JP5194034B2 - トウモロコシ澱粉の糖化を増強するトリコデルマ・レセイ(trichodermareesei)a−アミラーゼ - Google Patents
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Description
配列表
(1) 液状化:α-アミラーゼ(EC3.2.1.1)は、最初に30-40%w/wの乾燥固体(ds)を含むデンプン懸濁液をマルトースデキストランへ分解するために使用される。α-アミラーゼは内部α-1,4-D-グルコシド結合の無作為な切断を触媒するエンドヒドロラーゼである。液状化は通常、高温、例えば約90-100℃で行われるので、熱に安定なα-アミラーゼ、例えばバシラス属のα-アミラーゼが、この工程には好まれる。
(2) 糖化:グルコアミラーゼと/又はマルトースα-アミラーゼは、普通、液状化の後に生成されたマルトデキストランの非還元末端の加水分解を触媒し、D-グルコース、マルトース及びイソマルトースを遊離するために使用される。脱分岐酵素、例えば、プルラナーゼは糖化を促すために使用できる。糖化は通常、高温、例えば60℃、pH4.3で酸性条件下で起こる。この工程で使用されるグルコアミラーゼは通常、菌類から得られる。例えば、Optidex(商標登録)L400で使用されるアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)グルコアミラーゼ(AnGA)またはフミコラ・グリセア(Humicola grisea)グルコアミラーゼ(HgGA)である。この用途に現在使用されているマルトース α-アミラーゼは植物アミラーゼとアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)由来のα-アミラーゼ、Clarase(商標登録)Lの活性成分、を含む。
(3) 異性化:高グルコース含量のシロップは、甘い製品を望む場合には、さらに加工を受けフルクトースにされる。グルコースをフルクトースにする異性化はグルコースイソメラーゼで触媒され、約42%(w/v)のフルクトース、50-52%のグルコース、及び他の糖の混合物を生成する。さらに操作を加えて最終的にフルクトースの含量が、例えば42%、55%、又は90%の市販品質のHFCSを生成できる。
菌類のα-アミラーゼはトリコデルマ・レセイから提供される。TrAAは現在使用されているα-アミラーゼに勝るいくつかの利点を提供する。第一に、TrAAは比較的低いpHと高い温度で活性であり、この酵素を同一の反応条件で菌類のグルコアミラーゼと組み合わせて使用することを可能にする。これはpHと温度がα-アミラーゼ又はグルコアミラーゼの最適な使用のため再調整されなければならないバッチプロセスで、糖化反応を行わせる必要をなくす。第二に、プルラナーゼと組み合わせて、TrAAは、普通使用されるより高価な酵素、例えばClarase(商標登録) Lと同一の効率でマルトースの製造を触媒する。
この詳細な説明に従い、以下の略号と定義が使用される。本願で使用される場合、文脈から明らかに違う場合を除き、単数形は複数をもさす。例えば、「酵素」というときは複数のそのような酵素を含み、「調合剤」というときは1以上の調合剤と、本願技術分野の技術者に知られているそれらの均等物などをさす。
「アミラーゼ」は、特に、デンプンの分解を触媒できる酵素をいう。一般的に、α-アミラーゼ(EC 3.2.1.1;α-D-(1→4)-グルカングルカノヒドロラーゼ)は無作為にデンプン分子内部のα-D-(1→4)O-グリコシド結合を切断する、エンド型酵素として定義される。対照的に、エキソ型アミロース分解酵素、例えばマルトースα-アミラーゼ(EC 3.2.1.133);β-アミラーゼ(EC 3.2.1.2;とα-D-(1→4)-グルカン マルトヒドロラーゼ)、は基質の非還元末端からデンプン分子を切断する。β-アミラーゼ、α-グルコシダーゼ(EC3.2.1.20;α-D-グルコシド グルコヒドラーゼ)、グルコアミラーゼ(EC3.2.1.3;α-D- D-(1→4)-グルカン グルコヒドロラーゼ)、及び製品に特異的なアミラーゼは、デンプンから特定の長さのマルトオリゴ糖を生成できる。グルコアミラーゼはアミロースとアミロペクチン分子の非還元性末端からグルコシル残基を遊離する。グルコアミラーゼは、α-1,4結合よりはるかに遅い速度ではあるが、α-1-6とα-1-3結合の加水分解も触媒する。
1.2 略号
以下の略号が、別に指示がない限り使用される。
ADA アゾジカルボンアミド
AnGA アスペルギルス・ニゲル グルコアミラーゼ
ATCC アメリカンタイプカルチャーコレクション
BBA Spezyme(商標登録) BBA 1500L β-アミラーゼ
cDNA 相補的DNA
DE デキストロース等価物
DEAE ジエチルアミノエタノール
DNA デオキシリボ核酸
DNS 3,5-ジニトロサリチル酸
DPn n個のサブユニットの重合度
ds 乾燥固体
EC 酵素分類のための酵素委員会
EDTA エチレンジアミン四酢酸
FGSC 菌類遺伝子貯蔵センター
G173A 173位のグリシン(G)残基がアラニン(A)残基により置換されていること。アミノ酸は本願技術分野で共通の単一の略号により指定されている。
