JPH06327486A - 固定化酵素を用いるエステル交換法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 担体に固定化したリパーゼ又はホスホリパー
ゼであって、これらの酵素活性の発現に優れ、微水系で
エステル交換反応を行うのに特に適しており、かつ寿命
が長い固定化酵素を用いるパーム油を含まない油脂類お
よびレシチンのエステル交換法を提供すること。 【構成】 酵素と水溶液中で共有結合を形成する官能基
と弱塩基性陰イオン交換基とを有する樹脂担体にリパー
ゼ又はホスホリパーゼを固定化した固定化酵素の存在
下、パーム油を含まない油脂又はレシチンと脂肪酸ある
いはパーム油を含まない２種以上の油脂、あるいはパー
ム油を含まない油脂とレシチン、あるいは２種以上のレ
シチンをエステル交換することを特徴とするエステル交
換法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、特に油脂またはレシチンのエス
テル交換に適した固定化酵素を用いたパーム油を含まな
い油脂類またはレシチンのエステル交換法に関する。

【０００２】

【従来技術】エステル交換反応は、ワックスエステル、
各種脂肪酸エステル、糖エステルやステロイド等の製造
法、あるいは植物油、動物油、レシチンで代表されるリ
ン脂質等の改質法として重要な技術である。このエステ
ル交換反応の触媒として、脂質分解酵素の一種であるリ
パーゼ又はホスホリパーゼ（以下、単にリパーゼという
ことがある）を用いると温和な条件下でエステル交換反
応を行うことが可能となり、また、その基質特異性や位
置特異性により目的物を効率よく生産することができ
る。又、系内の水分をできる限り少なくし、かつ酵素の
活性が発現するに充分な量のリパーゼを存在させてエス
テル交換反応を行うことが提案されている。ところが、
リパーゼは水溶性であり、微水系（油系）では均一に分
散することが困難である。このような問題を解決するた
めにリパーゼを不溶性担体に担持させた固定化リパーゼ
が用いられている。そして、固定化リパーゼを採用する
ことによって、さらに、生産物の分離が容易となり、リ
パーゼの繰り返し利用が可能となり、反応系の連続化が
容易になるなどの利点が得られている。

【０００３】しかし、このような利点を有しているにも
係わらず、実用化に耐えうる固定化リパーゼは得られて
いない。固定化リパーゼの調製方法としては、多孔性の
キトサン成型物（特開昭５９−２１３３９０）、マクロ
ポーラス型陰イオン交換樹脂（特開昭６０−９８９８
４）、マクロポーラス型フェノール系吸着樹脂（特開昭
６１−２０２６８）、獣骨（特開昭６４−８０２８
６）、発泡性フェノール樹脂の焼成物（特開平２−１０
０６７８）、５０ｎｍ以上の細孔径を持つ疎水性担体
（特開平２−１３８９８６）、陽イオン交換樹脂（特開
平３−６４１８５）、マクロポーラス型アクリル系吸着
樹脂（特開平３−５０１９２２）を担体として用いるも
のが提案されている。しかしながら、これらの担体を使
用したのでは、十分なリパーゼ活性が得られない。又、
特開昭６０−１３７２９０では多糖類の水酸基を酸化し
たアルデヒド基を用いて酵素を多糖類担体に固定化する
方法が示されている。しかし、担体が親水性のため微水
系での反応には適していない。また、特開平１−２６２
７９５にはキレート樹脂に酵素を固定化する方法が示さ
れているが、実用に耐える活性を得るには至っていな
い。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、担体に固定
化したリパーゼ又はホスホリパーゼであって、これらの
酵素活性の発現に優れ、微水系でエステル交換反応を行
うのに特に適しており、かつ寿命が長い固定化酵素を用
いるパーム油を含まない油脂類およびレシチンのエステ
ル交換法を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、疎水性の母材
でかつその表面に酵素と水溶液中で共有結合を形成する
官能基と陰イオン交換基とを併せ持つ、マクロポーラス
型の樹脂で形成された特定の担体に、目的酵素を固定化
することにより、高活性で寿命の長い固定化酵素を得る
ことができるとの知見に基づいてなされたのである。す
なわち、本発明は、酵素と水溶液中で共有結合を形成す
る官能基と弱塩基性陰イオン交換基とを有する樹脂担体
にリパーゼ又はホスホリパーゼを固定化した固定化酵素
を用い、パーム油を含まない油脂又はレシチンと脂肪
酸、あるいはパーム油を含まない２種以上の油脂、ある
いはパーム油を含まない油脂とレシチン、あるいは２種
以上のレシチンをエステル交換することを特徴とするエ
ステル交換法を提供する。

