JPH02504342A - 固定化された、位置非特異的リパーゼ、その製造および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 固定化された、位置非特異的１．１バーゼ、その製造および使用 定義 本明細書中アンダーラインした言葉が表われる場合には次の定義が通用される。

一丈で上：虻は、たとえば水層と有機層の間の界面において水不溶性カルボン酸 エステルのエステル結合に関連する反応（たとえばエステル結合の加水分解、合 成および交換）を触媒化する酸素を意味するものである。

リパーゼは可溶性、誘導体化または固定化形である０皿足％ユニは、“ガイドラ インズ　フォア　ザ　ギャラクタリゼイション　オブ　インモビライズド　バイ オキ中タリスツ　　Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　　ｃｈａｒａ ｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　１ｍ５ｏｂｉｌｉｚｅｄｂｉｏｃａｔａｌ ｙｓｔｓ″（１９８３）、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、、 　５．３０４−３０７で定義されたように固定化酵素または固定化細胞のリパー ゼを意味する　ｋパー−Ｖはこれを固定化することなく化学的に変性されたリパ ーゼを意味する。旦且性ユバ−＋は非変性リパーゼを意味する。

リパーゼはその位置特異性にしたがって分けられる０本明細書で使用されるよう に、守　　　・１バーゼ（または略してにユニ）はトリグリセリド分子の１位ま たは３位における脂肪アシル基とのみ反応するものであり、ｍ、１ｔ＜−５（ま たは略してｌ　　、１　％＝４）はトリグリセリドの３つの脂肪アシル基すべて と反応するものである。

非特異的リパーゼ活性は、たとえば純粋脂肪酸と純粋なトリオレインまたはココ アバターステアヅンとの反応により、中間位置における反応速度を測定すること によりミ　トリグリセリドとのエステル基交換反応において測定される。

１バーゼ　　　　゛は、エステル加水分解、エステル合成およびエステル基交換 である。関係するエステルはトリグリセリドまたは他のカルボン酸エステルであ る。

バイリーのインダストリアル　オイル　アンド　ファツトプロダクツ（Ｂａｉｌ ｅｙ’ｓ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｏｉｌ　ａｎｄＦａｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ） 。

Ｖｏｌ、２　ｐ１２７，４版（ディ　スウェルン　Ｄ、Ｓｗｅｒｎ）Ｊｉ）によ れば、エステル基交換は脂肪または他のカルボン酸エステルパが脂肪酸基の交換 を伴なってカルボン酸、アルコールまたは他のエステルと反応を起こし新しいエ ステルを作る反応に関する。

したがってエステルと酸との反応はヱ之エユ２スと言われ、エステルとアルコー ルとの反応は７７１≦Ｗと言われ、そして１つのエステルと他の別のエステルと の反応はニス±土ｎまたはλ２ｊソロｌ換と言われる。　　　゛の一ン　ムエス ール　六　はトリグリセリドにおける３つのアシル基すべてが反応しその際３つ の位置すべてにおいて脂肪酸のほとんどランダムな分布が得られるエステル基交 換反応に関する。これは化学的触媒または非特異的リパーゼの使用により達成さ れる。

技術分野 本発明は、粒状形態の固定化非特異的リパーゼ製剤、その製法およびリパーゼ触 媒化方法すなわちエステル基交換、エステル合成ならびにエステル加水分解にお けるその使用に関する。特に、向上した熱を有するこのような固定化リパーゼに 関する。

従来技術 固定化非特異的リパーゼはワイ、キムラら（Ｙ、Ｋｆｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、）に よるＥｕｒ、　Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　１７　（１ ９８３）、　１０７−１１２に記載されている。リパーゼはカンジダ　シリンド ラセア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）から誘導され、論文におけ るデータは固定化リパーゼが最適温度約４０°Ｃを有し、５０℃でかなり失活す ることが示されている。

固定化非特異的リパーゼおよび脂肪のランダムエステル基交換のためのその使用 は、マクレ−ニー、アール、　（Ｍａｃｒａｅ。

Ａ、Ｒ，）（１９８３）、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａ＋５ｅｒｉｃａ ｎ　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’５ｏｃｉｅｔｙ（ＪＡＯＣＳ）、　６０．２９ １に記載されている。しかしながら、方法温度は４０°Ｃだけであった。この低 温はたぶんカンジダシリンドラセア　リパーゼの低い熱安定性のために選択され たものであろう。

このように、先行技術製剤は約４０℃またはそれ以下で使用されうるだけである 。他方、たとえばマーガリン工業における脂肪のランダム化のために、溶媒なし で約６０℃またはそれ以上で高融点基質を加工するための熱安定性、固定化、非 特異的リパーゼに対する必要性がある。ニー、アール、マクレ−（Ａ、Ｒ，Ｍａ ｃｒａｅ）およびアール、シイ、ハモンド（Ｒ，Ｃ，Ｈａｍｎ＋ａｎｄ）　：” Ｐｒｅｓｅｎｔ　ａｉｄ　Ｆｕｔｕｒｅ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｌ ｉｐａｓｅｓ”　Ｂｉｏｔｅｃｔ＋ｎｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｖｉｅｗｓ＋　３．１９３＋　２１７（１９８５）″ が参考となる。

したがって、本発明の目的は、６０°Ｃ以上での長期間使用にするものである。

リパーゼはこれらを経済的に製造しうるため微生物によるものであるべきである 。

熱安定固定化特異的リパーゼは公知である。たとえば、ヨーロッパ特許公開ＥＰ 　０１４０５４２号（ノボ　インダストシイ）には７０°Ｃでのエステル基交換 のためのこの生成物の使用が記載されている。しかし特異的リパーゼは本発明の 目的を満足するものではない。

多くの非特異的微生物性リパーゼは可溶形態で公知であり、熱安定性データは次 のようなものに公開されている：黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ｓ　ａｕｒｅｕｓ）（バプラ、ディ、ブイ。

Ｖａｄｅｈｒａ　Ｄ、Ｖ、（１９７４）、　Ｌｉｐｉｄｓ、　９．１５８）、ペ ニシリウム　シクロピウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）（ オクムラ、ニス、らＯｋｕｍｕｒａ、　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、（１９７６）、　 Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｗＣｈｅｍｉｓｔｒ ｙ、　４０＋　６５５およびレンシアウ　イ、シイ、　Ｒｅｎ５ｈａＥ、Ｃ，お よびサン　クレメント　シイ、エル、　Ｓａｎ　ＣｌｅｍｅｎｔｅＣ，Ｌ、（１ ９６６）　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌｏｇｙ＋　８゜２１４）、コリネバクテリウム　アクネス（Ｃｏｒｙ ｎｅｂａｃｔｅｒｉ’ｕｍ　ａｃｎｅｓ）（ハーシング、シイ、ニス、　）ｌａ ｓｓｉｎｇ、Ｇ、ｓ、（１９７１）、　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ　Ｂｉｏｐｈ ｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、　２４２．３８Ｌおよびバプロ　シイ、Ｐａｂｌ。

Ｇ、（１９７４）　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖ ｅ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、　６３＋２３１）、プロピオニバクテリウム　ア クネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓ）　（インハム、イー 、らＴｎｇｈａｍ、　Ｅ、ｅｔ　ａｌ、（１９８１）。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇＶ、　１２４ ＋　３９３）、カンジダシリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｙｌｉｎｄｒａｃ ｅａ）（カンジダ　ルゴサＣ８ｒｕｇｏｓａとしても知られている）（ベンゾナ ナ、シイ、　Ｂｅｎｚｏｎａｎａ。

Ｇ、およびエスポシト、ニス、　Ｅｓｐｏｓｉｔｏ、　５．（１９７１）、　Ｂ ｉｏｃｈｉｍｉｃａａｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ＋　２３Ｌ　１５　 ；およびキムラ　シイ、　ＫｉｍｕｒａＹ、（１９８３）　Ｅｕｒ、Ｊ、Ａｐｐ ｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、　１７＋　１０７）ゲオト リカム　カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ）　（ジエンセ ンアール、シイ、　Ｊｅｎｓｅｎ　Ｒ，Ｇ、　（１９７４）Ｌｉｐｉｄｓ、　ｆ ｉ＋　１４９　；ジエンセン　アール、シイ６ら（１９７２）Ｌｉｐｉｄｓ、ヱ 、７３８；およびッジサカ　シイ、　Ｔｓｕｊｉｓａｋａ　Ｙ、およびイヮイ　 エム、　Ｉｗａｉ　Ｍ。

（１９８４）　Ｋａｇａｋｕ　ｔｏ　ｋｏｇｙｏ、　５８．６０）　、しかしな がら、文献におけるデータはこれらのリパーゼすべてが固定化形態で約６゜°Ｃ 以上での長期間使用に対し熱安定性が不十分であることを示している。

本発明の説明 驚くべきことに、位置非特異的リパーゼがプソイドモナスセパシア（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ）から得られることが見出された。そしてまた驚 くべきことに、この固定形のリパーゼが６０°Ｃでの長期使用に十分な熱安定性 であり、したがって従来より公知の固定化非特異的リパーゼより一層熱安定性で あることが見出された。固定化リパーゼは特に６０〜８０°Ｃ程の高温での脂肪 のランダム化に適する。はとんどの脂肪はこのような温度で液状であり、そして 溶媒の不存在下でランダム化されうる。

