CN101657537B - 里氏木霉α-淀粉酶增强玉米淀粉的糖化 - Google Patents

Abstract

来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的生麦芽糖α-淀粉酶(TrAA)和其变体在葡糖淀粉酶存在下在从液化淀粉产生高葡萄糖糖浆中是有用的，其中由此产生的高葡萄糖糖浆含有至少约97％的葡萄糖。在这个方法中，TrAA有利地抑制葡萄糖逆转成麦芽低聚糖。也提供了用于产生TrAA和其变体的表达宿主和编码核酸。

Description

里氏木霉α-淀粉酶增强玉米淀粉的糖化

本申请要求2007年3月14日提交的美国临时申请60/906,811和2007年3月14日提交的美国临时申请60/906,812的优先权，其中每份文件通过引用的方式完整地并入本文作为参考。

序列表

也附上了包含SEQ ID NO：1-7的序列表，其中所述序列表通过引用的方式完整并入本文作为参考。

提供了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的生麦芽糖α-淀粉酶(TrAA)、编码所述酶的核酸和包含所述核酸的宿主细胞。使用TrAA的方法包括将淀粉糖化成富含葡萄糖的糖浆。

发明背景

高果糖的玉米糖浆(HFCS)是具有高果糖含量和与糖可比甜度的加工形式的玉米糖浆，从而使得利用HFCS作为软饮料和其他加工食品中的糖替代物。HFCS目前代表一项十亿美元的产业。产生HFCS的方法多年来已经从酸水解发展至一系列酶催化的反应。

(1)液化：首先使用α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)将含有30-40％w/w干燥固体(ds)的淀粉悬液降解成麦芽糖糊精。α-淀粉酶是催化随机切割内部α-1，4-D-糖苷键的内切水解酶。因为液化一般在高温例如90-100℃进行，所以对该步骤而言，优选热稳定的α-淀粉酶，如来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)的α-淀粉酶。

(2)糖化：通常使用葡糖淀粉酶和/或生麦芽糖α-淀粉酶来催化在液化后形成的麦芽糖糊精的非还原性末端水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。脱支酶如支链淀粉酶可以用来辅助糖化。糖化一般在酸性条件下在升高的温度例如60℃，pH 4.3进行。在该工艺中使用的葡糖淀粉酶一般从真菌获得，例如在

L400中使用的黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶(AnGA)或灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)。目前用于本申请的生麦芽糖α-淀粉酶包括植物淀粉酶和来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的α-淀粉酶(澄解酶L的活性成分)。糖化可以用来产生高麦芽糖或富含葡萄糖的糖浆。

(3)异构化：当需要更甜的产物时，富含葡萄糖的糖浆可以进一步加工以产生果糖。葡萄糖至果糖的异构化由葡萄糖异构酶催化并且产生约42％(w/v)果糖、50-52％葡萄糖、和其他糖的混合物。额外的操作最终可以产生例如具有42％、55％或90％果糖含量的商品级HFCS。

所述α-淀粉酶和葡糖淀粉酶直接添加至玉米糖浆的工艺批料(processbatch)并且不重复利用。另一方面，将葡萄糖异构酶固定在糖混合物从中通过的柱子上。该葡萄糖异构酶柱重复使用直至所述酶失去它们活性的大部分。

糖化步骤是HFCS生产的限速步骤。糖化一般进行48-72小时，在所述时间上众多真菌葡糖淀粉酶失去它们的大部分活性。此外，尽管生麦芽糖α-淀粉酶和葡糖淀粉酶均可以用来催化糖化，然而所述酶一般在不同的最适pH和温度处操作。例如，生麦芽糖α-淀粉酶一般具有至少pH 5.0的最适pH和低于55℃的最适温度，而AnGA一般具有pH 4.0-4.5的最适pH和约60℃的最适温度。这两种酶在反应条件上的差异导致必需调节pH和温度，这延缓了整个工艺并且可能导致不溶性直链淀粉聚集物形成。当降低所述pH时，将使任何残余的细菌α-淀粉酶失活；然而所述细菌α-淀粉酶可以后来由酸稳定的α-淀粉酶替代。

理想地，该糖化步骤产生具有组成为约95-97％w/w葡萄糖、1-2％w/w麦芽糖和0.5-2％w/w异麦芽糖的糖浆。这种富含葡萄糖的糖浆可以用于上文步骤(3)的异构化反应中或用于产生结晶葡萄糖。这些高的葡萄糖浓度不容易实现。例如，里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)相对于AnGA或HgGA提供了改善的比活性；但是，TrGA产生具有一般约88％w/v最终葡萄糖浓度的产物。此外，糖浆中的高葡萄糖浓度促使葡萄糖转化成麦芽糖和麦芽三糖。

因此，本领域需要制备HFCS的改良方法，该方法包括使用α-淀粉酶的糖化步骤，其中所述α-淀粉酶具有与利用真菌葡糖淀粉酶相容的最适pH和最适温度。还需要可以在更少时间中催化糖化的α-淀粉酶。此外，需要这样的α-淀粉酶，其可以实现这些目的，同时在糖化后产生具有约96％w/w葡萄糖浓度的糖浆。

发明简述

本领域中这些和其他需要由来自里氏木霉(TrAA)的生麦芽糖α-淀粉酶满足。提供了所述酶、所述酶的变体和编码核酸。也提供表达TrAA的宿主细胞。

TrAA有利地在多个工艺，尤其在液化后形成的麦芽糖糊精的糖化中使用。在一个实施方案中，TrAA单独使用或与其他酶如支链淀粉酶组合在麦芽糖生产工艺中使用。TrAA有利地在相对低的pH和高温催化麦芽糖产生，从而允许使用与真菌葡糖淀粉酶例如AnGA相容的反应条件。此外，TrAA产生的便利性使TrAA比当前用于麦芽糖生产的α-淀粉酶更经济。

在另一个实施方案中，TrAA用在产生高浓度葡萄糖的糖化工艺中。TrAA有利地抑制从葡萄糖形成麦芽低聚糖的逆反应，从而使得加工的玉米淀粉混合物中的葡萄糖浓度达到约96％w/v高的浓度。此外，该葡萄糖浓度可以在比该反应仅用葡糖淀粉酶催化时的更少时间中实现。在一个实施方案中，葡糖淀粉酶随TrAA添加。例如，该葡糖淀粉酶可以是真菌葡糖淀粉酶，如TrGA；或者可以是添加葡糖淀粉酶的掺合物，如TrGA、HgGA和AnGA的组合。

因此，一个目的是提供分离的多肽，所述多肽包含(i)SEQ ID NO：3的第21-463位残基或(ii)里氏木霉α-淀粉酶(TrAA)的变体，其中该变体具有α-淀粉酶活性并与SEQ ID NO：3的第21-463位残基具有至少80％、至少90％或至少95％的氨基酸序列同一性。例如，与SEQ ID NO：3的第21-463位残基相比，该变体可以具有1-10个氨基酸替代、插入或缺失。备选地，该多肽可以包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3的第21-463位残基，即缺少信号序列的成熟多肽序列。该多肽可以包含来自除里氏木霉之外的物种的信号序列。在一个实施方案中，所述多肽是糖基化的。还可以纯化所述分离的多肽。

另一个目的是提供编码上文多肽的多核苷酸。该多核苷酸可以包含SEQ ID NO：2，即一个cDNA序列。还提供分离的mRNA，其中将SEQ IDNO：2中的T残基替代为U(尿嘧啶)残基。

另一个目的是提供包含以上多核苷酸的载体和包含该载体的细菌细胞。也提供了表达该多核苷酸的宿主细胞，其中该宿主细胞在一个实施方案中是木霉属(Trichorderma sp.)，尤其里氏木霉(T.reesei)。此宿主备选地可以是RL-P37分离株、丝状真菌细胞、曲霉属(Aspergillus sp.)、镰孢属(Fusarium sp.)或青霉属(Penicillium sp.)。曲霉属宿主细胞可以是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉(A.niger)或日本曲霉(A.japonicus)。镰孢属宿主细胞可以是尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)或茄腐镰孢菌(F.solani)。该宿主细胞还可以表达编码异源性葡糖淀粉酶(即与该宿主细胞不相同的物种的葡糖淀粉酶)的核酸。该葡糖淀粉酶例如可以是灰腐质霉葡糖淀粉酶。该宿主细胞备选或额外地可以不表达宿主细胞内源性葡糖淀粉酶。

另一个目的是提供糖化淀粉的方法，包括：向液化淀粉溶液添加上文所述的多肽，和糖化液化淀粉溶液。所述多肽可以以每公吨干燥固体约0.3-1kg添加至液化淀粉溶液。液化淀粉溶液可以是约20-35％w/w干燥固体的液化淀粉浆液。

该方法还可以包括添加葡糖淀粉酶至液化淀粉溶液的步骤，其中糖化所述液化淀粉溶液产生了富含葡萄糖的糖浆。该富含葡萄糖的糖浆中的葡萄糖浓度可以达到至少约97％w/w ds。葡萄糖在该富含葡萄糖的糖浆中的最大浓度可以从添加所述多肽至液化淀粉溶液的约24小时内实现。该葡糖淀粉酶可以从植物、真菌或细菌衍生。例如，该葡糖淀粉酶可以是里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)、黑曲霉葡糖淀粉酶(AnGA)或灰腐质霉葡糖淀粉酶(HgGA)。该葡糖淀粉酶可以从曲霉属、泡盛曲霉、米曲霉的真菌、篮状菌属(Talaromyces sp.)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、T.leycettanus、T.duponti、嗜热篮状菌(T.thermophilus)、梭菌属(Clostridium sp.)、解淀粉热梭菌(C.thermoamylolyticum)或热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)衍生。该葡糖淀粉酶可以按照约0.02-2.0GAU/g ds或约0.1-1.0GAU/g ds的量添加。可以额外地添加其他酶，包括但不限于脱支酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、或它们的组合。糖化淀粉的方法还可以包括发酵糖化的淀粉溶液以产生乙醇。液化淀粉溶液可以在约40℃至约60℃。液化淀粉溶液可以处在约pH 4.0至约pH 6.0或约pH 4.2至约pH 4.8。

又一个目的是提供淀粉加工组合物，其中所述的淀粉加工组合物包含上述多肽和任选地包含葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、不是TrAA的真菌α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、异淀粉酶、或它们的组合。

另一个目的是提供包含在溶液或在凝胶中的上述多肽的烘烤用组合物。烘烤的方法包括添加权利要求46的烘烤用组合物至待烘烤的物质并烘烤该物质。

再一个目是提供织物退浆组合物，其包含在水溶液中的所述多肽，并且任选地还有另一种酶。使织物退浆的方法包括将所述退浆组合物与织物接触，持续足以使该织物退浆的时间。

附图简述

所附附图并入且构成本说明书的一部分，并且说明多个实施方案。在所述图中：

图1描述了TrAA在葡糖淀粉酶存在下以优于单独由葡糖淀粉酶所实现的效率催化糖化工艺的能力。y-轴显示在pH 4.2，60℃24小时糖化工艺后所产生的葡萄糖(DP1)的重量百分数。此反应由1.0kg/mt ds葡糖淀粉酶(GA)单独催化或与所示量的kg/mt ds TrAA组合的GA催化。应当指出添加1mg酶至含有32％干燥固体的50mL溶液例如意指该溶液含有1mg酶/16g ds或0.0625kg/mt ds。

图2描述TrAA在低pH催化麦芽糖产生的能力。y-轴显示在55℃由0.5kg/mt ds TrAA催化的24小时麦芽糖生产工艺后所产生的麦芽糖(DP2)的重量百分数。该反应的pH显示在x-轴上。

图3描述TrAA以可比于澄解酶L(

L)的效率催化麦芽糖产生的能力。在y-轴上显示48小时麦芽糖生产工艺后所产生的麦芽糖(DP2)的重量百分数。在x-轴上显示用来催化该反应的酶。“澄解酶”：在pH 5.5，55℃的10SKBU/g ds澄解酶

L。″10TrAA″：在pH 4.5，60℃的10SKBU/g ds里氏木霉α-淀粉酶。″15TrAA″和″20TrAA″分别代表在pH4.5，60℃的15SKBU/g ds和20SKBU/g ds的TrAA。″20TrAA+PU″代表添加0.25kg/mt ds支链淀粉酶至处于pH 4.5，60℃的20SKBU/g dsTrAA。

图4描述在最适量的支链淀粉酶情况下由TrAA催化的麦芽糖生产工艺。y-轴显示在0.5kg/mt ds TrAA存在下，在pH 4.6，58℃48小时后所产生的麦芽糖(DP2)的重量百分数。x-轴显示添加至该反应的以kg/mt ds为单位表示的支链淀粉酶的量。

图5显示SDS-PAGE解析的蛋白质，所述的蛋白质来自一小份表达TrAA的培养细胞(泳道1)或来自纯化的TrAA(泳道2)。分子量标记在泳道M中显示。

图6A显示作为pH函数的纯化TrAA的α-淀粉酶相对活性(以任意单位)，使用Ceralpha试剂(Megazyme International Ireland，Ltd.，Wicklow，Ireland；目录号K-CERA)作为底物。

