NL9001388A - Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan. - Google Patents

Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan. Download PDF

Info

Publication number
NL9001388A
NL9001388A NL9001388A NL9001388A NL9001388A NL 9001388 A NL9001388 A NL 9001388A NL 9001388 A NL9001388 A NL 9001388A NL 9001388 A NL9001388 A NL 9001388A NL 9001388 A NL9001388 A NL 9001388A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
xylanase
cell
recombinant dna
var
dna
Prior art date
Application number
NL9001388A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Unilever Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=19857272&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NL9001388(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Unilever Nv filed Critical Unilever Nv
Priority to NL9001388A priority Critical patent/NL9001388A/nl
Priority to DK91910872K priority patent/DK0600865T4/da
Priority to JP03510717A priority patent/JP3142134B2/ja
Priority to PCT/EP1991/001135 priority patent/WO1991019782A1/en
Priority to AT91910872T priority patent/ATE196501T1/de
Priority to US07/955,726 priority patent/US6586209B1/en
Priority to CA002085232A priority patent/CA2085232C/en
Priority to AU80668/91A priority patent/AU689436C/en
Priority to DK91910872T priority patent/DK0600865T3/da
Priority to EP91910872A priority patent/EP0600865B2/en
Priority to ES91910872T priority patent/ES2152217T5/es
Priority to DE69132422T priority patent/DE69132422T3/de
Priority to ZA914714A priority patent/ZA914714B/xx
Publication of NL9001388A publication Critical patent/NL9001388A/nl
Priority to FI925730A priority patent/FI111549B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01032—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1-3-beta-xylanase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Description

Recombinant DNA, cel die daarvan afgeleid DNA bevat, enzym waarvoor het recombinant DNA codeert en toepassingen daarvan
De uitvinding ligt op het gebied van de recombinant DNA technologie en meer in het bijzonder op een toepassing daarvan met het oog op de biotechnologische produktie van een bepaald type enzym dat voor broodverbeteringsdoeleinden gebruikt kan worden.
Bloem, gist, water en zout zijn de basis-ingrediënten van brood en andere bakkerijprodukten. Al eeuwenlang worden bij de bereiding van brood en soortgelijke bakkerijprodukten, voor het gemak verder aangeduid als de broodbereiding, materialen toegevoegd, die een positieve invloed hebben op de hanteerbaarheid van het deeg of de kwaliteit van het gebakken produkt. Deze als "broodverbeteraars" aangeduide toevoegingen bevatten enzymen uit mout of van microbiële afkomst, die een belangrijke rol spelen in de verschillende fasen van de broodbereiding, te weten de bereiding van het broodbeslag, de gisting, het bakken en het bewaren van het broodprodukt.
Een van de relevante karakteristieken van brood, die door de toevoeging van bepaalde enzymen wordt beïnvloed, is het zg. broodvolume. Om een hoog broodvolume te verkrijgen worden in de praktijk preparaten toegevoegd, die cellulolytische, hemi-cellulolytische en/of amylolytische enzymen bevatten. De in de handel verkrijgbare preparaten van microbiële herkomst, meestal afkomstig van een schimmel van een van de families Asoeraillus en Trichoderma. zijn nagenoeg ongezuiverde, complexe mengsels van uiteenlopende enzymactiviteiten, waarbij niet precies bekend is, welke enzymen in het preparaat aanwezig zijn en welke daarvan een broodverbeterende werking bezitten. Dit gebrek aan kennis staat een verdere broodverbetering en met name een controle over de verschillende deegverwerkings- en broodeigenschappen zoals het broodvolume in de weg.
De onderhavige uitvinding is gebaseerd op nader onderzoek waaruit naar voren is gekomen dat naast α-amylase ten minste ook een xylanase enzym van belang is voor het broodvolume. Een xylanase is een enzym dat de afbraak katalyseert van xylanen, die voorkomen in het pentosan gedeelte van zetmeel "tailings". Met de term "tailings" wordt gedoeld op een fractie van bijv. tarwezetmeel, die bestaat uit wateronoplosbare hemicellulose (pentosanen en arabinoxylanen) en beschadigd zetmeel. Deze fractie ontstaat bij het centrifugeren van een deegsuspensie, die door wassen van deeg ter verwijdering van de glutenfractie is verkregen, als de tussen- of bovenlaag op de zetmeelpellet.
In de literatuur zijn reeds verschillende xylanasen beschreven, waaronder xylanasen van de bacteriesoorten Bacillus oumilus (Panbangred et al., Mol. Gen. Genet. 192, 335-341, 1983, en Fukusaki et al., FEBS Lett. 171. 197-201, 1984), Bacillus subtilis (Paice et al., Arch. Microbiol. 144, 201-206, 1986), en Bacillus circulans (Yang et al., Nucl. Acids Res. 16. 7187, 1988), van de gist Aureobasidium (Leathers, Biotechn. Lett. 2jQl, 775-780, 1988) en van de schimmel Aspergillus niger (Fournier et al., Biotechnology and Bioengineering 22, 539-546, 1985) .
Uit de Europese octrooiaanvrage EP-A-0 338 452 is bekend dat de eigenschappen van deeg en de kwaliteit van brood kunnen worden verbeterd door aan het deeg diverse enzympreparaten toe te voegen, waaronder ook een enzympreparaat met hemicellulose afbrekende of xylanase activiteit, waarvan de herkomst niet nader wordt gespecificeerd. Zo'n hemicellulolytisch enzympreparaat is een betrekkelijk ongedefiniëerd enzymmengsel, dat verschillende hemicellulolytische enzymen met uiteenlopende effecten op de deeg- en broodeigenschappen kan bevatten. De aanwezigheid van in meerdere of mindere mate broodverbeterend werkzame xylanasen is het toevallige gevolg van de wijze waarop het als broodverbeteraar bedoelde enzympreparaat is verkregen. Een gerichte verdere optimalisatie van broodverbeteraars was echter niet mogelijk vanwege het ontbreken van de daarvoor benodigde kennis en van recombinant DNA constructen die voor een xylanase met broodverbeterende werking coderen en voor een hoge produktie van zo'n xylanase zouden kunnen worden benut.