プソイドモナス　セパシアおよび他のプソイドモナス種からのリパーゼは公知で あるが、しかしこれらのうちでトリグリセリドに対して位置非特異的であること が知られているものはない。１９８６年５月１７日のホノルルにおけるＡＯＣ５ ／ＪＯＣ５会議で提出された論文において、ビイ、エイグトウベドらＰ、Ｅｉｇ ｔｖｅｄ　ｅｔ　ａｌ、は、第二アルコールをエステル化する（はとんどの特異 的リパーゼと対照的に）が、しかしトリグリセリドにおけるその作用が位置特異 的であるプソイドモナスセパシア　リパーゼについて記載している。

したがって、本発明の第一の見地は、粒状形態の固定化、位置非特異的リパーゼ 製剤であって、該非特異的リパーゼがプソイドモナス　セパシアから製造されそ して／またはプソイドモナス　セパシア菌株ＤＳＭ　３９５９からの非特異的リ パーゼものと同一の免疫学的性質を有することが特徴的であるものを提供するの である。この製剤は、連続的に固定床エステル基交換で測定した場合６０℃にて １　、０００時間以上の半減期を有する。

本発明の別の見地は、リパーゼ触媒化方法における上述の固定化製剤の使用を提 供するものである。

本発明の詳細な説明 非特異的リパーゼ 本発明の実施に使用されうる非特異的リパーゼの一層は、プソイドモナス　セパ シアの株により製造されうるものでありそして／またはプソイドモナス　セパシ ア株ＤＳＭ　３９５９からの非特異的リパーゼのものと同一の免疫特性を有する ものである。免疫学的同一性は、エヌ、エイチ、アクセルセンら（Ｎ、Ｈ，Ａｘ ｅｌｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）（Ｗ）　　：　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｉｍｍ ｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｈｏｒｅｓｉｓ、　（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅ ｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ＋　１９７３）、特に第１０章および イワシ　ロイットＩｖａｎ　Ｒｏｉｔｔ　：　ＥｓｓｅｎｔｉａｌＩｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ、第５版（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃ ａｔｉｏｎｓ。

１９８４）　、特に第６章により測定される。

本発明で使用される非特異的リパーゼは、たとえば同一の微生物により２つのリ パーゼが作られるために特異的リパーゼも含んでよい。特異的リパーゼの有無は 本発明の実施に重要ではない。

本発明で使用される非特異的リパーゼは、他の重要な栄養素とともに同化性炭素 および窒素を含む普通培地であって当該技術で公知の原則にしたがって構成され ている培地中で好気性条件下にて菌株ＤＳＭ　３９５９を培養することにより作 られうる。

菌株ＤＳＭ　３９５９は、ブタペスト条約の条項下に１９８７年１月３０日付で 西ドイツ国のドイツチェ　ザムルング　ジエン　ミクロオルガニスメン（ＤＳＭ ）に寄託された。これはプソイドモナス　セパシアと同じである。

菌株はまた特異的リパーゼを作る０本明細書の例は、特異的リパーゼがかなり低 いレベルで非特異的リパーゼを作る培養を説明するが、しかし他の条件下で非特 異的リパーゼに対する特異的リパーゼの比は増加する。

本発明で使用される非特異的リパーゼはまた、日本の微工研菌寄第５４９４号の プソイドモナス　セパシア菌株から日本国出願公開第５７−６３０８７号にした がっても得られうる。前記出願で記載されたリパーゼ製剤の特異性はこれまで記 載されていないが、しかし我々は製剤が非特異的リパーゼを含むことを見出した 。

当該技術で公知の遺伝子工学技術は、本発明リパーゼを作りうる能力を他の微生 物株へ移すために使用されうる。このような株の使用もまた本発明範囲内である と考えられる。

固定化方法 本発明の実施のために、当該技術で公知のいずれかの方法、たとえばケイ、モス バッハＬｌ’１ｏｓｂａｃｈ　（Ｗ）　：　ｌ′１ｅｔｈｏｄｓ　１ｎＥｎｚｙ ＋＊ｏｌｏｇｙ＋　４４、“インモビライズド　エンザイムス”（Ａｃａ−ｄｅ ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１９７６）によりリパーゼは固定 化されうる。酵素固定化のための利用可能な方法には次のものが含まれる：細胞 ホモジネートの架橋、不溶性無機または有機担体に対する共有結合、ゲル中での 捕捉およびイオン交換樹脂または他の吸着材料における吸着。また、マクレ−ニ ー。

アール、およびハモンド　アール、シイ、　（１９８５）、　Ｂｉｏｔｅｃｈ− ｎｏｉｏｇｙ　ｉｎ６　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｖｉｅ ｗｓ、　３＋　１９３に記載されているように、粒状支持体上への塗布も使用さ れうる。

好ましい固定化方法は粒状の多孔性樹脂を使用する。リパーゼは樹脂に単純に吸 着するか、またはグルタルアルデヒドもしくは当該技術で公知の他の架橋剤で架 橋することにより樹脂に付着する。

好ましい樹脂タイプは、たとえばアクリル酸、ポリスチレンまたはフェノールタ イプの弱塩基性陰イオン交換樹脂である。市販製品の例は、レワティット　（Ｌ ｅｗａｔｉｔ）＠　Ｅ　１９９９／８５（西ドイツ、バイエル社の製品）である 。このタイプの樹脂における固定化がＥＰ　０１４０５４２号によれば好ましく 、これは参考としてここに編入される。

別の好ましい樹脂タイプはフェノール−ホルムアルデヒドタイプの吸着樹脂であ る。この樹脂における固定化はＤＫ８５７８７８にしたがって行なうのが好まし く、これは参考としてここに編入される。

別の好ましい固定化方法は無機支持体材料を使用し、そしてリパーゼは吸着また は共有結合により支持体へ付着するのが好ましい。このような支持体材料および 固定化技術は、ケイ、モスバッハ（Ｗ）　　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ ｙｍｏｌｏｇｙ＋　４Ｃ”Ｉ＋ｎ＋＋＋ｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙ＋＋＋ｅｓ ″（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　１９７６）に記載されている。

リパーゼ触媒化方法 本発明のリパーゼ触媒化方法は次のタイプのいずれかである。各々の場合、反応 タイプは括弧内に挙げるニーエステル加水分解（エステル＋水） −エステル合成（酸＋アルコール） −エステル基交換、次のものを含む二　′−アシドリシス（エステル合成酸） −アルコリシス（エステル＋アルコール）−エステル交換またはエステル置換（ エステル＋エステル） アルコールは一価または多価第一および／もしくは第二アルコールのいずれかま たはこれらの混合物である。酸はカルボン酸のいずれかまたはこれらの混合物で ある。エステルは上述のアルコールおよび酸から誘導されるエステルのいずれか 、またはこれらの混合物である０本発明の固定化リパーゼの使用は特にトリグリ セリドと有利であり、その際３つの位置をすべてにおける反応が望ましい。

プロセス温度 本発明方法における温度は６０°Ｃ以上であることが好ましく、その際はとんど の基質および興味のある生成物は液状である。

反応速度が増えるにしたがってより高い温度が一般に好ましく、そして固定化リ パーゼの物質移入および移出に対する拡散抵抗が減少する。また、カラム操作の 場合カラム全体の圧力低下を減少するためより高い温度が好ましい、一方、多く の場合基質および生成物はより高温で劣化するであろう。したがって、好ましい 範囲は６０−９０℃、より好ましくは６０−８０℃である。

エステル加水分解法 この方法の好ましい実施態様は脂肪分解およびコレステロールエステルの加水分 解である。これは、バッチ式または連続式のいずれかで行なわれる。

バッチ式反応容器において脂肪および水を固定化リパーゼの必要量とともに機械 的に混合する。回収における経済的理由のために含水量は通常４０％−／−未満 に保たれる。温度は脂肪の融点以上とすべきで、８０℃程度の高さでよい。反応 時間は酵素投与量および所望の転化率によるが、しかし数８間までである。反応 終了時、固体化リパーゼを回収しそして再使用し、これにより方法の経済性を向 上する。

連続方法において、その融点以上の脂肪を固定化リパーゼが保持された反応容器 に通す。たとえば脂肪中に水を分散させるかまたは固定化リパーゼ中に水を断続 的に吸収させる等の幾つかの方法によりこの系へ水を添加する。

エステル合成法 本発明方法は特にその他の点で製造が難しい第二アルコールのエステルの合成に 有利であり、これらは酸またはアルコールが高融点であるものを含む。

方法はバッチ式または連続式で行なわれうる。バッチ式方法において、固定化リ パーゼは回収および再使用されて経済性を向上する。好ましくは、たとえば減圧 蒸留または分子篩における吸収により反応の間に水を除去する。温度は反応混合 物が液状であるようなものとすべきであり、好ましくは６〇−９０℃、好ましく は６０−８０℃である。

アシドリシス 好ましくは反応物はトリグリセリド脂肪および脂肪酸からなる。

エステル交換 こ（Ｄ方’／Ｉｓの好ましい実施Ｂ様は脂肪のランダムなエステル基交換であり 、反応混合物はトリグリセリド脂肪からなり、そして反応はトリグリセリド分子 間のアシル基の交換により生じる。