GA グルコアミラーゼ
GAU グルコアミラーゼ活性単位
HFCS 高フルクトース含有コーンシロップ
HFSS 高フルクトース含有デンプン由来シロップ
HgGA フミコラ・グリセア グルコアミラーゼ
HS 高重合度糖類(higher sugars)(DPn、n>3)
Kb キロベース
LAT B.リケニホルミス(B.licheniformis)α-アミラーゼ
LB Luria Bertani 液体培地
LU リパーゼ力価単位、酵素1単位量当たりのホスホリパーゼ活性の尺度
MOPS 3-(n-モルホリノ)プロパンスルホン酸
mRNA メッセンジャーリボ核酸
mt メトリックトン(1000kg)
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PEG ポリエチレングリコール
ppm 百万当たりの部分
PU プルラナーゼ又はプルラナーゼ単位
RT-PCR 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
SD Sabouraud デキストロース液体培地
SDS-PAGE ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
SKBU/g ds 乾燥固体1グラム当たりのα-アミラーゼ力価単位 1α-アミラーゼ単位は、定量の条件下1時間当たりの1.0g の限界デキストリン基質(limit-dextrin substrate)を、デキストリン化(dextrinize)する。
1X SSC 0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0
SSF 同時的糖化、醗酵
TE 10mM トリス、pH7.4、1mM EDTA
TrAA トリコデルマ・レセイ α-アミラーゼ
TrGA トリコデルマ・レセイ グルコアミラーゼ
w/v 重量/容量
w/w 重量/重量
YM 酵母モルト抽出液体培地
μL マイクロリットル
SEQ IDNO:3を含む単離され、かつ/又は精製されたポリペプチドが提供される。これは、20個のアミノ酸先導配列(leader sequence)を含む野生型トリコデルマ・レセイα-アミラーゼ(TrAA)である。ある実施態様では、TrAAはポリペプチドの成熟型であり、20個のアミノ酸の先導配列は開裂され、このポリペプチドのN-末端は、SEQ ID NO:3の21位のアスパラギン酸(D)残基で始まる。SEQ ID NO:3を含むこのポリペプチドをコードする核酸、又はSEQ ID NO:3の21-463位のアミノ酸残基をコードする核酸もまた提供される。ある実施態様では、TrAAをコードする核酸はSEQ ID NO:1を含むゲノムDNAである。別の実施態様では、この核酸はSEQ ID NO:2を含むcDNAである。本願技術分野の技術者により良く理解されているように、遺伝子コードは縮重している。つまりある場合には多数のコドンが同一のアミノ酸をコードすることがある。核酸は、TrAAまたはその変異種をコードするゲノムDNA、mRNA及びcDNAを含む。
酵素変異種はその核酸及び一次ポリペプチド配列、三次構造のモデル、及び/またはその特異的活性により特徴づけることができる。TrAA変異種の他の特徴は、例えば、安定性、pH範囲、酸化安定性及び熱的安定性を含む。ある面では、野生型TrAAの性能特性を維持する一方、このTrAA変異種は野生型TrAAより高い水準で発現される。発現と酵素活性の水準はこの分野の技術者に知られている標準的な定量を用いて評価できる。別の面では、変異種は野生型酵素と比較して高温(つまり、70-120℃)での安定性、及び/又はpHの限度(つまり、pH4.0から6.0、またはpH8.0から11.0)を向上させるなど性能特性の向上を示す。
ある実施態様では、野生型TrAAはT.reesi株に発現され、使用前に、任意に単離される。別の実施態様では、野生型TrAAが、発現後、精製される。特に高水準で野生型TrAAを発現する有用なT.reesi株は技術者に良く知られた技術を用いて選択される。高水準の発現は、培地1リットル当たり約12-20gのTrAAまたはその変異種、約14-18g/L、または約16-19g/Lである。他の実施態様では、この野生型TrAAまたはその変異種は宿主細胞に組換えにより発現される。このTrAA遺伝子は、例えば米国で公開された出願No.2007/0004018とNo.2006/0094080に記載されているようにクローンされ、発現できる。
