JP2657887B2

JP2657887B2 - 固定化酵素の調製方法

Info

Publication number: JP2657887B2
Application number: JP12165193A
Authority: JP
Inventors: 祐三生田; 敏田代; 喜之將野; 登安藤; 佐知夫浅岡; 治人小林
Original assignee: CHODA KAKO KENSETSU KK; NITSUSHIN SEIYU KK
Current assignee: CHODA KAKO KENSETSU KK; NITSUSHIN SEIYU KK
Priority date: 1993-05-24
Filing date: 1993-05-24
Publication date: 1997-09-30
Anticipated expiration: 2012-09-30
Also published as: JPH06327475A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、特に油脂又はレシチンのエステ
ル交換に適した固定化酵素の調製方法に関する。

【０００２】

【従来技術】エステル交換反応は、ワックスエステル、
各種脂肪酸エステル、糖エステルやステロイド等の製造
法、あるいは植物油、動物油、レシチンで代表されるリ
ン脂質等の改質法として重要な技術である。このエステ
ル交換反応の触媒として、脂質分解酵素の一種であるリ
パーゼ又はホスホリパーゼ（以下、単にリパーゼという
ことがある）を用いると温和な条件下でエステル交換反
応を行うことが可能となり、また、その基質特異性や位
置特異性により目的物を効率よく生産することができ
る。又、系内の水分をできる限り少なくし、かつ酵素の
活性が発現するに充分な量のリパーゼを存在させてエス
テル交換反応を行うことが提案されている。ところが、
リパーゼは水溶性であり、微水系（油系）では均一に分
散することが困難である。このような問題を解決するた
めにリパーゼを不溶性担体に担持させた固定化リパーゼ
が用いられている。そして、固定化リパーゼを採用する
ことによって、さらに、生産物の分離が容易となり、リ
パーゼの繰り返し利用が可能となり、反応系の連続化が
容易になるなどの利点が得られている。

【０００３】しかし、このような利点を有しているにも
係わらず、実用化に耐えうる寿命を有する固定化リパー
ゼは得られていない。尚、固定化酵素の活性を改善する
ために種々の方法がこれまでに提案されている。例え
ば、酵素を前以て油脂で処理する方法（特開昭６０−２
５１８８４号公報）、脂肪酸存在下で乾燥する方法（特
開昭６２−１３４０９０号公報）、酵素をりん脂質と接
触させた状態で固定化する方法（特開昭６３−２１４１
８４号公報）、界面活性剤存在下で固定化する方法（特
開昭６４−２５８８号公報）、脂肪酸または誘導体で担
体を前処理する方法（特開平１−１５３０９０号公
報）、固定化時にアミノ酸を添加する方法（特開平３−
１８３４８０号公報）などである。しかしながらこれら
は活性は上がっても連続的に使用すると、いずれも寿命
が短く、実用化に耐えるまで至っていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、担体に固定
化したリパーゼ又はホスホリパーゼであって、これらの
酵素活性の発現に優れ、微水系でエステル交換反応を行
うのに特に適しており、かつ寿命が長い固定化酵素の効
率的な調製方法を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、疎水性の母材
でかつその表面に酵素と水溶液中で共有結合を形成する
官能基と陰イオン交換基とを併せ持つ、マクロポーラス
型の樹脂で形成された特定の担体に、目的酵素を固定化
する際に脂肪酸あるいはその誘導体の存在下で該酵素を
担体に接触させると、高活性で寿命の長い固定化酵素を
得ることができるとの知見に基づいてなされたのであ
る。すなわち、本発明は、酵素と水溶液中で共有結合を
形成する官能基と弱塩基性陰イオン交換基とを有する樹
脂担体に、リパーゼ又はホスホリパーゼを固定化するに
当たり、脂肪酸あるいはその誘導体の存在下で該酵素を
担体に接触させることを特徴とする固定化酵素の調製方
法を提供する。本発明において、担体を形成する不溶性
有機高分子としては、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）系共
重合体、メタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、
ポリプロピレン、ナイロン、フェノールなどを母材とす
るものが用いられるが、特にジビニルベンゼン系共重合
体が好ましく用いられる。また、樹脂の細孔径は５ｎｍ
〜１０００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１０００ｎｍの
ものが適当である。上記樹脂が有する、酵素と水溶液中
で共有結合を形成する官能基としては、エポキシ基、シ
アニド基、アルデヒド基、トリアジニル基などがあげら
れる。このうち、エポキシ基が好ましく、特に隣り合っ
た炭素に酸素原子が付加した１，２エポキシ基が好まし
い。又、上記樹脂が有する陰イオン交換基としては、１
級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基などがあげら
れるが、弱塩基性の３級アミノ基であるジエチルアミノ
エチル基（ＤＥＡＥ基）やジメチルアミノ基が好まし
い。

