JP2554469B2

JP2554469B2 - 脂肪酸エステル類の製造法

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Publication number: JP2554469B2
Application number: JP61007732A
Authority: JP
Inventors: 克範明星; 陽一松舟; 史朗吉川
Original assignee: NIPPON SHOE
Current assignee: NIPPON SHOE
Priority date: 1986-01-16
Filing date: 1986-01-16
Publication date: 1996-11-13
Anticipated expiration: 2011-11-13
Also published as: JPS62166895A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、脂肪酸のステロールエステル類又は特定の
脂肪族アルコールエステル類の酵素利用による改良され
た製造方法に関する。

従来の技術ステロール類と脂肪酸とのエステルは、従来より、例
えばコレステリツク液晶（特開昭52−24992号公報参
照）や医薬化粧用親水性基材（特開昭52−41215号公
報、特開昭52−79030号公報参照）等として、各種分野
で広く用いられている。

従来かかる脂肪酸ステロールエステル類等は、専ら有
機合成法により製造されているが、一般に有機合成法で
は苛酷な反応条件が採用され、しかも副反応等が惹起す
る弊害は避けられず、反応及び引続く目的物の単離精製
に繁雑な操作、工程等を必要とする。特にステロール類
の水酸基はセカンダリーであり、しかもこれはステロイ
ド骨格に近接しているために、通常の脂肪族セカンダリ
ーアルコールと比較しても反応性が低下しており、その
ためにこれと脂肪酸エステル類とを反応させ、ステロー
ル脂肪酸エステル類を製造する場合、金属ナトリウム等
の無機触媒下で、高温で長時間反応させる必要がある。
このような有機化学的方法は、反応の選択性が乏しく、
苛酷な条件の採用による基質の劣化やエネルギーの多量
消費を伴う不利があり、また触媒の除去を必要とし、し
かも反応収率が低いという致命的な欠点がある。

また、近年グリセライドのエステル交換反応について
は、これを有機合成によることなく、リパーゼ等の加水
分解酵素の逆反応を利用する方法が研究されつつある。
しかしながらステロール類及び／又は高級脂肪族アルコ
ール類と脂肪酸エステル類との反応については、かかる
酵素利用による方法は報告された例がない。また上記酵
素を利用したグリセライドのエステル交換反応において
は、系内における水分が合成の逆反応である加水分解反
応を引き起こすとして、該系内水分を可能な限り少なく
すべきであると考えられている。しかるにこの系内水分
を減じることは、一方で酵素活性を低くすることにな
り、この相反する要求を満たすことは、非常に厳格な反
応制御と反応系の構築をもってしても困難であり、しか
も反応時間を短くすることも実際上不可能である。

更に一般に酵素反応は基質特異的であり、基質とする
化合物が異なれば合成反応の進行は予測できず、また通
常酵素による合成反応の平衡は基質の方に大きく片寄る
ことが知られており、上記方法といえども、反応平衡を
合成反応側に移動させることは困難で目的とするエステ
ル類の合成率は通常低い。

発明が解決しようとする問題点本発明者らは上記苛酷な反応条件を要し、反応の選択
性に乏しく、基質の劣化を伴い、触媒除去の必要があ
り、反応収率も低く、エネルギー多消費型である有機合
成によることなく、所望のエステル類をより温和な条件
下に有利に収率よく経済的に製造できる方法を提供する
ことを目的として鋭意研究を重ねた結果、特定の酵素類
及び固定化された上記酵素類が、水媒系及び含水有機溶
媒系で、ステロール類又は高級脂肪族アルコール類と脂
肪酸エステル類とのエステル類の合成を非常に効率よく
触媒し、しかも上記合成反応は同一酵素を繰返し使用し
て連続的及び半連続的にも実施できることを見出し、こ
こに本発明を完成するに至った。

問題点を解決するための手段本発明によれば、リパーゼ及びコレステロールエステ
ラーゼから選択される酵素類又は固定化された上記酵素
類を用いて、ステロール類及び／又は炭素数12〜32の脂
肪族アルコール類と脂肪酸エステル類とを接触反応させ
て上記脂肪酸のステロールエステル類又は脂肪族アルコ
ールエステル類を製造する方法であつて、上記反応を水
媒系及び／又は含水有機溶媒系で行ない且つ酵素類又は
固定化酵素類を、単一回又は複数回繰返し、利用するこ
とを特徴とする脂肪酸エステル類の製造方法が提供され
る。

本発明方法では、酵素を利用することによつて、従来
の有機合成法に見られるごとき苛酷な反応条件を要し、
反応の選択性に乏しく、基質の劣化を伴い、触媒の利用
及びその除去を要することなく、非常に温和な条件下に
エネルギー消費を抑制して、容易にしかも収率よく目的
とするエステル類を製造できる。また本発明方法では上
記酵素類を繰返し利用して反応を連続的乃至半連続的に
行なうこともでき、自動化が容易で目的エステルの合成
の省力化、製造コスト、設備コスト等の大巾な低減が可
能である。また一般に酵素によるグリセライドの合成反
応においては、酵素の活性発現に必要な最小限の水を除
き反応系内の水を可及的に少なくすることが、反応の平
衡を合成側に移行させるために必須の要件とされる一
方、該水分が少ないと酵素の活性化が充分には行なわれ
ず反応速度が遅くなる傾向があるのに対して、本発明に
おける基質の組合せでは、反応系内に多量の水が存在し
ても反応の平衡は合成側に片寄り、また反応速度も充分
に早い。従って、本発明方法は特に工業的実施に適して
いる。

本発明方法において用いられる酵素類は、リパーゼ及
びコレステロールエステラーゼから選択される。ここで
リパーゼとは、グリセライドをグリセリンと脂肪酸に加
水分解する反応を触媒する酵素であり、コレステロール
エラテラーゼとは、コレステロールと脂肪酸とのエステ
ル結合を加水分解する酵素である。上記リパーゼ及びコ
レステロールエステラーゼは、その起源に特に制限はな
く、各種微生物、動物、植物起源のいずれでもよい。

リパーゼの起源微生物としては、例えばアクロモバク
ターイオフアーガス（Achromobacteriofurgus）、ア
クロモバクターリポリテイカム（Achromobacter lip
olyticum）等のアクロモバクター属、クロモバクテリウ
ムビスコサム（Chromobacterium viscosum）等の
クロモバクテリウム属、コリネバクテリウムアクネス
（Corynebacterium acnes）等のコリネバクテリウム
属、スタフイロコツカスアウレウス（Staphylococcus
aureus）等のスタフイロコツカス属、アスペルギルス
ニガー（Aspergillus niger）等のアスペルギルス
属、キヤンデイダシリンドラシア（Candida cylindr
acea）等のキヤンデイダ属、フミコーラランギノーサ
（Humicora lanuginosa）等のフミコーラ属、ペニシリ
ウムカセイコラム（Penicillium caseicolum）、ペ
ニシリウムクルストサム（Penicillium crustosum）、
ペニシリウムシクロピウム（Penicillium cyclopiu
m）、ペニシリウムロキユフオーテイ（Penicillium
roqueforti）等のペニシリウム属、トルロプシスエノ
ビ（Torulopsis ernobii）等のトルロプシス属、ムコ
ール、ミーヘイ（Mucor miehei）等のムコール属、バ
シラスズブチルス（Bacillus subtilis）等のバシラ
ス属、サーモマイセスイバダネンシス（Thermomyces
ibadanensis）等のサーモマイセス属、リゾプスデ
レマー（Rhizopus delemar）等のリゾプス属、シユー
ドモナスエアルギノーサ（Pseudomonas aeruginos
a）、シユードモナスフラギ（Pseudomonas frag
i）、シユードモナスフルオレスセンス（Pseudomonas
fluorescens）等のシユードモナス属、アルカリゲネ
スsp（Alcaligenes sp）等のアルカリゲネス属等に属
する各種の微生物を例示できる。

またコレステロールエステラーゼの起源としては、哺
乳動物の各種組織、例えば膵臓、肝臓、脳、副腎、睾
丸、卵巣等の他、微生物としてはシユードモナス属例え
ばシユードモナスエアルギノーサ（Pseudomonas aerug
inosa）、シユードモナスフレオレスセンス（Pseudom
onas fluorescens）、シユードモナスノブエスピ
ー、シユードモナスデイスモリテイカ等、アクロモバ
クター属、例えばアクロモバクターデリカチユラス
（Achromobacter delicatulus）等、フザリウム属、ノ
カルジア属、シユードモナス属、ストレプトミセス属、
キヤンデイダ属、例えばギヤンデイダリポリテイカ、
キヤンデイダトロピカリス、キヤンデイダインター
メデイアキヤンデイダシリンドラシア等をそれぞれ
例示できる。

上記各酵素の大部分は、精製された酵素として市販さ
れており、本発明ではこれらの市販品をそのまま用いる
ことができるが、特に精製された市販品を用いる必要は
なく、例えば目的とする酵素の生産能を有する微生物菌
体そのもの、その培養液、該培養液を処理して得られる
粗酵素液や酵素を含む組成物等を利用することもでき
る。

また本発明において固定化された上記酵素類として
は、上記酵素類を通常の方法により、適当な担体に固定
化させたものをいずれも用いることもできる。該固定化
酵素及びその調製の詳細については、後述する。