图6B显示作为温度函数的纯化TrAA的α-淀粉酶相对活性(以任意单位)，使用相同的人工底物。

图7A和图7B是SEQ ID NO：1-7的序列表

发明详述

提供了来自里氏木霉的真菌α-淀粉酶。TrAA提供优于目前所用α-淀粉酶的几个优势。首先，TrAA在相对低的pH和高温有活性，从而允许此酶与真菌葡糖淀粉酶在相同的反应条件下组合使用。这避免必需将糖化反应作为分批法运行，在所述分批法中必须重调pH和温度以最佳地利用α-淀粉酶或葡糖淀粉酶。其次，与支链淀粉酶组合时，TrAA以与常用的更昂贵的酶(如澄解酶

L)相同的效率催化麦芽糖产生。

1.定义和缩写

根据这份详述的描述，以下缩写和定义适用。应当指出如本文中所用，单数形式″一个″、″一种″和″该″包括复数称谓，除非上下文清楚地说明并非如此。因此，例如，对″一种酶″的指称包括多种此类酶，并且对“该配方”的指称包括对一个或多个配方和本领域技术人员已知的其等同物的指称等。

除非本文另外定义，本文中所用的全部技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同意义。下文提供以下术语。

1.1.定义

“淀粉酶”意指能够催化淀粉降解的酶，这只是其中之一。通常，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定义为以随机方式切割淀粉分子内部α-D-(1→4)O-糖苷键的内切作用酶。相反，外切作用解淀粉酶，如生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)；β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；和α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)从底物的非还原性末端切割淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的麦芽低聚糖。葡糖淀粉酶从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原性末端释放葡糖基残基。葡糖淀粉酶也催化α-1，6和α-1，3键水解，尽管速率比α-1，4键慢得多。

″α-淀粉酶变体″、″α-淀粉酶变体多肽″和″变体酶″意指具有已经从野生型α-淀粉酶的氨基酸序列修饰而来的氨基酸序列的α-淀粉酶蛋白。如本文中所用，“亲本酶”、“亲本序列”、“亲本多肽”、“野生型α-淀粉酶蛋白”和“亲本多肽”意指α-淀粉酶变体多肽以之为基础的酶和多肽，例如里氏木霉α-淀粉酶。“亲本核酸”意指编码该亲本多肽的核酸序列。野生型α-淀粉酶天然地存在，″α-淀粉酶变体″与野生型α-淀粉酶在成熟蛋白质的氨基酸残基方面不同，即其中所述成熟蛋白质无信号序列。该α-淀粉酶变体可以是含有异源性α-淀粉酶多肽的融合蛋白。例如，该α-淀粉酶蛋白可以包含与另一种α-淀粉酶的信号肽连接的成熟α-淀粉酶蛋白。

″变体″涉及多肽和核酸。术语“变体”可以与术语“突变体”彼此交换使用。变体分别包括在氨基酸或核苷酸序列中的一个或多个位置处插入、替代、颠换、截短和/或倒位。变体核酸可以包括与能够同本文中所述核苷酸序列杂交的序列互补的序列。例如，变体序列与能够同本文中所述核苷酸序列在严格条件(例如50℃和0.2×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0))下杂交的序列互补。更具体地，术语“变体”包括与能够在高严格条件(例如65℃和0.1×SSC)下同本文中所述核苷酸序列杂交的序列互补的序列。

如本文中所用，术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。

“分离的”意指该序列至少基本上不含与所述序列天然关联并在自然界中存在的至少一种其他组分。

“纯化”意指该材料处于相对纯的状态，例如，至少约90％纯，至少约95％纯或至少约98％纯。

“热稳定的”意指该酶在暴露于升高的温度后仍保留活性。酶(如α-淀粉酶)的热稳定性由其半寿期(t_1/2)度量，其中一半的酶活性在半寿期期间丧失。在定义的条件下通过测量残余淀粉酶活性计算半寿期值。

“pH范围”意指酶从跨度为5个或更多个pH单位的酸性条件至碱性条件显示催化活性的能力。

如本文中所用，″pH稳定的″涉及酶在宽pH范围内保留活性的能力。

如本文中所用，″氨基酸序列″与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义；在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

如本文中所用，“核苷酸序列”或“核酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其变体、同源物(homologues)、片段和衍生物。该核苷酸序列可以是基因组、合成或重组来源的并且可以是双链或单链，无论代表有义链或反义链。如本文中所用，术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。

“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有某种程度同一性或“同源性”的实体。“同源序列”包括与另一个序列具有某个百分数例如80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的多核苷酸或多肽。百分同一性是指在比对时比较这两个序列中相同的碱基或氨基酸残基的百分数。当在氨基酸序列中与主题序列相比，替代、缺失或添加了氨基酸，则氨基酸序列是不相同的。百分序列同一性通常相对于主题蛋白的成熟序列进行测量，即例如在翻译后修饰以除去信号序列之后进行。一般而言，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性部位残基。同源物也保留了生麦芽糖α-淀粉酶活性，尽管所述同源物可以具有与主题蛋白质不同的酶特性。

如本文中所用，“杂交”包括一条核酸链通过碱基配对作用与互补链结合的过程，以及如在聚合酶链反应(PCR)技术中那样进行的扩增过程。α-淀粉酶变体核酸可以作为单链或双链DNA或RNA、RNA/DNA异双链体或RNA/DNA共聚物存在。如本文中所用，“共聚物”指包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸这两者的单个核酸链。所述α-淀粉酶变体核酸可以进行密码子优化以进一步提高表达。

如本文中所用，“合成的”化合物通过体外化学合成或酶合成产生。它包括但不限于以针对宿主生物如甲基营养酵母-毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、链霉菌(Streptomyces)和木霉(例如里氏木霉)或所选其他表达宿主的最佳密码子使用所产生的α-淀粉酶变体核酸。

如本文中所用，″转化细胞″包括已经利用重组DNA技术转化的细胞，包括细菌细胞和真菌细胞。转化一般通过插入一个或多个核苷酸序列至细胞内进行。插入的核苷酸序列可以是异源性核苷酸序列，即对于待转化细胞而言不是天然的序列，如融合蛋白。

如本文中所用，“有效连接”意指所述组分处在使它们以预期方式发挥功能的关系中。例如，与编码序列有效连接的调节序列以这样的方式连接，从而在与所述调控序列相容的条件下实现该编码序列的表达。

如本文中所用，“生物活性的”指与天然存在序列具有相似结构、调节功能或生物化学功能的序列，尽管不必是相同程度。

术语“丝状真菌”指真菌亚门(Eumycotina)的全部丝状形式。参见Alexopoulos，INTRODUCTORY MYCOLOGY，Wiley，New York(1962)。这些真菌的特征是具有包含几丁质、纤维素和其他复杂多糖的细胞壁的营养菌丝体。丝状真菌在形态学、生理学和遗传上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝延伸进行，并且碳代谢是专性需氧的。丝状真菌的亲本细胞可以是木霉属(Trichoderma sp.)例如里氏木霉(先前分类为长枝木霉(T.longibrachiatum)并且目前也称作红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、绿色木霉(T.viride)、康氏木霉(T.koningii)、哈茨木霉(T.harzianum)；青霉属(Penicillium sp.)；腐质霉属(Humicola sp.)，例如特异腐质霉(H.insolens)和灰腐质霉(H.grisea)；金孢霉属(Chrysosporium sp.)例如C.lucknowense；粘帚霉属(Gliocladium sp.)；曲霉属(Aspergillus sp.)例如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)和泡盛曲霉(A.awamori)；镰孢属(Fusarium sp.)；脉孢菌属(Neurospora sp.)；肉座菌属(Hypocrea sp.)和裸胞壳属(Emericella sp.)的细胞。还参见Innis等，Science 228：21-26(1985)。

如本文中所用，术语“淀粉”指包含植物的复杂多糖碳水化合物的任意物质，所述的复杂多糖碳水化合物包含分子式(C₆H₁₀O₅)_x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任意数字。术语“颗粒淀粉”指生的，即未烹煮的淀粉，例如，还没有进行糊化的淀粉。

如本文中所用，术语“糖化”指淀粉至葡萄糖的酶转化。

术语“液化”指淀粉转化中水解糊化淀粉以产生低分子量可溶性糊精的阶段。术语“聚合度(DP)”指给定糖中脱水吡喃型葡萄糖单元的数目(n)。DP1的实例是单糖葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖麦芽糖和蔗糖。

如本文中所用，术语“干燥固体含量”(ds)指浆液中基于干燥重量百分数的总固体。术语“浆液”指含有不溶性固体的水质混合物。

术语“DE”或“葡萄糖当量”定义为作为糖浆中总碳水化合物的一部分的还原糖即D-葡萄糖的百分数。

短语“同时糖化和发酵(SSF)”指生物化学品生产中的一个工艺，其中微生物如产乙醇微生物和至少一种酶如TrAA或其变体在相同的工艺步骤中存在。SSF指例如在相同反应容器中将颗粒淀粉底物同时水解成包括葡萄糖在内的糖和将糖发酵成醇。

如本文中所用，“产乙醇微生物”指具有将糖或寡糖转化成乙醇的能力的微生物。

1.2.缩写

除非另外说明，使用以下缩写：

ADA     偶氮二甲酰胺

AnGA    黑曲霉葡糖淀粉酶

ATCC    美国典型培养物保藏中心

BBA

BBA 1500L β-淀粉酶

cDNA    互补的DNA

DE      葡萄糖当量

DEAE    二氨基乙醇

DNA     脱氧核糖核酸

DNS     3，5-二硝基水杨酸

DPn     具有n个亚单元的聚合度

ds      干燥固体

EC      酶分类酶学委员会

EDTA    乙二胺四乙酸

FGSC      真菌遗传学贮藏中心

G173A     在第173位置处的甘氨酸(G)残基替代为丙氨酸(A)残

          基，其中氨基酸由本领域通常已知的单字母缩写命名

GA        葡糖淀粉酶

GAU       葡糖淀粉酶活性单位

HFCS      高果糖的玉米糖浆

HFSS      基于高果糖淀粉的糖浆

HPLC      高效液相色谱

HgGA      灰腐质霉葡糖淀粉酶

HS        高级糖(DPn，其中n＞3)

kb        千碱基

LAT       地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶

LB        Luria Bertani肉汤

LU        脂肪酶单位，是每单位质量酶的磷脂酶活性的计量单

          位

MOPS      3-(n-吗啉代)丙磺酸

mRNA      信使核糖核酸

mt        公吨(1000kg)

PCR       聚合酶链反应

PEG       聚乙二醇

ppm       百万分之...

PU        支链淀粉酶或支链淀粉酶单位

RT-PCR    逆转录酶聚合酶链反应

SD        Sabouraud葡萄糖肉汤

SDS-PAGE  十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SKBU/g    每克干燥固体的α-淀粉酶单位。一个α-淀粉酶单位在

          测试条件下每小时使1.0g极限糊精底物糊精化

1×SSC      0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0

SSF         同时糖化和发酵

TE          10mM Tris，pH 7.4，1mM EDTA

TrAA        里氏木霉α-淀粉酶

TrGA        里氏木霉葡糖淀粉酶

w/v         重量/体积

w/w         重量/重量

YM          酵母麦芽提取物肉汤

μL         微升

2.里氏木霉α-淀粉酶(TrAA)和其变体

提供了包含SEQ ID NO：3的分离和/或纯化的多肽。这种多肽是包含20个氨基酸前导序列的野生型里氏木霉α-淀粉酶(TrAA)。在一个实施方案中，TrAA是所述多肽的成熟形式，其中切除了所述20个氨基酸的前导序列，从而该多肽的氨基末端始于SEQ ID NO：3的第21位置处的天冬氨酸(D)残基。还提供了编码多肽的核酸，其中所述多肽包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3的第21-463位氨基酸残基。在一个实施方案中，编码TrAA的核酸是包含SEQ ID NO：1的基因组DNA；在另一个实施方案中，该核酸是包含SEQ ID NO：2的cDNA。如本领域技术人员充分理解，遗传密码具有简并性，意指在一些情况下多个密码子可以编码相同的氨基酸。核酸包括编码TrAA或其变体的基因组DNA、mRNA和cDNA。

除了野生型里氏木霉α-淀粉酶(TrAA)外，还提供其变体，其中所述变体因替代、插入或缺失一个或多个氨基酸而与SEQ ID NO：3中所示的野生型TrAA序列不同。例如，变体α-淀粉酶可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35或40个氨基酸修饰，例如1-10个氨基酸替代，同时保留生麦芽糖α-淀粉酶活性。该变体TrAA可以保留比野生型TrAA更高或更低的比活性。所述变体与“同源物”同义。提供了编码所述变体多肽的变体核酸。变体核酸包括编码所述变体多肽的全部核酸。