【０００６】本発明においては、樹脂担体中の上記官能
基及び陰イオン交換基の割合は任意とすることができる
が、共重合する共有結合を形成する官能基を０．２〜
５．０mol/kg含有するのが好ましく、特に好ましくは
０．５〜２．０mol/kgである。また陰イオン交換基を
０．２〜５．０mol/kg含有するのが好ましく、特に好ま
しくは０．５〜２．０mol/kgである。これら官能基や陰
イオン交換基は常法により上記樹脂に導入することがで
きる。例えば、これらの官能基や陰イオン交換基を有す
るモノマーを上記樹脂の重合時に共存させて共重合させ
て導入すること、上記の樹脂やこれを前処理して反応性
の官能基を生成させたものに、エステル結合等の一般の
化学結合法で導入することなどがあげられる。このよう
な方法により上記特定の官能基と陰イオン交換基とを導
入した樹脂は、例えば、バイエル社のレバチットＲ２６
０Ｋが入手でき、また後述する参考例１のように調製し
てもよい。尚、レバチットＲ２６０Ｋは、エポキシ基と
２級アミノ基を有するが、エポキシ基と３級アミノ基を
有する参考例１に記載のものが一層好ましい担体樹脂で
ある。

【０００７】本発明では、担体として任意の粒径のもの
を使用することができるが、一般に担体の粒子径の９０
％以上が５０〜1,０００μｍのものを使用するのが好ま
しいが、特に平均粒径が３００〜６００μｍのものを使
用するのが好ましい。上記担体に固定される酵素は、リ
パーゼ及び／又はホスホリパーゼである。リパーゼとし
ては、ムコール属、リゾプス属、アスペルギルス属、ア
ルカリゲネス属、ジオトリクム属、キャンディダ属、シ
ュードモナス属、ペニシリウム属、クロモバクテリウム
属等の微生物由来のリパーゼがあげられる。このうち、
特に、ムコール属やリゾプス属のリパーゼを用いるのが
好ましい。又、ホスホリパーゼとしては、動物の脳、肝
臓、膵臓組織やリゾプス属等由来のホスホリパーゼ
Ａ₁、前記動物組織やエシエリヒア属、マイクロバクテ
リウム属等のホスホリパーゼＡ₂、前記動物組織やペニ
シリウム属、フスマ、米ヌカ等由来のホスホリパーゼＢ
等があげられる。好ましい固定化酵素のエステル交換活
性は固定化酵素１ｇ（乾燥重量）あたり１５０ユニット
以上である。

【０００８】本発明において、酵素を担体に接触させる
際に使用する脂肪酸又はその誘導体としては、脂肪酸あ
るいはその誘導体である脂肪酸エステルや油脂などがあ
げられ、反応原料あるいはその一部あるいはその生成物
あるいは、酵素の基質、生成物となりうる反応原料と同
類の脂肪酸もしくは油脂を用いることができ、好ましく
はエステル交換反応の反応原料が用いられる。これらの
例としてはナタネ油、大豆油、コーン油、パーム油、そ
れらの分別油、オレイン酸、レシチン、脂肪酸モノ又は
ジグリセリド等があげられ、その使用量は担体に対して
１〜１００重量％、好ましくは５〜３０重量％である。
このような脂肪酸やその誘導体が酵素を担体に接触させ
る際に存在すると、つまり、酵素は固定化されるときに
先ず担体に接触している例えば脂肪酸の誘導体である油
脂等と反応することにより、またはその類似物や反応生
成物等により活性化され、油脂などを分解して生成する
脂肪酸により保護される。脂肪酸は陰イオン交換基によ
り濃度が高められている。