反応混合物は１つの脂肪フラクションからなり、その際３つの異なった位置にお けるアシル基の間に交換が生じる。

反応混合物はまた２つ以上の脂肪タイプからなり、特に１つは雰囲気温度で液状 であり１つは高融点脂肪である。後者は天然供給源からの分別または水素添加に より得られうる。

このような混合物のランダム化により得られる生成物はマーガリン製造に有用で ある。

エステル交換方法の別の好ましい実施態様において、反応物はトリグリセリド脂 肪とカルボン酸エステル、特にメチルまたはエチルエステルとからなる。

有機溶媒たとえばヘキサンまたは他の炭化水素は反応混合物中に含まれる。しか しほとんどの場合溶媒に用いることなく溶融した脂肪中で方法を行なうことが可 能でありそして好ましい。

反応混合物はまた少量の水を含み酵素の活性を維持することができる。飽和まで の水分含有率を使うことができるが、しかし高い水分含有率は加水分解による副 産物形成を不所望な高い程度に導びく。

反応物の純度にしたがって、反応を実施する前に精製を行ない固定化リパーゼの 最も高い生産性を達成させることが必要である。通常の精製方法たとえば漂白土 類または活性炭を用いた処理が使用されうる。

リパーゼの優れた熱安定性のために、反応温度は８０°Ｃはどの高さである。反 応温度に対する低い方の限度は反応混合物の融点および粘度により測定される。

好ましい温度は６０〜９０°Ｃであり、最も好ましくは６０〜８０″Ｃである。

反応はバッチ式または連続式で行なわれる。

バッチ方法において、基質および都合がよければ溶媒をバッチ反応器中で混合し 、該反応器は固定化リパーゼとともに好ましい温度まで加熱されている。基質は 水で部分的にまたは完全に飽和される。酵素投与量は所望の転化率および反応時 間によって１０％までとする。反応期間は数時間〜数日までである。反応後、都 合が良ければ溶媒を洗浄してから酵素を濾去してそして再使用する。

連続方法において基質を固定化リパーゼ含有カラムに通過させる。都合が良けれ ば基質をヘキサンまたは同様の不活性溶媒中に溶かす。酵素カラムへ入れる前に 基質を水で部分的にまたは完全に飽和する。これは、水飽和樹脂を含むプレカラ ムによりまたは基質容器中で基質を飽和することにより行なわれろうる。所望の 転化率はカラムを通過する流速を調節することによりすなわち接触時間を変化さ せることにより達成されうる。

このようなシステムにおける操作時間は数千時間までとすることができる。：＆ 速を減らすことによりすなわち反応混合物の残留時間を増加させることにより活 性出現の遅い損失を補償する。代表的初期残留時間は所望の転化率によるもので あり、５分〜２時間である。

エステル基交換後、生成物をさらに処理する。たとえば遊離脂肪酸のような副産 物は常法によりたとえば苛性物を用いた精製によりその後除去される。

生成物自体は分別され、特定の用途にしたがって他の油類または類恨物と混ぜら れる。

本発明の実施態様 可溶性リパーゼの活性検定法 この方法はｐ）Ｉ−一定でのトリブチリンの加水分解に基づく。

ＩＬ直リパーゼユニット）は、乳化剤としてアラビアゴムを用いて３０°Ｃでｐ Ｈ７，０にて１分間につき滴定可能な酪酸１μｍｏｆｆを遊離する酵素の量であ る。さらに詳細には、必要により入手可能なノボ　アナリティカル　メソード（ Ｎｏｖｏ　ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＭｅｔｈｏｄ）ＡＦ　９５／　５に示されてい る。

非特異性の測定 この方法において、固定化リパーゼの位置特異性は、ココアバターステアリン（ これは主にχＯχ型のトリグリセリドからなり、その際Ｏ＝ニオレインおよびＸ ＝パルミチン酸またはステアリン酸である。）とラウリン酸のエステル基交換に より測定される。得られたトリグリセリドは脂肪酸メチルエステル（ＦＡ？’ｌ Ｅ）へ転化され、そしてこれらはガスクロマトグラフィ（ＧＬＣ）により分析さ れる。オレイン酸含量における低下は非特異性リパーゼ活性を表わし、非特異性 指数（Ｎｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ、　Ｎ５Ｉ）はオレイン酸 の低下およびラウリン酸の全混入量から計算される。Ｎ５Ｉ＝Ｏは、絶対位置特 異性を示し、そしてＮ５１＝１は完全な非特異性を示す。

より明確には、非特異性試験は次のようにして行なわれる：固定化リパーゼ（一 般に乾燥物として２５０■）は活性化に要求されるように通常水公約１０％まで 水和化される。次の混合物が使用されるニ ーココアバターステアリン３４５■（アールス　オリー社Ａａｒｈｕｓ　Ｏ］ｉ ｅ　Ａ／Ｓ、デンマークより供給され、そしてＳＯ５，ＰＯＳおよびｐｏｐ約９ ５％含有し、 トリグリセリド：Ｓ−ステアリン酸、０＝オレイン酸、Ｐ＝パルミチン酸） 一ラウリン酸（メルク社）４８０■、純度９９％。

Ｅ油［−−チル（ＢＤＨ）　ａ、　１　ｇ、沸点８０−１００″ｃ０−固定化リ パーゼ２５０■（乾燥物として）。

上記成分の混合物を、以下に定義する適当な転化率を得るのに必要な時間および 温度（４０−６０″Ｃの範囲）にて振とう水浴中でインキュベートする。次いで アルミナクロマトグラフィにより純粋なトリグリセリドを単離し、たとえばアメ リカン　オイル　ケミスッ　ソサイアティ（ＡＯＣＳ）により発表された方法Ｃ ｅ２−６６およびＣｅｌ　−６２に記載されたＦＡ？１Ｅ−ＧＬＣにより脂肪酸 組成を測定する。ラウリン酸含有率が３０−６２モル％である場合転化率が適当 であると考える。ＮＳＩは次のように計算される： （％０はオレイン酸のモル％、％Ｌａはラウリン酸のモル％である） 例１ プソイドモナス　セパシアからの非特異的リパーゼの調製プソイドモナス　セパ シア菌株ＤＳＭ　３９５９の培養物をＰＳＣ−３培地１００Ｊｄとともに５００ Ｈ１振とうフラスコへ移し、１日間３０℃にて振とうした。

ＰＣＳ−３の組成は次のようであるニ ゲルコース　　　　　　３ｇ／！ （ＮＨ４）　ｔｓＯａ　　　　　　　　１　ｇ　／　１ＮａＪＰＯａ　　　　　 　　　２．８　ｇ　／　ＩｔＫＨ２Ｐ０．　　　　　　　４．２　ｇ　／　ｆ酵 母抽出物　　　　　　３ｇ／！ １２１°Ｃで２０分間オートクレーブする。

得られたブロスを、以下の組成を有する培地３ｊ２とともに５Ｅ通常発酵器（イ ワシャ　ミニ　ジャー発酵器１ｗａｓｈｉｙａｍｉｎｉ　ｊａｒ　ｆｅｒｍｅｎ ｔｏｒ　ＡＣ−Ｄ−３）に対し種培養物として使用した：トウモロコシ浸漬液　 　　　３０ｇ／ｆグルコース　　　　　　　　６ｇ／１ Ｋ）１２Ｐ０４２　ｇ　／　ｊ！ （Ｎ）１．）！）ＩＰｏ、　　　　　　　　　３　ｇ　／　ｆＭｇＳＯａ　　・ ７８２０　　　　　　　１ｇ／ｌプルロニク（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｌ６０　１　 ｇ　／　４２ｐｌ（７，２ オートクレーブ後、種培養物３０ｄを培地に接種し、そして大豆油１．５戚／時 間および１８．６％（ＮＨ−）ｚＳＯ−４，２ｔａｉｌ／時間を連続供給しなか ら３０°Ｃにて良好に撹拌しエアレーションしながら５Ｂ間発酵した。カーボネ ートでｐ）ｌを６．３に調整した。

アミコン　ディアフロウ（Ａ＋１ｉｃｏｎ　Ｉｌｉａｆｌｏｗ）中空繊維カート リッジにより培養液を８００ｄまで濃縮した。９６％エタノール１容量を濃縮液 へ加え、混合物を４°Ｃにて６０分間撹拌し、４２００　ｇで遠心分離した。上 澄液を凍結乾燥し、粉末を水に溶かすと８０００ＬＬ］／　ｄとなツタ。

例２ プリイドモナス　セパシア　リパーゼの固定化レワティッ）Ｌｅｗａｔｉｔ　Ｅ 　１９９９／８５弱塩基性陰イオン交換樹脂（西ドイツ、バイエル社の製品）の 乾燥物質４．２５ｇをｐ）１７に調節しそして例１のリパーゼ溶液１２．５ｄと 混合した。室温で４時間回転後、製剤を濾過し、水で洗い、減圧下に乾燥した。