2.1.TrAA变体的表征

酶变体可以以其核酸和一级多肽序列、以三维结构建模和/或以其比活性为特征来描述。TrAA变体的额外特征例如包括稳定性、pH范围、氧化稳定性和热稳定性。在一个方面，所述TrAA变体以高于野生型TrAA的水平表达，同时保留野生型TrAA的性能特征。可以使用本领域技术人员已知的标准测定法评估表达水平和酶活性。在另一方面，变体表现了相对于野生型酶的改良性能特征，如在高温(即70-120℃)和/或极端pH(即pH4.0至6.0或pH 8.0至11.0)时提高的稳定性。

表达特征意指当变体在特定宿主细胞中产生时此变体的改变的表达水平。表达通常涉及使用本领域已知的标准技术，经给定量的时间后从发酵肉汤可回收的活性变体的量。表达也可以涉及在宿主细胞内产生或由此宿主细胞分泌的变体的量和速率。表达也可以涉及编码所述变体酶的mRNA的翻译速率。

与亲本α-淀粉酶相比，TrAA变体也可以具有改变的氧化稳定性。例如，降低的氧化稳定性可能在淀粉液化组合物中是有利的。

该变体TrAA可以比野生型α-淀粉酶具有更高热稳定性。此类TrAA变体有利于用在要求温度升高的烘烤或其他工艺中。例如，热稳定性TrAA变体可以在约55℃至约80℃或更高温度降解淀粉。热稳定性TrAA变体可以在暴露于高达约95℃的温度之后仍保留其活性。

本文中所述的α-淀粉酶变体多肽也可以相对于亲本酶具有这样的突变，其中所述突变延长半寿期达10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更多，尤其在约55℃至约95℃或更高的升高温度上，尤其在约80℃如此。在一个实施方案中，该TrAA变体可以在80℃或更高温度上加热约1-10分钟。

该TrAA变体多肽进一步地可以在亲本多肽的信号序列中或在TrAA亲本多肽中其他位置包含突变。例如，该TrAA变体可以是包含异源性多肽，如来自地衣芽孢杆菌(LAT)的信号肽的融合蛋白形式，其中所述的异源性多肽与TrAA融合以促进表达的蛋白质从细菌宿主细胞分泌。可以与该变体TrAA融合的其他异源性多肽包括例如有利于纯化所表达蛋白质的序列。在一个实施方案中，异源性序列包括允许从表达的变体TrAA切除该异源性序列的蛋白酶敏感位点。

在一个方面，由所述核酸编码的TrAA变体多肽具有与亲本序列相同的pH稳定性。在另一方面，该TrAA变体包含出于该酶的最终商业目的而赋予更大的pH稳定性范围或转变该pH范围至所需范围的突变。例如，在一个实施方案中，该TrAA变体可以在约pH 4.5至约pH 10.5降解淀粉。与亲本多肽相比，该TrAA变体多肽可以在相同条件下具有更长的半寿期或更高的活性(取决于测定法)或该TrAA变体可以具有与亲本多肽相同的活性。该α-淀粉酶变体多肽也可以在相同pH条件下与亲本多肽相比具有约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更长的半寿期。备选地或此外，该TrAA变体可以在相同pH条件下与亲本多肽相比具有更高的比活性。

在另一方面，提供了与编码本文中所述任意TrAA变体的核酸互补的核酸。另外，提供能够与该互补物杂交的核酸。在另一个实施方案中，在本文所述方法和组合物中使用的序列是合成序列。它包括但不限于为在宿主生物如甲基营养酵母-木霉、毕赤酵母和汉逊酵母中表达而以最佳密码子使用所制备的序列。

3.TrAA和其变体的产生

在一个实施方案中，野生型TrAA在里氏木霉菌株中表达并且任选地在使用前分离。在另一个实施方案中，将野生型TrAA在表达后纯化。使用技术人员熟知的技术，选出了以高水平表达野生型TrAA的特别有用的里氏木霉菌株。高水平表达可以是每升培养基约12-20g、约14-18g/L或约16-19g/L的TrAA或其变体。在其他实施方案中，野生型TrAA或其变体在宿主细胞中重组地表达。TrAA基因可以例如美国公开申请号2007/0004018和2006/0094080中所述那样克隆和表达。

重组表达的酶

在一些实施方案中，微生物进行基因工程化以表达TrAA或其变体。合适的宿主细胞包括例如可以是曲霉属、木霉属、镰孢属或青霉属菌株的丝状真菌细胞。特别合适的真菌宿主细胞包括构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉(T.viride)、尖镰孢菌和茄腐镰孢菌。曲霉属菌株在Ward等，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743(1993)和Goedegebuur等，Curr.Gene.41：89-98(2002)中披露。在一个特别合适的实施方案中，宿主是以相对高的水平例如15-20g/L产生TrAA的里氏木霉菌株。合适的里氏木霉是已知的，并且非限制性实例包括ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767和NRRL 15709。在一些实施方案中，宿主菌株是RL-P37的衍生物，其在Sheir-Neiss等，Appl.Microbiol.Biotechnology20：46-53(1984)中披露。当TrAA或其变体在真核宿主细胞中表达时，表达的TrAA在一个特别合适的实施方案中具有如在野生型TrAA中所发现的相同糖基化模式。特别合适的宿主细胞包括根据美国专利号5,874,276和WO 05/001036(Genencor International，Inc.)中所述的方法工程化设计的里氏木霉宿主细胞。

在其他实施方案中，该宿主细胞是具有失活的天然基因例如基因缺失的基因工程宿主细胞。例如，可以使用已知方法如美国专利号5,246,853、美国专利号5,475,101和WO92/06209中所述的那些方法失活真菌宿主细胞中的一个或多个基因。基因失活可以通过完全或部分缺失、通过插入失活或通过使得基因无法为其预定目的发挥作用的任意其他方法实现，如阻止该基因表达功能性蛋白质。失活的基因可以包括例如编码纤维素分解酶如内切葡聚糖酶和外切纤维二糖水解酶的基因，例如cbhl、cbh2、egll、egl2和egl3。在一个实施方案中，当宿主细胞是木霉属细胞、尤其是里氏木霉宿主细胞时，失活并且尤其缺失cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。在美国专利号5,874,276和WO 05/001036中给出和描写了具有四重缺失的蛋白质的特别合适的里氏木霉宿主细胞。在另一个实施方案中，美国专利号5,650,322披露了例如在cbh1基因和cbh2基因中具有缺失的RL-P37的衍生菌株。

在另一个实施方案中，合适的宿主细胞包括选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短小芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽胞杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽胞杆菌(B.lautus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)的革兰氏阳性细菌；或革兰氏阴性细菌，其中所述的革兰氏阴性细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)或假单胞菌属(Pseudomonas)物种。

在一些实施方案中，将宿主细胞进行基因工程化以表达具有如下氨基酸序列的TrAA变体，其中所述的氨基酸序列与野生型TrAA具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，编码TrAA或其变体的多核苷酸具有SEQ ID NO：2的核酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列。在其他实施方案中，表达TrAA或其变体的宿主菌株也进行基因工程化以表达异源性GA。

3.2.载体

在一些实施方案中，构建了在宿主细胞中待表达的DNA构建体，其包含编码TrAA或其变体的核酸。编码TrAA的代表性核酸包括SEQ IDNO：1和2。在一个实施方案中，该DNA构建体由表达载体转移至宿主细胞，其中所述的表达载体包含与TrAA编码序列有效连接的调节序列。

载体可以是当导入宿主细胞时能够整合至真菌宿主细胞基因组并复制的任意载体。FGSC菌株目录列出了合适的载体。参见www.fgsc.net上的密苏里大学FGSC菌株目录(2007年1月17日最新修改)。合适的表达和/或整合载体的额外实例在Sambrook等，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，第三版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York(2001)；Bennett等，MORE GENEMANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press，San Diego(1991)，第396-428页和美国专利号5,874,276中提供。特别有用的载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D、pDON^TM201、pDONR^TM221、pENTR^TM、

3Z和

4Z。用在细菌细胞中的合适质粒例如包括允许在大肠杆菌(E.coli)中复制的pBR322和pUC19以及允许在芽孢杆菌属(Bacillus)中复制的pE194。

在一些实施方案中，编码TrAA或其变体的核酸与允许在宿主细胞中转录的合适启动子有效连接。该启动子可以从编码与该宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因衍生。优选地，该启动子用于木霉属宿主中。启动子的合适非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1和egl2启动子。在一个实施方案中，该启动子是对宿主细胞为天然的一种启动子。例如，当里氏木霉是宿主时，该启动子是天然的里氏木霉启动子。在一个实施方案中，该启动子是里氏木霉cbh1启动子，它是以登录号D86235在GenBank登录的一种诱导型启动子。“诱导型启动子”是在环境或发育调节作用下有活性的启动子。在另一个实施方案中，启动子是对宿主细胞为异源的一种启动子。有用启动子的其他实例包括来自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子。参见Nunberg等，Mol.Cell.Biol.4：2306-2315(1984)和Boel等，EMBOJ.3：1581-1585(1984)。

在一些实施方案中，编码序列与信号序列有效连接。编码信号序列的DNA可以是与待表达的TrAA基因天然连接的DNA序列。例如，该编码性DNA可以包含编码SEQ ID NO：5的TrAA信号序列的核苷酸序列SEQID NO：4。在其他实施方案中，该编码性DNA不包含SEQ ID NO：4，其中SEQ ID NO：4以编码来自里氏木霉以外的物种的信号序列的核苷酸序列替代。在这个实施方案中，编码信号序列的多核苷酸紧邻于编码多肽的多核苷酸的上游并与之形成可读框。在额外的实施方案中，包含在待导入真菌宿主细胞的DNA构建体或载体中的信号序列和启动子序列从相同来源衍生。例如，在一些实施方案中，信号序列是与cbh1启动子有效连接的cbh1信号序列。

在一些实施方案中，所述表达载体也包括终止序列。在一个实施方案中，该终止序列和启动子序列从相同来源衍生。在另一个实施方案中，该终止序列与宿主细胞同源。特别合适的终止子序列是从木霉属菌株且尤其里氏木霉衍生的cbh1。其他有用的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的终止子。参见上文Nunberg等(1984)和上文Boel等(1984)。

在一些实施方案中，表达载体包括选择标记。合适选择标记的实例包括赋予抗微生物药(例如潮霉素或博来霉素)抗性的那些选择标记。营养选择标记也是适合的并且包括amdS、argB和pyr4。在用于转化木霉的载体系统中有用的标记是本领域已知的。例如，参见BIOTECHNOLOGY OFFILAMENTOUS FUNGI，Finkelstein等编辑，Butterworth-Heinemann，Boston，Mass.(1992)，第6章；和Kinghorn等，APPLIED MOLECULARGENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI，Blackie Academic andProfessional，Chapman和Hall，伦敦(1992)。在一个实施方案中，该选择标记是编码乙酰胺酶的amdS基因；它允许转化的细胞在作为氮源的乙酰胺上生长。在Kelley等，EMBO J.4：475-479(1985)和Penttila等，Gene 61：155-164(1987)中描述了使用构巢曲霉amdS基因作为选择标记。

包含具有编码TrAA或其变体的多核苷酸的DNA构建体的合适表达载体可以是能够在给定宿主生物中自主复制或整合入宿主DNA的任意载体。在一些实施方案中，该表达载体是质粒。在一些实施方案中，构思了两个类型的表达载体以获得基因表达。第一表达载体包含其中启动子、TrAA编码区和终止子均源自待表达基因的DNA序列。在一些实施方案中，通过缺失不想要的DNA序列(例如编码不想要的结构域的DNA)获得基因截短，以使待表达的结构域处在自身的转录性和翻译性调节序列控制下。第二类型的表达载体是预装配的并且含有高水平转录所需要的序列和选择标记。在一些实施方案中，将TrAA基因或其部分的编码区插入这种通用目的表达载体，从而该编码区处在此表达构建体的启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施方案中，将基因或其部分插入强cbh1启动子的下游。

用来连接DNA构建体的方法和将该构建体插入合适载体的方法是本领域熟知的，其中所述的DNA构建体包含编码TrAA或其变体的多核苷酸、启动子、终止子和其他序列。连接通常通过在便利限制性位点处的连接反应完成。如此类位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头。例如，参见上文Sambrook(2001)和上文Bennett等(1991)。另外，可以使用本领域熟知的已知重组技术构建载体。

已知方法可以用来获得具有一个或多个失活基因的真菌宿主细胞，如美国专利号5,246,853；美国专利号5,475,101和WO 92/06209中披露。基因失活可以通过完全或部分缺失、通过插入失活或通过使得基因无法为其预定目的发挥作用的任意其他方法实现，从而阻止该基因表达功能性蛋白质。可以缺失已经克隆的来自木霉属或其他丝状真菌宿主的任意基因，例如，cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。在一些实施方案中，基因缺失可以通过将待失活的目的基因的一种形式借助本领域已知的方法插入质粒而完成。该缺失质粒随后在目的基因编码区内部的适宜限制性酶位点处进行切割，并且将基因编码序列或其部分替代为选择标记。来自待缺失基因的基因座的侧翼DNA序列(例约0.5至2.0kb之间)仍留在标记基因的任意一侧。适宜的缺失质粒通常会具有单一限制性酶位点，其中所述限制性酶位点能够将含有所述缺失基因的片段(包括侧翼DNA序列和选择标记基因)作为单一线性段除去。