本発明において上記酵素類又は固定化酵素類を用いて
合成反応される一方の原料としてのステロール類とは、
分子内にステロイド骨格と水酸基とを有する化合物をい
う。ここでステロイド骨格とは、式〔Ｉ〕で表わされる骨格であり、水酸基は上記骨格に直接結合
しているのが一般的である。本発明に用いられる上記ス
テロール類の具体例としては、例えばコレステロール、
７−デハイドロコレステロール、β−コレスタノール、
コプロスタノール、ラトステロール、チモステロール、
チモステノール、デスモステロール、ベラシカステロー
ル、エルゴステロール、カンペステロール、β−シトス
テロール、γ−シトステロール、α−スピナステロー
ル、ステイグマステロール等、トリメチルステロールと
してラノステロール、ジヒドロラノステロール、アグノ
ステロール、ジヒドロアグノステロール及び之等の混合
物としての羊毛ロウより分離精製して得られるイソコレ
ステロール、シクロアルテノール等を例示できる。

また本発明では、上記ステロール類に代えて又はこれ
と共に炭素数12〜32の脂肪族アルコール類が一方の基質
として利用できる。該アルコール類は飽和でも不飽和で
もよく、また直鎖でも分枝鎖状でもよく、更に１価でも
２価以上でもよく、之等の混合物でもよいが、炭素数14
〜32の分枝脂肪族プライマリーもしくはセカンダリー−
アルコールであるのが好ましい。

直鎖飽和アルコールの具体例としては、ラウリルアル
コール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、ス
テアリルアルコール、エイコサノール、ドコサノール、
テトラコサノール、ヘキサコサノール、オクタコサノー
ル、ノナコサノール、ミリシルアルコール、ペンタデカ
ノール、ヘプタデカノール、ノナデカノール、テトラデ
カノール−２、ペンタデカノール−２、ヘキサデカノー
ル−２、ヘプタデカノール−２、オクタデカノール−
２、ノナデカノール−２、エイコサノール−２等を例示
できる。

分枝鎖状飽和アルコールとしては、一般式及び一般式で表わされるもの、例えば14−メチルヘキサデカノール
−１、16−メチルオクタデカノール−１、18−メチルノ
ナデカノール、18−メチルエイコサノール、20−メチル
ヘンエイコサノール、20−メチルドコサノール、22−メ
チルトリコサノール、22−メチルテトラコサノール、24
−メチルペンタコサノール−１、24−メチルヘキサコサ
ノール等及び之等の混合物、例えばラノリンアルコール
より溶剤分別により誘導されるステロールを含まない脂
肪族高級アルコール−グリコール混合物で飽和の炭素数
18〜32の直鎖及び分枝を主成分とするラノリンアルコー
ル等を例示できる。

不飽和の第１アルコールとしては、オレイルアルコー
ル、エライジルアルコール、リノレイルアルコール、リ
ノレニルアルコール等；α，ω−ジオール類、例えばテ
トラデカンジオール、ペンタデカンジオール、ヘキサデ
カンジオール、ヘプタデカンジオール、オクタデカンジ
オール、ノナデカンジオール、エイコサンジオール、ヘ
ンエイコサンジオール等；下式で示されるα，β−ジオ
ール類等を例示できる。

更に分枝（合成）アルコール類としては、ヘキサデシ
ルアルコール（エツソスタンダード社）、エヌジエコー
ル160A、160B、181A、200A、200C（いずれも新日本理化
社）、フアインオキソコール1800（日産化学社）、ダイ
ヤドール18G（三菱化成社）、オクチルドデカノール
（ヘンケル社）等を、また分枝（合成）セカンダリーア
ルコールとしては、イソトリデシルアルコール（クラレ
社）、下式で表わされるもの等を例示できる。

本発明において他方の原料とする脂肪酸エステル類
は、以下の脂肪酸のグリセリンエステル及び炭素数１〜
32の脂肪族アルコールエステル類のいずれでもよい。

該脂肪酸エステル類を構成する脂肪酸成分には、下記
各種の飽和の直鎖脂肪酸、飽和の分枝鎖脂肪酸、不飽和
の脂肪酸、オキシ脂肪酸、ポリカルボン酸等が包含され
る。

飽和の直鎖脂肪酸としては、例えば酢酸、酪酸、カプ
ロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリス
チン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベ
ヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、モンタン酸、メ
リシン酸、ｎ−ドトリアコンタン酸等の炭素数が偶数で
ある飽和直鎖脂肪酸、及び例えばプロピオン酸、ｎ−吉
草酸、エナント酸、ペラルゴン酸、ヘンデカン酸、トリ
デカン酸、ペンタデカン酸、ヘプタデカン酸、ノナデカ
ン酸、ヘンエイコサン酸、トリコサン酸、ペンタコサン
酸、ヘプタコサン酸等の炭素数が奇数である飽和直鎖脂
肪酸を例示できる。

飽和の分枝鎖脂肪酸としては、例えばイソ酪酸、イソ
カプロン酸、イソカプリル酸、イソカプリン酸、イソラ
ウリン酸、11−メチル−ドデカン酸、イソミリスチン
酸、13−メチル−テトラデカン酸、イソパルミチン酸、
15−メチル−ヘキサデカン酸、イソステアリン酸、17−
メチル−オクタデカン酸、イソアラキン酸、19−メチル
−エイコサン酸、α−エチル−ヘキサン酸、α−ヘキシ
ルデカン酸、α−ヘプチルウンデカン酸、２−デシルテ
トラデカン酸、２−ウンデシルテトラデカン酸、２−デ
シルペンタデカン酸、２−ウンデシルペンタデカン酸、
式〔II〕で表わされるフアインオキソコール180酸〔日産化学社
製〕等を例示できる。また上記飽和の奇数分枝鎖脂肪酸
には、例えば６−メチル−オクタン酸、８−メチル−デ
カン酸、10−メチル−ドデカン酸、12−メチル−テトラ
デカン酸、14−メチル−ヘキサデカン酸、16−メチル−
オクタデカン酸、18−メチル−エイコサン酸、20−メチ
ル−ドコサン酸、22−メチル−テトラコサン酸、24−メ
チル−ヘキサコサン酸、26−メチル−オクタコサン酸等
の末端がイソブチル基であるアンチイソ系の脂肪酸が包
含される。

不飽和の脂肪酸としては、例えばトウハウ酸、カプロ
レイン酸、リンデル酸、ラウロレイン酸、ツヅ酸、フイ
セトレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトオレイン
酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バク
セン酸、カドレイン酸、シス−11−エイコセン酸、セト
レイン酸、エルカ酸、セラコレイン酸、17−ヘキサコセ
ン酸、6,9,12,15−ヘキサデカテトラエン酸、リノール
酸、リノレン酸、α−エレオステアリン酸、β−エレオ
ステアリン酸、プニカ酸、6,9,12,15−オクタデカテト
ラエン酸、パリナリン酸、アラキドン酸、5,8,11,14,17
−エイコサペンタエン酸、7,10,13,16,19−ドコサペン
タエン酸、4,7,10,13,16,19−ドコサヘキサエン酸等を
例示できる。

また、本発明に用いられる脂肪酸成分は、分子内に水
酸基を有するオキシ脂肪酸であつてもよい。このオキシ
脂肪酸としては、例えばα−ヒドロキシラウリル酸、α
−ヒドロキシミリスチン酸、α−ヒドロキシパルミチン
酸、α−ヒドロキシステアリン酸、ω−ヒドロキシラウ
リル酸、α−ヒドロキシアラキン酸、９−ヒドロキシ−
12−オクタデセン酸、リシノール酸、α−ヒドロキシベ
ヘニン酸、９−ヒドロキシ−トランス−10,12−オクタ
デカジエン酸、カモレン酸、イプロリル酸、9,10−ジヒ
ドロキシステアリン酸、12−ヒドロキシステアリン酸等
を例示できる。

更に上記脂肪酸成分は、例えばシユウ酸、マロン酸、
コハク酸、グルタール酸、アジピン酸、ピメリン酸、セ
ベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、D,L−リンゴ酸
等のポリカルボン酸であつてもよい。

また上記脂肪酸エステル類を構成するアルコール成分
はグリセリン及び炭素数１〜32の脂肪族アルコールであ
り、該脂肪族アルコールには１価及び２価の直鎖又は分
枝鎖アルコールが含まれ、その内炭素数が14迄のもの、
特に炭素数１〜６の脂肪族アルコールであるメチルアル
コール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、
イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、イソ
ブチルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコール等は好まし
い。

上記脂肪酸のグリセリンエステル類は、モノエステ
ル、ジエステル及びトリエステルのいずれでもよく之等
の混合物でもよい。更に本発明に原料として利用する脂
肪酸エステル類には天然の又は合成の油脂（グリセライ
ド）、天然又は合成ワツクス等も含まれる。この天然油
脂としては、例えばアマニ油、オリーブ油、カカオ油、
米糖油、大豆油、ツバキ油、ナタネ油、パーム油、パー
ム核油、ヒマシ油、綿実油、木ロウ、ヤシ油、ラツカセ
イ油、ヒマワリ油等の植物油、牛脂、乳脂、羊脂、牛脚
油、鯨油、タラ肝油、イワシ油、オレンジラフイー油、
ニシン油等の動物油及び之等の硬化油等を例示できる。
また天然ワツクスとしては例えば鯨ロウ、イボタロウ、
カーナバロウ、カンデリラロウ、ヌカロウ、セラツクロ
ウ、ミツロウ、モンタンロウ、羊毛ロウ、綿ロウ等を例
示できる。