濾液中の残留活性はリパーゼ活性９５％の除去に担当する４５００ＬＵであり、 固定化リパーゼ乾燥物質１ｇ当り２Ｂ、０ＯＯＬＵの荷重であった。

非−特異的指数は本明細書中に記載のように測定される。

以下の表において、脂肪酸組成は６０℃にて６０分間反応に続いてモル−％で与 えられる： リパーゼ製剤が非特異的であることがわかる。

固定化製剤の活性を測定するために、乾燥物製剤２５０■を１０％曽／−まで水 和化し、トリオレイン６００■を加え、次いでパルミチン酸１７４■を含む石油 エーテル１２ｄを加え、混合物を４０°Ｃにて１２分間インキエベートし、混入 されたパルミチン酸（％−／−）を測定した。この数字から、次のようにパルミ チン酸混入の初期割合として活性を計算した：混入されたパルミチン酸：　２２ ．０モル％活性：　　　　　　　１２０　ｐ　ｍｏ　ｉ、　ｅ／ｓｉｎ／　ｇ固 定化製剤の熱安定性を測定するために、活性測定を幾り返すが、しかしトリオレ イン添加後混合物を７０°Ｃにて２４時間インキュベートした。結果は次のよう である：混入されたパルミチン酸：　１８．６モルー％残留活性＝　　　　　　 　　７７．２μｍｏｆｅ／分／ｇ製剤は７０℃にて２４時間後その活性の６４％ を保持していることがわかる。

例３ 脂肪のランダム化 プソイドモナス　セパシア固定化非特異的リパーゼのトリグリセリドをランダム 化しうる（すなわち、トリグリセリドにおけるランダムな位置へ脂肪酸を結びつ ける）能力を、化学的方法を用いて固定化された１、３位置特異的リパーゼによ るエステル基交換と比較した。ココアバターステアリン（ＣＢＳ）　（パルミチ ン酸２７．２モル−％、ステアリン酸３９．６モルー％、オレイン酸３１．３モ ル−％、リルン酸０．９モル−％およびアラキドン酸１．１モル−％）を、これ がトリグリセリドの２位に集中した不飽和脂肪酸（オレイン酸およびリルン酸） を有するために試験物質として使用した。

化学的ランダム化は次ようにして行なった二回転蒸発器により減圧下に３０分間 ９５°ＣにてＣＢＳ　３．０　ｇを乾燥した。メトキシル化ナトリウム（ＮａＯ ＣＨｓ）３０■添加前に、温度を８５℃まで下げ大気圧下にて減圧を窒素に置き 換えた。回転下に反応をめ６０°Ｃにて脱イオン水５ＩＩｉで３回洗った。回転 蒸発器中で１時間９５°Ｃにてサンプルを乾燥させ、その後分析した。

固定化プソイドモナス　セパシア　リパーゼ（例２と同様にして作るが、しかし リパーゼ荷重３２．０００ＬＵ／　ｇ樹脂を有する）、およびリポザイムＬｉｐ ｏｚｙｓｅ”　１Ｍ２０（ノボ　インダストリイ社の製品）　、ＥＰ　０１４０ ５４２号により調製されたムコールミニヘイＭｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉからの固 定化位置特異的リパーゼを用いて酵素エステル基交換を行なった。両方とも次の 方法による：乾燥重量２５０■の固定化リパーゼを１０％まで水和化し、ＣＢ５ １．７ｇを加えた。混合物を７０″Ｃ水浴に置きそして１時間振とうした。酵素 を濾去することにより反応を停止した。

トリグリセリドの２位における脂肪酸組成を次のように分析した：ＣＢＳまたは エステル基交換したＣＢＳ　１００■、膵臓リパーゼ溶液３ｄ（ＬＭ）リス緩衝 液ｐＨ８１０ｄ中に溶解したシグマ触媒ＮαＬ３１２６からの豚膵臓リパーゼ等 級■２５０■）、２　ＭＣａＣｌ　ｚ　３００ｍ　、および０．２％１１／ｖタ ウロコレート０．７５−を混合した。エマルジョンを２分間４０°Ｃにて水浴中 で加熱後９６％エタノール４−を添加して反応を停止した。サンプルを分液ロー トへ移し、ジエチルエーテル４Ｘ２Ｍで抽出した。

脱イオン水２０１ｄで４回エーテル層を洗浄し、その後Ｎａ、ＳＯ，フィルター により乾燥しそして蒸発した。サンプルを１，１゜１−トリクロロエタン１−に 再溶解した。グリセリドは、展開溶媒としてジエチルエーテル−ｎ−ヘキサン７ ０　：　３０で凹所飽和展開タンクにてメルク社からのプレコートされたＴＬＣ プレートシリカゲル６０中で調製用Ｔ　Ｌ　Ｃ（１１０°Ｃにて３０分間活性化 ）により分離された。ＴＬＣは２０°Ｃにて４０分間作動した。

モノグリセリドバンドはヨウ素蒸気により同定化され、切り取られそしてジエチ ルエーテル１０戚で３回抽出した。エーテル層を濾過し、蒸発しそしてサンプル をメチル化しそしてＧＬＣ中で分析した（ノボ　インダストリイから入手可能な ＡＦ　２０６／２に記載された方法）。

結果は以下のように表わされる： ２位の脂肪酸組成 飽和脂肪酸：バルミチン酸、ステアリン酸およびアシラキドン酸 不飽和脂肪酸；オレイン酸およびリルイン酸プソイドモナス　セパシア　エステ ル基交換は、２位に対するその活性のために、脂肪酸のランダムな分布に近づい ていることが示される。１．３位置特異的リポザイム９１？Ｉ２０エステル基交 換はこれが２位に大部分非付着であるため非常に異なった組成を与える。

例４ 連続エステル基交換 例２の固定化リパーゼ４．５ｇを、内径１．５　ｃｍの水ジヤケツトカラムへ充 てんした。

循環温水、すなわち６０°Ｃを用いてカラムを加熱した。水飽和樹脂（デュオラ イトｅＥｓ５６１）を含むプレカラムを酵素カラムの前に置きそしてこれもまた ６０°Ｃまで加熱した。過酸化物価３未満の７１％高分散漂白および脱イオン化 大豆油および２９％分析用ラウリン酸とからなる基質をポンプによりカラムに通 す。酵素カラムからの出口で分析用のためサンプルを採取し、そしてＧＬＣによ りラウリン酸混入量を測定した。ラウリン酸１４％−／Ｗ混入を試み、そして前 記値における転化を保つために流速を調節した。プレカラムを乾燥するときはい つでもこれを新しいものと代えた。

補正書の翻訳文揚出書 （特許法第１８４条の８） 平成２年１月ユ１日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＤＫ８８１００１２５ ２　発明の名称 固定化リパーゼ、その製造および使用（新名称）３　特許出願人 住　所　デンマーク国、デーコー−２８８０バグスバエルト。

ノボ　アレ（番地なし） 名　称　ノボ−ノルディスク　アクティーゼルスカブ補正書の翻訳文　　　　　 　　　　　　　　　　　　　１通明　　　細　　　書 固定化リパーゼ、その製造および使用 定義 本明細書中アンダーラインした言葉が表われる場合には次の定義が通用される。

−１で上＝忙は、たとえば水層とを機層の間の界面において水不溶性カルボン酸 エステルのエステル結合に関連する反応（たとえばエステル結合の加水分解、合 成および交換）を触媒化する酸素を意味するものである。

リパーゼは可溶性、誘導体化または固定化形である。ｉｆ上ユハニ亙は、“ガイ ドラインズ　フォア　ザ　キャラクタリゼイション　オブ　インモビライズド　 バイオキャタリスツ　　Ｇｕｉｄｅｉｉｎｅｓ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　　ｃｈａ ｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｂｉｏｃａｔ ａｌｙｓｔｓ’　（１９８３Ｌ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈｎｏｌ 、＋　”４．３０４−３０７で定義されたように固定化酵素または固定化細胞の 形の’）ハーセ’；：意味する。延星生ユバユニはこれを固定化することなく化 学的に変性されたリパーゼを意味する。二車ユユバニ亙は非変性リパーゼを意味 する。

リパーゼはその位置特異性にしたがって分けられる。本明細書で使用されるよう に、−・リパーゼ（または略して１且煎ユパニ亙）はトリグリセリド分子の１位 または３位における脂肪アシル基とのみ反応するものであり、ＩＥ−非巷選皇日 二針ユ１（または略して吏上」■Ｌｂ士二ｆ）はトリグリセリドの３つの脂肪ア シル基すべてと反応するものである。

非特異的リパーゼ活性は、たとえば純粋脂肪酸と純粋なトリオレインまたはココ アバターステアリンとの反応により、中間位置における反応速度を測定すること により、トリグリセリドとのエステル基交換反応において測定される。

１パーゼ　　　　“は、エステル加水分解、ニス与ル合成およびエステル基交換 である。関係するエステルはトリグリセリドまたは他のカルボン酸エステルであ る。

バイリーのインダストリアル　オイル　アンド　ファントプロダクツ（Ｂａｉｌ ｅｙ’ｓ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｏｉｌ　ａｎｄ　Ｆａｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ）。

Ｖｏｌ、２　ｐ１２７，４版（ディ　スウエルン　Ｄ、ＳｗｅｒｎＥ）によれば 、エステル基交換は脂肪または他のカルボン酸エステルが脂肪酸基の交換を伴な ってカルボン酸、アルコールまたは他のエステルと反応を起こし新しいエステル を作る反応に関する。