宿主细胞的转化、表达和培养

DNA构建体或载体导入宿主细胞包括技术，如转化；电穿孔；核内微量注射；转导；转染(例如脂质转染法介导和DEAE-葡聚糖介导的转染)；与磷酸钙DNA沉淀物孵育；DNA涂敷微粒的高速轰击；和原生质体融合。一般转化技术是本领域已知的。例如，参见上文Ausubel等(1987)，第9章；上文Sambrook等(2001)和Campbell等，Curr.Genet.16：53-56(1989)。木霉中异源蛋白质的表达例如在美国专利号6,022,725；美国专利号6,268,328；Harkki等，Enzyme Microb.Technol.13：227-233(1991)；Harkki等，BioTechnol。7：596-603(1989)；EP 244,234；EP 215,594；以及在Leong与Berka编辑的MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY中第129-148页Nevalainen等，“木霉的分子生物学和其表达同源和异源基因的用途”，Marcel Dekker Inc.，New York(1992)中描述。对于曲霉菌株转化，还参考Cao等，Science 9：991-1001(2000)。在一个实施方案中，用其中编码TrAA或其变体的核酸稳定整合入宿主细胞染色体的载体系统构建遗传上稳定的转化体。转化体随后通过已知技术纯化。

在一个非限制性实例中，包括amdS标记的稳定转化体与不稳定转化体区别在于它们的生长速率更快并在含有乙酰胺的固体培养基上形成光滑、而不是粗糙外形的环状菌落。此外，在一些情况下如下进行又一个稳定性试验，即通过在固体非选择性培养基(例如缺少乙酰胺的培养基)上培育所述转化体，从这种培养基收获孢子并随后确定在含有乙酰胺的选择性培养基上萌发并生长的这些孢子的百分数。本领域已知的其他方法可以用来选择转化体。

在一个具体实施方案中，制备用于转化的木霉包括从真菌菌丝体制备原生质体。参见Campbell等，Curr.Genet.16：53-56(1989)。在一些实施方案中，菌丝体从萌发的无性孢子获得。所述菌丝体用消化细胞壁的酶处理，从而产生原生质体。原生质体因悬浮介质中存在渗透稳定剂受到保护。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。通常，这些稳定剂的浓度在0.8M和1.2M之间变动，例如可以在该悬浮介质中使用1.2M山梨醇溶液。

宿主木霉菌株摄入DNA依赖于钙离子浓度。通常，在摄取溶液中使用约10-50mM之间的CaCl₂。额外的合适化合物包括缓冲系统，如TE缓冲液(10mM Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS，pH 6.0和聚乙二醇。认为聚乙二醇使细胞膜融合，因而使介质的内容物送递至木霉菌株的细胞浆。这种融合往往引起多个拷贝的质粒DNA整合至宿主染色体。

通常，木霉的转化使用已经进行透化处理的原生质体或细胞，一般以10⁵至10⁷个/mL的密度，尤其是2×10⁶个/mL。将适宜溶液(例如，1.2M山梨醇和50mM CaCl₂)中的体积100μL的这些原生质体或细胞与目的DNA混合。通常，将高浓度的PEG添加至所述摄取溶液。0.1至1体积的25％PEG 4000可以添加至原生质体悬液；然而，添加约0.25体积至该原生质体悬液是有用的。添加剂，如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等也可以添加至该摄取溶液以促进转化。类似方法可用于其他真菌宿主细胞。例如，参见美国专利号6,022,725和6,268,328，两者均通过引用方式并入本文作为参考。

通常，该混合物随后在大约0℃孵育10至30分钟时间。随后将另外的PEG添加至该混合物以进一步增强目的基因或DNA序列的摄取。通常以5至15倍于转化混合物体积的体积添加25％PEG 4000；然而，更大和更小的体积可以是适合的。25％PEG 4000一般约10倍于转化混合物的体积。在添加PEG后，转化混合物在室温或在冰上孵育，随后添加山梨醇和CaCl₂溶液。该原生质体悬液随后又添加至熔化的等分量生长培养基。这种生长培养基仅允许转化体生长。

通常，细胞在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养。例如，参见Pourquie等，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSEDEGRADATION，Aubert等编辑，Academic Press(1988)，第71-86页；和Ilmen等，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306(1997)。常见商业制备的培养基例如酵母麦芽提取物(YM)肉汤、Luria Bertani(LB)肉汤或Sabouraud葡萄糖(SD)肉汤也是适合的。

标准培养条件是适合的，例如，培养物在大约28℃在适宜的培养基中于摇动培养箱或发酵罐内温育直至实现所需水平的TrAA或其变体表达。对于给定丝状真菌的优选培养条件是本领域已知的并且例如可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)和真菌遗传学贮藏中心(FGSC)获得。在已经建立真菌生长后，使细胞暴露于有效引起或允许TrAA或其变体表达的条件。

3.4.TrAA活性的鉴定

为评价宿主细胞中TrAA或其变体的表达，测定法可以测量表达的蛋白质、相应的mRNA或生麦芽糖α-淀粉酶活性。例如，合适的测定法包括RNA印迹法和DNA印迹法、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)和使用适宜标记的杂交探针的原位杂交。合适的测定法也包括测量样品中的TrAA活性，例如通过直接测量培养基中还原糖如葡萄糖的测定法。例如，葡萄糖浓度可以使用葡萄糖试剂盒No.15-UV(Sigma Chemical Co.)或仪器如Technicon自动分析仪确定。葡糖淀粉酶活性可以通过3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测试。见Goto等，Biosci.Biotechnol Biochem.58：49-54(1994)。

通常，由木霉属或曲霉属宿主表达的TrAA在培养基中具有大于每升1克蛋白质(g/L)、大于2g/L、大于5g/L、大于10g/L、大于20g/L或大于25g/L的浓度。在一个实施方案中，由木霉属或曲霉属宿主表达的TrAA或其变体是糖基化的，即，该TrAA或其变体包含糖基部分。在一个特别合适的实施方案中，糖基化模式与野生型TrAA中存在的糖基化模式相同。

3.5.用于纯化TrAA的方法

通常而言，细胞培养中产生的TrAA或其变体被分泌至培养基并且可以进行纯化或分离，例如，通过除去来自细胞培养基的不想要的组分。在一些情况下，TrAA或其变体可以从细胞裂解液回收。在这类情况下，使用本领域技术人员例行使用的技术，从产生酶的细胞中纯化该酶。实例包括但不限于亲和层析法、离子交换层析法(包括高分辩率离子交换)、疏水相互作用层析法、双相分配法、乙醇沉淀法、反相HPLC、在二氧化硅或阳离子交换树脂(例如DEAE)上的层析法、聚焦层析法、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀法和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤法。

发酵

在一些实施方案中，表达TrAA或其变体的真菌细胞在分批或连续发酵条件下培育。经典的分批发酵是一个封闭系统，其中培养基的组分在发酵伊始设定并且在发酵期间不作更改。在发酵开始时，用所需生物接种培养基。在该方法中，允许发酵进行而不添加任何组分至该系统。一般，分批发酵就碳源添加而言视为一个“批次”，并且往往尝试控制下述因素，如pH和氧浓度。该分批系统的代谢物和生物质组成经常变化直至停止发酵之时。在分批培养物中，细胞从静止滞后期推进至高速生长对数期并最终至稳定期，在稳定期生长速率下降或停顿。若不处理，稳定期中的细胞最终死亡。通常而言，在对数期的细胞负责产物的大量产生。

对所述标准分批培养系统的一种合适变化是“补料分批发酵”系统。在典型分批培养系统的这种变化中，随发酵进行而增量地添加底物。当分解代谢物阻抑可能抑制细胞代谢时和当希望在培养基中具有有限量的底物时，补料分批培养系统是有用的。测量补料分批培养系统中的实际底物浓度是困难的，并且因而基于可度量因素如pH、溶解氧和废气如CO₂的分压进行估计。分批发酵和补料分批发酵是本领域常见且熟知的。

连续发酵是一种开放系统，其中连续地添加定义的发酵培养基至生物反应器并且同时取出等量的条件培养基用于加工。连续发酵通常使培养物保持在其中细胞主要处于对数期生长的恒定高密度。连续发酵允许调整影响细胞生长和/或产物浓度的一个或多个因素。例如，在一个实施方案中，将限制性营养物如碳源或氮源保持在固定速率上并且允许调节全部其他参数。在其他系统中，可以连续地变更影响生长的众多因素，同时通过培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续系统尽力保持稳定状态生长条件。因此，因抽取培养基所致的细胞损失应当针对该发酵中的细胞生长速率进行平衡。调节营养物和生长因素用于连续发酵工艺的方法以及使产物形成率最大化的技术是工业微生物领域已知的。

4.TrAA和其变体的组合物和用途

通过上述方法产生和纯化的TrAA和其变体用于多种工业用途。在一个实施方案中，TrAA和其变体用于淀粉转化工艺中，尤其用于已经发生液化的淀粉的糖化工艺。所需的终产物可以是可通过淀粉底物的酶转化作用产生的任意产物。例如，所需产物可以是富含麦芽糖的糖浆，其可以用在其他工艺中，如HFCS的制备中。备选地，该产物可以是富含葡萄糖的糖浆，例如所述的富含葡萄糖的糖浆可以直接用作结晶葡萄糖的来源或可以转化成众多的其他有用产物，如抗坏血酸中间体(例如葡糖酸；2-酮基-L-古洛糖酸；5-酮基-葡糖酸和2，5-二酮基葡糖酸)；1，3-丙二醇；芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；有机酸(例如乳酸、丙酮酸、琥珀酸、异柠檬酸和草酰乙酸)；氨基酸(例如丝氨酸和甘氨酸)；抗生素；酶；维生素和激素。

在又一个实施方案中，所述淀粉转化工艺可以在设计旨在产生燃料用或饮料用醇(即饮用醇)的发酵工艺之前或同时进行。本领域技术人员明白可以在产生这些终产物中使用的多种发酵条件。TrAA和其变体也用在制备食物的组合物和方法中。TrAA和其变体的这些不同用途在下文更详细地描述。

淀粉底物的制备

本领域普通技术人员十分清楚可以用来制备淀粉底物的可用方法，以用在本文所披露的方法中。例如，有用的淀粉底物可以从块茎、根、茎、豆科植物、禾谷植物或完整谷粒获得。更具体地，颗粒淀粉可以从玉米、玉米穗、小麦、大麦、黑麦、谷子、西米、木薯(cassava)、木薯(tapioca)、高粱、稻、豌豆、菜豆(bean)、香蕉或马铃薯获得。玉米含有约60-68％淀粉；大麦含有约55-65％淀粉；谷子含有约75-80％淀粉；小麦含有约60-65％淀粉；并且精米含有70-72％淀粉。特别构思的淀粉底物是玉米淀粉和小麦淀粉。来自谷粒的淀粉可以是研磨或完整的，并且包括玉米固形物，如谷粒(kernel)、糠麸和/或玉米穗。该淀粉可以是高度精制的生淀粉或来自淀粉精制工艺的原料。多种淀粉可商业地获得。例如，玉米淀粉可从Cerestar、Sigma和Katayama Chemical Industry Co.(日本)获得；小麦淀粉可从Sigma获得；甘薯淀粉可从Wako Pure Chemical Industry Co.(日本)获得；并且马铃薯淀粉可从Nakaari Chemical Pharmaceutical Co.(日本)获得。

淀粉底物可以是来自研磨完整谷粒的粗制淀粉，其含有非淀粉部分，例如，胚芽渣(germ residues)和纤维。研磨可以包括湿法研磨或干法研磨。在湿法研磨中，将完整谷粒浸泡在水或稀酸中以将谷粒分解成组成部分，如淀粉、蛋白质、胚芽、油、谷粒纤维。湿法研磨高效地分离胚芽和粗粉(即淀粉颗粒和蛋白质)并且尤其适用于生产糖浆。在干法研磨中，将完整谷粒研磨成细粉并在不筛分该谷粒的情况下加工成其组成部分。因此除淀粉之外，干法研磨的谷粒还包含显著量的非淀粉碳水化合物。大部分乙醇来自干法研磨。备选地，待加工的淀粉可以是高度精制的淀粉纯度(starchquality)，例如，纯度至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％。

淀粉的糊化和液化

如本文中所用，术语“液化”或“使液化”意指淀粉借以转化成粘度较低及链更短的糊精的工艺。通常，这个工艺包括淀粉的糊化，同时或随后添加α-淀粉酶，尽管任选地可以添加额外的诱导液化的酶。在一些实施方案中，如上述制备的淀粉底物与水混合成浆。该淀粉浆液可以含有干燥固体重量百分数约10-55％、约20-45％、约30-45％、约30-40％或约30-35％的淀粉。例如，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)可以用计量泵添加至该浆液。一般用于本申请的α-淀粉酶是热稳定的细菌α-淀粉酶，如地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。例如，通常以每千克淀粉干物质约1500单位供应该α-淀粉酶。为优化α-淀粉酶的稳定性和活性，将该浆液的pH调节至约pH 5.5-6.5并且一般添加约1mM钙(约40ppm游离钙离子)。其他α-淀粉酶可能需要不同条件。可以通过在后续反应步骤中降低pH或从浆液中除去钙使液化后浆液中残留的细菌α-淀粉酶失活。