【０００６】本発明において、担体を形成する不溶性有
機高分子としては、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）系共重
合体、メタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、ポ
リプロピレン、ナイロン、フェノールなどを母材とする
ものが用いられるが、特にジビニルベンゼン系共重合体
が好ましく用いられる。また、樹脂の細孔径は５nm〜１
０００nm、好ましくは１０nm〜１０００nmのものが適当
である。上記樹脂が有する、酵素と水溶液中で共有結合
を形成する官能基としては、エポキシ基、シアニド基、
アルデヒド基、トリアジニル基などがあげられる。この
うち、エポキシ基が好ましく、特に隣り合った炭素に酸
素原子が付加した１，２エポキシ基が好ましい。又、上
記樹脂が有する陰イオン交換基としては、１級アミノ
基、２級アミノ基、３級アミノ基、第４級アンモニウム
基などがあげられるが、弱塩基性の３級アミノ基である
ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ基）やジメチルアミ
ノ基が好ましい。

【０００７】本発明においては、樹脂担体中の上記官能
基及び陰イオン交換基の割合は任意とすることができる
が、共重合する共有結合を形成する官能基を 0.2〜5.0m
ol/kg 含有するのが好ましく、特に好ましくは 0.5〜2.
0mol/kg である。また陰イオン交換基を 0.2〜5.0mol/k
g 含有するのが好ましく、特に好ましくは 0.5〜2.0mol
/kg である。これら官能基や陰イオン交換基は常法によ
り上記樹脂に導入することができる。例えば、これらの
官能基や陰イオン交換基を有するモノマーを上記樹脂の
重合時に共存させて共重合させて導入すること、上記の
樹脂やこれを前処理して反応性の官能基を生成させたも
のに、エステル結合等の一般の化学結合法で導入するこ
となどがあげられる。このような方法により上記特定の
官能基と陰イオン交換基とを導入した樹脂は、例えば、
バイエル社のレバチットＲ２６０Ｋが入手でき、また後
述する参考例１あるいは３のように調製してもよい。
尚、レバチットＲ２６０Ｋは、エポキシ基と２級アミノ
基を有するが、エポキシ基と３級アミノ基を有する参考
例１に記載のものが一層好ましい担体樹脂である。

【０００８】本発明では、担体として任意の粒径のもの
を使用することができるが、一般に担体の粒子径の９０
％以上が５０〜1,０００μｍのものを使用するのが好ま
しいが、特に平均粒径が３００〜６００μｍのものを使
用するのが好ましい。上記担体に固定される酵素は、リ
パーゼ及び／又はホスホリパーゼである。リパーゼとし
ては、ムコール属、リゾプス属、アスペルギルス属、ア
ルカリゲネス属、ジオトリクム属、キャンディダ属、シ
ュードモナス属、ペニシリウム属、クロモバクテリウム
属等の微生物由来のリパーゼがあげられる。このうち、
特に、ムコール属やリゾプス属のリパーゼを用いるのが
好ましい。又、ホスホリパーゼとしては、動物の脳、肝
臓、膵臓組織やリゾプス属等由来のホスホリパーゼ
Ａ₁、前記動物組織やエシェリヒア属、マイクロバクテ
リウム属等のホスホリパーゼＡ₂ 、前記動物組織やペニ
シリウム属、フスマ、米糖等由来のホスホリパーゼＢ等
があげられる。好ましい固定化酵素のエステル交換活性
は固定化酵素１ｇ（乾燥重量）あたり１５０ユニット以
上である。

【０００９】本発明の固定化酵素は、例えば、多孔質の
不溶性担体である樹脂に酵素液を接触させることにより
担体にリパーゼ又はホスホリパーゼを担持させて製造す
ることができる。ここで、酵素液としては用いるリパー
ゼ又はホスホリパーゼによって決まるが、例えば、酵素
を0.０５〜１０重量％含む水溶液を担体（乾燥重量）１
重量部当たり１〜２００重量部使用するのが好ましい。
この際緩やかに撹拌することが好ましい。固定化に要す
る時間は１０分から４０時間で、好ましくは１時間から
２４時間である。固定化時の温度は４℃から５０℃、好
ましくは５℃から２５℃である。また、必要に応じて酵
素液を緩衝液で調製することもできる。この場合、調整
ｐＨは酵素の至適ｐＨ付近が好ましく、リパーゼを用い
る場合、遊離酵素の状態で測定した加水分解活性の至適
ｐＨ、例えばｐＨ５〜９に調整するのが好ましい。同様
にホスホリパーゼの場合はpH４〜１０がよい。緩衝液の
種類は特に規定されないが、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液
を用いることができる。酵素を担持した担体は濾過等に
より残液を除き、必要に応じてイオン交換水等で洗浄す
る。この際、洗浄液にトリス塩酸緩衝液等のアミノ基を
有する物質を含んだ水溶液を用いることにより、担体に
残存する、未反応の共有結合を形成する官能基をブロッ
クすることも可能である。除液した固定化酵素は減圧乾
燥法等により乾燥するのが好ましく、乾燥後の水分が0.
５重量％〜３０重量％、好ましくは５重量％〜１０重量
％となるようにするのがよい。乾燥後の水分が0.５重量
％未満の場合、十分にエステル交換活性が発現されず、
また３０重量％を超える場合、失活の原因になるととも
に副反応である加水分解が無視できなくなる。固定化操
作において使用する担体と酵素の割合は、担体１ｇ（乾
燥重量）に対し、酵素中のタンパク質が0.１ｇから１０
ｇ、好ましくは0.２ｇから５ｇであるが、特にこれに限
定されるものではない。