したがってエステルと酸との反応はヱ２ヱユ之λと言われ、エステルとアルコー ルとの反応はアルコリシスと言われ、そして１つのエステルと他の別のエステル との反応は孟λ±酉ｎまたは１三２」上次１０灸と言われる。

脂　の−ン°ムエステル　六　はトリグリセリドにおける３つのアシル基すべて が反応しその際３つの位置すべてにおいて脂肪酸のほとんどランダムな分布が得 られるエステル基交換反応に関する。これは化学的触媒または非特異的リパーゼ の使用により達成される。

技術分野 本発明は、固定化、位置非特異的リパーゼ製剤を使用し反応物としてトリグリセ リド脂肪を用いたリパーゼ触媒化方法、すなわちリパーゼがトリグリセリドの３ つのアシル基すべてと反応する方法に関する。

特に、脂肪のランダムエステル基交換および脂肪加水分解方法、特に約６０°Ｃ 以上の方法に関する。

本発明はまた上記方法における使用のための粒状形態の固定化、非特異的リパー ゼ製剤に関する。

従来技術 脂肪のランダムエステル基交換のための固定化非特異的リパーゼの使用は、マク レ−ニー、アール、（Ｍａｃｒａｅ　Ａ、Ｒ，）（１９８３）、　Ｊｏｕｒｎａ ｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａ＋ｎｅｒｉｃａｎ　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’　５ｏｃ ｉｅｔｙ（ＪＡＯＣＳ）、　６０．２９１に記載されている。しかしながら、方 法温度は４０℃だけであった。

ガンシダ　シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）がらの 固定化非特異的リパーゼはまた、ワイ、キムラら（Ｙ、Ｘｉｍｕｒａ６ｔ　ａｌ 、）によるＥｕｒ、ＪＪｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、］７　（１ ９８３）。

１０７−１１２に記載されている。この論文におけるデータは固定化リパーゼが 最適温度約４０°Ｃを有し、５０°Ｃでかなり失活することが示されている。

多くの非特異的微生物性リパーゼは可溶形態で公知であり、熱安定性データは次 のようなものに公開されている：黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ｓ　ａｕｒｅｕｓ）（バプラ、ディ、ブイ。

Ｖａｄｅｈｒａ　Ｄ、Ｖ、（１９７４）、Ｌｉｐｉｄｓ、　９．１５８）、ペニ シリウム　シクロビウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）（オ クムラ、ニス、らＯｋｕｍｕｒａ＋Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、（１９７６）、Ａｇｒ ｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

４０、６５５およびレンシアウ　ィ、シイ、　Ｒｅｎｓｈａｗ　Ｅ、Ｃ，および サン　クエメント　シイ、エル、　Ｓａｎ　Ｃ］ｅ＋ｎｅｎｔｅ　Ｃ，Ｌ、（１ ９６６）フグ。シイ、ニス、　Ｈａｓｓｉｎｇ、Ｇ、Ｓ、（１９７１）、　Ｂｉ ｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、　２４２＋　３８１ およびパブ口　ジ４　、　Ｐａｂｌｏ　Ｇ。

（１９７４）　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　 ＤｅｒＩＩＩａｔｏｌｏｇｙ、　６３＋２３１）、プロピオニバクテリウム　ア クネス（Ｐｒｏｐ　ｉｏｎ　１ｂａｃ　ｔｅｒ　ｉｕｍａｃｎｅｓ）　（インハ ム、イー、らＴｎｇｈａｍ、　Ｅ、ｅｔ　ａｌ、（１９８１）。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　１２Ｃ ３９３Ｌ　カンジダシリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ ）（カンジダ　ルゴサＣ０ｒｕｇｏｓａとしても知られている）（ベンゾナナ、 シイ、　Ｂｅｎｚｏｎａｎａ。

Ｇ、およびエスポシト、ニス、　Ｅｓｐｏｓｉｔｏ、　Ｓ、（１９７１）、　Ｂ ｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、　２３Ｌ　１５　 ；およびキムテ　ヮイ、　ＸｉｍｕｒａＹ、（１９８３）　Ｅｕｒ、Ｊ、Ａｐｐ ｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、　１’Ｌ　１０７）ゲオト リカム　カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ）（ジエンセン アール、シイ、　Ｊｅｎｓｅｎ　Ｒ，Ｇ、（１９７４）Ｌｉｐｉｄｓ、　９．１ ４９　；ジエンセン　アール、シイ、ら（１９７２）Ｌｉｐｉｄｓ、　７．７３ ８　；およびツジサカ　ワイ、　Ｔｓｕｊｉｓａｋａ　Ｙ、およびイヮイ　エム 、　Ｉｗａｉ　Ｍ。

（１９８４）　Ｋａｇａｋｕ　ｔｏ　ｋｏｚｙｏ、　５８．６０）　、しがしな がら、文献におけるデータはこれらのリパーゼすべてが固定化形態で約６゜°Ｃ 以上での長期間使用に対し熱安定性が不十分であることを示している。

このように、先行技術製剤は約４０℃またはそれ以下で使用されうるだけである 。他方、たとえばマーガリン工業における脂肪のランダム化のために、溶媒なし で約６０″Ｃまたはそれ以上で高融点基質を加工するための熱安定性、固定化、 非特異的リパーゼに対する必要性がある。ニー、アール、マクレ−（Ａ、Ｒ，Ｍ ａｃｒａｅ）およびアール、シイ、ハモンド（Ｒ，Ｃ，ｔｌａ＋＋＋ｍｏｎｄ） 　：”Ｐｒｅｓｅｎｔ　ａｎｄ　Ｆｕｔｕｒｅ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ 　Ｌｉｐａｓｅｓ”　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ）ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅ ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、　３．１９：Ｌ　２１７（１９８５） ”が参考になる。

したがって、本発明の目的は、６０°Ｃ以上での長期間使用に対し十分な熱安定 性である固定化、非特異的リパーゼを提供するものである。リパーゼはこれらを 経済的に製造しうるため微生物によるものであるべきである。

熱安定固定化特異的リパーゼは公知である。たとえば、ヨーロッパ特許公開ＥＰ 　０１４０５４２号（ノボ　インダストリイ）には７０°Ｃでのエステル基交換 のためのこの生成物の使用が記載されている。しかし特異的リパーゼは本発明の 目的を満足するものではない。

本発明の説明 驚くべきことに、位置非特異的リパーゼがプソイドモナスセパシア（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ）から得られることが見出された。そしてまた驚 くべきことに、この固定形のリパーゼが６０°Ｃでの長期使用に十分な熱安定性 であり、したがって従来より公知の固定化非特異的リパーゼより一層熱安定性で あることが見出された。固定化リパーゼは特に６０〜８０°Ｃ程の高温での脂肪 のランダム化に適する。はとんどの脂肪はこのような温度で液状であり、そして 溶媒の不存在下でランダム化されうる。

したがって、本発明の第一の見地は、固定化、位置非特異的リパーゼ製剤を用い て反応物としてのトリグリセリド脂肪を使用したリパーゼ触媒化方法であって、 該リパーゼがプソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の菌株の培養により製 造可能であり、そして／またはプソイドモナス　セパシア菌株はＤＳＭ３９５９ から由来される非特異的リパーゼのものと同一の免疫特性を有するものである方 法を提供するものである０本発明の別の見地は上記方法に使用される粒状形態の 固定化非特異的リパーゼ製剤であって、該リパーゼがプソイドモナスの菌株の培 養により製造されうるものであり、そして／またはプソイドモナス　セパシア菌 株ＤＳＭ　３９５９から由来される非特異的リパーゼのものと同一の免疫特性を 有することが特徴的であるものを提供するものである。

プソイドモナス　セパシアＦＥＲ１’ｌ　５４９４の培養から得られる耐熱性リ パーゼはこれまでに記載されている（ＪＰ−Ａ　５７−６３０８７）。

前記出願に記載されたリパーゼ製剤の特異性はこれまで記載されていなかったが 、しかし、我々はこの製剤が非特異的リパーゼを含むことを見出した。

プソイドモナス　セパシアおよび他のプソイドモナス種からの他のリパーゼは公 知であるが、しかしこれらのうちでトリグリセリドに対して位置非特異的である ことが知られているものはない。１９８６年５月１７日のホノルルにおけるＡＯ Ｃ５／ＪＯＣ５会議で提出された論文において、ビイ、エイグトウベドらＰ、　 Ｅｉｇｔｖｅｄ　ｅｔ　ａｌ、は、第二アルコールをエステル化する（はとんど の特異的リパーゼと対照的に）が、しかしトリグリセリドにおけるその作用が位 置特異的であるプソイドモナス　セパシア　リパーゼについて記載している。

本発明の詳細な説明 非特異的リパーゼ 本発明の実施に使用されうる非特異的リパーゼの一層は、プソイドモナス　セパ シアの株により製造されうるものでありそして／またはプソイドモナス　セパシ ア株ＤＳＭ　３９５９からの非特異的リパーゼのものと同一の免疫特性を有する ものである。免疫学的同一性は、エヌ、エイチ、アクセルセンら（Ｎ、Ｈ，Ａｘ ｅｌｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）（ｍ）　　：　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｉｍ＋ ｎｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｂｏｒｅｓｉｓ、　（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　１９７３）＋特に第１０章およ びイワン　ロイントＩｖａｎ　Ｒｏｉｔｔ　：　ＥｓｓｅｎｔｉａｌＩｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ、第５版（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉ ｃａｔｉｏｎｓ。