可以将淀粉浆液及所述α-淀粉酶连续地泵过由蒸汽加热至105℃的喷射式蒸煮锅。糊化在这些条件下迅速发生，并且酶活性连同相当大剪切力开始水解淀粉底物。在喷射式蒸煮锅中的停留时间极短暂。部分糊化的淀粉可以送入一系列保持在100-105℃的容纳管并维持5分钟以完成糊化工艺。在收集槽中在90-100℃或更高温度上持续约1至2小时完成了成为所需DE的水解。这些收集槽可以含有折流板以防止回流混合。

如本文中所用，术语“次级液化”指初级液化(加热至90-100℃)后的液化步骤，此时使所述浆液冷却至室温。该冷却步骤可以是30分钟至180分钟，例如90分钟至120分钟。如本文中所用，术语“次级液化的分钟”指从开始次级液化至测量葡萄糖当量(DE)时刻止消逝的时间。

从上述工艺产生的液化淀粉一般含有约98％的寡糖和约2％的麦芽糖及0.3％的D-葡萄糖。此液化淀粉一般处于具有约10-50％ds；约10-45％；约15-40％；约20-40％；约25-40％；或约25-35％ds的浆液形式。

糖化：葡萄糖糖浆或麦芽糖糖浆的产生

使用TrAA和其变体，任选在另外的酶存在下，此液化淀粉可以糖化成葡萄糖糖浆或麦芽糖糖浆。糖化的产物的精确组成取决于所用的酶组合，以及所加工的颗粒淀粉类型。有利地，使用所提供的TrAA和其变体可获得的葡萄糖糖浆可以含有约96％w/w的D-葡萄糖。目前在任意糖化条件组合下可获得的葡萄糖的最大量是约95-97％。该葡萄糖糖浆可以在浓缩后直接用于产生高果糖糖浆或用于产生结晶葡萄糖。同样有利地，使用所提供的TrAA和其变体可获得的麦芽糖糖浆可以含有超过60％w/w的麦芽糖。

通常而言，TrAA或其变体将以每公吨干燥固体约0.01-1kg酶的量添加至颗粒淀粉底物的浆液。在一些实施方案中，以0.1-5kg/mt ds或0.3-1kg/mt ds或者以约0.5kg/mt ds添加TrAA或其变体。TrAA或其变体的比活性可以是约10,000-80,000SKBU/g酶或约15,000-60,000SKBU/g或约15,000-30,000SKBU/g。

TrAA或其变体可以以纯化酶的形式添加至浆液。备选地，TrAA或其变体可以作为分离酶的溶液添加。在一个实施方案中，TrAA或其变体以细胞提取物的形式添加，其中所述的细胞提取物从表达该TrAA或其变体的细胞培养物中产生。在另一个实施方案中，TrAA或变体以宿主细胞的形式添加，其中所述的宿主细胞表达TrAA或其变体并将其分泌至反应介质中，从而将酶持续地提供至反应。在这个实施方案中，表达TrAA或其变体的宿主细胞也可以表达除TrAA或其变体之外用来催化糖化的另一种酶。例如，宿主细胞(例如里氏木霉或黑曲霉)可以经工程化以共表达TrAA或其变体以及葡糖淀粉酶，例如TrGA或HgGA。在一个实施方案中，该宿主细胞被基因修饰，从而不表达宿主细胞内源性葡糖淀粉酶。

葡萄糖糖浆

在一个方面，TrAA和其变体用在产生富含葡萄糖的糖浆的糖化工艺中。为产生葡萄糖糖浆，TrAA或其变体一般随葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)(例如AMG^TM葡糖淀粉酶)一起添加。如表1、图1中所示并且在下文实施例中所讨论，在葡糖淀粉酶存在下受TrAA或其变体催化的糖化工艺可以产生接近或超过97％的葡萄糖浓度。有利地，最大葡萄糖浓度可以在比该反应仅用葡糖淀粉酶催化时的更少时间中实现。在一个实施方案中，最大葡萄糖浓度在12小时、24小时或36小时中实现。见实施例中的表2和相关文字。特别有利地，TrAA和其变体抑制从葡萄糖至麦芽低聚糖的逆反应，从而使所述最大葡萄糖浓度保持比常规糖化工艺中更长的时间。见表2。在一些实施方案中，所述最大葡萄糖浓度在达到该最大浓度后保持约12小时或约24小时。

一种示例性葡糖淀粉酶是具有优异比活性和热稳定性的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)和其变体。见美国公开申请号2006/0094080、2007/0004018和2007/0015266(Genencor International，Inc.)。TrGA的合适变体包括具有葡糖淀粉酶活性和与野生型TrGA具有至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的那些变体。TrAA和其变体有利地提高在受TrGA催化的糖化工艺中所产生的葡萄糖的产率。当不添加TrAA或其变体，TrGA一般在pH 4.3产生含约88％葡萄糖的溶液；然而，当添加TrAA或其变体至该反应时，TrAA和TrGA的混合物大量产生具有更高(例如94％)葡萄糖浓度的溶液。

备选地，该葡糖淀粉酶可以是从植物、真菌或细菌衍生的另一种葡糖淀粉酶。例如，所述葡糖淀粉酶可以是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶或其变体(例如，Boel等，EMBO J.3：1097-1102(1984)、WO 92/00381和WO00/04136(Novo Nordisk A/S))和泡盛曲霉葡糖淀粉酶(例如，WO84/02921(Cetus Corp.))。构思的其他曲霉属葡糖淀粉酶包括具有增强的热稳定性的变体，例如，G137A和G139A(Chen等，Prot.Eng.9：499-505(1996))；D257E和D293E/Q(Chen等，Prot.Eng.8：575-582(1995))；N182(Chen等，Biochem.J.301：275-281(1994))；A246C(Fierobe等，Biochemistry，35：8698-8704(1996))；和在位置A435和S436中具有Pro残基的变体(Li等，Protein Eng.10：1199-1204(1997))。构思的其他葡糖淀粉酶包括篮状菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，尤其从埃默森篮状菌(T.emersonii)(例如，WO 99/28448(Novo Nordisk A/S)、T.leycettanus(例如，美国专利号RE 32,153(CPC International，Inc.))、T.duponti或嗜热篮状菌(T.thermophilus)(例如，美国专利号4,587,215)衍生。构思的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)、尤其解淀粉热梭菌(C.thermoamylolyticum)(例如，EP 135,138(CPC International，Inc.)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(例如，WO 86/01831(MichiganBiotechnology Institute))的葡糖淀粉酶。合适的葡糖淀粉酶包括从米曲霉衍生的葡糖淀粉酶，如与WO 00/04136(Novo Nordisk A/S)的SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性的葡糖淀粉酶。商业化葡糖淀粉酶也是合适的，如AMG 200L；AMG 300L；SAN^TM SUPER和AMG^TM E(来自Novozymes)；

300(来自Genencor International，Inc.)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(来自DSM)；G-

G900(来自EnzymeBio-Systems)和G-G990ZR(低蛋白酶含量的黑曲霉葡糖淀粉酶)。葡糖淀粉酶一般以0.02-2.0GAU/g ds或0.1-1.0GAU/g ds(例如0.2GAU/gds)的量添加。

可以与TrAA或其变体使用的其他合适酶包括脱支酶，如异淀粉酶(EC3.2.1.68)。脱支酶可以按照本领域技术人员熟知的有效量添加。支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)例如

也是合适的。一般以100U/kg ds添加支链淀粉酶。其他合适的酶包括蛋白酶，如真菌蛋白酶和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括从曲霉属如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉；毛霉属(Mucor)(例如，米赫毛霉(M.miehei))和根霉属(Rhizopus)获得的那些真菌蛋白酶。其他合适的酶包括但不限于纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶和角质酶。

液化通常以连续工艺进行，而糖化往往以分批工艺进行。糖化一般在约60℃温度和pH约4.0-4.5(例如pH 4.3)最有效，这需要冷却液化淀粉并调节其pH。糖化可以例如在约40℃、约50℃或约55℃至约60℃之间的温度进行。糖化通常在搅拌罐内进行，这可能花费几小时以填充罐或倒空罐。酶一般在搅拌罐灌满时以相对于干燥固体的固定比率添加或在灌充阶段开始时以单剂量添加。产生葡萄糖糖浆的糖化反应一般运行约24-72小时或24-28小时或尤其是24或更少的小时，例如20-21小时。当已经达到最大DE时，例如通过加热至85℃持续5分钟终止该反应。进一步孵育将产生较低的DE，最终至约90DE，原因在于积累的葡萄糖以热动力平衡方式再聚合成异麦芽糖。作为总溶解干燥固体的百分数，葡萄糖的终产率可以是至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一个实施方案中，在连续工艺中产生葡萄糖，并且基本上全部葡萄糖用来产生发酵产物，如乙醇。

4.3.2.麦芽糖糖浆

在另一方面，TrAA或其变体在产生高麦芽糖糖浆的工艺中使用。在TrAA和其变体提供的优势当中包括能够在相对低的pH使用TrAA和其变体。在图2中描述了用于产生麦芽糖(DP2)的TrAA的代表性的pH依赖性。因为糖化一般在酸性条件下升高的温度，例如60℃，pH 4.3进行，所以TrAA或其变体在这些条件下的高活性有利地允许在对糖化中所用的其他酶(如葡糖淀粉酶)为最佳的条件下使用TrAA或其变体。

用TrAA或其变体产生的高麦芽糖糖浆具有有利的特性。使用TrAA或其变体实现的麦芽糖浓度可比于或高于用常规生麦芽糖酶如BBA或真菌α-淀粉酶-澄解酶

L所实现的麦芽糖浓度。见表3和表4以及图2。在一个实施方案中，麦芽糖的浓度达到约50％至约62％的干燥固体百分数。在另一个实施方案中，麦芽糖的浓度达到约55％、约60％或约61％至约62％。此外，使用TrAA获得的高麦芽糖糖浆可以含有浓度约8-9％的葡萄糖，而在可比较条件下(例如使用澄解酶

L)产生的常规高麦芽糖糖浆一般具有约4-5％的葡萄糖浓度。见表3。相对高的葡萄糖产率有利地导致利用TrAA或其变体产生的高麦芽糖糖浆比利用常规酶产生的高麦芽糖糖浆更甜。

TrAA或其变体可以在至少一种其他酶存在下由自身催化高麦芽糖糖浆的产生。与TrAA或其变体使用的特别合适的酶是支链淀粉酶。支链淀粉酶的添加显著提高麦芽糖的产率，如表5和图3中所示。添加的支链淀粉酶量可以是约0.1kg/mt ds、约0.25kg/mt ds或约0.5kg/mt ds。在一个实施方案中，添加所述量的支链淀粉酶以使该反应中所产生的麦芽糖增加最多。表5中的数据表明在下文实施例中附表5的文本中所指出的用来产生麦芽糖的特定条件下，当支链淀粉酶的浓度是约0.25kg/mt ds时，所述支链淀粉酶对麦芽糖形成的影响最大。

适于与TrAA或其变体使用的其他酶包括细菌β-淀粉酶(例如BBA)、其他真菌α-淀粉酶(例如澄解酶

L)或葡糖淀粉酶。其他合适的酶包括蛋白酶，如真菌蛋白酶和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括从曲霉属如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉；毛霉属如米赫毛霉；和根霉属获得的那些真菌蛋白酶。其他合适的酶包括但不限于纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、异淀粉酶和角质酶。

β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)是外切作用生麦芽糖淀粉酶，其催化1，4-α-糖苷键水解成支链淀粉和相关葡萄糖聚合物，因而释放麦芽糖，β-淀粉酶已经从多种植物和微生物分离。参见Fogarty等PROGRESS IN INDUSTRIALMICROBIOLOGY，第15卷，第112-115页(1979)。这些β-淀粉酶具有范围从40℃至65℃的最适温度和范围从约4.5至约7.0的最适pH。构思的β-淀粉酶包括但不限于来自大麦的β-淀粉酶

BBA 1500、

DBA，Optimalt^TM ME、Optimalt^TM BBA(GenencorInternational，Inc.)；和Novozym^TM WBA(Novozymes A/S)。

HFCS生产和发酵

在一个实施方案中，用TrAA、其变体或包含TrAA或其变体的酶掺合物处理所产生的可溶性淀粉水解产物被转化成基于高果糖淀粉的糖浆(HFSS)，如高果糖的玉米糖浆(HFCS)。这种转化可以使用葡萄糖异构酶、尤其固定在固体支持物上的葡萄糖异构酶实现。将pH提高至约6.0至约8.0例如pH 7.5，并且通过离子交换除去Ca²⁺。合适的异构酶包括