【０００９】次に本発明の調製方法について説明する。
例えば、予め担体を脂肪酸又はその誘導体により前処理
しておき、ついで前処理した担体に酵素液を接触させる
ことにより担体に酵素を担持させることができる。ここ
で、酵素液としては用いるリパーゼ又はホスホリパーゼ
によって決まるが、例えば、酵素を0.０５〜１０重量％
含む水溶液を担体（乾燥重量）１重量部当たり１〜２０
０重量部使用するのが好ましい。この際緩やかに撹拌す
ることが好ましい。固定化に要する時間は１０分から４
０時間で、好ましくは１時間から２４時間である。固定
化時の温度は４℃から５０℃、好ましくは５℃から２５
℃である。また、必要に応じて酵素液を緩衝液で調製す
ることもできる。この場合、調整ｐＨは酵素の至適ｐＨ
付近が好ましく、リパーゼを用いる場合、遊離酵素の状
態で測定した加水分解活性の至適ｐＨ、例えばｐＨ５〜
９に調整するのが好ましい。同様にホスホリパーゼの場
合はｐＨ４〜１０がよい。緩衝液の種類は特に規定され
ないが、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液を用いることができ
る。酵素を担持した担体は濾過等により残液を除き、必
要に応じてイオン交換水等で洗浄する。この際、洗浄液
にトリス塩酸緩衝液等のアミノ基を有する物質を含んだ
水溶液を用いることにより、担体に残存する、未反応の
共有結合を形成する官能基をブロックすることも可能で
ある。除液した固定化酵素は減圧乾燥法等により乾燥す
るのが好ましく、乾燥後の水分が0.５重量％〜３０重量
％、好ましくは５重量％〜１０重量％となるようにする
のがよい。乾燥後の水分が0.５重量％未満の場合、十分
にエステル交換活性が発現されず、また３０重量％を超
える場合、失活の原因になるとともに副反応である加水
分解が無視できなくなる。固定化操作において使用する
担体と酵素の割合は、担体１ｇ（乾燥重量）に対し、酵
素中のタンパク質が0.１ｇから１０ｇ、好ましくは0.２
ｇから５ｇであるが、特にこれに限定されるものではな
い。

【００１０】本発明では、予め担体を脂肪酸又はその誘
導体により前処理する代わりに、脂肪酸あるいはその誘
導体を担体の懸濁水に添加し、ここにリパーゼ又はホス
ホリパーゼを加えてから１０分から１０時間、好ましく
は１０分から１時間攪拌して担体に酵素を均一に担持さ
せることもできる。この後の操作は、予め担体を脂肪酸
又はその誘導体により前処理したものについての操作と
同じである。本発明の固定化酵素を用いて、油脂類のエ
ステル交換を効率的に行うことができる。特に、反応系
中の水分含有量を５０〜２０００ｐｐｍ、好ましくは１
００〜１０００ｐｐｍに低下させた微水系でエステル交
換反応を行うのに適している。本発明において、好適な
エステル交換反応としては、温度３０〜７０℃であり、
必要に応じて有機溶媒を用いることもできる。用いる有
機溶媒としては固定化酵素の活性を低下させないものが
選ばれ、例えばｎ−ヘキサンや石油エーテルがあげられ
る。又、対象となる油脂類としては、大豆油、ナタネ
油、パーム油、オリーブ油等の通常の油脂、レシチン、
脂肪酸、それらの誘導体を含めるものであり、とりわけ
植物由来の油脂、レシチンおよび脂肪酸が好適である
が、この他に動物油脂、魚貝類油脂およびそれらの脂肪
酸を対象とすることもできる。エステル交換反応の原料
の組み合わせは、リパーゼの場合、油脂と脂肪酸又はそ
のエステル、１種もしくは２種以上の油脂であり、ホス
ホリパーゼの場合にはレシチンと脂肪酸又はそのエステ
ルであり、またリパーゼとホスホリパーゼを併用すれば
油脂とレシチンとの組み合わせも可能である。なお本発
明において、レシチンとはホスファチジルコリン、ホス
ファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシト
ール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、それ
らのリゾ体等のモノあるいはジアシルグリセロリン脂質
を好適な例としてあげることができ、これらの１種もし
くは２種以上の混合物、さらにこれに油脂を含むものも
使用できる。ワックスエステル、各種脂肪酸エステル、
糖エステルやステロイド等の製造法、あるいは植物油、
動物油の改質法として種々のエステル交換反応を行うこ
とができる。

【００１１】本発明により製造された固定化酵素を用い
て油脂を改質する場合には、原料油脂に脂肪酸ないし固
定化酵素の反応にて油脂から脂肪酸を生成する水あるい
は／およびアルコール類を添加することができる。ここ
で、添加するアルコール類としては、エタノール、グリ
セリンないしモノあるいはジグリセライドの一種又は二
種以上の混合物を使用することができる。その添加量は
０．０１〜１０重量％が好ましい。又、エステル交換や
改質の対象となる油脂を活性炭あるいは活性白土等の吸
着剤による処理または水蒸気蒸留処理を行い、過酸化物
を低減化した後に使用することができる。改質は所望の
温度で行うことができるが、４０〜７０℃の温度で行う
のが好ましい。