上記脂肪酸エステル類は、その一種を単独で又は二種
以上を混合して本発明の反応に利用することができる。

本発明方法は、バツチ法、半連続法及び連続法で行な
うことができる。之等のいずれの方法においても反応
は、上記ステロール類及び／又は特定の脂肪族アルコー
ル類と脂肪酸エステル類とを基質として、之等を前記酵
素類又は固定化酵素類の存在下に接触させることにより
進行する。上記反応は、両基質と酵素とを単に接触させ
るのみで進行するが、通常攪拌混合するのが好ましい。
本発明者らの研究によれば、特に上記反応は水媒系、含
水有機溶媒系（水−有機溶媒２相系を含む）で容易に進
行し、しかも目的物の合成率はこれらの反応系にほとん
ど影響を受けないことが見出された。

尚、上記水媒系とは、反応系の構成が、酵素、両基質
及び酵素を溶解する水又はこれと親水性物質とからなる
系を言う。また含水有機溶媒系とは、少なくとも一方の
基質を溶解することのできる含水有機溶媒を用いた系
で、その構成は両基質、水又はこれと親水性物質とで活
性化されている酵素及び少なくとも一方の基質を溶解す
ることのできる含水有機溶媒からなる系を言う。ここで
含水有機溶媒とは、飽和量又はそれ以上の水を含む有機
溶媒を言う。この系において系内水分が有機溶媒の溶解
度をこえる場合、この系は水−有機溶媒２相系となり、
この系では静置、遠心分離、選択的過等により酵素
（又はこれと親水性物質と）を含む水相と基質及び有機
溶媒を含む有機溶媒相とを分離することができる。

上記親水性物質とは、水と自由に混合する物質であ
り、用いる酵素をできるだけ失活させないものが望まし
く、例えばグリセロール等を例示できる。また含水有機
溶媒系に利用される有機溶媒としては、用いる酵素をで
きるだけ失活させない水不混和性のものが望ましい。そ
の具体例としては例えばｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、
ｎ−オクタン、イソオクタン、シクロヘキサン、ｎ−デ
カン、ｎ−トリデカン、ｎ−テトラデカン、ｎ−ヘキサ
デカン、ポリブテン、ジイソブチレン、流動パラフイ
ン、スクワラン、スクワレン、プリスタン等の炭化水素
系溶媒を例示できる。上記各炭化水素の２種以上を混合
するか又は之等を含有する混合溶媒、例えば「アイピー
ソルベント1016」（出光石油化学社製、C₈＝63％、C₉＝
30％を主成分とするイソパラフイン系混合物）や「アイ
ソパーＥ」（エクソン化学社製、C₈＝25〜35％、C₉75〜
60％を主成分とするイソパラフイン系混合物）も同様に
使用できる。之等の用語は以下本明細書において同様の
意味で用いるものとする。

一般に、酵素によるグリセライドの合成反応では、反
応系の水分含量が非常に重要な因子であり、酵素の活性
発現に必要な最小現の水を除いて反応系内の水を可及的
に少なくすることが、反応の平衡を合成側に移行させる
ために必須の要件とされているが、本発明では反応系内
に多量の水が存在する場合でも反応の平衡が合成側に片
寄り反応は良好且つ迅速に進行する。また上記含水有機
溶媒系でも反応は良好に進行する。

特に、上記含水有機溶媒系として水−有機溶媒２相系
を採用すれば、反応終了後、酵素は水相乃至水−有機溶
媒界面に、目的とするエステル及び末反応基質は有機溶
媒相に分配することが認められ、これにより酵素と目的
エステル及び未反応基質とを容易に分離することができ
る。また有機溶媒の利用によれば、通常固形であるステ
ロール類及び脂肪族アルコール類を該溶媒溶液の形態で
反応に供することができ、反応液の性状を改善して酵素
−基質の接触をより有利に行ない得る。

上記接触時の反応条件は、用いられる酵素の失活がな
いかこれが最小限に抑制される条件であればよく、通常
酵素の最適pH及び最適温度条件が採用される。一般に上
記温度としては、約10〜60℃の範囲が好適であるが、耐
熱性リパーゼ等の耐熱性の酵素を用いる場合には、該酵
素に応じてより高温条件を採用することもできる。pH
は、用いる酵素に応じてアルカリ性、中性及び酸性のい
ずれかが採用され、このpHを調節するために適当な酸や
アルカリ、例えば塩酸、硫酸等や水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム等及び例えばリン酸緩衝液等の適当な緩衝
液を、必要に応じて、反応系内に添加することもでき
る。更に用いる酵素の賦活因子として知られている例え
ばカゼイン、アルブミン、カルシウムイオン、胆汁酸及
びその塩等や両基質と酵素との接触性を高めるための、
酵素阻害のない界面活性剤、例えば「ツイーン80」（花
王アトラス社製）、「トリトン×100」（ロームアンド
ハース社製）等を添加することもできる。

反応系内に存在させる酵素と両基質との比率は、特に
制限はなく、それらの種類、反応条件、本発明方法をバ
ツチ法で行なうか連続法乃至半連続法（反復法）で行な
うか等に応じて適宜選択できる。通常１回当りの反応に
ついて検討すれば、酵素はアルコール成分原料（ステロ
ール及び／又は脂肪族アルコール）1g当り、リパーゼで
は、約１〜10万単位、好ましくは500〜５万単位程度、
コレステロールエステラーゼでは約１〜10万単位、好ま
しくは50〜５万単位程度とすることができる。両基質の
使用比率も任意に決定でき、いずれを過剰としてもよく
特に制限はない。通常一方の基質に対して他方を約0.1
〜20倍モル量の範囲で用いるのが普通である。

なお、用いられる酵素の合成活性発現のためには、該
酵素（絶乾重量）1gに対して少なくとも約0.001mlの水
の存在が必要である。一般に反応系を水媒系とする時に
は、通常利用する酵素量に対して水を好ましくは約７〜
700倍重量程度用いるのがよい。また含水有機溶媒系で
は、系内に含まれる水（有機溶媒に飽和させた水分）に
より、酵素類を再使用する際、該酵素類の活性発現のた
めの必要水分量は保証される。特に有機溶媒の溶解度を
越える水を含ませた水−有機溶媒２相系の採用によれ
ば、酵素は水相及び水−有機溶媒界面に局在し、水相と
有機溶媒相とを分離することにより、酵素−基質を分離
でき、酵素の再使用が可能である。

また上記含水有機溶媒系における水と有機溶媒との使
用割合、特に系内に存在させる水量は、反応速度に多少
の影響を与えるので、用いる両基質、酵素及び溶媒の種
類、之等の混合方法、反応容器の形状、大きさ、反応液
全体の体積、その他の各種反応条件に応じて、その適当
量を決定するのが望ましい。

本発明方法は、バツチ法によることもできるが、用い
る酵素類自体比較的高価なものであるため、これを複数
回繰返し利用する連続法乃至半連続法によるのが好まし
い。上記酵素類を複数回利用する方法は、第１回目の接
触反応の後に、酵素類又は固定化酵素類を反応混合物よ
り分離するか分離しないかにより、半連続法（バツチ法
の繰返し反復法）と連続法とに大別され、之等各方法は
更に固定化酵素を用いる場合と未固定化酵素を用いる場
合とで、各々以下の如く分けられる。

即ち、未固定化酵素を用いる本発明方法は、半連続法
及び連続法のいずれの場合でも、相分離を利用するか、
適当な過手段を採用するか、遠心分離を利用して実施
される。

相分離を利用する本発明方法は、半連続法の場合、第
１回目の反応終了後、反応混合液に水又は（及び）有機
溶媒を添加して水相−疎水性基質相の２相系に転換し
（水−有機溶媒２相系の場合はそのまま静置すればよ
い）、静置又は遠心分離により水相と疎水性基質相との
相分離を行ない、水相及び水−有機溶媒界面に存在する
酵素と、目的エステル及び未反応基質を含む有機相とを
分離し、かくして分離された酵素を繰返し利用すること
により行なわれる。上記相分離の際、水媒系における有
機溶媒の添加は、反応液の乳化を破壊して相分離を促進
する効果がある。また分離された有機相は分配係数の差
を利用した液々抽出により、例えばメタノール等の低級
アルコール水溶液で抽出することにより、極性の強い原
料ステロール類及び脂肪族アルコール類等の未反応基質
を低級アルコール水溶液中に抽出し、容易に収率よくこ
れと目的エステルとに分離することができる。

過手段を採用する方法では、反応系が含水有機溶媒
系ではあるが水−有機溶媒２相系でない場合、酵素は非
水性基質及び有機溶媒には溶けず粒子の形で系内に懸濁
しているため、例えば精密過、限外過等の適当な
過手段により分離することができる。上記精密過とし
ては、通常の紙と過助剤とを組合せて用いる方法を
採用でき、この場合酵素は過助剤に吸着された形で捕
捉され、そのまま再使用できる。またメンブランフイル
ター等を用いた精密過も可能である。該フイルターと
しては特に約0.02〜10μｍの孔径を有するものが好まし
く、その材質はガラス、金属等の耐薬品性に優れた無機
物でも、合成樹脂例えば再生セルロース、テフロン、ポ
リプロピレン、ポリアミド、ポリイミド等の有機物でも
よい。

水媒系の場合、上記過手段としては限外過が採用
され、これにより酵素類を再使用できる。この限外過
は、通常市販の各種限外過膜、例えば耐薬品性に優れ
たポリアミド、ポリイミド、高分子電解質複合体等を用
いて実施できる。