IT(Novozymes A/S)；G-

IMGI和G-

G993、

G-G993、G-

G993液体和IGI。异构化之后，该混合物一般含有约40-45％的果糖，例如42％的果糖。

在另一个实施方案中，所述可溶性淀粉水解产物，尤其富含葡萄糖的糖浆，通过所述水解产物与发酵生物一般在约32℃温度，如30℃至35℃接触进行发酵。发酵产物包括乙醇、柠檬酸、谷氨酸单钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡萄糖酸-δ-内酯和异抗坏血酸钠。糖化和发酵工艺可以以同时糖化和发酵(SSF)工艺进行。发酵任选地可以包括乙醇的后续纯化和回收。在发酵期间，肉汤或“啤酒(beer)”的乙醇含量可以达到至少约8％、至少约12％或约16％乙醇。可以将该肉汤蒸馏以产生富集(例如纯度96％)的乙醇溶液。此外，由发酵产生的CO₂可以用CO₂涤气器收集、压缩并销售用于其他用途，例如碳酸饮料或干冰生产。来自发酵工艺的固体废弃物可以作为富含蛋白质的产品(例如家畜饲料)使用。

产乙醇微生物包括表达醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的酵母(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和细菌(例如，运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis))。在一些实施方案中，该产乙醇微生物表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，为使木糖转化成木酮糖的酶。酵母的商业来源包括RED STAR(Red Star)；

(DSM Specialties)和(Alltech)。

在一个实施方案中，表达异源性葡糖淀粉酶和/或TrAA或其变体的真菌细胞在分批或连续发酵条件下培育。经典的分批发酵是一个封闭系统，其中培养基的组分在发酵伊始设定。也就是说，允许发酵进行而不添加任何组分至该系统。在分批培养物中，细胞从静止滞后期推进至高速生长对数期并最终至稳定期，在稳定期生长速率下降或停顿。通常，在对数期的细胞负责葡糖淀粉酶和/或TrAA或其变体的大量异源性产生。

该工艺的一种变化是“补料分批发酵”系统，其中随发酵进行而增量地添加底物。当分解代谢物阻抑可能抑制细胞代谢时和当希望在培养基中具有有限量的底物时，补料分批培养系统是有用的。通过可度量因素如pH、溶解氧和废气如CO₂的分压的变化来估计补料分批培养系统中的实际底物浓度。分批发酵和补料分批发酵是本领域常见且熟知的。

连续发酵是一种开放系统，其中连续地添加定义的发酵培养基至生物反应器并且同时取出等量的条件培养基用于加工。连续发酵通常使培养物保持在其中细胞主要处于对数期生长的恒定高密度。连续发酵允许调整细胞生长和/或产物浓度。例如，在一个实施方案中，将限制性营养物如碳源或氮源保持在固定速率上并且允许调节全部其他参数。因为生长维持在稳定状态上，所以因抽取培养基所致的细胞损失应当针对该发酵中的细胞生长速率进行平衡。优化连续发酵工艺和使产物形成率最大化的方法是工业微生物学领域熟知的。

用于烘烤和食品制备的组合物和方法

对于面粉用于烘烤和食物生产的商业和家庭用途而言，重要的是维持面粉中适宜水平的α-淀粉酶活性。过高的活性水平可以产生粘稠和/或夹生并且因而不可销售的产品。α-淀粉酶活性不足的面粉可能不含有对于适度酵母功能而言足够的糖，从而产生干燥、多屑的面包或烘烤产品。因此，可以将单独或与另一种α-淀粉酶组合的TrAA或其变体添加至面粉以增强面粉中的内源性α-淀粉酶活性水平。所述TrAA或其变体在该实施方案中可以在淀粉存在下具有例如30-90℃，40-80℃，40-50℃，45-65℃或50-60℃范围的最适温度。1％可溶性淀粉溶液中的最适pH可以例如在pH4.5至6之间。

谷物如大麦、燕麦、小麦以及植物组分如玉米、酒花和稻也用于酿造，即工业酿造和家庭酿造。酿造中所用的组分可以是非麦芽化(unmalted)或可以是麦芽化的(malted)，即部分萌发的，导致酶(包括α-淀粉酶)的水平提高。为成功酿造，需要有足够水平的α-淀粉酶活性以确保适宜水平的糖用于发酵。因此，可以将单独或与另一种α-淀粉酶组合的TrAA或其变体添加至用于酿造的组分中。

如本文中所用，术语“面粉”意指磨制或研磨的谷粒。术语“面粉”还可以意指已经被碾碎或捣碎的西米或块茎产物。在一些实施方案中，面粉也可以含有除研磨或捣碎的谷物或植物物质之外的组分。尽管不意图是限制性的，额外组分的实例是膨胀剂。谷粒包括小麦、燕麦、黑麦和大麦。块茎产物包括木薯面粉、木薯粉和蛋糕粉。术语“面粉”也包括碎玉米粉、玉米粉(maize-meal)、稻粉、全麦粉、自发粉、木薯面粉、木薯粉、碎稻、富强粉和蛋糕粉。

如本文中所用，术语“原料(stock)”意指被碾碎或破碎的谷粒和植物组分。例如，用于啤酒生产中的大麦是已经被粗略研磨或碾碎以产生适于生产发酵用浆的稠度的谷物。如本文中所用，术语“原料”包括处于碾碎或粗磨形式的任意前述类型的植物和谷物。本文中所述的方法可以用来确定面粉或原料中的α-淀粉酶活性水平。

TrAA或其变体也可以单独或与其他淀粉酶组合添加以防止或迟滞老化，即烘烤产品的屑粒硬化。防老化的淀粉酶量一般将在每千克面粉0.01-10mg酶蛋白(例如0.5mg/kg ds)的范围内。可以与TrAA或其变体组合使用的额外防老化淀粉酶包括内切淀粉酶(endo-amylase)，例如来自芽孢杆菌属的细菌内切淀粉酶。所述额外的淀粉酶可以是另一种生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)，例如来自芽孢杆菌属。

是来自嗜热脂肪芽胞杆菌菌株NCIB11837的一种示例性生麦芽糖α-淀粉酶并且在Christophersen等，Starch 50：39-45(1997)中描述。防老化内切淀粉酶的其他实例包括从芽孢杆菌如地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌衍生的细菌α-淀粉酶。所述防老化淀粉酶可以是外切淀粉酶，如β-淀粉酶，例如，来自植物来源，如大豆；或来自微生物来源，如芽孢杆菌。

包含TrAA或其变体的烘烤用组合物还可以包含磷脂酶。所述磷脂酶可以具有A₁或A₂活性以从磷脂中除去脂肪酸，形成溶血磷脂。它可以具有或不具有脂肪酶活性，即对甘油三酯底物的活性。该磷脂酶一般具有30-90℃(例如30-70℃)范围的最适温度。添加的磷脂酶可以是动物来源的，例如来自胰腺(例如牛或猪胰腺)、蛇毒或蜂毒。备选地，该磷脂酶可以源自微生物，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，如以下属或种，曲霉属，黑曲霉；网柄菌属(Dictyostelium)、盘基网柄菌(D.discoideum)；毛霉属、爪哇毛霉(M.javanicus)、高大毛霉(M.mucedo)、细孢毛霉(M.subtilissimus)；链孢霉属(Neurospora)、粗糙链孢霉(N.crassa)；根毛霉属(Rhizomucor)、微小根毛霉(R.pusillus)；根霉属(Rhizopus)、少根根霉(R.arrhizus)、日本根霉(R.japonicus)、匐枝根霉(R.stolonifer)；核盘菌属(Sclerotinia)、大豆核盘菌(S.libertiana)；毛癣菌属(Trichophyton)、红色毛癣菌(T.rubrum)；维氏核盘菌属(Whetzelinia)、核盘菌(W.sclerotiorum)；芽孢杆菌属(Bacillus)、相当大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)；肠杆菌属(Enterobacter)、产气肠杆菌(E.aerogenes)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)；爱德华菌属(Edwardsiella)、迟缓爱德华菌(E.tarda)；欧文氏菌属(Edwardsiella)、草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃西氏菌属(Escherichia)、大肠杆菌；克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；变形杆菌属(Proteus)、普通变形杆菌(P.vulgaris)；普罗威登斯菌属(Providencia)、斯氏普罗威登斯菌(P.stuartii)；沙门氏菌属(Salmonella)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)、液化沙雷氏菌(S.liquefasciens)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏菌属(Shigella)、福氏志贺菌(S.flexneri)；链霉菌属(Streptomyces)、紫红链霉菌(S.violeceoruber)；耶尔森氏菌属(Yersinia)、小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)；镰孢属、尖镰孢(F.oxysporum)(菌株DSM 2672)。

所述磷脂酶以改善焙烤后开始期间尤其头24小时期间面包柔软度的量添加。磷脂酶的量一般在每千克面粉0.01-10mg酶蛋白(例如0.1-5mg/kg)的范围内。也就是说，磷脂酶活性通常将在20-1000脂肪酶单位(LU)/kg面粉的范围内，其中脂肪酶单位定义为以阿拉伯胶作为乳化剂并且以三丁精作为底物，在30℃，pH 7.0每分钟释放1μmol丁酸所需的酶量。

面团的组合物通常包含小麦全粉或小麦粉和/或其他类型的全粉、面粉或淀粉，如玉米粉、玉米淀粉、黑麦全粉、黑麦粉、燕麦粉、燕麦全粉、大豆粉、高粱全粉、高粱粉、马铃薯全粉、马铃薯粉或马铃薯淀粉。所述面团可以是新鲜的、冷冻的或半烘烤的(par-baked)。面团可以是膨松面团或待进行发酵的面团。面团可以以多种方式，如通过添加化学膨胀剂(例如碳酸氢钠)或通过添加发酵剂，即发酵面团进行发酵。面团也可以通过添加合适的酵母培养物如酿酒酵母(面包酵母)培养物，例如酿酒酵母市售菌株进行发酵。

该面团也可以包含其他常规面团成分，例如蛋白质，如乳粉、面筋和大豆；卵(例如，全蛋、卵黄或卵白)；氧化剂如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮二甲酰胺(ADA)或过硫酸铵；氨基酸如L-半胱氨酸；糖；或盐，如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙。面团还可以包含脂肪，例如甘油三酯，如颗粒脂肪或短链脂肪。面团还可以包含乳化剂，如甘油单酯或甘油二酯、甘油单酯或甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的聚甘油酯、甘油单酯的乳酸酯、甘油单酯的乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、或溶血卵磷脂。尤其，面团可以在不添加乳化剂的情况下制作。

任选地，额外的酶可以与所述防老化淀粉酶和磷脂酶一起使用。所述额外的酶可以是第二种淀粉酶，如淀粉葡糖苷酶、β-淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶或所述额外酶可以是肽酶，尤其外肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶，尤其戊聚糖酶如木聚糖酶、蛋白酶、蛋白质二硫化物异构酶例如WO 95/00636中披露的蛋白质二硫化物异构酶(例如糖基转移酶)、分支酶(1，4-α-葡聚糖分支酶)、4-α-葡聚糖转移酶(糊精糖基转移酶)或氧化还原酶，例如过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂加氧酶、L-氨基酸氧化酶或糖氧化酶。所述额外酶可以是来自任意来源，包括来自哺乳动物和植物，并且特别来自微生物(细菌、酵母或真菌)，并且可以通过本领域常规使用的技术获得。

木聚糖酶一般是微生物来源的，例如，衍生自细菌或真菌，如曲霉菌株，尤其棘孢曲霉、黑曲霉(参考WO 91/19782)、泡盛曲霉(例如，WO91/18977)或塔宾曲霉(A.tubingensis)(例如，WO 92/01793)；来自木霉菌株，例如里氏木霉；或来自腐质霉菌株，例如特异腐质霉(例如，WO 92/17573)。

和Novozym

是从里氏木霉产生的市售木聚糖酶制备物。所述淀粉葡糖苷酶可以是黑曲霉淀粉葡糖苷酶(如

)。其他有用的淀粉酶产品包括

A 1000或A 5000(可从丹麦Grindsted Products获得)和

H或P(可从荷兰Gist-Brocades获得)。葡萄糖氧化酶可以是真菌葡萄糖氧化酶，尤其黑曲霉葡萄糖氧化酶(如

)。示例性蛋白酶是

示例性脂肪酶可以从嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(腐质霉属)、根毛霉属、假丝酵母属(Candida)、曲霉属、根霉属或假单胞菌属菌株、尤其从疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)(柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa))、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、黑曲霉、德氏根霉(Rhizopusdelemar)或少根根霉或洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)衍生。在具体的实施方案中，该脂肪酶可以例如是从如WO 88/02775中所述南极假丝酵母(Candida antarctica)衍生的脂肪酶A或脂肪酶B或该脂肪酶可以从例如EP238,023中所述的米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)或例如EP 305,216中所述的柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)或例如EP 214,761和WO 89/01032中所述的洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)衍生。

该方法可以用于从具有柔软或易碎特征的面团制备的任意类型烘烤产品，即白色、浅色或深色类型烘烤产品。烘烤产品实例是面包，尤其白色全麦面包或黑麦面包，一般为块状或棍状形式，如但不限于法国长棍式面包(French baguette-type bread)、口袋面包(pita bread)、墨西哥薄饼、蛋糕、烙饼、饼干、小甜饼(cookies)、馅饼皮、脆皮面包、馒头、皮萨饼等。