【００１０】本発明の固定化酵素を用いて、パーム油を
含まない油脂類及び／又はレシチンのエステル交換を効
率的に行うことができる。特に、反応系中の水分含有量
を５０〜２０００ｐｐｍ、好ましくは１００〜１０００
ｐｐｍに低下させた微水系でエステル交換反応を行うの
に適している。本発明において、好適なエステル交換反
応としては、温度３０〜７０℃であり、必要に応じて有
機溶媒を用いることもできる。用いる有機溶媒としては
固定化酵素の活性を低下させないものが選ばれ、例えば
ｎ−ヘキサンや石油エーテルがあげられる。又、対象と
なる油脂類としては、パーム油を含まない油脂、レシチ
ン、脂肪酸、それらの誘導体が含まれ、とりわけ植物由
来の油脂、レシチンおよび脂肪酸が好適であるが、この
他に動物油脂、魚貝類油脂およびそれらの脂肪酸を対象
とすることもできる。エステル交換反応の原料の組み合
わせは、リパーゼの場合、パーム油を含まない油脂と脂
肪酸又はそのエステル、パーム油を含まない２種以上の
油脂であり、ホスホリパーゼの場合にはレシチンと脂肪
酸又はそのエステル、２種以上のレシチンであり、また
リパーゼとホスホリパーゼを併用すれば、パーム油を含
まない油脂とレシチンとの組み合わせも可能である。な
お本発明において、パーム油とはパーム油、その分別
油、水添油等の加工油脂等のほか、これらを混合した各
種油脂をいう。またレシチンとはホスファチジルコリ
ン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル
イノシノール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン
酸、それらのリゾ体等のモノあるいはジアシルグリセリ
ン脂質を好適な例としてあげることができ、これらの１
種もしくは２種以上の混合物、さらにこれに油脂を含む
ものも使用できる。本発明の固定化酵素を用いれば、ワ
ックスエステル、各種脂肪酸エステル、糖エステルやス
テロイド等の製造法、あるいは植物油、動物油の改質法
として種々のエステル交換反応を行うことができる。

【００１１】

【発明の効果】本発明によれば、物理的強度と化学的強
度に優れ、高活性でかつ担持された酵素の活性発現状態
が安定で寿命の長い固定化酵素を用いて、パーム油を含
まない油脂又はレシチンのエステル交換反応を効率的に
行わしめることができる。次に実施例により本発明を説
明する。

【００１２】

【実施例】

参考例１ ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）７０％とメタクリル酸グリ
シジル１５％とＤＥＡＥメタクレート１５％を通常の方
法で共重合し、樹脂担体を得た。この樹脂担体の平均細
孔径は１2.３nmで細孔容積は0.５cm³ ／ｇであった。 参考例２ 参考例１で得た樹脂担体１００ｇにRhizopus sp.由来の
リパーゼＦＡＰ−１５（天野製薬（株）製１５0,０００
ｕ／ｇ）の２％水溶液１０００mlを加え、４時間２５℃
で攪拌しながら固定化を行った。濾過、洗浄後真空乾燥
器で３時間乾燥した。得られた固定化酵素は５０ｇで水
分は５％であった。 参考例３ 参考例２でリパーゼをChromobacterium Viscosum由来の
リパーゼＬＰ（東洋醸造（株）製１０0,０００ｕ／
ｇ）、Pseudomonus sp. 由来のリパーゼＣＥＳ（天野製
薬（株）製２0,０００ｕ／ｇ）に替えて固定化酵素を調
製し、そのエステル交換活性を測定した。