更に水−有機溶媒２相系の場合、水−油混合系又は水
−有機溶媒混合系の分離を、疎水性の多孔質分離膜の選
択的透過性を利用した過手段により実施することがで
きる。即ち、疎水性の基質及び有機溶媒は、疎水性の分
離膜にあいた微細孔の中を浸透して透過できるが水及び
酵素は、表面張力が大きいため該疎水性膜の表面を濡ら
すことができず、微細孔の中に浸透できない。このこと
より、酵素と基質及び反応物との過分離が可能であ
る。上記方法に利用できる疎水性の分離膜としては、臨
界表面張力が透過すべき疎水性物質より大きく、水より
小さいもの、例えば約30〜55ダイン/cmのものを挙げる
ことができる。また上記膜の有する微細孔の径としては
必ずしも酵素より小さい必要はなく、約10μｍ迄であれ
ばよく、その例としては市販のマイクロ過用のメンブ
ランフイルターの内疎水性のテフロン、ポリプロピレン
製のものを例示できる。

前記した相分離を利用する本発明方法を連続法により
行なう場合、該連続法は、例えば未固定化酵素を水溶液
形態又は前記した水媒系に用い得る親水性物質の水溶液
（以下、酵素につき水溶液という場合は、この親水性物
質の水溶液を含むものとする）で利用し、これと基質又
は基質の有機溶媒溶液とを接触反応させるための反応部
と相分離を行なうための分離部とを有する適当な反応装
置を利用して、反応及び相分離を連続的に行ない、酵素
水溶液を繰返し利用しつつ分離された有機相より連続的
に目的物を得、基質である油相又は有機溶媒相は連続的
に反応部に供給する。

上記連続法の実施に適した反応器としては、公知の各
種のものをいずれも使用できる（化学工学III、東京化
学同人発行、1964年）。その代表例としては、ミキサー
セトラー型及びスプレー塔を例示できる。

ミキサーセトラー型は、混合器（ミキサー）と、混合
物を比重差により分離する沈降器（セトラー）とを組合
せたもので、その利用によれば混合器に酵素水溶液を満
たし、該水溶液中に基質又はその有機溶媒溶液を連続的
に供給しながら、混合器中で酵素水溶液と基質又はその
有機溶媒溶液とを攪拌混合して接触反応させ、反応混合
液を沈降器に送る。反応混合液は該沈降器内の滞留中に
相分離により水相と、目的物を含む基質相又はその有機
溶媒相（反応液）とに分離し、かくして分離された酵素
を含む重液を混合器に戻しながら、沈降器の上層の反応
液を系外に抜き出すことにより連続合成ができる。

スプレー塔を利用する方法では、例えば酵素水溶液
と、両基質又はその水不混和性有機溶媒溶液のいずれか
の相を分散相として塔中を上昇又は下降させて反応させ
るもので、特に上記基質相を分散相とするのが酵素を不
必要に循環させる必要がなく好ましい。この好ましい方
法は、より詳しくは酵素水溶液を塔中に連続相として入
れておき、基質相を塔下部ノズルより連続的に塔中に供
給して分散相として該酵素水溶液の液柱中を接触反応さ
せながら上昇させ、塔上部で相分離させる。塔上部で分
離された基質相を連続的に又は逐次系外に抜き出すこと
により実施される。連続相である酵素水溶液は、通常一
度塔内に仕込んだ後はその力価が低下する迄は取り替え
る必要がなく、また力価の低下に応じて逐次新しい酵素
水溶液を追加補給することもできる。上記における接触
反応は塔内を上昇する基質相の液滴と酵素水溶液との界
面で行なわれるため、一般の液々抽出の場合と同様に液
滴の生成初期と凝集時の接触効果が大であり、この点か
ら液滴の生成と消滅とを多数回繰返すのが好ましく、従
つて基質相を循環させるのが目的エステルの合成率の向
上に効果的であり、また該液滴の径を小さくしたり、酵
素濃度を高くしたり、液滴の上昇速度を遅くして接触時
間を長くさせるのも反応速度向上に役立つ。

また上記スプレー塔利用による方法をより効率よく行
なう方法としては、例えば多孔板を備えた塔（多孔板
塔）を用いる方法が例示できる。これは塔の途中に多孔
板を設け段塔を構成させたもので、重い酵素水溶液が連
続相となり、軽い基質相は分散相となつて、第１段目の
多孔板の孔より液滴となつて酵素水溶液相中を上昇し接
触反応し、第２段目の多孔板の下部で液相をなし、次い
で再度液滴となつて第２段目の板の孔を通過上昇し、こ
れを繰返す。従つて該多孔板塔の利用では、液滴の生成
消滅が何回も繰返されるためスプレー塔より効率が高く
有利である。

上記多孔板塔の代りに、例えば塔内の流路に多くの邪
魔板を設けて両相の接触時間を長くした邪魔板塔、邪魔
板の代りに適当な充填物を充填した塔、塔内に円周、円
板等の攪拌軸を設けて機械的攪拌を行なわせるべくした
回転円筒塔や回転円板塔又は上記充填物と攪拌手段とを
交互に積み重ねた塔（Scheibel塔）等も有利に利用で
き、更に機械的攪拌による代りに脈動により攪拌を行な
う脈動抽出器の他高速回転による遠心力を利用したPodb
ielniak抽出器、Luwesta抽出器等の遠心抽出器も利用で
き、之等を組合せることもできる。

また、本発明方法は、多孔性の反応膜で界したいずれ
か一方に親水性の酵素水溶液を、他方に疎水性の基質又
はその含水有機溶媒溶液を存在させ、上記反応膜を介し
て酵素水溶液と基質又は基質溶液とを接触反応させ、酵
素水溶液を基質と混合させることなく目的エステルを合
成し且つ酵素を繰返し利用する方法を包含している。

この方法によれば、酵素と基質とは膜により隔てられ
ているため互いに混合されることなく、該膜を介して接
触するため、基質を膜で仕切られた一方側へ連続的に供
給しながら、反応液を連続的に系外へ抜き出すことがで
き、反応系が乳化することもなく、基質相への酵素蛋白
の混入もなく、また基質による酵素の活性低下もなく、
水相に加えた酵素安定剤等による反応への悪影響もない
という利点がある。更に室温、気密状態で反応を行ない
得るため、酸化安定性の低い基質に対しても自動酸化や
二重結合の異性化、位置移動等の副反応が起る心配もな
い。

上記方法において用いられる多孔質反応膜の材質は、
特に限定はなく、例えばガラス、、セラミツク、ステン
レス網、ポーラスステンレススチール等の無機物でもよ
く、合成樹脂例えばテフロン、ポリプロピレン、ポリエ
チレン等のポリオレフイン、再生セルロース、ニトロセ
ルロース、アセチルセルロース等のセルロース誘導体、
ナイロン66等のポリアミド、ポリカーボネート等の有機
物でもよい。その孔径は通常約0.05μｍ〜10μｍのもの
が適当であり、その代表例としては、市販の精密過用
のメンブランフイルターを例示できる。該メンブランフ
イルターとしては、アセチルセルロース、ニトロセルロ
ース、再生セルロース製等の親水性のもの及びテフロ
ン、ポリプロピレン製等の疎水性のものがよく知られて
おり、本発明ではそれらのいずれをも使用できる。

上記反応膜の他の好ましい性質としては、膜厚約10〜
100μｍ、より好ましくは約20〜50μｍ、空孔率20〜80
％、より好ましくは約40〜60％が挙げられ、之等の性質
を有する限り本発明に有利に用いられる。膜の形状は特
に制限はなく、通常の平膜形状でもよいが、例えば円筒
状、スパイラル状、チユーブラー状、ホロフアイバー状
等の形状とするのがよく、之等の形状では、酵素と基質
との接触面積を平膜に比し大きくすることができ、反応
時間を短縮して合成率を高めることができる。

かかる反応膜利用による本発明方法では、酵素水溶液
と疎水性の基質が該膜を介して接触して反応が進行す
る。膜が疎水性の場合、疎水性基質が膜の細孔を透過し
て酵素水溶液側に侵入するのを防止するため、酵素水溶
液に圧力をかけておくのが好ましい。この圧力は、膜の
材質により異なり、通常その上限値は、水が膜との表面
張力による反発力に打ちかつて膜の微細孔に浸透してい
くのに必要な圧力即ちウオーターイニシエーシヨン値で
あり、一般には約0.001〜20kg/cm²の範囲が好ましい。
また膜が親水性の場合、酵素水溶液が膜の孔を透過して
基質側に侵入するのを防止するため、基質側の圧力を約
0.001〜20kg/cm²の範囲としておくのが望ましい。膜を
介して一方に導入される酵素水溶液は、通常その力価が
低下するまでは入れ替えや補給の必要はなく、攪拌や循
環の必要もない。反対側に導入される基質相は膜の細孔
により酵素と接触反応し、この時接触時間を長くすれば
合成率は高くなる。また酵素と基質との接触面積を大き
くすることにより上記接触時間を短縮して合成率を向上
させ得る。

更に本発明は、固定化酵素を用いて実施する方法をも
包含している。ここで用いられる固定化酵素とは、上述
したリパーゼ又はコレステロールエステラーゼを適当な
固定化用担体に固定化させたものであり、その固定化方
法は、従来公知の各種方法により行なうことができる。
代表的固定化方法としては、例えば包括固定化法、無機
担体共有結合法、有機担体共有結合法、物理的吸着法等
を例示できる。以下之等各方法につき詳述する。

包括固定化法は、公知の各種担体を用いて実施でき
る。該担体としては、本反応に利用する基質が疎水性で
あるため特にゲル内に基質が浸透しやすく疎水性物質に
対する分配係数の大きい担体が好ましい。その例として
は、例えば下記式（１）に示されるENTP等の疎水性光硬
化性樹脂［European J.Appli.Microbiol.Biotechnol.,
５,325（1979）及び特開昭57−118792号公報参照］や下
記式（２）で示されるウレタンプレポリマーPU［Biotec
hnol.Bioeng.,20,1465−1469（1978）及びEur.J.Appln.
Microbiol.Biotechnol.,８,143−155（1979）参照］等
を例示できる。