在另一个实施方案中，TrAA或其变体可以在预混料(pre-mix)中使用，所述的预混料包含面粉和防老化淀粉酶、磷脂酶和磷脂。该预混料可以含有其他面团改进和/或面包改进添加剂，例如，包括上文提及的酶的任意添加剂。在一个方面，该TrAA或其变体是包含防老化淀粉酶和磷脂酶的酶制品的组分，用作烘烤添加剂。

酶制品任选地处于颗状或结块粉剂形式。该制品可以具有窄的粒径分布，超过95％(重量)的粒子处在25至500μm范围内。颗粒剂和结块粉可以通过常规方法制备，例如通过将TrAA或其变体喷到流化床制粒机中的载体上。该载体可以由具有合适粒径的颗粒性核组成。该载体可以是可溶性或不溶性的，例如盐(如NaCl或硫酸钠)、糖(如蔗糖或乳糖)、糖醇(如山梨醇)、淀粉、稻、玉米粗磨粉或大豆。

另一个方面构思了对包含TrAA或其变体的粒子即α-淀粉酶粒子的包封。为制备经包封的α-淀粉酶粒子，使所述酶与足量的食品级脂质接触以悬浮全部α-淀粉酶粒子。如本文中所用，食品级脂质可以是不溶于水但溶于非极性有机溶剂如烃或乙醚中的任意天然有机化合物。合适的食品级脂质包括但不限于，饱和或不饱和的脂肪或油形式的甘油三酯。组成饱和甘油三酯的脂肪酸和其组合的实例包括但不限于丁酸(衍生自乳脂肪)、棕榈酸(衍生自动物和植物脂肪)和/或硬脂酸(衍生自动物和植物脂肪)。组成不饱和甘油三酯的脂肪酸和其组合的实例包括但不限于棕榈油酸(衍生自动物和植物脂肪)、油酸(衍生自动物和植物脂肪)、亚油酸(衍生自植物油)和/或亚麻酸(衍生自亚麻籽油)。其他合适的食品级脂质包括但不限于从上文讨论的甘油三酯衍生的甘油单酯和甘油二酯、磷脂和糖脂。

将所述食品级脂质、尤其处于液体形式的食品级脂质与粉末形式的α-淀粉酶粒子以这样的方式接触，从而所述脂质材料覆盖至少大多数(例如100％)α-淀粉酶粒子的至少一部分表面。因此，每个α-淀粉酶粒子独立地包封在脂质中。例如，向全部或基本上全部α-淀粉酶粒子提供薄的、连续的脂质包封膜。这可以通过如下方式实现，首先将一定量的脂质倾入容器，并随后混入α-淀粉酶粒子，从而所述脂质彻底湿润每个α-淀粉酶粒子的表面。在短暂的搅拌时间后，回收在其表面携带大量脂质的经包封α-淀粉酶粒子。如此应用至α-淀粉酶粒子的包封层的厚度可以通过选择所用脂质的类型和在需要时通过重复该操作旨在建立更厚的膜进行控制。

经充填的递送载体(loaded delivery vehicle)的贮存、操作和掺入可以借助包装的混合物(packaged mix)进行。这种包装的混合物可以包含所述经包封的α-淀粉酶。然而，该包装的混合物还可以含有制造商或面包师所需要的额外成分。在经包封的α-淀粉酶已经掺入面团后，面包师继续进行用于产品的正常生产工艺。

包封α-淀粉酶粒子的优势是双重的。首先，对那些热不稳定酶而言，食品级脂质保护所述酶在烘烤工艺期间免于热变性。结果是，虽然α-淀粉酶在发酵和烘烤阶段期间得到稳定并得到保护，但在最终烘烤物品中α-淀粉酶从该保护性包衣中释放出来，从而α-淀粉酶水解聚葡聚糖中的糖苷键。所述经充填的递送载体也提供该活性酶持续释放至烘烤物品。也就是说，在烘烤工艺后，从保护性包衣中以抵抗老化机制并且因而降低老化速率的速率持续释放活性α-淀粉酶。

通常，应用至α-淀粉酶粒子的脂质的量可以从所述α-淀粉酶总重量的几个百分数至该重量的许多倍之间变化，这取决于该脂质的本质、该脂质应用至α-淀粉酶粒子的方式、待处理面团混合物的组成和所涉及面团揉混操作的剧烈程度。

经充填的递送载体，即经脂质包封的酶，以有效量添加至用来制备烘烤物品的成分，旨在延长此烘烤物品的贮存期限。面包师计算如上文所述制备的经包封α-淀粉酶的量，其中需要所述的量以实现想要的防老化作用。基于所包封的酶的浓度和α-淀粉酶对所指定面粉的比例，计算所需的经包封α-淀粉酶的量。尽管已经发现宽泛的浓度是有效的，然而如已经讨论那样，可观察到的防老化改善并不与α-淀粉酶浓度线性对应，不过在某些最低水平以上，α-淀粉酶浓度的大幅提高产生微弱的进一步改善。具体烘烤生产中实际使用的α-淀粉酶浓度可能比必需的最小量高得多，目的是为面包师提供针对由该面包师疏忽所致低估误差的某些保障。酶浓度的下限由面包师希望实现的最小防老化作用决定。

制备焙烤物品的方法可以包括：a)制备脂质包被的α-淀粉酶粒子，其中基本上全部α-淀粉酶粒子均被包被；b)混合含有面粉的面团；c)在所述混合结束前添加脂质包被的α-淀粉酶粒子至该面团并在所述脂质包衣从α-淀粉酶上消去前终止混合；d)使面团醒发；和e)焙烤该面团以提供烘烤物品，其中所述α-淀粉酶在混合、醒发和烘烤阶段没有活性而在烘烤物品中有活性。

经包封的α-淀粉酶可以在混合循环期间(例如接近混合循环结束时)添加至面团。在混合阶段中的某个时间点添加经包封的α-淀粉酶，其中该时间点允许经包封的α-淀粉酶充分地扩散至整个面团；然而，在所述保护性包衣从α-淀粉酶粒子上被剥离之前终止所述混合阶段。取决于面团的类型及体积和混合作用及速度，在任何位置处可能需要1至6分钟或更多时间以将经包封的α-淀粉酶混合入所述面团，不过平均需要2至4分钟。因此，几个变量可决定确切的操作。首先，经包封的α-淀粉酶的量应当具有足以使经包封的α-淀粉酶扩散至整个面团混合物的总体积。若经包封α-淀粉酶的制备物是高度浓缩的，可能需要添加额外的油至该预混物，随后将所述经包封的α-淀粉酶添加至面团。配方和生产方法可能需要具体修改；然而，当从面团中扣除25％在面包面团配方中规定的油并且用作浓缩的经包封α-淀粉酶的载体时，其中接近混合循环结束时添加，则通常可以产生良好结果。在面包或其他烘烤制品，尤其具有低脂肪含量的那些烘烤制品(例如法式面包)中，含大约1％干面粉重量的经包封α-淀粉酶混合物足以使经包封α-淀粉酶恰当地与面团混合。合适百分数的范围是宽泛的并且取决于配方、成品和个人面包师的生产方法学要求。第二，经包封的α-淀粉酶混悬剂应当以足够时间添加至混合物，以便完全混入面团，但不是持续这样的时间，以至于过度机械作用从经包封的α-淀粉酶粒子上剥离保护性脂质包衣。

7.织物退浆组合物及用途

还构思了使用TrAA或其变体处理织物(例如使织物退浆)的组合物和方法。织物处理方法是本领域熟知的(例如见美国专利号6,077,316)。例如，在一个方面，通过一种方法改善了织物的触感和外观，所述的方法包括使该织物与溶液中的TrAA或其变体接触。在一个方面，该织物在压力下用所述溶液处理。

在一个方面，在织物的织造期间或之后或在退浆阶段或一个或多个额外的织物加工步骤期间应用TrAA或其变体。在织物的织造期间，纱线暴露于相当大的机械应力。在机械织机上织造之前，经纱往往用上浆淀粉或淀粉衍生物涂敷以提高其拉伸强度并防止断裂。TrAA或其变体可以在织造期间或之后应用，以除去这些上浆淀粉或淀粉衍生物。在织造后，TrAA或其变体可以用来在进一步加工该织物之前除去上浆涂层，以确保均匀和耐洗涤的结果。

TrAA或其变体可以单独地或与其他退浆化学试剂和/或退浆酶一起作为洗涤添加剂例如在含水组合物中使用，旨在使织物(包括含棉织物)退浆。TrAA或其变体也可以在用于靛蓝染色的牛仔布织物和服装上产生石磨水洗外观的组合物和方法中使用。对于衣服制造，可以将织物裁切并缝制成衣服或服装，随后对其进行整理。特别地，已经为制造粗斜纹牛仔布开发了不同的酶整理方法。牛仔布服装的整理通常始于酶退浆步骤，在该步骤期间服装受到解淀粉酶作用以赋予织物柔软度并使棉更容易进行后续的酶整理步骤。TrAA或其变体可以在整理牛仔布服装(例如“生物石磨水洗法”)、酶退浆和赋予织物柔软度的方法和/或整理工艺中使用。

本领域技术人员显而易见可以对所使用的组合物和方法作出各种修改和变化而不脱离预期用途的精神和范围。因此，若所述修改和变化处在所附权利要求书及其等同物的范围内，则它们是本发明的修改和变化。

实施例

实施例1：

1.1TrAA基因的克隆

使用BIO101 Fast

系统，根据供应商(Qbiogene，Inc.，Irvine，CA)描述的方法，从马铃薯葡萄糖肉汤(Difco^TM目录号254920)中液体培养物的菌丝团分离里氏木霉QM6a的染色体DNA。使用Quick离心柱(Qiagen，Inc.，Valencia，CA；目录号28106)纯化所述DNA。使用根据美国能源部联合基因组研究所的里氏木霉基因组数据库中的预测核苷酸序列设计的具有TrAA特异序列的引物，正向引物NSP331(SEQ ID NO：6：ATGAAGCTCCGGTACGCTCTCC)和反向引物NSP332(SEQ ID NO：7：TCACGAAGACAGCAAGACAATGGGC)分离TrAA基因。所述引物在5’末端侧翼分布有attB序列(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)。使用里氏木霉QM6a染色体DNA作为模板。

PCR混合物含有以下成分：4μL正向引物(10μM)；4μL反向引物(10μM)；1μL模板DNA(500ng/μL)；2μLdNTP混合物(10mM)；10μL 10xCx缓冲液和0.5μL

Cx热启动DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA；目录号600410)。添加去离子水至100μL总体积。PCR方案如下：初始变性98℃30秒；分别变性98℃10秒；复性68℃30秒；延伸72℃45秒，30个循环；和终末延伸步骤72℃10分钟。

PCR片段通过在1％琼脂糖中电泳进行分析。使用凝胶提取纯化试剂盒(Qiagen目录号28706)分离具有预期大小的片段。将PCR片段克隆至

进入载体pDONR201并转化至大肠杆菌DH5α Max Efficiency细胞(Invitrogen目录号18258012)。测定所插入DNA的核苷酸序列，从中推导TrAA基因的基因组DNA序列(SEQ ID NO：1)。

1.2里氏木霉的转化和发酵/TrAA的表达

含有TrAA基因的载体DNA重组至里氏木霉表达载体pTrex3g，该载体在WO 2006/060062中详细描述。使用PDS-1000/Helium系统(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA；目录号165-02257)的粒子轰击法，将所得表达载体转化至从RL-P37衍生的里氏木霉宿主菌株，具有多个基因缺失(Δcbh1、Δcbh2、Δegl1、Δegl2，即“四重缺失”；参见WO 92/06184和WO 05/001036)。下文概述此方案，并且参考WO 05/001036的实施例6和11。

制备了来自里氏木霉四重缺失菌株的孢子悬液(大约5×10⁸个孢子/mL)。将100-200μL孢子悬液涂布在极限培养基(MM)乙酰胺培养基平板的中心。MM乙酰胺培养基是0.6g/L乙酰胺；1.68g/L CsCl；20g/L葡萄糖；20g/L KH₂PO₄；0.6g/L CaCl₂.2H₂O；痕量元素溶液；20g/L Noble琼脂；pH 5.5。1000X痕量元素储液含有5.0g/L FeSO₄·7H₂O；1.6g/LMnSO₄·H₂O；1.4g/L ZnSO₄·7H₂O和1.0g/L CoCl₂.6H₂O。随后使该孢子悬液在MM乙酰胺培养基的表面上干燥。