１９８４）　、特に第６章により測定される。

本発明で使用される非特異的リパーゼは、たとえば同一の微生物により２つのリ パーゼが作られるために特異的リパーゼも含んでよい。特異的リパーゼの有無は 本発明の実施に重要ではない。

本発明で使用される非特異的リパーゼは、他の重要な栄養素とともに同化性炭素 および窒素を含む普通培地であって当該技術で公知の原則にしたがって構成され ている培地中で好気性条件下にて菌株ＤＳＭ　３９５９を培養することにより作 られうる。

菌株ＤＳＭ　３９５９は、ブタベスト条約の条項下に１９８７年１月３０日付で 西ドイツ国のドイツチェ　ザムルング　フォノ　ミクロオルガニスメン（ＤＳＭ ）に寄託された。これはプソイドモナス　セパシアと同じである。

菌株はまた特異的リパーゼを作る。本明細書の例は、特異的リパーゼがかなり低 いレベルで非特異的リパーゼを作る培養を説明するが、しかし他の条件下で非特 異的リパーゼに対する特異的リパーゼの比は増加する。

本発明で使用される非特異的リパーゼはまた、日本の微工研菌寄第５４９４号の プソイドモナス　セパシア菌株から日本国出願公開第５７−６３０８７号にした がっても得られうる。

当該技術で公知の遺伝子工学技術は、本発明リパーゼを作りうる能力を他の微生 物株へ移すために使用されうる。このような株の使用もまた本発明範囲内である と考えられる。

固定化方法 本発明の実施のために、当該技術で公知のいずれかの方法、たとえばケイ、モス バｙ　ハに、Ｍｏ５ｂａｃｈ　（Ｗ）　　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＥｎｚｙ＋ ｎｏｌｏｇｙ、　４４、′インモビライズド　エンザイムス”（＾ｃａ−ｄｅｍ ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７６）によりリパーゼは固定化 されうる。酵素固定化のための利用可能な方法には次のものが含まれる：細胞ホ モジネートの架橋、不溶性無機または有機担体に対する共有結合、ゲル中での捕 捉およびイオン交換樹脂または他の吸着材料における吸着。また、マクレ−ニー 。

アール、およびハモンド　アール、シイ、　（１９８５）、　Ｂｉｏｔｅｃｈ− ｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｖｉｅ ｗｓ、　３＋　１９３に記載されているように、粒状支持体上への塗布も使用さ れうる。

好ましい固定化方法は粒状のマクロポーラス（多孔性）樹脂を使用する。リパー ゼは樹脂に単純に吸着するか、またはグルタルアルデヒドもしくは当該技術で公 知の他の架橋剤で架橋することにより樹脂に付着する。

好ましい樹脂タイプは、たとえばアクリル酸、ポリスチレンまたはフェノールタ イプの弱塩基性陰イオン交換樹脂である。市販製品の例は、レワティット　（Ｌ ｅｈａｔｉｔ）　＠　Ｅ　１９９９／　８５（西ドイツ、バイエル社の製品）で ある。このタイプの樹脂における固定化がＥＰ　０１４０５４２号によれば好ま しく、これは参考としてここに編入される。

別の好ましい樹脂タイプはフェノール−ホルムアルデヒドタイプの吸着樹脂であ る。この樹脂における固定化はＤＸ８５／８７８にしたがって行なうのが好まし く、これは参考としてここに編入される。

別の好ましい固定化方法は無機支持体材料を使用し、そしてリパーゼは吸着また は共有結合により支持体へ付着するのが好ましい。このような支持体材料および 固定化技術は、ケイ、モスバー）ハ（ｄ）　　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ＋　４＋Ｌ″２ｍｍｏｏｉｉｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙ＋ｎｅｓ”　 （Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　１９７６）に記載されている。

リパーゼ触媒化方法 本発明方法は反応物としてトリグリセリド脂肪を有しそしてトリグリセリドの３ つのアシル基すべてと反応する非特異的リパーゼにより触媒化されるものである 。

方法は脂肪のエステル基交換または脂肪加水分解である。

本発明方法における温度は６０°Ｃ以上であることが好ましく、その際はとんど の基質および興味のある生成物は液状である。

反応速度が増えるにしたがってより高い温度が一般に好ましく、そして固定化リ パーゼの物質移入および移出に対する拡散抵抗が減少する。また、カラム操作の 場合カラム全体の圧力低下を減少するためより高い温度が好ましい。一方、多く の場合基質および生成物はより高温で劣化するであろう。したがって、好ましい 範囲は６０−９０″Ｃ１より好ましくは６０−８０°Ｃである。

脂肪加水分解 脂肪分解（脂肪加水分解）がバッチ式または連続式のいずれかで行なわれる。

バッチ弐反応容器において脂肪および水を固定化リパーゼの必要量とともに機械 的に混合する。回収における経済的理由のために含水量は通常４０％−７−未満 に保たれる。温度は脂肪の融点以上とすべきで、８０°Ｃ程度の高さでよい。反 応時間は酵素投与量および所望の転化率によるが、しかし数日間までである。反 応終了時、固体化リパーゼを回収しそして再使用し、これにより方法の経済性を 向上する。

連続方法において、その融点以上の脂肪を固定化リパーゼが保持された反応容器 に通す。たとえば脂肪中に水を分散させるかまたは固定化リパーゼ中に水を断続 的に吸収させる等の幾つかの方法によりこの系へ水を添加する。

ランダムエステル基交換 本発明のランダムエステル基交換はアシドリシスであり、その際反応物はトリグ リセリド脂肪と脂肪酸である。

これに代わり、ランダムエステル基交換はエステル交換法でもよく、特に反応混 合物はトリグリセリド脂肪からなり、そして反応はトリグリセリド分子間のアシ ル基の交換により生じるものである。反応混合物は１つの脂肪フラクションから なり、その際３つの異なった位置におけるアシル基の間に交換が生じる。反応混 合物はまた２つ以上の脂肪タイプからなり、特に１つは雰囲気温度で液状であり １つは高融点脂肪である。後者は天然供給源からの分別または水素添加により得 られうる。このような混合物のランダム化により得られる生成物はマーガリン製 造に有用である。

エステル交換方法の別の好ましい実施Ｂ様において、反応物はトリグリセリド脂 肪とカルボン酸エステル、特にメチルまたはエチルエステルとからなる。

本発明のエステル基交換法において、有機溶媒たとえばヘキサンまたは他の炭化 水素は反応混合物中に含まれる。しかしほとんどの場合溶媒を用いることなく溶 融した脂肪中で方法を行なうことが可能でありそして好ましい。

反応混合物はまた少量の水を含み酵素の活性を維持することができる。飽和まで の水分含有率を使うことができるが、しかし高い水分含有率は加水分解による副 産物形成を不所望な高い程度に導びく。

反応物の純度にしたがって、反応を実施する前に精製を行ない固定化リパーゼの 最も高い生産性を達成させることが必要である。通常の精製方法たとえば漂白土 類または活性炭を用いた処理が使用されうる。

リパーゼの優れた熱安定性のために、反応温度は８０°Ｃはどの高さである。反 応温度に対する低い方の限度は反応混合物の融点および粘度により測定される。

好ましい温度は６０〜９０°Ｃであり、最も好ましくは６０〜８０°Ｃである。

反応はバンチ式または連続式で行なわれる。

バッチ方法において、基質および都合がよければ溶媒をバッチ反応器中で混合し 、該反応器は固定化リパーゼとともに好ましい温度まで加熱されている。基質は 水で部分的にまたは完全に飽和される。酵素投与量は所望の転化率および反応時 間によって１０％までとする。反応期間は数時間〜数日までである。反応後、都 合が良ければ溶媒を洗浄してから酵素を濾去してそして再使用する。

連続方法において基質を固定化リパーゼ含有カラムに通過させる。都合が良けれ ば基質をヘキサンまたは同様の不活性溶媒中に溶かす。酵素カラムへ入れる前に 基質を水で部分的にまたは完全に飽和する。これは、水飽和樹脂を含むプレカラ ムによりまたは基質容器中で基質を飽和することにより行なわれろうる。所望の 転化率はカラムを通過する流速を調節することによりすなわち接触時間を変化さ せることにより達成されうる。

このようなシステムにおける操作時間は数千時間までとすることができる。流速 を減らすことによりすなわち反応混合物の残留時間を増加させることにより活性 出現の遅い損失を補償する。代表的初期残留時間は所望の転化率によるものであ り、５分〜２時間である。

エステル基交換後、生成物をさらに処理する。たとえば遊離脂肪酸のような副産 物は常法によりたとえば苛性物を用いた精製によりその後除去される。

生成物自体は分別され、特定の用途にしたがって他の油類または類イ以物と混ぜ られる。

本発明の実施態様 可溶性リパーゼの活性検定法 この方法はｐ）ｌ−一定でのトリブチリンの加水分解に基づ（。

ＩＬＬＩ（リパーゼユニット）は、乳化剤としてアラビアゴムを用いて３０°Ｃ でｐＨ７，０にて１分間につき滴定可能な酪酸１μｍｏｉ！を遊離する酵素の量 である。さらに詳細には、必要により入手可能なノボ　アナリティカル　メソー ド（Ｎｏνｏ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ？Ｉｅｔｈｏｄ）ＡＦ　９５／　５に示さ れている。