上記ENTP樹脂は分子内のプロピレンオキサイド含量
を、PU樹脂はEO/PO含量を、各々変化させることにより
樹脂の疎水性度を任意に変化させ得る。

上記ENTP等の疎水性光硬化性樹脂を用いる包括固定化
は、例えば鎖長40nmのENTP−4000に重合開始剤を加え、
約60℃にて溶解し、４℃まで温度を下げた後、酵素を粉
末形態で又は予めセライト、シリカ等の多孔質無機担体
に吸着させた形態で添加混合（このとき、適宜界面活性
剤等を添加することもできる）し、その後、混合物をガ
ラス又はプラスチツクの透明板上に拡げ、その上をプラ
スチツクのシートでカバーした後、近紫外の光を数分間
照射してゲル化させ、得られるシート状の固体化酵素を
小さく切つて目的とする固定化酵素剤を収得できる。

ウレタンポリマーを用いる包括固定化は、例えばPU樹
脂中でもより疎水性の強いPU−３（平均分子量2529、NC
O含量4.2％、エチレンオキサイド含量57％、上記文献参
照）を、約50℃に加熱して流動性が出たところで、30℃
に冷却し、流動性のある間に酵素水溶液を加え、数分練
り合せた後、４℃で約60分間反応させ、その後水で洗浄
して未反応のNCO基を除去した後、適当な大きさに切つ
て目的固定化酵素剤とすることができる。上記反応の際
温度が30℃を越えると酵素の失活を招くことがあるので
注意する必要がある。

無機又は有機担体を用いた共有結合法に用いられる担
体としては、マイクロポーラスな多孔性を有し、その細
孔表面が疎水性であるものが好ましい。通常その細孔平
均半径は約10Å〜1000Åであるのがよい。上記マイクロ
ポーラスとは、通常担体粒子１個当りの酵素結合面積が
多くなるようなものであれば、孔の形状が縦長で細孔半
径が求められないようなものでもかまわない。上記担体
の好ましい具体例としては、例えば無機担体としてポー
ラスガラス、ポーラスセラミツク、セライト、チタン酸
化物等の多孔性金属粒子、アルミナ、多孔性シリカゲ
ル、モレキユラーシーブ、活性炭、白土、カオリナイ
ト、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カル
シウムゲル及び之等のアルキルアミン誘導体等、及び有
機担体として例えばマイクロポーラスなスチレンやアル
キルアミン等の重合体を母体とする吸着樹脂、キレート
樹脂、イオン交換樹脂等、例えば「ダウエツクスMWA−
１」（平均細孔半径150Å、粒子サイズ20−50メツシユ
のポリスチレン鎖をジビニルベンゼンで架橋した母体を
持つ第３級アミンを交換基とする弱塩基性陰イオン交換
樹脂、ダウケミカル社製）、親水性セルロース樹脂、例
えば「セルロフアインGC700−ｍ」（粒径45−105μｍ、
チツソ社製）等のセルロース系担体の親水基をマスクし
て調製したもの等を例示できる。

上記無機担体を用いた共有結合法による酵素の固定化
は、例えば次のごとくして実施できる。即ち、上記例示
の無機担体のアルキルアミン誘導体を調製し、該担体の
細孔表面の疎水性度を高めた後、グルタールアルデヒド
法又はカルボジイミド法により酵素を固定化すればよい
［H.H.Weetall,Methods in Enzymology,44,134−148
（1976）参照］。

また上記有機担体を用いた共有結合法は、疎水性の多
孔質樹脂の場合は、そのままこれに酵素を吸着させた
後、上記と同様にグルタールアルデヒド法により固定化
することができる［Rev.Ferment.Ind.Aliment,11,237
（1956）参照］。より詳しくは、例えばダウエツクスMW
A−１の1gを蒸留水及び1/15Mのマツクルベインバツフア
（pH5.0）で洗浄後、酵素液0.2ml（1500U）を加え、８
℃で一夜振盪吸着させ、マツクルベインバツフア1ml及
び25％グルタールアルデヒド溶液80μを加え、８℃で
10分間振盪し、イオン交換樹脂に結合させ、最後に20％
亜硫酸水素ナトリウム0.2mlを加えて、80℃で10分間振
盪し余分のグルタールアルデヒドを除去し、水で洗浄す
ればよい。

有機担体として、例えばセルロフアインGC700−ｍ等
の親水性樹脂を用いる場合、固定化は、先ず上記樹脂の
表面に存在する親水性の水酸基をエポキシ化し、次にこ
のエポキシ化されたセルロフアインをエチレンジアミン
でアミン化した後、グルタールアルデヒドで処理してア
ルデヒド化セルロフアインを調製し、これをリン酸バツ
フア中で酵素と反応させることにより実施できる。

物理的吸着法は、担体として例えば親水性のアガロー
スゲル等の多糖類にアルキル基、フエニル基、トリチル
基等の疎水基を導入し、細孔表面を疎水性とした担体、
具体的には「オクチルセフアロースCL−4B」、「フエニ
ルセフアロースCL−4B」（いずれもフアルマシア社
製）、トリチルアガロースゲル等の有機担体やポーラス
ガラス、ポーラスセラミツク、セライト、チタン酸化物
等の多孔性金属粒子、アルミナ、多孔性シリカゲル、モ
レキユラーシーブ、活性炭、白土、カオリナイト、ベン
トナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムゲ
ル及び之等のアルキルアミン誘導体等の無機担体を用い
て実施される。上記有機担体における疎水性度は水和性
のない非極性のアルキル基等を多くするか、水酸基等の
水和性の親水基をアルキル基等で修飾することにより増
加させ得る。

上記有機担体を用いた物理的吸着法は、例えば担体を
リン酸バツフアー等でよく洗浄した後、酵素水溶液と振
盪してこれに酵素を吸着させて調製できる。この物理的
吸着法によれば、共有結合法に比べ固定化時の酵素の活
性低下が少なく、しかも担体は親水性ゲルに疎水性のリ
ガントが付いたものであるため酵素の活性発現に必要な
充分量の水を保有、供給でき、更に疎水性の基質との親
和性も疎水基の導入により高められているため、本発明
方法に特に適している。

更に無機担体を利用する物理的吸着法は、単に担体と
酵素水溶液とを振盪するのみで実施でき、最も簡便で且
つ安価な固定化法であり、固定化時の活性低下も少な
く、物理的及び化学的にも安定なものである。

上記各種方法により固定化された固定化酵素を用いる
本発明方法は、これをバツチ法又は半連続法で実施する
場合には、例えば適当な反応容器に固定化酵素と基質と
を入れ、水媒系及び／又は含水有機溶媒系で基質と酵素
との接触反応を行なえばよく、反連続法の場合には、次
いで反応混合物より固定化酵素を通常の方法、例えば
過、遠心分離等により分離し、これを再度基質と酵素と
の反応に繰返し利用すればよい。上記接触反応は、固定
化酵素を物理的に破壊しない適当な条件下、例えば振盪
条件又は通液条件下に実施できる。固定化酵素を分離し
た反応混合物からの目的エステルの収得は、前述した相
分離を利用する方法の場合と同様にして行なうことがで
きる。

また上記固定化酵素を用いる連続法は、例えば固定化
酵素を適当なカラムに充填し、このカラムに基質又は基
質の含水有機溶媒溶液を連続的に通過させて接触反応さ
せ、目的エステル又はこれと未反応基質とを連続的に回
収し、これらか目的エステルを分離収得することにより
実施される。上記半連続法及び連続法のいずれも固定化
酵素の回収は容易で、目的エステルの精製段階での酵素
蛋白の除去の必要はなく、しかも回収した酵素は反復使
用できる利点がある。加えて、連続法では反応中、空気
と接触することが少ないので基質として不飽和脂肪酸等
を用いる場合にもこれが空気酸化をうけないという利点
がある。

上記各種の方法により得られる目的エステルは、常法
に従い例えばカラムクロマトグラフイー等により更に精
製することができる。

かくして得られる目的エステルは、この種エステルが
従来利用されている各種の広範な用途に利用できる。

実施例以下、本発明を更に詳しく説明するため実験例及び実
施例を挙げる。

尚、各例において酵素量の表示は、以下に示す方法に
より求められた国際単位を用いた。

〈リパーゼの活性測定〉「ポバール＃117」（倉敷レーヨン社製）18gと「ポバー
ル＃205」（同上社製）2gとを水800mlに懸濁し、75〜80
℃に加温攪拌して完全に溶かした後、冷却し、水を加え
て1000mlに調製したポリビニルアルコール溶液75mlに、
オリーブ油22.9gをホモジナイザーにて乳化して調製し
たオリーブ油乳化液5mlと0.1Mリン酸緩衝液4mlとの混液
及び試料酵素液1mlを加え、マグネチツクスタラーで500
rpmで攪拌しつつ37℃で20分間反応させ、次いでこれに
エチルアルコール40mlを注加して、0.05N水酸化カリウ
ム溶液で遊離脂肪酸を滴定する。この条件で１分間に１
μモル当量の脂肪酸を遊離する酵素量を１国際単位
（Ｕ）とする。

〈コレステロールエステラーゼの活性測定〉コレステロールエステラーゼの１単位（1U）とは、子
牛血清を基質として37℃で１分間に１μモルのコレステ
ロールを遊離させる活性であり、以下の反応液、酵素溶
液を用いて遊離コレステロールをコレステロールオキシ
ダーゼで酸化し、生成する過酸化水素をパーオキシダー
ゼで比色定量することにより求められる。