【００１２】

【発明の効果】本発明により、高活性で担持された酵素
の活性発現状態が安定な固定化酵素を得ることができ
る。次に実施例により本発明を説明する。

【００１３】

【実施例】参考例１ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）５０％とメタクリル酸グリ
シジル２５％とＤＥＡＥメタクリレート２５％を通常の
方法で共重合し、樹脂担体を得た。この樹脂担体の平均
細孔径は１１．７ｎｍで細孔容積は０．５ｃｍ^３／ｇで
あった。実施例１参考例１で得た樹脂担体１００ｇにナタネ油２０ｇとイ
オン交換水１０００ｍｌを加え３０℃で３０ｍｉｎ振盪
した後、ろ過洗浄した。得られた処理担体にＲｈｉｚｏ
ｐｕｓｓｐ．由来のリパーゼＦＡＰ−１５（天野製
薬（株）製１５０，０００ｕ／ｇ）の２％水溶液１００
０ｍｌを加え４時間２５℃で攪拌しながら固定化を行っ
た。濾過洗浄後真空乾燥器で３時間乾燥した。得られた
固定化酵素は５０ｇで水分は５％であった。実施例２実施例１で使用したリパーゼをＣａｎｄｉｄａｃｙｌ
ｉｎｄｒａｃｅａ由来のリパーゼＯＦ（名糖産業（株）
製３６０，０００ｕ／ｇ）、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍＶｉｓｃｏｓｕｍ由来のリパーゼＬＰ（東洋醸
造（株）製１００，０００ｕ／ｇ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎｕｓｓｐ．由来のリパーゼＣＥＳ（天野製薬（株）
製２０，０００ｕ／ｇ）に代えて固定化酵素を調製し、
そのエステル交換活性を測定した。活性はそれぞれ８０
ｕｎｉｔ／ｍｌ固定化酵素、８５ｕｎｉｔ／ｍｌ固定化
酵素、９０ｕｎｉｔ／ｍｌ固定化酵素となった（表−１
参照）。

【００１４】比較例１参考例１で得た樹脂担体１００ｇに直接リパーゼＦ AP-
15の２％水溶液１０００mlを加え４時間２５℃で攪拌し
ながら固定化を行った。濾過、洗浄後真空乾燥器で３時
間乾燥した。得られた固定化酵素は５０ｇで水分は５％
であった。上記実施例及び比較例で得られた固定化酵素
のエステル交換活性と寿命を次のようにして測定した。固定化酵素のエステル交換活性エステル交換活性は５０℃でのトリオレインへのパルミ
チン酸の取り込み速度（μmol/min/g 固定化酵素）で測
定し、固定化酵素の単位容量に換算した。（単位：unit
/ml 固定化酵素）固定化酵素の寿命固定化酵素をカラムに詰め、パーム油とナタネ油の混合
物をＳＶ（空間速度）＝１（リットル／リットルカラム
・hr) で流し、構成脂肪酸の炭素数の合計が５０および
５２のトリグリセリドの組成の変化から反応率を出し、
７０％の応率を維持できる間の通油可能量を固定化酵素
の寿命とした。結果を表−１に示す。

【００１５】

【表１】表−１固定化酵素エステル交換活性寿命の例 (unit/ml固定化酵素) （１原料油／１固定化酵素）実施例１１９９４０００実施例２８０１８００８５２１００９０２２００比較例１１００１０００

【００１６】実施例３参考例１で得た樹脂担体１００ｇにナタネ油２０ｇとイ
オン交換水１００mlを加えて３０℃で３０分間振とうし
た後、ろ過洗浄した。得られた処理済担体に豚膵臓由来
のホスホリパーゼＡ₂（ノボノルディスク社製、３７０
０ユニット／ml）２００mlを加え２５℃で４時間攪拌し
ながら樹脂担体にホスホリパーゼを固定した。ろ過洗浄
後、真空乾燥機で３時間乾燥した。得られた固定化酵素
は５０ｇで水分は５％であった。この固定化酵素の加水
分解活性は３９０ユニット／ｇであった。実施例４実施例１で得られた固定化酵素を用いて、油脂を改質す
るにあたり、各種添加物について固定化酵素の劣化を防
ぐ効果を調べた。各種添加物を添加した反応系（通液速
度ＳＶ＝３）での通油初期の反応率と寿命を表−２示
す。