Onder "broodverbeterende werking" wordt hier in algemene zin een gunstig effect verstaan op een willekeurige eigenschap van het bereide bakkerijprodukt (waaronder brood) of van het deeg waaruit het bakkerij- of broodprodukt wordt gevormd, en wordt met name een gunstig effect op het broodvolume verstaan.
Het onderzoek, waarop de uitvinding is gebaseerd, heeft zich uitgestrekt tot het identificeren en kloneren van een voor een xylanase met broodverbeterende werking coderend gen (xvlA), afkomstig van een schimmel van de soort Aspercrillus nicrer var. awamori, alsmede tot het zodanig transformeren van diverse soorten gastheercellen, dat het gen daarin tot expressie komt resp. tot expressie kan worden gebracht. De uitvinding laat zich echter gemakkelijk gemakkelijk uitbreiden tot alle, van schimmels en vooral van schimmelstammen uit dezelfde familie afkomstige xylanase genen en is daarom niet tot het feitelijk gekloneerde gen beperkt.
De onderhavige uitvinding bestaat in een eerste aspect uit recombinant DNA materiaal, omvattende DNA met een nucleotiden-sequentie, welke codeert voor een rijpingsvorm van een xylanase van schimmel oorsprong.
Meer in het bijzonder bestaat de uitvinding voor wat dit eerste aspect betreft uit recombinant DNA materiaal, omvattende DNA met een nucleotidensequentie, welke codeert voor een rijpingsvorm van een xylanase van Asperqillus oorsprong.
Bij voorkeur gaat het bij dit aspect van de uitvinding om recombinant DNA materiaal, omvattende DNA met een nucleotidensequentie, welke codeert voor een rijpingsvorm van een xylanase van Asperaillus niqer oorsprong.
Meer in het bijzonder betreft dit aspect van de uitvinding bij voorkeur recombinant DNA materiaal, omvattende DNA met een nucleotidensequentie, welke codeert voor een rijpingsvorm van een xylanase van Asperaillus niaer var. awamori oorsprong.
Met de term "rijpingsvorm" wordt gedoeld op de verschillende vormen waarin het enzym na expressie van het bijbehorende gen kan voorkomen. Meer in het bijzonder wordt hiermee gedoeld op zowel de al dan niet van nature voorkomende prepro-, pre- en pro-vormen als op de uiteindelijke rijpe vorm van het enzym, die resulteert na afsplitsing van een "leader" peptide.
Meer concrete voorkeursuitvoeringsvormen van dit aspect van de uitvinding zijn recombinant DNA materiaal, omvattende DNA met een nucleotidensequentie, coderend voor een rijp xylanase of een pre(pro)-xylanase met een aminozuurvolgorde zoals weergegeven in figuur 1, en nog concreter recombinant DNA materiaal, omvattende DNA met een voor een rijp xylanase of een pre(pro)-xylanase coderende nucleotidensequentie zoals weergegeven in figuur 1.
De essentie van het recombinant DNA volgens de uitvinding wordt gevormd door de sequentie die codeert voor de schimmel, i.h.b. Asoeraillus xylanase rijpingsvorm. Daarnaast kan het recombinant DNA vele andere soorten informatie bevatten, zoals regulatiesequenties (met name een transcriptie-promoter) en een vector-gedeelte, dat gewoonlijk van een of meerdere merkergenen is voorzien. Veelal zullen deze andere soorten informatie verband houden met de gekozen gastheer. Zo zullen bijv. de vector, de merkergenen en de regulatiesequenties worden gekozen in afhankelijkheid van de gekozen gastheer. Het recombinant DNA kan echter ook andere genen bevatten, die men in de gekozen gastheer tot expressie wil brengen.
In een tweede aspect heeft de uitvinding betrekking op een cel, welke van recombinant DNA materiaal volgens de uitvinding, zoals hierboven gedefiniëerd, afgeleid genetisch materiaal bevat, en meer in het bijzonder een dergelijke cel die tot expressie van de xylanase rijpingsvorm, gecodeerd op het recombinant DNA materiaal, in staat is.
Bij een dergelijke cel kan het zowel gaan om een cel die zelf het directe resultaat van een genetische manipulatie is, als ook om een cel die op enigerlei wijze afstamt van zo'n door genetische manipulatie getransformeerde cel. Verder strekt de uitvinding zich zowel over nog levende cellen als over niet meer levende cellen uit.
Ten aanzien van de aard van de cellen, waarvan die welke tot expressie van een xylanase rijpingsvorm in staat zijn de voorkeur hebben, kent de uitvinding in principe geen bijzondere beperkingen, maar bij voorkeur worden de cellen gekozen uit de groep bestaande uit bacteriecellen, schimmelcellen, gistcellen en plantecellen.