反応液組成 0.2Mリン酸緩衝液（pH6.5） 0.6ml パーオキシダーゼ〔シグマケミカル社製、タイプII No.P−8250〕 0.3ml 0.35％４−アミノアンチピリン水溶液 0.3ml 0.2w/w％フエノール水溶液 0.3ml コレステロールオキシダーゼ水溶液〔東洋醸造社製、プロダクトNo.T−04 を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0、 0.05w/v％のトリトンＸ−100 を含む）で10U/mlとする〕 0.6ml 子牛血清〔グランドアイランドバイオロジカル（USA）社製〕 0.3ml 蒸留水 0.3ml 試料酵素溶液としては、酵素を10mMリン酸緩衝液（pH
7.5、0.1％アルブミンを含む）に溶かして約1U/mlに調
製して用いる。上記反応液3mlを比色用セルに入れ、37
℃で10分間インキユベートし、0.05mlの試料酵素溶液を
加え、静かに転倒混合し、493nmで経時測定を行ない、
吸収の増加率（ΔAs/分）を測定する。同じことを試料
酵素溶液の代りに、希釈用緩衝液を用いて行ない増加率
（ΔAb/分）を求める。上記吸収増加率の差（ΔA/分＝
ΔAs−ΔAb）が0.05以下の時は、これが0.05以上になる
まで試料酵素溶液の濃度を高くして操作を繰返す。酵素
活性（U/mg）は次式により算出される。

また目的エステルの合成率は、次の方法により算出し
た。即ち、反応終了後、反応液を水−有機溶媒２相系に
転換し、有機溶媒相を分離する。この有機溶媒相の濃度
を適当に調整後、クロマロツド（石英ロツドにシリカゲ
ルを溶着したもの、ヤトロン社製、クロマロツドS II）
に脂質分として10〜30μｇ程度チヤージし、目的エステ
ルと未反応基質が分離する適当な条件（例えばヘキサン
／エーテル／蟻酸＝56/14/0.3）で展開し、必要があれ
ば、硝酸銀含浸クロマロツド等を用いて各成分を分離す
る。展開後、数分乾燥し、展開溶媒を除去したクロマロ
ツドをイアトロスキヤンTH−10（ヤトロン社製、FID水
素炎イオン化方式）検出器にかけて、反応液中の脂質成
分のピーク面積を求める。目的エステルの合成率は、上
記面積をもとに、各例に示した式を利用して算出され
る。

各例では、特に断わらない限り、反応は37℃の恒温室
内で行ない、反応液の攪拌混合は20mm×300cpmの振盪培
養機（いわしや生物科学社製、RMR−Ｓ−20）にて行な
い、また有機溶媒は水を飽和させた含水有機溶媒として
使用した。

実験例１この例は、生成ステロールエステルの合成率と、原料
脂肪酸エステル対ステロール（基質比）との関係を調べ
た例である。

コレステロール（以下「cho」と略す）100mgに対し
て、メチルオレイン酸エステル（以下「MO」と略す）の
所定量を用い、キヤンデイダ・シリンドラシア（Candid
a cylindracea）由来のリパーゼ（「リパーゼMY」、各
糖産業社製）1000U（33.3mg）を、0.05Mリン酸バツフア
ー（pH7.0）（以下「PB」と略す）8mlに溶かして反応系
に添加した。反応系は、水で飽和したイソオクタン3.0m
lに上記基質を溶解させ、水−含水有機溶媒系とした。
反応容器としては、内径3cm及び高さ5cmのネジブタ付円
筒型ガラスビンを用いた。以下の例においても特記しな
い限り同様とする。

37℃で２時間反応させたときの生成コレステロールオ
レイン酸エステル（以下「CO」と略す）の合成率を第１
表に示す。尚、該合成率は、下式（１）により算出し
た。

合成率（％）＝（COピーク面積）×100 ／（COピーク面積＋choピーク面積）以下の例においても、特筆しない限り合成率は、この
（１）に示す式により算出する。

上記第１表より、合成率は原料MOの対choモル比が高
くなる程高くなる傾向が認められる。

実験例２イソオクタン2ml、PB8ml、リパーゼMY500U及び反応温
度６時間とした以外は、実験例１と同様にして、cho100
mgに対してMOを第２表に示す割合で用いた。結果を第２
表に示す。尚合成率は、choが大過剰となるため下記式
（２）により算出した。

合成率（％）＝（COピーク面積）×100 ／（COピーク面積＋MOピーク面積＋オレイン酸ピーク面積）第２表より、第１表とは異なり、cho過剰の場合、モ
ル比が小さくなり、MOが少なくなる程、合成率は高くな
る。上記実験例１と合せ考えると基質はどちらが過剰で
もよく、そのモル比の差が大きくなる程合成率は高くな
ることが判る。

実験例３この例は、水媒系及び含水有機溶媒系での目的エステ
ル類の合成率を調べたものである。

cho100mg、MO230mg及びリパーゼMY1000Uを反応容器に
入れ、これに第３表に示すPB及び／又はイソオクタンを
添加し、４時間反応させた。結果を第３表に示す。

第３表より、反応液の全容積が10mlの場合、イソオク
タン/PB＝2ml/8ml付近の合成率が最も高いことが判る。
また、PB無添加の系では、イソオクタンに飽和した水分
並びに基質及び酵素中に含まれる水分により、酵素の活
性が実現され、これにより所望の反応が起るものと考え
られる。尚この場合、合成率が低いのは、酵素が反応液
中で固相で存在してフロツクを形成するため、水−疎水
性界面で作用すると考えられる酵素にとり、充分な接触
面積が得難いことと、原料脂肪酸エステルの加水分解に
必要な水分が他の実験条件に比して少なく、該分解反応
が反応の律速段階となるためと考えられる。

実験例４反応容器として、500mlの坂口フラスコを用いて、第
５表に示したイソオクタン及びPBを用いて反応させた。
反応は、坂口フラスコを振幅6cm、振盪数120cpmの振盪
器（LR、いわしや生物科学社製）にて攪拌した以外は、
実験例３と同条件で行なった。結果を第４表に示す。

第４表より、この系では、反応液の全容積が増加する
に伴い、合成率は低下する傾向が認められ、また反応液
容積に拘わらず、反応系内のPBの割合が多い程合成率は
高くなることが判る。

実験例５この例では、反応系を水媒系（有機溶媒を用いること
なくPBのみを用いた系）とし、リパーゼMY1000U及び基
質としてchoとMOとを第５表に示した量（cho/MO（モル
比）＝1/2（一定））で用いて反応を行ない、目的とす
るコレステロールオレイン酸エステル（CO）を得た。結
果を第５表に示す。尚、PBを0.5mlを用いた系では、混
合状態の改善のため反応容器内に12mm径のガラスビーズ
１個を入れた。また第５表には、コレステロールオレイ
ン酸エステル（CO）標準液を用いて作成した面積基準合
成率−重量基準合成率換算表から算出されたCO合成量を
併記する。

実験例６この例は、cho100mg、MO230mg、リパーゼMY500U及び
有機溶媒/PB＝2ml/8mlからなる系を用いて、29時間反応
させ、有機溶媒の種類による合成率の変化を調べたもの
である。有機溶媒として次のものを用いた結果を第６表
に示す。

第６表試験No. 使用有機溶媒の種類合成率（％）１イソオクタン 99.0 ２シクロヘキサン 99.5 ３ｎ−ヘキサデカン 69.5 実験例７この例では、cho100mg、MO230mg、リパーゼMY1000U及
びイソオクタン/PB＝5ml/5ml〜1ml/9mlからなる系を用
いて、反応を行ない、合成率の経時変化を調べた。結果
を第７表に示す。

第７表より、反応速度の遅いイソオクタン/PBの系で
も反応時間を長くすれば、合成率95％が得られることが
判る。

実施例１ cho100mgと、第８表に示す脂肪酸メチルエステル及び
酵素のそれぞれ所定量を用い、同表に示す時間、合成反
応を行なった。反応系としては、同表にioc/PBとして示
すイソオクタン/0.05Mリン酸バツフアー（pH7.0）の所
定量混合系を用いた。結果を第８表に併記する。

尚、合成率は次式により算出した。

合成率（％）＝（ステロールエステルピーク面積） ×100/（ステロールエステルピーク面積＋choのピーク面積）但し第８表における略号は次の通りである。

〈酵素〉 MY…リパーゼMY（名糖産業社製、キヤンデイダシリン
ドラシア由来、30μ/mg） LP…リパーゼＴ−01（東洋醸造社製、クロモバクテリウ
ムビスコサム由来、280μ/mg）Ａ…リパーゼ「アマノＡ」（天野製薬社製、アスペルギ
ルス属由来、４μ/mg） D10…リパーゼＤ−10（天野製薬社製、リゾプスデレ
マー由来、10μ/mg） CE−１…コレステロールエステラーゼＴ−18（東洋醸造
社製、105μ/mg） CE−２…コレステロールエステラーゼ（キヤンデイダ・
シリンドラシア由来、20μ/mg、生化学工業社製）〈原料脂肪酸エステル類〉Ｂ−１…メチルプロピオン酸エステルＢ−２…メチルカプリン酸エステルＢ−３…メチルステアリン酸エステルＢ−４…メチルベヘニン酸エステルＢ−５…メチルオレイン酸エステルＢ−６…メチルラノリン脂肪酸エステル（吉川製油社
製）Ｂ−７…メチルイソステアリン酸エステル（エメリー社
製イソステアリン酸より合成）Ｂ−８…メチルリノール酸エステルＢ−９…メチル 12−ヒドロキシステアリン酸エステルＢ−10…ジメチルコハク酸エステル実施例２第９表に示すステロール成分（使用量100mg）と共
に、MO（対choモル比＝1.2）及びリパーゼMY1000Uを用
い、反応系としてイソオクタン/PB＝2ml/8mlを採用し
て、第９表に示す時間で反応を行なった。結果を第９表
に併記する。但し、合成率は次式により算出した。