ある実施態様では、微生物はTrAA又はその変異種を発現するように遺伝学的に操作を受ける。適した宿主細胞は糸状菌細胞を含み、これは、例えば、アスペルギルス属、トリコデルマ属、フザリウム属またはペニシリウム属の株でも良い。特に適した宿主細胞は、アスペルギルス・ニードランス、A・アワモリ、A・オリゼ、A・アクレアタス(A.aculeatus)、A.・ニゲル、A・ジャポニカス、トリコデルマ・レセイ、T・ビブレ、フザリウム・オキシポラム及びF・ソラニを含む。アスペルギルス株は、Wardら、Appl.Microbiol.Biotechnol.39:738-743(1993)とGoedegebuurら、Curr.Gene.41:89-98(2002)に開示されている。特に適した実施態様では、宿主細胞は、比較的高い水準、例えば15-20g/LでTrAAを産生するTrichoderma reesei株である。適したT.reeseiは知られており、非限定的な例は、ATCC No 13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No. 56767及びNRRL 15709を含む。ある実施態様では、宿主株はRL-P37から誘導され、これはSheir-Neiseら、Appl.Microbiol.Biotechnology 20:46-53(1984)に開示されている。TrAAまたはその変異種が真核宿主細胞で発現されるときは、特に適した実施態様の発現されたTrAAは野生型のTrAAで見出されるものと同一のパターンのグリコシル化を受けている。特に適した宿主細胞は、米国特許第5,874,276号及びWO05/001036(Genencor International, Inc.)に記載された手順に従い操作される。
ある実施態様では、TrAAまたはその変異種をコードする核酸を含むDNA構造体は宿主細胞で発現されるように構成されている。TrAAをコードする代表的な核酸はSEQ ID NO:1及び2を含む。ある実施態様では、このDNA構造体はTrAAコーディング配列に機能的に連結している調節配列を含む発現ベクターにより宿主細胞へ移される。
宿主細胞へのDNA構造体又はベクターへの導入は、形質転換;電気穿孔;核のマイクロインジェクション;形質導入;トランスフェクション、例えば、リポフェクション(lipofection)を介した、及びDEAE-デキストリンを介したトランスフェクション;リン酸カルシウムDNA沈殿との混合;DNAコート微粒子銃による高速導入;プロトプラスト融合のような技術を含む。一般的な形質転換の技術は本願技術分野で知られている。例えば、Ausbelら(1987)、上記、第9章;Sambrookら(2000)、上記;及びCampbellら、Curr.Genet.16:53-56(1989)参照。トリコデルマの異種タンパク質の発現は、例えば、米国特許第6,022,725号;米国特許第6,268,328号;Harkkiら Enzyme Microb. Technol. 13 :227-233;EP244,234;EP215,594;及びNevalainen らMOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Leong and Berka編 Marcel Dekker Inc., New Yrok(1992)、pp.129-148、”The molecular biology of Trichoderma and its application to the expression of both homologous and heterologous genes” に述べられている。また、Aspergillus株の形質転換についてCaoら、Science 9:991-1001(2000)も参照されよ。一実施態様では、一般的に安定な形質転換はTrAA又はその変異種が安定に宿主細胞染色体へ組み込まれるベクター系により行われる。形質転換された細胞は次に既知の技術により精製される。
宿主細胞におけるTrAAとその変異種の発現を評価するために、定量は発現されたタンパク質、対応するmRNA、またはマルトース産生α-アミラーゼ活性を測定できる。例えば、適当な定量はノーザン及びサウザーンブロッティング、PT-PCR(逆転写ポリメラーゼ連鎖反応)、及び適当にラベルされたハイブリダイズプローブを用いた、取り出しを要しない(in situ)ハイブリダイゼーションを含む。適当な定量はまた、サンプル中のTrAA活性を測定することも含み、例えば、培地中のグルコースのような還元糖を直接に測定する定量による。例えば、グルコース濃度はグルコース試薬キットNo.15-UV(Sigma Chemical Co.)または、Technicon Autoanalyzerのような機器を用いて決定しても良い。グルコアミラーゼ活性は、3,5-ジニトロサリチル酸(DNS)法により定量しても良い。Gotoら、Biosci.Biotechnol.Biochem.58:49-54(1994)参照。
一般的に、細胞培養で産生されるTrAAまたはその変異種は、培地中に分泌され、例えば、不要な化合物を細胞培養培地から除くことにより、精製または単離される。ある場合には、TrAAまたはその変異種は細胞の加水分解により回収しても良い。そのような場合、この酵素は産生した細胞から本願の技術分野の技術者により日常的使用されている技術を用いて精製される。例には、アフィニティークロマトグラフィー、高分離イオン交換(high resolution ion-exchange)、疎水性相互作用クロマトグラフィー、二相分配、エタノールによる沈殿、逆相HPLC、シリカまたは、DEAEのような陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫酸アンモニウム沈殿、例えば、Sephadex G-75を用いたゲルろ過、を非限定的に含む。