Geprefereerde voorbeelden van bij uitstek geschikte gastheercellen zijn (a) schimmelcellen van een van de families Asoeraillus en Trichoderma. met name schimmelcellen van een van de soorten Aspercrillus niaer var. niaer. Asoercrillus nicrer var. awamori, Aspergillus nidulans, Aspercrillus oryzae. Trichoderma reisei en Trichoderma viride; (b) gistcellen van een van de families Saccharomyces, Kluyveromvces. Hansenula en Pichia, met name gistcellen van een van de soorten Saccharomvces cerevisiae. Saccharomyces carlberoensis. Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus. Hansenula polvmorpha en Pichia pastoris; (c) plantecellen van een plantenfamilie, gekozen uit de groep bestaande uit tarwe, gerst, haver, maïs, erwt, aardappel en tabak, zoals bijvoorbeeld plantecellen van een van de soorten Solanum tuberosum en Nicotiana tabacum; en (d) bacteriecellen van een van de bacteriefamilies Bacillus, Lactobacillus en Streotococcus. zoals bacteriën van de soort Bacillus subtilis.
Cellen volgens de uitvinding zoals hierboven gedefinieerd kunnen van belang zijn als middel voor het vermenigvuldigen van het recombinant DNA of als middel voor het produceren van de xylanase rijpingsvorm. In het laatstgenoemde geval is zowel mogelijk, dat de cellen alleen gebruikt worden in de produktie van de xylanase rijpingsvorm, die na zijn isolatie als zodanig wordt toegepast, als ook mogelijk, dat de cellen zelf worden toegepast. Een directe toepassing van de cellen zelf is bijv. mogelijk indien de gastheerstam zonder bezwaar in de produktie van voedingsmiddelen kan worden toegelaten, zoals voor diverse schimmel-, gist-, plante- en bacteriesoorten het geval is. In verband met de bereiding van brood kan men hierbij bijv.
V
vooral denken aan conform de onderhavige uitvinding genetisch gemanipuleerde giststammen.
Mede afhankelijk van de gekozen gastheer zal men het voor xylanase coderende gen met of zonder het daarin voorkomende intron, met zijn eigen dan wel van een ander gen afkomstige transcriptie terminatiesignalen, en met zijn eigen leader sequentie dan wel een van een ander gen afkomstige signaal-sequentie toepassen. Zo heeft het bij transformatie van gist zoals Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist) de voorkeur, dat het intron wordt verwijderd en dat de eigen leader sequentie vervangen wordt door een voor gist geschikte signaalsequentie, zoals de signaalsequentie van het invertase gen die voor een correcte processing en uitscheiding van het rijpe eiwit zorgt. Bij transformatie van bacteriën zoals Bacillus subtilis is de verwijdering van het intron zonder meer noodzakelijk. Als signaalsequentie kan in dat geval bijv. de α-amylase signaalsequentie worden toegepast.
Voor vele organismen, waaronder diverse bacterie-, gist-, schimmel- en plantensoorten, zijn al geschikte transformatie methoden en geschikte expressievectoren, voorzien van bijv. een geschikte transcriptie-promoter, geschikte transcriptie terminatiesignalen en geschikte merkergenen voor selectie van getransformeerde cellen bekend. Louter bij wijze van voorbeeld kan bijv. voor gist worden gewezen op Tajima et al., Yeast 1, 67-77, 1985, waarin expressie in gist van een vreemd gen onder controle van de door galactose induceerbare promoter GAL7 wordt getoond, en voor Bacillus subtilis op EP-A-0 157 441, waarin als expressievector een plasmide pMS48 met daarop de SP02 promoter wordt beschreven. Voor andere mogelijkheden bij deze en andere organismen wordt verwezen naar de daarvoor bestaande literatuur.
In een derde aspect bestaat de onderhavige uitvinding uit een rijpingsvorm van een xylanase van schimmel, i.h.b. van Asoergillus oorsprong, welke verkregen is door expressie van recombinant DNA materiaal volgens de uitvinding, zoals hierboven gedefiniëerd. Hierbij gaat de voorkeur vooral uit naar een rijp xylanase met een aminozuurvolgorde zoals weergegeven in figuur 1, alsmede naar een pre(pro)-xylanase met een aminozuurvolgorde zoals weergegeven in figuur 1.
Weer een volgend aspect van de uitvinding bestaat uit een werkwijze voor het produceren van een rijpingsvorm van een xylanase van schimmel, i.h.b. Asperaillus oorsprong, omvattende het kweken in een geschikt voedingsmedium van een cel volgens de uitvinding, die tot expressie van de xylanase rijpingsvorm, gecodeerd op het recombinant DNA materiaal, in staat is, en eventueel het isoleren van de gevormde xylanase rijpingsvorm. Met "isoleren van de gevormde xylanase rijpingsvorm" wordt ook een partiële zuivering omvat, waarbij een enzympreparaat wordt gewonnen waarvan het desbetreffende xylanase deel uitmaakt.
Verdere aspecten van de onderhavige uitvinding zijn een broodverbeteraarsamenstelling, omvattende een rijp xylanase van schimmel, i.h.b. Asperaillus oorsprong, dat verkregen is door expressie van recombinant DNA materiaal volgens de uitvinding; een meel- en deegsamenstelling, omvattende een rijp xylanase van schimmel, i.h.b. Asperaillus oorsprong, dat verkregen is door expressie van recombinant DNA materiaal volgens de uitvinding; een bakkerijprodukt, verkregen onder toepassing van een dergelijke meel- of deegsamenstelling; en een werkwijze voor het bereiden van een bakkerijprodukt, waarbij een deegsamenstelling wordt toegepast, waarin een rijp xylanase van schimmel, i.h.b. Asperaillus oorsprong, verkregen door expressie van recombinant DNA materiaal volgens de uitvinding, is opgenomen. De uitvinding strekt zich echter ook uit over andere toepassingen van schimmel xylanasen, zoals gebruik in het kader van de bierbereiding, vooral de bereiding van bieren op basis van tarwe, teneinde de filtreerbaarheid te verbeteren, gebruik in de papierindustrie om de waterabsorptie door het papiermateriaal te verlagen, gebruik in de verwerking van landbouwafval, e.d.