非特異性の測定 この方法において、固定１ヒリバーゼの位置特異性は、ココアバターステアリン （これは主にＸＯＸ型のトリグリセリドからなり、その［０＝オレイン酸および Ｘ＝バルミチン酸またはステアリン酸である。）とラウリン酸のエステル蟇交換 により測定される。得られたトリグリセリドは脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ ）へ転化され、そしてこれらはガスクロマトグラフィ（ＧＬＣ）により分析され る。オレイン酸含量における低下は非特異性リパーゼ活性を表わし、非特異性指 数（Ｎｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ、　Ｎ５Ｉ）はオレイン酸の 低下およびラウリン酸の全混入量から計算される。Ｎ５Ｉ＝Ｏは、絶対位置特異 性を示し、そしてＮ５Ｉ＝１は完全な非特異性を示す。

より明確には、非特異性試験は次のようにして行なわれる：固定化リパーゼ（一 般に乾燥物として２５０■）は活性化に要求されるように通常水公約１０％まで 水和化される。次の混合物が使用されるニ ーココアバターステアリン３４５■（アールス　オリー社Ａａｒｈｕｓ　０１ｉ ｅ　Ａ／Ｓ、デンマークより供給され、そしてＳＯＳ、　ＰＯＳおよびＰＯＰ約 ９５％を含有し、 トリグリセリド：Ｓ＝ニステアリン、０−オレイン酸、Ｐ＝パルミチン酸） 一ラウリン酸（メルク社）４８０■、純度９９％。

−石油エーテル（ＢＤＨ）　８．１　ｇ、沸点８０−１００°Ｃ０−固定化リパ ーゼ２５０■（乾燥物として）。

上記成分の混合物を、以下に定義する適当な転化率を得るのに必要な時間および 温度（４０−６０°Ｃの範囲）にて振とう水浴中でインキュベートする。次いで アルミナクロマトグラフィにより純粋なトリグリセリドを単離し、たとえばアメ リカン　オイル　ケミスツ　ソサイアティ（ＡＯＣ５）により発表された方法Ｃ ｅ２−６６＄よびＣｅ１−６２に記載されたＦＡＭＥ　　ＧＬＣにより脂肪酸組 成を測定する。ラウリン酸含有率が３０−６２モル％である場合転化率が適当で あると考える。ＮＳＩは次のように計算される： （％０はオレイン酸のモル％、％Ｌａ　はラウリン酸のモル％である） 例１ プソイドモナス　セパシアからの非特異的リパーゼの調製プソイドモナス　セパ シア菌株ＤＳ？１３９５９の培養物をＰＳＣ−３培地１００ｄとともに５０〇− 振とうフラスコへ移し、１日間３０°Ｃにて振とうした。

ＰＣＳ−３の組成は次のようであるニ ゲルコース　　　　　　　３ｇ／！ （ＮＨ４）２ＳＯ−１ｇ　／　’ ＮａＪＰＯａ　　　　　　　　２．８　ｇ　／　１−ＫＨ２ＰＯ，４，２ｇ　／ 　ｆ 酵母抽出物　　　　　　３ｇ／！ １２１°Ｃで２０分間オートクレーブする。

得られたブロスを、以下の組成を有する培地３！とともに５２通常発酵器（イワ シャ　ミニ　ジャー発酵器１ｗａｓｈｉｙａｍｉｎｉ　ｊａｒ　ｆｅｒｍｅｎｔ ｏｒ　ＡＣ−Ｄ−３）に対し種培養物として使用した：トウモロコシ浸漬液　　 　　３０　ｇ　／　ｆプルロニク（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｌ６０　　１　ｇ　／　 １ｐ）Ｉ　　　　　　　　　　　　　７．２オートクレーブ後、種培養物３０１ ｄを培地に接種し、そして大豆油１．５滅／時間および１８．６％（ＮＨ４）２ ＳＯ−４，２１ｄ１時間を連続供給しながら３０°Ｃにて良好に撹拌しエアレー ションしながら５日間発酵した。カーボネートでｐｎを６．３に調整した。

アミコン　ディアフロウ（Ａｍｉｃｏｎ　Ｄｉａｆｌｏｗ）中空繊維カートリッ ジにより培養液を８００雄まで濃縮した。９６％エタノール１容量を濃縮液へ加 え、混合物を４　”Ｃにて６０分間撹拌し、４２００　ｇで遠心分離した。上澄 液を凍結乾燥し、粉末を水に溶かすと８０００Ｌｔｌ／雄となった。

例２ プリイドモナス　セパシア　リパーゼの固定化レワティ７　）Ｌｅｗａｔｉｔ　 Ｅ　１９９９／８５弱塩基性陰イオン交換樹脂（西ドイツ、バイエル社の製品） の乾燥物質４．２５ｇをｐＨ７にｇｌｌｉ３節しそして例１のリパーゼ溶液１２ ．５−と混合した。室温で４時間回転後、製剤を濾過し、水で洗い、減圧下に乾 燥した。濾液中の残留活性はリパーゼ活性９５％の除去に担当する４５００ＬＬ ｌテあり、固定化リパーゼ乾燥物質１ｇ当り２Ｂ、０ＯＯＬＨノ荷重であった。

非−特異的指数は本明細書中に記載のように測定される。

以下の表において、脂肪酸組成は６０°Ｃにて６０分間反応に続いてモル−％で 与えられる： 固定化製剤の活性を測定するために、乾燥物製剤２５０■を１０％賀／−まで水 和化し、トリオレイン６００■を加え、次いでパルミチン酸１７４■を含む石油 エーテル１２ｍＡを加え、混合物を４０°Ｃにて１２分間インキュベートし、混 入されたパルミチン酸（％−／−）を測定した。この数字から、次のようにパル ミチン酸混入の初期割合として活性を計算した：混入されたパルミチン酸：　２ ２．０モル％活性：　　　　　　　１２０μｍｏｆｅ／ｎ＋ｉｎ／　ｇ固定化製 剤の熱安定性を測定するために、活性測定を幾り返すが、しかしトリオレイン添 加後混合物を７０°Ｃにて２４時間インキュベートした。結果は次のようである ：混入されたパルミチン酸：　１８．６モルー％残留活性：　　　　　　　　７ ７．２μｍｏｊ！ｅ／分／ｇ製剤は７０°Ｃにて２４時間後その活性の６４％を 保持していることがわかる。

例３ 脂肪のランダム化 プソイドモナス　セパシア固定化非特異的リパーゼのトリグリセリドをランダム 化しうる（すなわち、トリグリセリドにおけるランダムな位置へ脂肪酸を結びつ ける）能力を、化学的方法を用いて固定化された１、３位置特異的リパーゼによ るエステル基交換と比較した。ココアバターステアリン（ＣＢＳ）　（パルミチ ン酸２７．２モル−％、ステアリン酸３９．６モルー％、オレイン酸３１．３モ ル−％、リルン酸０．９モル−％およびアラキドン酸１．１モル−％）を、これ がトリグリセリドの２位に集中した不飽和脂肪酸（オレイン酸およびリルン酸） を有するために試験物質として使用した。

化学的ランダム化は次ようにして行なった：回転蒸発器により減圧下に３０分間 ９５°ＣにてＣＢ５３．０ｇを乾燥した。メトキシル化ナトリウム（ＮａＯＣＨ ｚ）３０■添加前に、温度を８５℃まで下げ大気圧下にて減圧を窒素に置き換え た０回転下に反応をめ６０°Ｃにて脱イオン水５１ｄｌで３回洗った。回転蒸発 器中で１時間９５°Ｃにてサンプルを乾燥させ、その後分析した。

固定化プソイドモナス　セパシア　リパーゼ（例２と同様にして作るが、しかし リパーゼ荷重３２．０ＯＯＬＵ／　ｇ樹脂を有する）、およびリポザイムＬｉｐ ｏｚｙｍｅ″ｒ”　１Ｍ２０（ノボ　インダストリイ社の製品）　、ＥＰ　０１ ４０５４２号により調製されたムコールミニヘイＭｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉから の固定化位置特異的リパーゼを用いて酵素エステル基交換を行なった。両方とも 次の方法による：乾燥重量２５０ｍｇの固定化リパーゼを１０％まで水和化し、 ＣＢ５１．７ｇを加えた。混合物を７０°Ｃ水浴に置きそして１時間振とうした 。酵素を濾去することにより反応を停止した。

トリグリセリドの２位における脂肪酸組成を次のように分析した：　ＣＢＳまた はエステル基交換したＣＢＳ　１００■、ｗｇ臓リパーゼ溶液３ｄ（ＩＭ）リス 緩衝液ｐＨ８１０ａｌｉ中に溶解したシグマ触媒Ｎ１１Ｌ３１２６からの豚膵臓 リパーゼ等級１１２５０■）、２　ＭＣａＣｌ　ｚ　３００Ｊ１１、および０． ２％−／シタクロロレート０．７５ｗ１を混合した。エマルジョンを２分間４０ ″Ｃにて水浴中で加熱し９６％エタノール４−を添加して反応を停止した。サン プルを分液ロートへ移し、ジエチルエーテル４Ｘ２０ｄで抽出した。