ある実施態様では、TrAAまたはその変異種を発現する菌類はバッチ又は連続醗酵条件で培養される。古典的なバッチ醗酵は閉鎖システムであり、培地成分は醗酵の開始時に投入され、醗酵の間変わらない。醗酵の開始時に、培地に目的生物が加えられる。この方法では、醗酵はどの成分もこのシステムに追加することなく起こる。通常、バッチ醗酵は炭素源の追加に関し「バッチ」であり、pH及び酸素濃度のような因子の調節は行われることが多い。このバッチ系の代謝とバイオマス組成は醗酵が停止されるときまで継続して変化する。バッチ培地内では、細胞の増殖は定常的な遅滞期から高速対数増殖期そして最後の定常期(ここで増殖速度は減少または半減する)を経て進行する。処置をしない場合、定常期の細胞は最後には死滅する。一般に、対数増殖期の細胞が、製品の生産の大部分に寄与している。
上記の方法によるTrAAとその変異種は種々の工業的用途に有用である。ある実施態様では、TrAAとその変異種はデンプン変換工程では有用であり、特に液状化を受けたデンプンの糖化工程においてそうである。目的の最終製品はデンプン基質の酵素的変換により製造されるどのような製品でも良い。例えば、目的の製品は高マルトース含有のシロップであり、HFCSの製造のような他の工程に使用できるものである。または製品は高グルコース含有シロップであり、たとえば、結晶性ブドウ糖の原料として直接に使用しうるか、アスコルビン酸中間体(例.グルコン酸;2-ケト-L-グルコン酸;5-ケト-グルコン酸;2,5-ジケトグルグルコン酸);1,3-プロパンジオール;芳香族アミノ酸(例.チロシン、フェニルアラニン及びトリプトファン);有機酸(例.乳酸、ピルビン酸、コハク酸、イソクエン酸及びオギザロ乳酸);アミノ酸(例.セリンとグリシン);抗生物質;酵素;ビタミン;及びホルモンのような多くの他の有用な製品に変換できる。
本願技術分野の一般的技術者は本願に開示された製造法で使用するデンプン基質を調製するために使用できる方法を良く知っている。例えば、有用なデンプン原料は塊茎、根、茎、マメ科植物、穀物または全穀類から得られる。より特異的には、顆粒デンプンはトウモロコシ、トウモロコシの穂軸、小麦、大麦、ライ麦、マイロ、サゴ、キャッサバ、タピオカ、モロコシ、米、エンドウ、豆、バナナまたは馬鈴薯から得ても良い。トウモロコシは約60-68%のデンプンを含む。大麦は約55-65%のデンプンを含む。キビは約75-80%のデンプンを含む。小麦は約60-65%のデンプンを含む。脱穀精米された米は70-72%のデンプンを含む。特に認められているデンプン原料はトウモロコシ澱粉と小麦澱粉である。穀類から得られるデンプンは磨り潰されても良く、全体のままでも良く、穀粒、種皮、及び/またはトウモロコシの穂軸のようなコーンソリッド(corn solid)を含んでも良い。このデンプンは、未精製のデンプンまたはデンプン精製工程による精製された原料でも良い。種々のデンプンも市販されている。例えば、トウモロコシ澱粉はCerestar,Sigma及びKatayama Chemical Industry 社.(日本)から入手できる。;小麦デンプンはSigmaから入手できる。甘藷デンプンは、Wako Pure Chemical Industry 社(日本)から入手できる。馬鈴薯デンプンはNakaari Chemical Pharmaceutical 社(日本)から入手できる。
デンプンのゼラチン化と液状化
約30-40%、又は約30-35%の乾燥固体の重量パーセントで、デンプンを含んでいる。例えば、α-アミラーゼ(EC 3.2.1.1)が、定量ポンプによりスラリーへ加えられても良い。この用途に使用されるα-アミラーゼは、通常、熱的に安定であり、B.リケニフォルミスα-アミラーゼのような細菌α-アミラーゼである。このα-アミラーゼは普通、デンプンの乾燥体1kg当たり約1500単位で供給される。α-アミラーゼ安定性と活性を最適化するために、スラリーのpHは約pH5.5-6.5に調節され、約1mMのカルシウム(約40ppmの遊離カルシウムイオン)が通常加えられる。他のα-アミラーゼは異なる条件を必要としても良い。液状化後のスラリー中に残存する細菌α-アミラーゼは、その後の反応工程でpHを低くすることにより、またはスラリーからカルシウムイオンを取り除くことにより不活性化されてもよい。
糖化:グルコースまたはマルトースシロップの製造
ある面では、TrAAとその変異種は糖化工程で使用されグルコースを多量含むシロップを製造するために用いられる。グルコースシロップを製造するために、TrAAまたはその変異種は、通常グルコアミラーゼ(EC 3.2.1.3)、例えば、AMGTMグルコアミラーゼとともに加えられる。表1、図1に示すように、また下記の実施例で述べるように、グルコアミラーゼの存在下TrAAまたはその変異種により触媒された糖化工程は、97%に近いまたは超えるグルコース濃度を与えることができる。最高のグルコース濃度が、この反応がグルコアミラーゼのみにより触媒された場合よりも短い時間で達成されえることが便宜である。ある実施態様では、最高グルコース濃度は12時間、24時間または36時間達成される。表2と関連する実施例の説明を参照せよ。TrAAとその変異種がグルコースからマルトースオリゴ多糖へ戻る反応を抑え、その結果グルコースの最高濃度が従来の糖化工程より長い時間維持されることが特に有利である。表2参照。ある実施態様では、最高濃度に達した後、グルコースの最高濃度は約12時間または約24時間維持される。