De uitvinding zal thans aan de hand van een uitvoerige beschrijving van de identificatie, klonering en expressie van een als broodverbeteraar bruikbaar xylanase worden toegelicht. In het in de voorbeelden beschreven experimentele werk is als bron voor het xylanase gebruik gemaakt van de schimmelstam Asperaillus nicrer var. awamori CBS 115.52 (ATCC 11358), die blijkens onderzoek van de uitvinders in staat is om na inductie met tarwezemelen een xylanase met broodverbeterende eigenschappen te produceren, terwijl het kweekmedium onder deze inductie-omstandigheden een α-amylase activiteit, een lage glucanase activiteit en een lage protease activiteit vertoont. De door de wildtype stam geproduceerde hoeveelheid van het xylanase is echter te gering voor gebruik in een commerciëel proces. De uitvinding voorziet mede om die reden in genetische manipulaties, die een biotechnologische produktie op commerciële schaal van het xylanase mogelijk maken.
Het uitgevoerde experimentele werk omvat de isolatie van het voor een xylanase enzym coderende gen (het xylA gen) uit een genenbank van chromosomaal Aspergillus niger var. awamori DNA, gemaakt in een λ-vector. Voor de isolatie is een probe gemaakt, waarvan de samenstelling was afgeleid van de door de uitvinders bepaalde N-terminale aminozuurvolgorde van het gezuiverde, rijpe eiwit. Met behulp van deze probe zijn een aantal λ-klonen geïsoleerd, die mogelijk het gen bevatten. Een DNA-fragment uit deze positieve λ-klonen werd gesubkloneerd. Vervolgens werd de DNA-sequentie bepaald van een deel van het gekloneerde chromosomale DNA fragment. Met behulp van deze resultaten en die van mRNA analyse zijn de lengte van het xylA gen, de lengte van het mRNA, alsmede de aanwezigheid en positie van een intron vastgesteld. Uit de gegevens kon worden afgeleid dat het xvlA gen codeert voor een eiwit van 211 aminozuren (een pre(pro)-vorm), waarin het rijpe eiwit van 184 aminozuren wordt voorafgegaan door een "leader" peptide van 27 residuen.
Er zijn drie expressievectoren geconstrueerd die het xylanase gen inclusief de xylA terminator bevatten. In één van deze vectoren wordt het xylA gen voorafgegaan door de eigen expressiesignalen. In de tweede vector zijn de χγΙΑ expressie-signalen (tot het ATG codon) vervangen door de constitutieve expressiesignalen van het Asperqillus nidulans glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (crpdA) gen (zie Punt et al., Gene ü9, 49-57, 1988), terwijl in de derde vector het xylA gen vooraf wordt gegaan door de induceerbare expressiesignalen van het Aspercrillus niqer var. nicrer glucoamylase (qlaA) gen. Alle expressievectoren bevatten als selectiemerker het Aspergillus nidulans aceetamidase (amdS) gen, dat beschreven is door K. Wernars, "DNA-mediated transformation of the filamentous fungus Asperqillus nidulans". thesis, Landbouw Hogeschool Wageningen 1986. Met behulp van deze selectiemerker kunnen transformanten worden verkregen, waarin de vector, en dus ook het xylA gen, in een groot aantal kopieën in het genoom geïntegreerd is.
Door transformatie van de Asperqillus stammen A. niqer var. awamori en A. niqer var. niqer N402 met de bovengenoemde expressievectoren werden multicopy transformanten verkregen. In schudkolf experimenten werd na kweken van de verkregen transformanten in verschillende media de produktie van xylanase gemeten. De resultaten (maximale produktieniveau's) zijn vermeld in de onderstaande tabel A, waarin de xylanase activiteit is uitgedrukt in 103 units (ü) per ml. Een unit is gedefiniëerd als de hoeveelheid enzym die per minuut uit xylaan een hoeveelheid reducerende groepen vrijmaakt equivalent aan 1 μg xylose.
Tabel A
Overzicht van de maximale xylanase produktieniveau1s in schudkolf-experimenten na kweken in diverse media S.tam-promoter xylaan rijk medium zetmeel zemelen A. niger var.awamori xvlA s.c. 15 0 0 14 A. niaer var.niger N402 xylA s.c. 5 n.b. n.b. 4 Δ. nigex var.awamori xylA m.c. 59 78 Δ. niger var.nicrer N402 xylA m.c. n.b. 120 A. niqer var.niger AB4.1 xylA m.c. 36 140 Δ. niger var.awamori gpdA m.c. 20 32 A. niger var.niger N402 qpdA m.c. 11 12 A. nicrer var.awamori glaA m.c. 71 45 Δ. niger, var.niger N402 glaA m.c. 54 72 s.c. : "single copy" wildtype stam m. c. : "multicopy" transformanten n. b. : niet bepaald
De A. niger var. awamori en A. niger var. niger N402 "xylA" multicopy transformanten met xylA promoter produceren na inductie met xylaan veel meer xylanase dan de wildtype A. niger var. awamori en A. niger var. niger stammen. Hieruit en uit gegevens, verkregen bij de moleculaire analyse van het gen, kan worden afgeleid dat het gekloneerde gen codeert voor een functioneel xylanase. Verder blijkt hieruit dat de multicopy transformanten in staat zijn tot overproduktie van het actieve enzym. Ook in bakproeven heeft dit enzympreparaat de gewenste eigenschappen.