合成率（％）＝（ステロールエステルピーク面積） ×100/（ステロールエステルピーク面積＋ステロールピーク面積）実施例３ cpo100mgと、第10表に示す原料脂肪酸エステル類200m
gとを基質として、リパーゼMY1000Uを用い、イソオクタ
ン/PB＝5ml/10mlの反応系で、70時間反応を行なった。
実施例１と同様にして求めた合成率を第10表に示す。

実施例４ cho100mgと第11表に示すオリーブ油の所定量とを基質
とし、リパーゼMY500Uを用いて、イソオクタン/PB＝2ml
/8mlの系で、1.5時間反応を行なった。オリーブ油はい
ずれも1.5時間で完全に分解した。結果を第11表に示
す。但し、表中試験No.1及び２の合成率は前記式（１）
で算出し、試験No.3〜５のそれらは次式で求めた。

合成率（％）＝（COピーク面積）×100 ／（COピーク面積＋脂肪酸ピーク面積）第 11 表試験No. オリーブ油（mg）合成率（％）１ 229 96.6 ２ 114.5 94.5 ３ 76.3 96.3 ４ 57.2 97.1 ５ 45.8 97.5 実施例５ cho100mgに代えて、ステアリルアルコール70mgを用い
た他は、実施例４と同様にした。結果を第12表に示す。
但し表中試験No.1及び２の合成率は下式（３）で算出
し、試験No.3〜５のそれらは下式（４）で求めた。

合成率（％）＝（合成アルコールエステルのピーク面積 ×100）／（合成アルコールエステルのピーク面積＋原料アルコールのピーク面積）（３）合成率（％）＝（合成アルコールエステルのピーク面積 ×100）／（合成アルコールエステルのピーク面積＋脂肪酸のピーク面積）（４）第 12 表試験No. オリーブ油（mg）合成率（％）１ 229 99.5 ２ 114.5 99.3 ３ 76.3 96.9 ４ 57.2 99.0 ５ 45.8 98.4 実施例６第13表に示すアルコール又はステロールと油脂とを基
質とし、リパーゼMY1000Uを用い、同表に示す反応系
（第８表と同様の略号で示す）及び反応時間で反応を行
なった。

結果を第13表に示す。但し、表中試験No.1〜４の合成
率は前記式（１）で算出したものであり、試験No.5〜12
のそれらは上記式（３）によるものである。

実施例７基質としてオレイルアルコール139mg及びラウリルス
テアリン酸エステル117mgを、酵素としてリパーゼMY100
0Uを各々用い、第14表に示す反応系及び反応時間で反応
を行ない、目的とするオレイルステアリン酸エステルを
得た。

次式により算出された合成率を第14表に併記する。

合成率（％）＝（目的エステルのピーク面積） ×100/（目的エステルのピーク面積＋原料エステルのピーク面積）実施例８ cho100mg、MO153mg、イソオクタン2ml、PB8ml及びリ
パーゼMY1000Uからなる反応液を３時間混合反応させた
後、上層よりサンプリングし、コレステロールオレイン
酸エステル（CO）合成率を測定した。

その後、静置し上層のイソオクタン層を水との界面部
分を残してとり除いた後、更にイソオクタ16mlを加え、
混合後、静置して再びイソオクタン層15mlを除去し、界
面部分に残つている未反応基質及び反応生成物を洗浄除
去した。上記洗浄操作を合計２回繰返した後、再度酵素
を含む水層にcho100mg、MO153mg及びイソオクタン1mlを
添加して３時間反応させた。

上記のように、反応後リパーゼを含む水層及び界面層
を残して、上層の基質及び反応生成物を含むイソオクタ
ン層を取り、その後、新たに基質及びイソオクタンを加
えるという操作を含む合計７回繰返して本発明を実施し
た。

その結果を第15表に示す。尚、エステル合成率測定
後、新たに基質を交換するまでは反応液は酵素と基質と
が混合接触された状態のままに保持した。

第 15 表反応反復回数（回）合成率（％）１ 91.0 ２ 91.4 ３ 90.4 ４ 91.1 ５ 92.3 ６ 90.5 ７ 89.6 第15表より、上記繰返し反復合成反応によっても、酵
素は何ら活性を失わないことが判る。

実施例９ cho100mg、α−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステ
ル230mg及びイソオクタン2mlからなる基質溶液に、リパ
ーゼMY1000U（33.3mg）を水8mlに溶かした酵素水溶液を
加え、72時間反応させた。反応後、反応液をポリプロピ
レン製疎水性多孔質膜「ジユラガード＃2400」（空孔率
38％、最大孔径0.02×0.2μｍ、臨界表面張力35ダイン/
cm、ポリプラスチツク社製）を用いて、乳化した上層部
分を少しづつ過した。酵素水溶液は、表面張力が上記
膜の臨界表面張力より大きいため該膜の表面を濡らすこ
とができず、膜表面に存在する微細孔を通過できない
が、イソオクタンはこの微細孔を透過した。

透過しなかつた酵素水溶液を反応容器に戻し、これに
新たに上記と同一の基質溶液を加えて再び72時間反応さ
せた。

上記第１回目の反応の合成率は72.5％及び第２回目の
反応の合成率は70.4％であつた。

上記例は、水−有機溶媒２相系で反応させ、反応液を
疎水性多孔質膜で過して選択的に有機溶媒を透過させ
たものであり、少し乳化した反応液からの酵素水溶の分
離は、膜の表面張力による選択的透過性を利用しても実
施できることが判る。

実施例10 内径2cm、長さ2mのガラスカラム（Ｇ）、ポンプ（P
1、P2、P3）、分配器（Ｂ）、オートサンプラー
（Ａ）、受器（T1）、混合器（T2）、原料タンク（T
3）、反応液タンク（T4）及び反応停止液入試験管（T
5）を備えた第１図に示すフローチヤートの連続反応装
置を用いて、そのカラム（G2）部にリパーゼMY108U/ml
のPB水溶液500mlを満たし、cho/MO/イソオクタン＝1200
mg/1840mg/600mlの基質溶液を、ポンプ（P1）を用い
て、8.52ml/分の速度でカラムの下部ノズル（N1）より
小粒径油滴として酵素水溶液層（G2）部に導入した。

導入された小粒径油滴は噴出された勢いと浮力とによ
り酵素水溶液中を上昇しながら反応してガラスカラムの
（G1）部に反応生成物を含むイソオクタン層として分離
される。このイソオクタン層を、ノズル（N2）よりオー
バーフローさせ、受器（T1）に一時的に貯留させ、その
１部をポンプ（P2）により分配器（Ｂ）を経て、0.127m
l/分の速度で反応液タンク（T4）へ連続的に抜き出す。

また受器（T1）よりオーバーフローしたイソオクタン
溶液は、混合タンク（T2）に入れ、そこで原料タンク
（T3）からポンプ（P3）にて0.127ml/分の速度で供給さ
れた上記と同一組成の新しい基質溶液と混合させ、この
混合された基質溶液は、ポンプ（P1）より8.52ml/分の
速度で再度ノズル（N1）を通してガラスカラムのG2部に
供給する。

オートサンプラー（Ａ）は、分配器（Ｂ）より３時間
毎に反応液を抜き出し、これを反応停止液（アセトン／
エタノール＝1/1）の入つた試験管（T5）にサンプリン
グする。

この様にして、基質溶液を酵素水溶液中に繰返し循環
反応させ、オートサンプラー（Ａ）により３時間毎にサ
ンプリングした反応液におけるエステル合成率を測定し
た結果を第２図に示す。

第２図は縦軸に合成率（％）を、横軸に反応開示ゼロ
タイムからの反応時間（hr）をとり、合成率を時間に対
してプロツトしたものである。

なお、反応開始後48時間前後まではカラム上部（G1）
のイソオクタン層は乳化するが、反応の進行と共に分離
し始め64時間前後で完全に分離する。

第２図より、第１図に示す簡単なスプレー塔でも水−
有機溶媒２相系の反応系を採用すれば、乳化を起らず、
酵素を繰返し使用して連続的に目的エステルを合成で
き、しかも240時間以上も酵素の交換及び補給を行なう
ことなく、80％以上の合成率を維持できることが判る。

実施例11 ポリプロピレン製の疎水製膜（「ジユラカード250
0」、ポリプラスチツク社製、厚さ25μｍ、平均細孔0.1
μｍ、最大孔径0.04×0.4μｍ、空孔率45％、有効面積
（これは膜面積より膜の取付のために塞がれた部分を除
いた面積をいう）10.6cm²）により容器を上下に仕切
り、該膜の下側部屋（本体8cm³）にリパーゼMY595U/ml
の水溶液8cm³を満たし、また該部屋に接続した連通管に
も同酵素水溶液を入れ、その液面を膜面よりも30cm高く
した。

上記容器の上側部屋に、cho100mg、MO153mg及びイソ
オクタン10mlからなる基質溶液を入れ容器全体を振幅6c
m、振盪数120cpmの振盪器にかけ、反応を行なつた。