TrGAの適した変異種はグルコアミラーゼ活性と、野生型TrGAと少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%配列の同一性もつ株を含む。TrAAとその変異種はTrGAにより触媒される糖化工程で製造されるグルコースの収量を高めることが有利である。TrAAまたはその変異種を加えない場合、TrGAは通常pH4.3で約88%の溶液を与える。しかし、TrAAまたはその変異種が反応に加えられると、TrAAとTrGAの混合物はより高いグルコーズ濃度、例えば、94%の溶液を与える。このことは重要である。
、WO92/00381とWO00/04136(Novo Nordisk A/S));とA・アワモリグルコアミラーゼ(例.WO84/02921(Centus Corp.)でも良い。他の認められるアスペルギルスグルコアミラーゼは熱的安定性が向上した変異種、例えば、G137AとG139A(Chenら、Prot.Eng.9:499-505(1996));D257EとD293E/Q(Chenら、Prot. Eng.8:575-582(1995));N182(Chenら、Biochem.J.301:275-281(1994));A246C(Fierobe ら、Biochenistry, 35:8968-8704(1996));及びA435とS436位にPro残基をもつ変異種(Liら、Protein Eng. 10:1199-1204(1997))を含む。他の認められるグルコアミラーゼはタラロマイセス(Talaromyces)グルコアミラーゼ、特にT・エメルロニ(T.emersonii)(例.WO99/28448(Novo Nordisk A/S)、T・レイセタナス(例.米国特許第RE32,153号(CPC International,Inc.))、T・デュポンチ(T.duponti)、またはT・テルモフィラス(例.米国特許第4,587,215号)を含む。認められる細菌グルコアミラーゼはクロストリウム属、特にC.テルモアミロリチカム(C.thermoamylolyticum)(例.EP135,138号(CPC International, Inc.)とC・テルモヒドロスルフリカム(C.thermohydrosulfuricum)(例.WO86/01831(Michigan Biotechnology Institute))由来のグルコアミラーゼを含む。適したグルコアミラーゼはアスペルギルス・オリゼ由来のグルコアミラーゼを含む。例えば、WO00/04136(Novo Nordisk A/S)の、SEQ IDNO:2に示されたアミノ酸配列と50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、または90%もの相同性をもつグルコアミラーゼである。また、AMG 200L;AMG 300L;SANTMSUPERとAMGTME(Novozymes製);OPTIDEX(商標登録)300(Genencor International, Inc,製);AMIGASETMとAMIGASETMPLUS(DSM製);G-ZYME(商標登録)G900(Enzyme Bio-Systems);及びG-ZYME(商標登録)G990ZR(低タンパク質含量のA.nigerグルコアミラーゼ)のような市販のグルコアミラーゼが適している。グルコアミラーゼは通常、0.02-2.0GAU/g dsまたは0.1-1.0GAU/g ds、例えば0.2GAU/g dsで加えられる。
別の実施態様では、TrAAまたはその変異種は高マルトース含量のシロップを製造する工程で使用される。TrAAとその変異種による利点には、TrAAとその変異種を比較的低いpHで使用できることがある。マルトース(DP2)の製造に用いるTRAAのpH依存性の代表例は図2に示されている。糖化は通常、高温で酸性条件下、例えば、60℃、pH4.3で起こるので、これらの条件下でのTrAAまたはその変異種の高活性は、TrAAまたはその変異種が、糖化で使用される他の酵素、例えば、グルコアミラーゼにとり最適である条件下で使用される場合に利点となる。
ある実施態様では、TrAA、その変異種またはTrAAまたはその変異種を含む混合物による加水分解物の処理によって産生された可溶性デンプン加水分解物は、高フルクトース含有デンプンベースシロップ(HFSS)、例えば、高フルクトース含有コーンシロップ(HFCS) へ変換される。この変換はグルコースイソメラーゼ、特に固体担体上に固定化されたグルコースイソメラーゼを用いて達成できる。pHは約6.0から約8.0、例えばpH7.5へ上げ、Ca2+はイオン交換により除かれる。適したイソメラーゼはSweetzyme(商標登録)、IT(Novozymes A/S);G-zyme(商標登録)IMGI、及びG-zyme(商標登録)G993、Ketomax(商標登録)、G-zyme(商標登録)G993、G-zyme(商標登録)G993液及びGenSweet(商標登録)IGIを含む。異性化に続き、この混合物は通常約40-45%のフルクトース、例えば42%のフルクトースを含む。