Multicopy transformanten van de gastheerstammen met de heterologe gpdA of alaA promoter zijn eveneens in staat tot een verhoogde produktie van actief xylanase. De "gpdA" transforman ten produceren in rijk medium een duidelijk grotere hoeveelheid xylanase dan de wildtype A. niaer var. awamori stam. De in de uitgevoerde proeven waargenomen produktieniveau1s liggen wel beduidend lager dan het niveau, dat in de proeven met "xylA” multicopy transformanten is bereikt. De produktieniveau1s van "alaA" multicopy transformanten zijn na inductie met zetmeel vergelijkbaar met die van "xylA" multicopy transformanten in xylaan medium.
In medium met tarwezemelen produceren de beste A. niaer var. awamori "xylA" multicopy transformanten veel meer xylanase dan in xylaanmedium het geval is. De beste A.niaer var. niaer N402 "xvlA" transformanten bereiken in dit medium een zeer hoog xylanase produktieniveau. De hoogst producerende "crpdA" multicopy transformanten van zowel A. niaer var. awamori als van A.niaer var. niaer N402 produceren in zemelen even veel xylanase als in rijk medium. De produktie door A. niger var. awamori "alaA" transformanten is in medium met tarwezemelen lager dan in zetmeel. Daarentegen produceren A.niaer var. niaer N402 "alaA" transformanten in dit medium meer dan in zetmeel.
De door Asoeraillus niaer var. niaer N402 transformanten bereikte produktie is hoger dan dat van Asoeraillus niaer var. awamori transformanten. Het produktieniveau van de A.niaer var. awamori transformanten kan echter verder verhoogd worden door gebruik te maken van geschikte A.niaer var. awamori mutant stammen, zoals A.niaer var. awamori #40, die duidelijk meer xylanase produceert dan de wildtype stam. De mutant A.niaer var. awamori #40 is verkregen door mutagenese van A.niaer var. awamori sporen en selectie op xylanase produktie. De "xylA" A.niaer var. awamori #40 transformant produceerde in zemelenmedium 190 000 U xylanase, hetgeen een aanzienlijke verhoging is ten opzichte van de best producerende A.niaer var. awamori transformant.
Verdere experimenten betreffen de isolatie en toepassing als broodverbeteraar van het aldus geproduceerde xylanase (zie voorbeeld II), en expressie-experimenten in een giststam en een bacterie (resp. de voorbeelden III en IV).
Fiquurbesorekinq
Figuur 1 toont de DNA sequentie van een gedeelte van een ca. 2,1 kb Pstl-PstI Asoerqillus niaer var. awamori fragment, aanwezig in het plasmide pAW14B, welk fragment een voor een xylanase coderend gen, aangeduid als het xylA gen, bevat. De translatiestart en het stopcodon zijn dubbel onderstreept. Het 49 bp intron is onderstreept. De N-terminus van het rijpe eiwit is vet gedrukt. De aminozuurvolgorde van het eiwit (zowel van de pre(pro)-vorm als van het rijpe eiwit) is eveneens in fig. 1 vermeld, gebruikmakend van de éénlettercode.
Figuur 2 toont de restrictiekaart van het genomische DNA gebied van A. niger var. awamori. dat het in de fagen λ-l en λ-14 gekloneerde xylA gen omvat. De gebruikte afkortingen staan voor: S: Sall: E: EcoRI: H: HindiII: P: PstI; B: BamHI; S#:
Sall site afkomstig van de polylinker van 1-EMBL3; Δ: Sau3A. De massieve balk duidt een met XylOö hybridiserend 1,2 kb Pstl*-BamHI fragment aan.
Figuur 3 toont het plasmide pAW14B, dat verkregen is door een insertie van een 5,3 kb A. niqer var. awamori Sall fragment in pUC19.
Figuur 4 toont het plasmide pAW14S, dat het xylA gen met eigen promoter en amdS als selectiemerker bevat.
Figuur 5 toont het plasmide pAW14B-2, dat een translatie-fusie van het xylA gen met de A. nidulans qpdA promoter bevat.
Figuur 6 toont het plasmide pAW14S-2, dat een translatie-fusie van het xylA gen met de A. nldulans qpdA promoter en amdS als selectiemerker bevat.
Figuur 7 toont het plasmide pAW14S-3, dat een translatie-fusie van het xylA gen met de A. niqer glaA promoter en amdS als selectiemerker bevat.
Figuur 8 toont de nucleotidensequenties van het DNA fragment BAK1 en van de synthetische oligonucleotiden waaruit dit fragment is opgebouwd.
Figuur 9 toont schematisch de constructie van het plasmide pBAKl.
Figuur 10 toont de nucleotidensequenties van het DNA fragment BAK2 en van de synthetische oligonucleotiden waaruit dit fragment is opgebouwd.
Figuur 11 toont schematisch de constructie van het plasmide pBAK21.
Figuur 12 toont schematisch de constructie van het plasmide pUR2901.
Figuur 13 toont schematisch de constructie van het plasmide pUR2904.
Figuur 14 toont de nucleotidensequenties van het DNA fragment BAK4 en van de synthetische oligonucleotiden waaruit dit fragment is opgebouwd.
Figuur 15 toont schematisch de constructie van het plasmide pUR2951.
Voorbeeld I
1 Klonering en karakterisering van het xylanase gen (xylA) van Aspergillus nioer var, awamori 1.1 Isolatie van het Asoergillus nicrervar. awamori_x^lA_g_en Ten einde het xylA gen te isoleren uit chromosomaal DNA van A.niaer var. awamori werden diverse probes gesynthetiseerd, bestaande uit mengsels van oligonucleotiden (tabel B). De samenstelling van deze mengsels was afgeleid van de N-terminale aminozuurvolgorde van gezuiverd xylanase eiwit.