【００１７】

【表２】表−２添加物初期反応率寿命（％）（１原料油／１固定化酵素）無し８７２１００エタノール（０．５％）９５３７００脂肪酸（５％）８０３８００エタノール＋脂肪酸８３５９００実施例５実施例１で得られた固定化酵素を用いて油脂を改質する
にあたり、過酸化物を低減させることにより固定化酵素
の劣化を防ぐ効果を調べた。過酸化物の異なる原料油に
ついての初期反応率と寿命を表−３に示す。

【００１８】

【表３】表−３原料油の過酸化物価初期反応率寿命（％）（１原料油／１固定化酵素）５．０８６１００００．２８７２１００実施例６実施例１で得られた固定化酵素を用いて油脂を改質する
にあたり、反応温度を低くすることにより固定化酵素の
劣化を防ぐ効果を調べた。反応温度による影響を調べ
た。反応温度６０、５０、４５℃における初期反応率と
寿命を表−４に示す。

【００１９】

【表４】表−４反応温度初期反応率寿命（℃）（％）（１原料油／１固定化酵素）６０９０１６００５０８７２１００４５８３１９００実施例７実施例１で得た固定化酵素を容量１００mlのカラムにつ
め、パーム油：ナタネ油＝１：１の混合油を６５℃にて
ＳＶ＝１で流した。１５００時間後に約１kgをサンプリ
ングし、反応率を測定した。また、このエステル交換油
脂を５℃にてウインタリングし、得られた液体部の収率
を測定した。比較例２比較例１で得た固定化酵素を容量１００mlのカラムにつ
め、カラムにつめ、実施例７と同様に反応、サンプリン
グを行い反応率およびウインタリング時の液体部の収率
を測定した。上記実施例７および比較例２で得られた反
応率ならびにウインタリング時の液体部収率を表−５に
示した。

【００２０】

【表５】表−５反応率ウインタリング時液体部収率（％）（％）実施例７９１７５比較例２３９５２実施例８実施例１で得た固定化酵素をカラムにつめ、ハイオレイ
ックヒマワリ油（オレイン酸含量８３％）：ステアリン
酸（純度９８％）＝１：１の混合物を６５℃でＳＶ＝１
にて流した。１５００時間後にサンプリングし、トリグ
リセリド組成を測定し、反応前後のトリグリセリド組成
の変化から反応率を算出した。この反応油から蒸留によ
り遊離脂肪酸を５％以下まで除去した。次に、アセトン
を用いて１８℃および５℃にて２段分別した後、中融点
部を精製してカカオ代用脂を得た。結果を表−６に示
す。比較例３比較例１で求めた固定化酵素を用いる以外は実施例８と
同様にして反応率の測定ならびに中融点部を得た。結果
を表−６に示す。

【００２１】

【表６】表−６反応率中融点部収率（％）（％）実施例８９２３４比較例３４５１９実施例９実施例１で酵素を豚膵臓由来のホスホリパーゼＡ₂（ノ
ボノルディスク社製；３７００ユニット／ml）の水溶液
１０００mlに替え、固定化酵素を調製した。得られた固
定化酵素０．１ｇを、０．４４３ｇ／mlジオレイルホス
ファチジルコリンおよび５０ｍＭパルミチン酸のヘキサ
ン溶液（水分０．０１％）１０mlに加え、５０℃で２４
時間振盪後に遊離脂肪酸中のオレイン酸含量を測定した
ところ、２０％であった。

フロントページの続き (72)発明者安藤登神奈川県横浜市神奈川区守屋町３丁目13 番地千代田化工建設株式会社千代田リサーチパーク内 (72)発明者浅岡佐知夫神奈川県横浜市神奈川区守屋町３丁目13 番地千代田化工建設株式会社千代田リサーチパーク内 (72)発明者小林治人神奈川県横浜市神奈川区守屋町３丁目13 番地千代田化工建設株式会社千代田リサーチパーク内

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】酵素と水溶液中で共有結合を形成する官
能基と弱塩基性陰イオン交換基とを有する樹脂担体に、
リパーゼ又はホスホリパーゼを固定化するに当たり、脂
肪酸あるいはその誘導体の存在下で該酵素を担体に接触
させることを特徴とする固定化酵素の調製方法。
【請求項２】弱塩基性陰イオン交換基が第３級アミノ
基、共有結合を形成する官能基がエポキシ基であり、か
つ樹脂担体が多孔性である請求項１記載の調製方法。