【００１３】参考例４ 予め、メタクリル酸を母材とし１級アミンを含む多孔性
樹脂であるＦＥ４６１２（オルガノ社製）１００ｇに１
重量％グルタルアルデヒド（0.０５Ｍリン酸緩衝液中）
２００mlを加え、室温で１時間緩やかに攪拌し、水洗し
た後ろ過により水をきった樹脂担体を用いた以外は参考
例２と同様にして固定化酵素を調製した。 参考比較例１ 参考例１で担体を官能基として共有結合基も陰イオン交
換基もない疎水性の樹脂であるDuolite S861を用いて参
考例２と同様に調整した。 参考比較例２ 固定化酵素として市販されている陰イオン交換樹脂を担
体としたリポザイム（ノボ・ノルディスク・バイオイン
ダストリー社製）を使用した。 参考比較例３ 参考例１で担体を官能基として陰イオン交換基がない疎
水性の樹脂であるLewatit R259K を用いて参考例２と同
様に調製した。

【００１４】実施例１ 上記参考例及び参考比較例で得られた固定化酵素のエス
テル交換活性と寿命を次のようにして測定した。固定化酵素のエステル交換活性 エステル交換活性は５０℃でのトリオレインへのパルミ
チン酸の取り込み速度（μmol/min/g 固定化酵素）で測
定し、固定化酵素の単位容量（単位unit/ml 固定化酵
素）に換算した。固定化酵素の寿命 固定化酵素をカラムに詰め、綿実油とナタネ油の混合物
をＳＶ（空間速度）＝１（リットル／リットルカラム・
hr）で流し、構成脂肪酸の炭素数の合計が５０および５
２のトリグリセリドの組成の変化から反応率を出し、７
０％の反応率を維持できる間の通油可能量を固定化酵素
の寿命とした。結果を表−１に示す。

【００１５】

【表１】 表−１ 固定化酵素 エステル交換活性 寿命 の例 (unit/ml固定化酵素) （１原料油／１固定化酵素） 参考例２ ９０ １０００ 参考例３ ６５ ８５０ ６０ ８５０ 参考例４ ９０ ９００ 参考比較例１ ８７ ４００ 参考比較例２ ４６ ２５０参考比較例３ ８３ ５００

【００１６】実施例２ 参考例２で得た固定化酵素をカラムにつめ、ハイオレイ
ックヒマワリ油（オレイン酸含量８３％）：ステアリン
酸（純度９８％）＝１：１の混合物を６５℃でＳＶ＝１
にて流した。７５０時間後にサンプリングし、トリグリ
セリド組成を測定し、反応前後のトリグリセリド組成の
変化から反応率を算出した。この反応油から蒸留により
遊離脂肪酸を５％以下まで除去した。次に、アセトンを
用いて１８℃および５℃にて２段分別した後、中融点部
を精製してカカオ代用脂を得た。結果を表−２に示す。 比較例１ 参考比較例１で求めた固定化酵素を用いる以外は実施例
２と同様にして反応率の測定ならびに中融点部を得た。
結果を表−２に示す。

【００１７】

【表２】 表−２ 反応率 中融点部収率 （％） （％） 実施例２ ８４ ３０ 比較例１ ３０ １６

【００１８】実施例３ 参考例２で酵素を豚膵臓由来のホスホリパーゼＡ₂ （ノ
ボ・ノルディスク社製；３７００ユニット／ml）の水溶
液１０００mlに替えて固定化酵素を調製した。得られた
固定化酵素０．１ｇを、０．４４３ｇ／ｍｌジオレイル
ホスファチジルコリンおよび５０ｍＭパルミチン酸のヘ
キサン溶液（水分０．０１％）１０ｍｌに加え、５０℃
で２４時間振盪後に遊離脂肪酸中のオレイン酸含量を測
定したところ、１２％であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 將野 喜之 神奈川県横浜市保土ヶ谷区岩井町397−Ｂ −108 (72)発明者 安藤 登 神奈川県横浜市神奈川区守屋町３丁目13番 地 千代田化工建設株式会社千代田リサー チパーク内 (72)発明者 浅岡 佐知夫 神奈川県横浜市神奈川区守屋町３丁目13番 地 千代田化工建設株式会社千代田リサー チパーク内 (72)発明者 小林 治人 神奈川県横浜市神奈川区守屋町３丁目13番 地 千代田化工建設株式会社千代田リサー チパーク内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵素と水溶液中で共有結合を形成する官
   能基と弱塩基性陰イオン交換基とを有する樹脂担体にリ
   パーゼ又はホスホリパーゼを固定化した固定化酵素の存
   在下、パーム油を含まない油脂又はレシチンと脂肪酸あ
   るいはパーム油を含まない２種以上の油脂、あるいはパ
   ーム油を含まない油脂とレシチン、あるいは２種以上の
   レシチンをエステル交換することを特徴とするエステル
   交換法。
2. 【請求項２】 弱塩基性陰イオン交換基が第３級アミン
   基、共有結合を形成する官能基がエポキシ基であり、か
   つ樹脂担体が多孔性である請求項１記載のエステル交換
   法。