Tabel B
Probes, afgeleid van de N-terminale aminozuurvolgorde van xylanase eiwit N-terminale aminozuurvolqorde van xylanase eiwit: 15 10 15
SerAlaGlylleAsnTyrValGlnAsnTyrAsnGlyAsnLeuGlyAspPhe probe_basenvolgorde 3^51_
XylOl TTAATACAXGTTTTAATATTACC
G G C G G G
Xyl04 CGGCCGTAGTTGATGCAGGTCTTGATGTTGCCGTTGGACCCGCTGAA
Xyl05 ATGTTGCCATTAAAXCCACTGAA
G GG G C C
XylO6 CGGCCGTAGTTGATGCAGGTCTTGATGTTGCCGTTGGAGCCGCTGAA
_G C. C._Γ. T_G CC_
X=A, G, C Of T
XylOl: een mengsel van 256 oligo's met een lengte van 23 deoxy-nucleotiden, waarvan de sequentie complementair is aan het deel van de coderende streng, dat codeert voor de aminozuren 5-12. Xyl04: een oligo met een lengte van 47 deoxynucleotiden, waarvan de sequentie complementair is aan het deel van de coderende streng, dat codeert voor de aminozuren 2-17.
Xyl05: een mengsel van 144 oligo's met een lengte van 23 deoxynucleotiden, waarvan de sequentie complementair is aan het deel van de coderende streng, dat codeert voor de aminozuren 10-17. XylO6: een mengsel van 256 oligo's' met een lengte van 47 deoxynucleotiden, waarvan de sequentie complementair is aan het deel van de coderende streng, dat codeert voor de aminozuren 2-17.
In Xyl05 en XylO6 zijn op de derde positie van de codons niet alle mogelijk voorkomende basen geïntroduceerd om niet meer dan 256 oligonucleotiden in het mengsel te krijgen.
Met behulp van Southern blot analyse werd vastgesteld, dat in digesten van chromosomaal DNA - onder stringente condities -slechts één band hybridiseert met de gebruikte probes. In het EcoRI. Sall en BamHI digest van A.nicrer var. awamori DNA hybridiseert één band, van resp. 4,4, 5,3 en 9,5 kb, met zowel XylOl, Xyl04 als Xyl06. Met Xyl05 werd bij 41°C geen eenduidig signaal gevonden. Op basis van dit resultaat werd een λ-genen-bank van A.nicrer var. awamori DNA bij 65°C gehybridiseerd met het oligonucleotidenmengsel Xyl06 als probe. Van de 65 000 geteste plaques (overeenkomend met 32 keer het genoom) hybridiseerden drie plaques (λ-1, λ-14 en λ-63) met deze probe. Na hybridisatie van digesten van λ-l en λ-14 DNA met Xyl06 werd in het EcoRI digest van λ-l een hybridiserende band gevonden van >10kb. De grootte van de hybridiserende band in het λ-14 en het chromosomale EcoRI digest was 4,4 kb. In het Sall digest van λ-l hybridiseert een 4,6 kb band; in het Sall digest van λ-14 is dit, evenals in chromosomaal DNA, een 5,3 kb band. Ook een 1,2 kb Pstl-BamHI fragment (figuur 2) hybridiseert met Xyl06. Op basis van restrictiepatronen met diverse enzymen en kruishybridisatie van λ-l en λ-14 digesten met het 5,3 kb Sall fragment van λ-14 werd bevestigd, dat deze λ'ε overlappende fragmenten van het genoom van A.niaer var. awamori bevatten.
Ook homologe hybridisatie van totaal, geïnduceerd RNA met resp. λ-l, λ-14 en het 5,3 kb Sall fragment van λ-14 bevestigde de aanwezigheid van xylA sequenties op deze X's. Hierbij werd hybridisatie gevonden met een door xylaan geïnduceerd mRNA van ca. 1 kb. De grootte hiervan komt overeen met die van het met Xyl06 hybridiserende mRNA molecuul.
1.2 Subklonerinq van het A.nicrer var, awamori xylA oen
De met Xyl06 hybridiserende Sall fragmenten van resp. λ-l (4,6 kb) en λ-14 (5,3 kb) werden in twee oriëntaties gekloneerd in de Sall site van pUC19, hetgeen resulteerde in resp. plasmide pAWl (A en B) en plasmide pAW14 (A en B, zie fig.3). Het met Xyl06 hybridiserende 1,2 kb Pstl-BamHI fragment en het aangrenzende 1,0 kb BamHI-PstI fragment uit resp. pAW14A en pAWlA werden gesubkloneerd in met BamHI en PstI geknipt M13mpl8 en M13mpl9, resulterend in de ml8/ml9 AW vectoren van tabel C.
Tabel C
Enkelstrengs subklonen van λ-l en λ-14 fragmenten fragment_verkregen vectoren_ pAW IA BamHI-PstI* (1,2 kb) ml8AW 1A-1 / ml9AW 1A-1 pAW14A BamHI-PstI* (1,2 kb) ml8AW14A-l / ml9AW14A-l pAW IA Pstl-BamHI (1,0 kb) ml8AW 1A-2 / ml9AW 1A-2 pAW14A Pstl-BamHI (1,0 kb) ml8AW14A-2 / ml9AWl4A-2 1.3 Bepaling van de transcriptierichting van het xylA gen
De transcriptierichting van het xylA gen werd vastgesteld door middel van spotblot hybridisatie van ss-DNA van resp. ml8AW14A-l en ml9AW14A-l met Xyl06. Gevonden werd dat ss-DNA van ml9AW14A-l (5' *PstI-BamHI 3') met deze probe hybridiseert. Omdat de sequentie van Xyl06 gelijk is aan die van de niet-coderende streng, bevat ml9AW14A-l de coderende streng. Op grond hiervan werd de in fig.2 aangegeven transcriptierichting bepaald. Deze richting is bevestigd door de resultaten van een primer-extension experiment.