ベーキングと食品用の穀物粉の商用または家庭での使用では、穀物粉に適当な水準のα-アミラーゼ活性を維持することが重要である。余りにも高い活性水準があると、粘り気がありかつ/または生焼けで、そのため販売できない製品となるかもしれない。不十分なα-アミラーゼ活性をもつ穀物粉は適切に酵母が働くには不十分な糖しか含まず、乾燥した、もろいパンまたは焼き製品などになるかもしれない。従って、穀物粉中の、α-アミラーゼの水準を高めるためTrAAまたはその変異種がそれのみで又は別のα-アミラーゼと組み合わせて、穀物粉へ加えられてもよい。この実施態様のTrAAとその変異種は、例えば、30-90℃、40-80℃、40-50℃、45-65℃または50-60℃の範囲にデンプン存在下での最適温度を持つことができる。1%可溶デンプンの最適pHは、例えばpH4.5から6でも良い。
麦芽が混ぜられなくてもよく、混ぜられて、つまり部分的に大麦が発芽して、α-アミラーゼ等の酵素の水準が高くなっても良い。醸造を成功させるために、発酵に用いる適当な水準の糖を得るために適当な水準のα- アミラーゼ酵素活性が必要である。従って、TrAAまたはその変異種が、それのみで又は別のα-アミラーゼと組み合わせて醸造に使用する原料に加えられても良い。
F・オキシスポラム(F.ocysporum)由来である。
パン生地は新鮮、冷凍または焼くときに調製されても良い。このパン生地はパン種を入れた生地またはパン種が加えられる予定の生地でも良い。この生地は種々の方法で、パン種が加えられても良く、例えば化学的なパン種、例えば重炭酸ナトリウム、または酵母を加えることにより、つまり生地を発酵させても良い。生地は、また適した酵母、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(パン酵母)、例えばS・セレビシエ(S.cerevisiae)の市販されている株を加えても良い。
オランダ)を含む。グルコースオキシダーゼは菌類のグルコースオキシダーゼでも良く、特にアスペルギルス・ニゲルグルコースオキシダーゼ(例えばGluzyme(登録商標))でも良い。プロテアーゼの例は、Neutrase(登録商標)である。リパーゼの例はテルモマイセス(Thermomyces)(フミコラ)、リゾムコール(Rhizomucor)、カンジダ属、アスペルギルス属、リゾパス属(Rhizopus)、またはシュードモナス属(Pseudomonas)、特にテルモマイセス・ラヌジノサス(Thermomyces lanuginosus)(フミコラ・ラヌギノサ)(Humicola lanuginosa)、リゾムコル・ミヘイ(Rhizomucor miehei)、カンジダ・アンタークチカ(Candida antarctica)、アスペルギル・ニゲル(Aspergillus niger)、リゾパス・デレマール(Rhizopus delemar)またはリゾパス・アルヒザス(Rhizopus arrhizus)または、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)の株に由来しても良い。具体的な実施例では、リパーゼは、例えば、WO88/02775に記載されているように、カンジダ・アンタークチカ由来のLipase AまたはLipase Bでも良く、またはリパーゼは例えばEP238,023に記載されているようなリゾムコル・ミヘイに由来しても良く、または、例えばEP305,216に記載されている、フミコラ・ラヌギノサ、または例えばEP214,761とWO89/01032に記載されているシュードモナス・セパシアに由来しても良い。
TrAAとその変異種を用いて、布地類を処理する組成物と方法(例えば、織物の糊抜き)もまた考えられている。布地類の処理法は本願技術分野で良く知られている(例えば、米国特許第6,077,316号)。例えば、ある面では、布地の感触と外観はこの布地をTrAAやその変異種を溶液中で接触させることを含む方法により改善される。ある面では、この布地は圧力下でこの溶液で処理される。
実施例1
1.1 TrAA遺伝子のクローニング
T・レセイQM6aの染色体DNAは、供給元(Qbiogene,Inc.,Irvine,カリフォルニア)により記載された方法に従いBIO101 Fast Prep(登録商標)Systemを使用したPotato Dextrose Broth(DifcoTMCat. No.254920)中の液体培養の菌糸体の集団から単離された。DNAはQuick Spin column(Qiagen, Inc.,カルフォルニア;Cat.第28106)を使用して精製された。TrAA遺伝子はTrAA-特異的配列をもつプライマーを使用して単離された。順方向プライマーNSP 331(SEQ ID NO:6:ATGAAGCTCCGGTACGCTCTCC)と逆方向のプライマーNSP322(SEQID NO:7:TCACGAAGACAGCAAGACAATGGGC)は、米国エネルギー省共同ゲノム研究所(United States Department of Energy Joint Genome Institute)のトリコデルマ・レセイゲノムのデータベースの予測されたヌクレオチド配列に従い設計された。これらのプライマーは、5’末端にGateway(登録商標)attB 配列(Invitrogen Corp., Carlsbad,カルフォルニア)が付されている。T.・レセイQM6a染色体のDNAがテンプレートとして使用された。