脱イオン水２０ｄで４回エーテル層を洗浄し、その後Ｎａ２５Ｏａフイルターに より乾燥しそして蒸発した。サンプルを１．１゜１−トリクロロエタン１−に再 溶解した。グリセリドは、展開溶媒としてジエチルエーテル−ｎ−ヘキサン（７ ０：３０）　Ｔ：凹所飽和展開タンクにてメルク社からのプレコートされたＴＬ Ｃプレートシリカゲル６０中で調製用Ｔ　Ｌ　Ｃ（１１０″Ｃにて３０分間活性 化）により分離された。ＴＬＣは２０″Ｃにて４０分間作動した。

モノグリセリドバンドはヨウ素蒸気により同定化され、切り取られそしてジエチ ルエーテル１０−で３回抽出した。エーテル層を濾過し、蒸発しそしてサンプル をメチル化しそしてＧＬＣ中で分析した（ノボ　インダストリイから入手可能な ＡＰ２０６／２に記載された方法）。

結果は以下のように表わされる： ２位の脂肪酸組成 飽和脂肪酸：パルミチン酸、ステアリン酸およびアキラドン酸 不飽和脂肪酸ニオレイン酸およびリルイン酸プソイドモナス　セパシア　エステ ル基交換は、２位に対するその活性のために、脂肪酸のランダムな分布に近づい ていることが示される。１．３位置特異的リボザイム＠　１Ｍ２０エステル基交 換はこれが２位に大部分非付着であるため非常に異なった組成を与える。

例４ 連続エステル基交換 例２の固定化リパーゼ４．５ｇを、内径】、５ｃの水ジヤケツトカラムへ充てん した。

循環温水、すなわち６０″Ｃを用いてカラムを加熱した。水飽和樹脂（デュオラ イト＠Ｅ５５６１）を含むプレカラムを酵素カラムの前に置きそしてこれもまた ６０″Ｃまで加熱した。過酸化物価３未満の７１％高分散漂白および脱イオン化 大豆油および２９％分析用ラウリン酸とからなる基質をポンプによりカラムに通 す。酵素カラムからの出口で分析用のためサンプルを採取し、そしてＧＬＣによ りラウリン酸混入量を測定した。ラウリン酸１４％−／−混入を試み、そして前 記値における転化を保つために流速を調節した。プレカラムを乾燥するときはい つでもこれを新しいものと代えた。

Ａ　ｌ　ｚｏｓ−カラムクロマトグラフィにより遊離脂肪酸およびモル−とジグ リセリドを除去し、Ｎａ０ＣＨｚによりトリグリセリドをメチル化しそして最後 にＧＬＣ中でメチルエステルを分析することによりサンプルを分析した。

１４％Ｌａ混入を得るための流速は次のように時間とともに減少した二 １隻！皿　　　　　　跋−五 ２３９時間　　　　　１０１．０　ｇ　／　ｈ３５８時間　　　　　　９７．８ ｇ／ｈ４０８時間　　　　　９８．２　ｇ　／　ｈ２００時間の操作で非常にわ ずかな失活が起きるだけであり、半減期（すなわち、活性（または流速）が初期 値の半分まで低下する時間）は１　、０００時間を越えると推定されることがわ かる。

請求の範囲 １、固定化、位置非特異的リパーゼ製剤を使用する反応物としてトリグリセリド 脂肪を用いたリパーゼ触媒化方法であって、 該リパーゼがプソイドモナス（Ｐｓｅｕｃｌｏｍｏｎａｓ）の菌株の培養により 製造可能であり、そして／またはプソイドモナス　セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ）菌株ＤＳＭ　３９５９由来の非特異的リパーゼのもの と同一の免疫特性を有することを特徴とする、前記方法。

Ｚ　リパーゼが、プソイドモナス　セパシア菌株ＤＳＭ　３９５９または日本の 徴工研菌寄第５４９４号の菌株の培養により得られうる請求項１に記載の方法。

３、　リパーゼが粒状のマクロポーラス−樹脂に、好ましくは吸着および／また は架橋により固定化される前記請求項のいずれかに記載の方法。

４、樹脂が弱塩基性陰イオン交換樹脂である請求項３に記載の方法。

５、反応温度が６０°Ｃ以上、好ましくは６０〜９０°Ｃである前記請求項のい ずれかに記載の方法。

６、前記請求項のいずれかに記載の脂肪のランダムなエステル交換方法。

７、溶媒を使うことのない前記請求項のいずれかに記載の方法。

８、　反応がトリグリセリド分子間のアシル基交換により生ずる請求項７に記載 のエステル交換方法。

９、反応物がトリグリセリド脂肪およびカルボン酸エステル、好ましくはメチル またはエチルエステルとからなる請求項７に記載のエステル交換方法。

１０、反応がトリグリセリドと脂肪酸の間で生じる請求項７に記載のアシドリシ ス方法。

１１、請求項１−６のいずれかに記載の脂肪加水分解方法。

１２、前記請求項のいずれかに記載の連続した固定床方法。

１３、請求項１−１２のいずれかに記載のバッチ式方法。

１４、リパーゼがプソイドモナス菌株の培養により製造可能であり、そして／ま たは前記リパーゼがプソイドモナス　セパシア菌株ＤＳＭ　３９５９由来非特異 的リパーゼのものと同一の免疫特性を有することからなる、上述の方法における 使用のための粒状形の固定化、非特異的リパーゼ製剤。

１５、リパーゼがプソイドモナス　セパシア菌株ＤＳＭ　３９５９または日本の 徹工研菌寄第５４９４号の菌株の培養により得られる請求項１４に記載の製剤。

１６、リパーゼが、好ましくは吸着および／または架橋によた粒状の多孔性樹脂 に固定化される請求項１４または１５に記載の製剤。

１７、樹脂が弱塩基性陰イオン交換樹脂である請求項１６に記載の製剤。

国際調査報告 １．、、．１１．７や−Ｐ口Ｔ／ＱＫε８／ごロユ２５

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．非特異的リパーゼがプソイドモナスセパシア（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ　 ｃｅｐａｃｉａ）菌株により製造可能であり、そして／またはプソイドモナスセ パシア菌株ＤＳＭ　３９５９由来の非特異的リパーゼのものと同一の免疫特性を 有することからなる粒状形の固定化、位置非特異的リパーゼ製剤。
2. ２．非特異的リパーゼが、プソイドモナスセパシア菌株ＤＳＭ３９５９または日 本の徴工研菌寄第５４９４号の菌株から産生される請求項１に記載の製剤。
3. ３．リパーゼが粒状のマクロポーラス樹脂に好ましくは吸着および／または架橋 により固定化される請求項１−２に記載の製剤。
4. ４．樹脂が弱塩基性陰イオン交換樹脂である請求項３に記載の製剤。
5. ５．樹脂が吸着樹脂好ましくはフェノール−ホルムアルデヒド型のものである請 求項３に記載の製剤。
6. ６．グルタルアルデヒドを用いて架橋を行なう請求項３に記載の製剤。
7. ７．リパーゼが無機支持体上に、好ましくは共有結合または吸着により固定化さ れる請求項１−２に記載の製剤。
8. ８．適当な普通培地において、プソイドモナスセパシアの非特異的リパーゼ産生 株または非特異的リパーゼを暗号化しそして発現する遺伝子を含む形質転換体を 好気的に培養し、その後培養プロスから非特異的リパーゼを回収し該リパーゼを 固定化することからなる粒状形態の固定化位置特異的リパーゼの製造方法。
9. ９．プソイドモナスセパシア菌株ＤＳＭ３９５９もしくはＦＲＩ５４９４または そのリパーゼを暗号化しそして発現する遺伝子を含む形質転換体を培養すること からなる請求項８に記載の方法。
10. １０．請求項８−９に記載の方法により作られた固定化リパーゼ。
11. １１．請求項１−７または１０に記載の製剤のリパーゼー触媒化方法における使 用。
12. １２．エステル加水分解、好ましくは脂肪分解またはコレステロールエステルの 加水分解における請求項１１に記載の使用。
13. １３．連続方法における請求項１２に記載の使用。
14. １４．水分含有率が４０％ｗ／ｗ未満である請求項１２−１３に記載の使用。
15. １５．エステル合成における請求項１１に記載の使用。
16. １６．反応の間に水を除去するバッチ式方法における請求項１５に記載の使用。
17. １７．１つの反応物が第二アルコールである請求項１５−１６に記載の使用。
18. １８．溶媒を使用しない請求項１５−１７に記載の使用。
19. １９．好ましくは溶媒を用いることのないエステル交換における請求項１１に記 載の使用。
20. ２０．連続的、固定床方法における請求項１９に記載の使用。
21. ２１．好ましくはトリグリセリドと脂肪酸の間のアシドリシスにおける請求項１ ９−２０に記載の使用。
22. ２２．アルコリシスにおける請求項１９−２０に記載の使用。
23. ２３．エステル交換における請求項１９−２０に記載の使用。
24. ２４．脂肪のランダムエステル交換における請求項２３に記載の使用。
25. ２５．反応混合物がトリグリセリド脂肪およびカルボン酸エステル、好ましくは メチルまたはエチルエステルからなる請求項２３に記載の使用。