1.4 Identificatie van het xvlA gen
De DNA sequentie van een deel van het promotergebied werd bepaald door sequentie-analyse van pAW14 met Xyl06 als primer (5' gedeelte van het gen). In dit gebied werd een primer Xylll met de sequentie 5'-GCA TAT GAT TAA GCT GC-3’ gekozen, waarmee de DNA-sequentie van de complementaire streng van ml8AW14A-l en ml8AWlA-l werd bepaald. Uit de resultaten bleek, dat deze vectoren een DNA-sequentie bevatten, welke vrijwel gelijk is aan die van Xyl06, terwijl de uit de basenpaarsequentie afgeleide aminozuurvolgorde identiek was met de N-terminale aminozuurvolgorde van het rijpe xylanase eiwit. Hiermee werd de klonering van ten minste het 51 uiteinde van het xylA gen bewezen. De aanwezigheid van het gehele xylA gen in de vectoren pAW14 en pAWl leek aannemelijk op basis van de positie van het 5' uiteinde van het gen op de Sall fragmenten (fig.2) en de grootte van het xylA mRNA (ca. lkb).
1.5 Seauentie-analvse
De basenvolgorde van het xylA gen werd in twee richtingen vastgesteld in zowel de ml3AW14 als de ml3AWl subklonen met behulp van de Sanger-dideoxy procedure (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74. 5463-5467, 1977). De sequentie rond de BamHI site, gelegen stroomafwaarts van de PstI* site (fig.2) werd vastgesteld door sequentie-analyse van dubbelstrengs pAW14 en pAWl DNA. Comprimeringen zijn opgehelderd door gebruik te maken van dITP in plaats van dGTP. In de onafhankelijke klonen λ-l en λ-14 is een identieke xylA sequentie vastgesteld. De volledige (coderende) sequentie van het pre(pro)-xylanase gen is getoond in fig.l. Het rijpe xylanase eiwit wordt voorafgegaan door een leader-peptide van 27 aminozuren. Tussen de alanine-residuen op de posities 16 en 17 is waarschijnlijk een splitsingsplaats aanwezig voor het signaalpeptidase. Uit de lengte van het leaderpeptide kan worden afgeleid, dat in het eiwit een tweede processingsplaats aanwezig is. De splitsing van de band tussen Arg (27)en Ser (28) vindt mogelijk plaats door een KEX2-achtig protease.
1.6 Localisatie van het intron
In het xylA gen werd een intron van 49 of 76 bp (581-629 of 581-656, zie fig.l) voorspeld op basis van de aanwezigheid van sequenties, welke overeenkomen met "donor" en "acceptor" sites van introns in Asperailli. Definitief bewijs voor de afwezigheid van een 76 bp intron werd verkregen door isolatie van een xylanase peptide met de volgorde Tyr-Ser-Ala-Ser-Gly... Dit peptide kan in het eiwit alleen worden gelocaliseerd vanaf positie 652 (zie fig.l).
1.7 Bepaling van het 3* uiteinde van het xylA gen
Uit DNA sequentie gegevens werd de positie van het stop-codon van het xylA gen (positie 1033 in fig.l) afgeleid. Dit stopcodon werd bevestigd, doordat de aminozuurvolgorde van een peptide identiek is aan de C-terminale aminozuurvolgorde die uit DNA sequentiegegevens (positie 991-1032 in fig.l) is afgeleid.
1.8 Evaluatie van DNA en eiwit gegevens
Op basis van bovengenoemde gegevens is het gen dat codeert voor een xylanase van A.niqer var. awamori gekloneerd op een 5,3 kb Sall fragment. Vastgesteld werden de DNA sequentie van het gen, de positie van het intron en de lengte van het mRNA.
De vastgestelde N-terminale aminozuurvolgorde van het rijpe eiwit werd volledig door de DNA sequentie bevestigd. Op basis van genoemde gegevens kan worden geconcludeerd dat het xylA gen codeert voor een eiwit van 211 aminozuren en dat de eerste 27 aminozuren post-translationeel worden verwijderd. De aminozuurvolgorde, afgeleid uit de DNA sequentie van het xylA gen, vertoont een grote mate van homologie met de aminozuursequentie van Bacillus pumilus (201 aminozuren) en Bacillus circulans (213 aminozuren inclusief signaal) xylanasen.
2 Expressie-vectoren
Er werden drie expressie-vectoren geconstrueerd, die het genomische xylA gen bevatten vanaf de translatiestart, met inbegrip van de xylA terminator. Deze vectoren zijn afgeleid van pAW14B (fig.3).
2.1 Vector pAW14S met A.niqer var, awamori xylA promoter
De vector pAW14S (fig.4) omvat een 5,3 kb chromosomaal DNA fragment van A.niqer var. awamori. waarop het xylA gen met zijn eigen expressie-signalen is gelegen. Verder is in dit plasmide een 5,3 kb fragment van A. nidulans aanwezig, waarop het aceet-amidase (amdS) gen is gelegen. In pAW14S hebben het amdS en het xylA gen dezelfde transcriptierichting.
2.2 Vector PAW14S-2 met A. nidulans qpdA promoter
Het plasmide pAW14S-2 (fig.6) verschilt van pAW14S, doordat het A.niqer var. awamori fragment, dat stroomopwaarts van het ATG codon van het xylA gen is gelegen, vervangen is door de constitutieve expressiesignalen (tot het ATG triplet) van het A. nidulans glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (qpdA) gen. In het plasmide hebben het amdS en het xylA gen dezelfde oriëntatie. De juiste aansluiting tussen de qpdA promoter en het ATG codon van het xylA gen werd verkregen met behulp van een synthetisch DNA fragment. Tijdens de constructie werd ook het plasmide pAW14B-2 verkregen, waarin de amdS selectiemerker ontbreekt (fig.5).