1.2 T・レセイの形質転換とTrAAの発酵/発現
MMアセトアミドプレート上での5日の培養後、安定した形態を示す形質転換株が、30mLのProfro培地を含む250mL振とうフラスコに接種された。Profro培地は、30g/Lα-グルコース;6.5g/L(NH4)2SO4;2g/L KH2PO4;0.3g/L MgSO47H2O;0.2g/L CaCl2;微量元素溶液;2mL/L 10% Tween 80;22.5g/L ProFlo 綿実粉(Traders Protein, Memphis, テキサス);及び0.72g/L CaCO3を含んでいた。140rpmで振とうしながら28℃で培養した後、10%のProflo 培地が、30mLのラクトース規定培地(Lactose Defined Media)を含有する250mL振とうフラスコへ移された。このラクトース規定培地の組成は5g/L (NH4)2SO4;33g/LPIPPS緩衝液;9g/L カザミノ酸;4.5g/L KH2SO4;1.0g/LMgSO47H2O;5mL/L Mazu DF60-P 消泡剤(Mazur Chemicals, II);微量元素溶液;pH5.5である。滅菌後、40mL/L 40%(w/v)ラクトース溶液がこの培地に加えられた。このラクトース規定培地を含む振とうフラスコは、28℃、140rpmで4-5日間培養した。
TrAAを発現する形質転換株は3L培養液で培養された。この宿主細胞はTrAAを約15-20g/Lの濃度で培地に分泌した。この培地のろ液は10,000Daの分子量限界をもつ超ろ過装置を使用して濃縮された(Pall Corp., OmegaTMMembrane, Cat. No. OS010c10)。この未精製酵素調製物はAKTA explorer 100FPLC System(Amersham Biosciences , Piscataway, ニュージャージー)を用いて精製された。HiPrep 16/10 FFQ-Sepharose カラム(Amersham BioSciences, Cat. No. 17-5190-01)は、25mM Tris, pH6.0で平衡化され、このタンパク質は100 mM NaCl、25mM Tris, pH6.0で溶出された。第2のアフィニティークロマトグラフィーの段階はCbind 200樹脂(Novagen Cat. No. 701212-3)と、溶出緩衝液として500mM NaClを含む50mM Tris pH7.0 を使用して行われた。このアフィニティークロマトによる精製後、TrAAは上記のようにして超ろ過により再度濃縮されても良い。精製されたTrAAはSDS-PAGEにより分析され、結果が図5、レーン2に示されている。TrAAは、純度約98%と見積もられた。
TrAAは低pHでグルコアミラーゼにより触媒される糖化反応でグルコースの収量を増加させるため有用である。TrAA (Lot No. GCI2004017/018-UF)は実施例1の1.3節で述べたように精製された。グルコアミラーゼはGA-L、Lot No.901-04290-001(Genencor International.,Inc.)であり、活性は385GAU/gであった。液状化したデンプン基質からなる基質は次のようにして調製された。:745g生のトウモロコシデンプンが水に稀釈され、32% w/w ds のスラリーとされた。熱的に安定な細菌α-アミラーゼSpezyme(登録商標)Ethyl(Genencor International, Inc.), Lot No. 107-04107-001、が0.3kg/mt dsの濃度へ加えられ、この溶液は92℃で25分間液状化された。ヨウ素試験が、デンプンの残存濃度を測定するために本願技術分野で良く知られている手順を使用して行われた。
実施例3
TrAAも糖化反応でマルトースの収量を増加させるため有用である。TrAAは、以下の実験で決定されたとおり比較的低いpHでマルトース産生活性を示す。デンプン基質からなる基質は、生のトウモロコシが水で稀釈され30% w/wのスラリーを作ることを除き、実施例2で述べられたように調製された液状化され、0.25kg/mt dsのSpezyme(登録商標)Ethyl(Genencor International, Inc., Lot No. 107-04107-001)が加えられた。92℃で25分間液状化の後、液状化されたデンプンは55℃へ冷却され、pHは20% v./v 硫酸を使用して調整された。DPnが上記実施例2に記載したように測定された。図2は0.5kg/mt ds TrAA(Lot No. GCI12004017/018-UF)で触媒された反応の48時間後のDP2産生のpH依存性を示す。図2に示すように、TrAAはpH5.0-5.5で最適な活性を示した。しかし、TrAAは、また、pH4.5から6.0の範囲にわたってほぼ最適の活性も示した。この実験はTrAAが比較的低いpH4.5で高度に活性であることを示す。