48時間反応後の合成率は87.2％であり、反応系は乳化
せず、基質相への水の侵入も見られなかつた。

以上のように多孔質の反応膜を介して酵素と基質とを
接触反応させる上記方法によれば、酵素水溶液は表面張
力が大きいため疎水性膜を濡らすことがでず該膜に存在
する微細孔を通過できず、疎水性の基質とは混合されな
いが、疎水性基質は疎水性膜の微細孔を透過して膜の下
側で該疎水性界面に吸着している酵素と接触反応するの
で、反応時間は酵素と基質との接触頻度が大きくなれば
短くなる。従つて上記の如き平膜型からクループ型、ス
パイラル型、チユーブラー型、ホロフアイバー型等に代
えれば反応時間はより短縮される。

実施例12 実施例11において用いた「ジユラガード2500」に代
え、該ジユラガード2500をメタノール及び水中に浸漬
し、微細孔を水で置換処理した親水性膜を用い、該膜の
上下各部屋に同様に各々基質溶液及び酵素水溶液を入れ
た。但し連通管の液面は膜面と同じ高さとした。

実施例11と同様の反応を行ない、合成率が90％以上に
なった時、基質溶液を更新して同一反応を合計10回繰返
し、各回の合成率及びCO合成量を求めた。

結果を第３図に示す。図において横軸は反応時間（h
r）を、縦軸はCO合成量（mg）を示す。

第３図より、この例のように親水性の膜を用いると、
酵素水溶液は膜の微細孔を浸透して膜の上側で基質と接
触反応し、約500時間以上、酵素の補給や交換を要する
ことなく、反応を継続でき、500時間後の全CO合成量は1
280mgであることが判る。

実施例13 実施例11において、膜として第16表に示す５種の膜を
用い、膜下側部屋の体積を8cm³として、同条件下に反応
を行なつた。その結果を下記第16表に併記する。

第16表より、いずれの膜を用いる場合も合成反応は良
好に進行し、しかも反応系の乳化はないことが判る。

実施例14 まず、リパーゼMYを、次の方法で固定化用樹脂と混合
して固定化させた。

光硬化性樹脂ENTP−4000（関西ペイント社製）1gにベ
ンゾイルエチルエーテル10mgを加え、60℃にて加熱混合
溶解後、室温まで冷却し、これに酵素3000U（100mg）及
びベンゼン；ヘプタン＝1:1混液2mlを加え、よく練り込
んだ後、7cm×10cm×0.5mmの大きさでシート状に拡げ、
その上をポリエステルの透明シートでカバーした後、光
照射（東芝ケミカルランプ使用、３分間）して硬化させ
た。上記方法でリパーゼMY3gを固定化して硬化後、樹脂
を４〜5mm角の大きさに切り、ベンゼン：ヘプタン＝1:1
混液で洗浄後、イソオクタンで洗浄して固定化酵素剤と
した。

上記で得た固定化酵素を内径2cm、長さ46cmのガラス
カラムに約36cmの長さに充填した。基質溶液としてcho1
000mg、MO1534mg及びイソオクタン150mlからなる液を調
製し、該液を上記カラムに6.3ml/分の速度で循環させ
た。COの合成率が80％前後になつた時点で、基質溶液を
更新し、反応を繰返した。

各回の合成率より、実験例５（第５表）と同様にし
て、CO合成量を算出し、該合成量と反応時間との関係を
調べた。結果を第３図と同様にして第４図に示す。

実施例15 コレステロールエラテラーゼＴ−18（東洋醸造社製）
2000U（19.0mg）を実施例14の方法で固定化して固定化
酵素剤を調製した。

この固定化酵素剤にcho100mg、MO153mg及びイソオク
タン15mlを加えて反応させた。休日を除いて１日１回、
反応液を過して固定化酵素を回収し、これを用いて第
１回目と同じ反応系でその都度基質溶液を更新しながら
79日間反応を繰返した。80日目の反応のタイムコースを
第17表に示す。

第 17 表反応時間（hr）合成率（％） 1 29.4 3 72.1 5 81.9 18 84.6 23 91.7 実施例16 セライトNo.545（ジヨンズマンビレセールズ社
（Johns Manville Sales Co.）製）40gを電気炉中で
500℃で２時間加熱し活性化した。次に２％アミノプロ
ピルトリエトキシシランアセトン溶液中に50℃で20時間
浸漬した。浸漬後、アセトン400mlで洗浄し過しシラ
ン化セライトを得た。

該シラン化セライト20gを１％グルタールアルデヒド
水溶液に浸漬し、４℃で一夜反応させた後、0.1Mリン酸
バツフアー（pH7.0）にてよく洗浄、過してアルデヒ
ド化セライトを得た。該アルデヒド化セライト1gに対し
てリパーゼMY1500U、0.1Mリン酸バツフアー2mlを加え、
４℃で一夜固定化した後、過してグルタルアルデヒド
−セライト固定化酵素を得た。

一方上記シラン化セライト1gに対してリパーゼMY1500
U、0.1Mリン酸バツフアー（pH7.0）5ml、カルボジイミ
ド試薬（１−シクロヘキシル−３−（モルホリノエチ
ル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホン酸）50
mgを加え、４℃で一夜反応後、水洗、過してカルボジ
イミド−セライト固定化酵素を得た。

また上記において、セライトに代え多孔質ガラス（CP
G00500、平均細孔半径257.5Å、粒子サイズ120〜200メ
ツシユ、エレクトロヌクレオニクス社製）を用い、同様
にして、グルタルアルデヒド−ガラス固定化酵素及びカ
ルボジイミド−ガラス固定化酵素を得た。

上記で調製した各固定化酵素剤にcho100mg、MO230m
g、イソオクタン2ml及びPB8mlを加えて24時間反応さ
せ、反応後、反応液ヲ過し、固定化酵素をケーキとし
て回収し、紙と共に反応容器に戻し、再度上記反応系
で反応を繰返した。この操作を合計３回行なつた。３回
目の合成率を下記第18表に示す。

実施例17 水で洗浄過した湿つた状態のセルロフアインGC−70
0−ｍ（チツソ社製）75gに、1N水酸化ナトリウム水溶液
を21.6ml及びエピクロルヒドリン12mlを加え、30℃で４
時間緩かに振盪して細孔表面に存在する親水性の水酸基
をエポキシ化した。蒸留水500mlで洗浄したエポキシ化
セルロフアインをエチレンジアミン6.7ml及び1N水酸化
ナトリウム水溶液1.05mlと共に60℃で2.5時間反応さ
せ、水洗、過した。吸引過して集めたエチレンジア
ミンセルロフアイン1gに0.1Mリン酸バツフアー（pH7.
0）10ml及び25％グルタールアルデヒド溶液1mlを加え、
室温で一夜振盪した後、リン酸バツフアーで洗浄、過
してアルデヒド化セルロフアインを得た。

上記で得たアルデヒド化セルロフアインとリパーゼMY
1500Uとを、リン酸バツフアー中、室温で一夜反応さ
せ、セロフアイン固定化リパーゼ製剤を得た。

上記固定化酵素剤にcho100mg、MO230mg及びイソオク
タン2mlからなる基質溶液とPB8mlとを加え、24時間反応
させた。反応後、反応液を過して回収した固定化酵素
剤に、上記と同一の基質溶液を加えて、再度反応を行な
つた。

この操作を３回繰返した結果、３回目の合成率は95.2
％であつた。

実施例18 cho100mgと第19表に示す油脂の所定量とを基質とし、
リパーゼMY1000Uを用い、同表に示すイソオクタン/PB混
合系で所定時間反応を行なった。結果を同表に示す。

実施例19 第20表に示す酵素、アルコール成分及び脂肪酸エステ
ル類の所定量を用い、イソオクタン/PB＝3ml/8mlの系で
所定時間反応を行なった。結果を反応時間と共に第20表
に併記する。

第20表における略号は、前記したものであるか又は次
のものを示す。

〈酵素〉Ｅ−ａ…コレステロールエステラーゼ（シユードモナス
属由来、100U/mg、フナコシ薬品社製）Ｅ−ｂ…リパーゼ（リゾプスデレマー由来、600U/m
g、生化学工業社製）Ｅ−ｃ…リパーゼOF（キヤンデイダシリンドラシア由
来、360U/mg、名糖産業社製）〈アルコール成分〉Ａ−１…コレステロールＡ−２…イソコレステロールＡ−３…イソトリデシルアルコール（クラレ社製）Ａ−４…エヌジエコール200A（新日本理化社製）Ａ−５…ラノリンアルコールHH（吉川製油社製）Ａ−６…フアインオキソコール1800（日産化学社製）〈脂肪酸エステル類〉Ｂ−11…トリオレイン（東京化成工業社製）Ｂ−12…トリステアリン（東京化成工業社製）Ｂ−13…トリラウリン（東京化成工業社製）Ｂ−14…トリブチリン（東京化成工業社製）Ｂ−15…大豆油Ｂ−16…牛脂Ｂ−17…綿実油Ｂ−18…オリーブ油

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法の実施に適したひとつの装置の概略
図、第２図は第１図に示す装置を用いて実施した本発明
方法におけるエステル合成率を示すグラフ、第３図は実
施例12に示す本発明方法の実施によるエステル合成量の
経時変化を示すグラフ及び第４図は実施例13に従う本発
明方法を実施したときのエステル合成率の経時変化を示
すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭60−58086（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】リパーゼ及びコレステロールエステラーゼ
から選択される酵素類又は固定化された上記酵素類を用
いて、ステロール類及び／又は炭素数12〜32の脂肪族ア
ルコール類と脂肪酸エステル類とを接触反応させて上記
脂肪酸のステロールエステル類又は脂肪族アルコールエ
ステル類を製造する方法であつて、上記反応を水媒系及
び／又は含水有機溶媒系で行ない且つ酵素類又は固定化
酵素類を単一回又は複数回繰返し利用することを特徴と
する脂肪酸エステル類の製造方法。