエステル交換脂の製造方法
   。 １４、脱溶媒油分を蒸留し、脂肪酸と脱脂肪酸油脂に分
   離することを特徴とする特許請求の範囲第１又は１２項
   記載のエステル交換脂の製造方法。 １５、脱脂肪酸油脂を有機溶媒に溶解し、冷却、沈澱、
   分画して更に精製することを特徴とする特許請求の範囲
   第１、１０、１１又は１４項記載のエステル交換脂の製
   造方法。