转化按照制造商说明书进行。简而言之，在微量离心管中放置60mg的M10钨粒子。添加1mL乙醇，并将该溶液静置15秒。将粒子以15,000转/分钟离心15秒。除去乙醇，并将钨粒子用无菌dH₂O洗涤3次，随后添加250μL的50％(v/v)无菌甘油。在微量离心管中放置25μL钨粒子悬液。随后添加以下溶液，伴以连续涡旋：5μL(100-200ng/μL)质粒DNA、25μL的2.5M CaCl₂和10μL的0.1M亚精胺。将粒子离心3秒。除去上清液，并将粒子用200μL的100％乙醇洗涤并离心3秒。除去上清液，添加24μL的100％乙醇并通过抽吸混合，随后取出8μL的粒子等份样并置于干燥器中大载体圆盘的中心上。一旦钨/DNA溶液变干，将大载体圆盘置于轰击室中，并放置具有孢子的MM乙酰胺平板，并根据制造商说明书开展轰击操作。在用钨/DNA粒子轰击铺板的孢子后，将平板在30℃温育。转化的菌落转移至MM乙酰胺培养基的新鲜平板并在30℃温育。

1.3表达的TrAA的α-淀粉酶活性的展示

在MM乙酰胺平板上生长5日后，显示稳定形态的转化体接种含有30mL Proflo培养基的250mL摇瓶。Proflo培养基含有30g/Lα-乳糖；6.5g/L(NH₄)₂SO₄；2g/L KH₂PO₄；0.3g/L MgSO₄·7H₂O；0.2g/L CaCl₂；痕量元素溶液；2mL/L 10％吐温80；22.5g/L ProFlo棉籽粉(TradersProtein，Memphis，TN)；和0.72g/L CaCO₃。伴以140转/分钟摇动，在28℃生长2日后，将10％的Proflo培养物转移至含有30mL限定乳糖的培养基的250mL摇瓶。限定乳糖的培养基的组成是5g/L(NH₄)₂SO₄；33g/LPIPPS缓冲液；9g/L酪蛋白氨基酸；4.5g/L KH₂SO₄；1.0g/L MgSO₄·7H₂O；5mL/L Mazu DF60-P消泡剂(Mazur Chemicals，IL)；痕量元素溶液；pH5.5。消毒后，添加40mL/L 40％(w/v)乳糖溶液至该培养基。限定乳糖的培养基摇瓶在28℃，140转/分钟温育4-5日。

通过离心去除菌丝体，并且分析上清液的总蛋白(BCA蛋白质测试试剂盒，Pierce CA；目录号23225)。使用Ceralpha试剂(亚苄基封闭的对硝基苯基麦芽庚糖苷)(Megazyme International Ireland，Ltd.，Wicklow，Ireland；目录号K-CERA)作为底物，测试α-淀粉酶活性。

培养上清液的样品与适宜体积的2X含还原剂的上样缓冲液混合，并且使用

Novex 10％Bis-Tris凝胶，利用MES SDS运行缓冲液，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质。蛋白质用SimplyBlue^TM SafeStain(Invitrogen，Carlsbad，CA)染色。在图5，泳道1中显示来自培养上清液的粗样品的蛋白质染色图谱。显而易见该宿主细胞表达了相对大量的蛋白质，其表观分子量约47kDa，如与泳道M中的分子量标记比较所确定。估计这种TrAA的纯度是约89％。

1.4TrAA基因产物的生物化学表征

在3L培养物中生长表达TrAA的转化体。宿主细胞将TrAA以约15-20g/L浓度分泌至该培养物。使用具有10,000Da分子量截止值的超滤装置(Pall Corp.，Omega^TM Membrane，目录号OS010c10)浓缩培养物滤液。使用AKTA探索者100FPLC系统(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)纯化粗酶制备物。用25mM Tris，pH 6.0平衡HiPrep 16/10 FFQ-Sepharose柱(Amersham BioSciences，目录号17-5190-01)，并且用100mM NaCl，25mM Tris，pH 6.0从该柱洗脱蛋白质。使用Cbind 200树脂(Novagen目录号701212-3)并且利用含有500mM NaCl的50mM Tris pH7.0作为洗脱缓冲液，开展第二个亲和层析步骤。进行该亲和纯化后，TrAA可以通过如上所述的超滤再次浓缩。通过SDS-PAGE分析纯化的TrAA，并且在图5，泳道2中显示结果。估计这种TrAA的纯度是约98％。

使用Ceralpha试剂(Megazyme International Ireland，Ltd.，Wicklow，Ireland；目录号K-CERA)作为底物，确定该基因产物的α-淀粉酶活性的pH和温度曲线。在测试条件下，如图6A中所示，TrAA显示约pH 5-6的最适pH，并且如图6B中所示，TrAA显示约42℃的最适温度。

实施例2：

TrAA用于提高由葡糖淀粉酶在低pH催化的糖化反应中葡萄糖的产率。TrAA(批号GCI2004017/018-UF)如实施例1的1.3节中所述进行纯化。葡糖淀粉酶来自GA-L，批号901-04290-001(Genencor International，Inc.)，其活性为385GAU/g。底物由如下制备的液化淀粉底物组成：745g生玉米淀粉用水稀释以产生32％w/w ds的浆液。添加热稳定的细菌α-淀粉酶Ethyl(Genencor International，Inc.)批号107-04107-001至浓度0.3kg/mt ds，并且溶液在92℃液化25分钟。使用本领域熟知的方法，开展碘试验以测量残余淀粉浓度。

将液化淀粉冷却至60℃并用20％v/v硫酸调节pH至4.2。以下文所示浓度添加TrAA和

4060，并且反应在60℃进行30小时。在该反应结束时，在用HPLC级水1∶40稀释样品并用0.45微米滤器过滤该样品后，使用HPLC确定由反应产生的DPn。对于HPLC分析，将20μL样品注射至Phenomenex Rezex ROA-有机酸(H+)柱并且在60℃于HPLC级水的流动相中，在16分钟运行中解析。通过折射率的变化测量洗脱液中的产物(DPn)。

表1显示从代表性反应中获得的DPn；图1描述作为本实验中所用酶浓度的函数的DP1产生。可以见到，TrAA在葡糖淀粉酶存在下比仅有葡糖淀粉酶本身时产生了具有更高葡萄糖浓度的富含葡萄糖的糖浆。

表1：

GA	TrAA	时间(小时)	DP1	DP2	DP3	DP4+
							0.6kg/mt ds	无	30	95.7	1.7	0.2	2.5
0.6kg/mt ds	0.06kg/mt ds	30	96.7	1.7	0.1	1.5
							0.6kg/mt ds	0.12kg/mt ds	30	96.7	1.8	0.2	1.3
0.6kg/mt ds	0.18kg/mt ds	30	97.0	1.8	0.2	1.1
							0.6kg/mt ds	0.3kg/mt ds	30	97.2	1.8	0.2	0.8

实施例3：

由TrAA和葡糖淀粉酶催化的糖化反应比仅由葡糖淀粉酶催化的反应在更短的时间中达到更高水平的葡萄糖。如实施例2中所述，将液化的生玉米淀粉制备为32％ds的浆液。将此液化淀粉冷却至60℃并调节pH至4.2，随后以表2中所示的浓度添加酶。如实施例1的1.3部分中所述，制备了TrAA(批号GCI12004017/018-UF)。以385GAU/g提供作为GA-L(批号901-04290-001)的葡糖淀粉酶。如上文实施例2中所示，在反应结束时测量DPn。

表2：

向所述糖化反应添加TrAA引起该反应中DP1即葡萄糖提高。发现DP1生产的最适条件是葡糖淀粉酶为1kg/mt ds并且TrAA为0.5kg/mtds。DP1在这些条件下达到95.9％w/w ds，这高于没有TrAA时所获得的DP1最大水平95.2％w/w ds。DP1最大水平在TrAA存在下于24小时后达到，但在只有葡糖淀粉酶的情况下仅于24小时后达到。在0.5kg/mt dsTrAA存在下，DP1至高级寡糖的逆转换直到启动该反应后48小时才开始。

实施例4：

TrAA也用于糖化反应中提高麦芽糖的产率。如以下实验中测定，TrAA在相对低的pH展示生麦芽糖活性。底物由液化淀粉底物组成，其中所述的液化淀粉底物如实施例2中所述制备，除了生玉米用水稀释以产生30％w/w ds浆液，向所述底物添加0.25kg/mt ds的

Ethyl(Genencor International，Inc.，批号107-04107-001)。在92℃液化25分钟后，将液化淀粉冷却至55℃并用20％v/v硫酸调节pH。如上文实施例2中所述测量DPn。图2描述了由0.5kg/mt ds TrAA(批号GCI12004017/018-UF)催化反应48小时后DP2生产的pH依赖性。如图2中所示，TrAA在pH 5.0至5.5显示最佳活性；然而，TrAA在4.5至6.0的pH范围内也显示几乎最佳的活性。该实验表明TrAA在4.5的相对低pH是高活性的。

实施例5：

TrAA可以催化产生DP2到这样的水平，该水平与用生麦芽糖真菌α-淀粉酶-澄解酶

L(Genencor International，Inc.)所获得的那些水平是可比较的。根据上述实施例1中所述的方法，从里氏木霉产生并纯化TrAA。用于本实验的TrAA(批号150906)显示约18,000SKBU/g的比活性。还测试了与

L-1000(Genencor International，Inc.，批号107-04224-001)形式的支链淀粉酶组合的TrAA，其中所述的支链淀粉酶具有约1040PU单位/g的比活性。本实验中澄解酶

L(批号107-04330-001)的比活性是约41,000SKBU/g。

液化淀粉如实施例2中所述制备并调节至55℃，pH 5.5或60℃，pH4.5。以下文所示浓度添加酶，并且反应在所示温度进行48小时。在启动反应后24小时和48小时时，使用实施例2中所述的方法测量反应期间产生的DPn。表3显示从代表性反应中获得的DPn；图3描述糖化反应48小时后，获得的作为酶浓度(单位SKBU/g)函数的DP2浓度。

表3：

截至48小时，在55℃，pH 5.5的10SKBU/g澄解酶

L存在下，DP2浓度已经升高到约58％w/w ds。通过比较，由20SKBU/g TrAA在60℃，pH 4.5催化的反应截至48小时产生约55％DP2。然而在20SKBU/g TrAA和0.25kg/mt支链淀粉酶存在下，DP2在48小时中升高到约59％w/w ds，超过了用澄解酶

L获得的浓度。进一步地，TrAA本身或与支链淀粉酶组合的情况下产生富含麦芽糖的糖浆，所述富含麦芽糖的糖浆具有比用澄解酶L所获得的DP1浓度具有更高的DP1浓度：约11％w/w ds对约4％w/w ds。因此，该实验显示TrAA可以在低pH用来产生高麦芽糖糖浆，其中所述糖浆含有与用澄解酶

L获得麦芽糖水平可比较的麦芽糖水平，以及更高水平的葡萄糖。

实施例6：

在低pH使用时，TrAA显著地超过其他常规的生麦芽糖淀粉酶，如以下实验中所示。所用的实验条件与实施例5中相同，除了该反应在58℃，pH 4.6进行和由0.2kg/mt ds BBA(β-淀粉酶；批号05189-001)，0.2kg/mt ds澄解酶

L(批号9016231002)或0.5kg/mt ds TrAA(批号GCI2004017/018-UF)催化DPn生产之外。如表4中所示，在TrAA存在下，获得了较BBA或澄解酶

L存在下明显更高的DP2浓度。

表4：

实施例7：

TrAA催化的DP2生产因添加支链淀粉酶而显著提高。在以下实验中，实验条件与实施例5中所述相同，除了该反应在58℃，pH 4.6进行之外。以表5中所示的浓度添加

L-1000(Genencor International，Inc.；批号9016167004，1165PU/g)形式的支链淀粉酶。该反应在58℃，pH 4.6进行所示的时间段。如表5中所示，0.1-0.25kg/mt ds支链淀粉酶截至48小时明显地提高由TrAA催化的DP2产生。图4描述在本实施例中所述的各种条件下在48小时时形成的DP2。

表5：

本文中提到的全部参考文献通过引用的方式完整并入本文作为参考用于全部目的。

Claims (14)

1.分离的多肽，其由SEQ ID NO：3组成。

2.分离的多肽，其由SEQ IDNO：3的第21-463位残基组成。

3.编码根据权利要求1所述多肽的多核苷酸。

4.权利要求3的多核苷酸，其由SEQ ID NO：2组成。

5.载体，其包含权利要求3的多核苷酸。

6.细菌细胞，其包含权利要求5的载体。

7.表达权利要求3的多核苷酸的宿主细胞。

8.权利要求7的宿主细胞，其中所述宿主细胞是木霉属(Trichordermasp.)。

9.权利要求7的宿主细胞，其中所述的宿主细胞还表达编码异源性葡糖淀粉酶的核酸。

10.糖化液化淀粉以产生富含葡萄糖的糖浆的方法，包括：添加根据权利要求1或2的多肽至液化淀粉溶液，添加葡糖淀粉酶至液化淀粉溶液，和糖化液化淀粉溶液，其中所述的糖化液化淀粉溶液产生了富含葡萄糖的糖浆。

11.权利要求10的方法，其中所述多肽以每公吨干燥固体0.3-1kg添加至所述液化淀粉溶液。

12.权利要求10的方法，其中所述的液化淀粉溶液是20-35％w/w干燥固体的液化淀粉浆液。

13.淀粉加工组合物，其包含权利要求1或2的多肽。

14.烘烤的方法，包括添加权利要求1或2的多肽至待烘烤的物质，和烘烤该物质。

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