TrAAはDP2の産生を触媒してマルトース産生菌類α-アミラーゼClarase(登録商標)L(Genencor International, Inc.)により得られるものに匹敵する水準に至らせることができる。TrAAはT・レセイから産生され、上記実施例1に記載されている手順に従い生成される。この実験に使用されたTrAA(Lot No. 150906)は約18,000SKBU/gの特異的活性を示した。TrAAは、また、Optimax(登録商標)L-1000(Genencor International, Inc., Lot No. 107-04224-001)の形態のプルラナーゼ(約1040PUunit/gの特異的活性をもっていた)と組み合わせて試験された。この実験におけるClarase(登録商標)L(Lot No. 107-04330-001)の特異的活性は約41,000SKBU/gであった。
低いpHで使用するとき、TrAAは、以下の実験で示すように、他のこれまでのマルトース産生アミラーゼを相当に上回った。使用した実験条件は、反応が58℃、pH4.6で行われることを除き、実施例5と同一であり、DPn産生が0.2kg/mt ds BBA(β-アミラーゼ;Lot No. 05189-001)、0.2kg/mt ds Clarase(登録商標)L(Lot No. 9016231002)、または0.5 kg/mt ds TrAA(Lot NO. GCI2004017/018-UF)で触媒された。表4に示すとおり、BBAまたはClarase(登録商標)Lよりも相当に高い濃度のDP2がTrAA存在下で得られた。
TrAAにより産生されるDP2は、プルラナーゼの添加により相当に増加した。以下の実験では、実験条件は実施例5の条件と、58℃、pH4.6で反応が行われたことを除き、同じである。プルラナーゼはOptimax(登録商標)L-1000(Genencoor International, Inc,:1165PU/g で.;Lot No.9016167004)の形態で表5に示されている濃度で加えられた。この反応は、示した時間、58℃、pH4.6で行われた。表5に示すように0.1-0.25kg/mt dsのプルラナーゼは48時間でTrAAにより触媒されるDP2産生を相当に増加させる。
Claims (20)
- 単離されたポリペプチドであって、SEQ ID NO:3の21-463残基を含むポリペプチド。
- 単離されたポリペプチドであって、トリコデルマ・レセイα-アミラーゼの変異種であって、当該変異種がマルトースα-アミラーゼ活性を有しSEQ ID NO:3の21-463残基と少なくとも90%一致するポリペプチド。
- 請求項2の単離されたポリペプチドであって、当該変異種はSEQ ID NO:3の21-463残基と少なくとも95%一致するポリペプチド。
- 請求項2の単離されたポリペプチドであって、当該変異種はSEQ ID NO:3の21-463残基と比較して1-10個のアミノ酸の置換、挿入または欠失をもつものであるポリペプチド。
- SEQ ID NO:3を含む請求項1の単離されたポリペプチド。
- SEQ ID NO:3の21-463残基からなる請求項1の単離されたポリペプチド。
- 請求項1又は2のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- SEQ ID NO:2からなる請求項7のポリヌクレオチド。
- 請求項7のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項9のベクターを含む細菌の細胞。
- 請求項9のベクターを含む、請求項7のポリヌクレオチドを発現する宿主細胞。
- 請求項11の宿主細胞であってトリコデルマ属の種(Trichoderma sp.)である宿主細胞。
- 請求項11の宿主細胞であってRL-P37単離体、糸状菌細胞、アスペルギルス属の種(Aspergillus sp)、フザリウム属の種(Fusarium sp.)またはペニシリウム属の種(Penicillium sp.)である宿主細胞。
- 請求項11の宿主細胞であって、さらに異種のグルコアミラーゼをコードする核酸を発現する宿主細胞。
- グルコース高含有シロップを生産するための液状化デンプンを糖化する方法であり、液状化デンプン溶液に請求項1または2に記載するポリペプチドを加え、当該液状化デンプン溶液にグルコアミラーゼを加え、当該液状化デンプン溶液を糖化することを含むものであり、当該液状化デンプン溶液の前記糖化はグルコース高含有シロップを生産するものである方法。
- 請求項15に記載する方法であって、前記ポリペプチドは、デンプン乾燥固体1トン当たり0.3-1kgの割合で、当該液状化デンプン溶液に加えられるものである方法。
- 請求項15に記載する方法であって、当該液状化デンプン溶液は20-35%w/w のデンプン乾燥固体を含有する液状化デンプンのスラリーである方法。
- 請求項1または2のポリペプチドを含むデンプン処理剤組成物。
- ベーキング(baking)の方法であって、請求項1または2のポリペプチドを焼く対象である基質へ加えることと、当該基質を焼くことを含む方法。
- 織物の糊を除く方法であって、当該織物と請求項1または2のポリペプチドを、当該織物の糊を除くために十分な時間接触させることを含む方法。
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