2.3 Vector PAW14S-3 met A.niqer var, niger qlaA promoter
De vector pAW14S-3 (fig.7) omvat de induceerbare expressiesignalen van het A.niqer var. niger glucoamylase (glaA) gen tot het ATG codon, gevolgd door A.niqer var. awamori sequenties, beginnend bij het ATG triplet van het xylA gen. Daarnaast omvat ook dit plasmide het A. nidulans amdS gen als selectiemerker. Het amdS gen en het xylA gen hebben dezelfde oriëntatie.
Met behulp van de amdS selectiemerker kunnen met de drie genoemde piasmiden transformanten worden verkregen, waarin de vector, en dus ook het (al dan niet hybride) xylA gen, in een groot aantal kopieën in het genoom geïntegreerd is ten einde de produktie van het xylanase eiwit te verhogen.
3 Transformatie van Asoergillus
De transformatie-frequentie van A.niger var. awamori varieerde van 0,03 tot 0,23 (AW) transformanten per μg vector DNA. In totaal heeft dit geresulteerd in vijf AW14S (xylA promoter), veertig AW14S-2 (gpdA promoter) en acht AW14S-3 (claA promoter) transformanten. Diverse transformanten bleken in het vervolgonderzoek een afwijkend groeigedrag te hebben.
Eén ervan, AW14S #1, gaf goed sporulerende (AW14S #1A) en slecht sporulerende (AW14S #1B) kolonies.
Transformatie van A.niger var. niger N402 verliep efficiënter dan die van A.niger var. awamori. Met pAW14S, pAW14S-2 en pAW14S-3 werden resp. 0,3, 0,3 en 1 (AB) transformanten gevonden per μg DNA. Twintig pAB14S (xylA promoter), dertig pAB14S-2 (godA promoter) en zestien pAB14S-3 (glaA promoter) transformanten werden reingestreken.
Co-transformatie van A.niger var. niger pyrG AB4.1 met pAW14S en het A.niqer var. niger pyrG gen in pAB4.1 resulteerde in 0,2 transformanten per μg pAW14S DNA, wanneer voor beide merkers geselecteerd werd. Bij eerste selectie op amdS werden 2 transformanten per μg DNA gevonden, terwijl de frequentie bij eerste selectie op pyrG ca. 20 per μg pAW14S DNA was. Van de co-transformanten (AB4.1-14S) bleek ca. 30% beide merkers te bezitten. Een zestal hiervan werd verder geanalyseerd.
4 Analyse van multicopv transformanten 4.1 Analyse van A.nicrer var, awamori "xvlA" transformanten (AW14S) na kweken in medium met xvlaan als inductor
Na kweken van AW14S transformanten met xylaan als inductor werd in het medium na 10 dagen een significant hoger xylanase-produktieniveau bereikt dan met de wildtype Asoeraillus niqer var. awamori stam. Het enzym is bij bewaren van de media bij 4°C volledig stabiel. De produktieniveau's in xylaanmedium zijn aangegeven in de onderstaande tabel D.
Tabel D
Xylanase produktieniveau's (in 103 ü/ml) van AW14S transformanten na diverse kweekperioden in xylaan medium bij 25°C
Hsl._3 dagen_IQ dagen.
IA 28 58 2 21 56 3 20 31 4 25 58 5 8 22 wt 5 13 4.2 Analyse van Asperaillus niger var, niger N402 "xylA" (co)transformanten (AB4.1-14SÏ na kweken in medium met xylaan als inductor.
In xylaan medium van de gastheer stam A.niger var. niger pyrG AB4.1 en van zeven AB14S-1 Pyr+ cotransformanten werd de xylanase activiteit bepaald na resp. 48 en 72 uur kweken (zie Tabel E). A.niger var. niger AB4.1 produceert weinig xylanase (ca. 5 000 ü). Voor vier van de zeven cotransformanten werd een hoge xylanase activiteit gevonden van ca. 30 000 U. De andere cotransformanten produceren wat minder xylanase.
Tabel E
Xylanase produktieniveau's (in 10·^ ü/ml) van AB4.1-14S en AB14S transformanten na diverse kweekperioden in xylaan medium, 25°C
AB4.1-14S_48 uren_72 uren #1 36 36 #6 31 20 #12 29 23 #23 10 6 #42 15 10 #44 21 30 #45 pyrG 22 18 AW.wt 3 7 N402 3 5 AB4.1 4 5 4.3 Karakterisering van overoeproduceerd xylanase en.zvm
Uit de sterk verhoogde xylanase activiteit in het medium van A.niger var. awamori en A.niger var. nieter N402 multi-copy "xylA” transformanten kan worden afgeleid, dat het gekloneerde gen codeert voor xylanase uit A.niger var. awamori en dat de transformanten in staat zijn tot overproduktie van actief xylanase. De aanwezigheid van het gewenste produkt werd aangetoond door eiwit-chemische analyse van het medium van AW14S #1A. In het medium was één dominant eiwit aanwezig. Het isoelektrisch punt (pi) en de N-terminale aminozuurvolgorde van deze hoofdcomponent waren gelijk aan die van gezuiverd xylanase uit wildtype A.niger var. awamori. De gevonden pl-waarde kwam overeen met de waarde, berekend voor het rijpe eiwit van 184 aminozuren, waarvan de samenstelling uit de DNA-sequentie is afgeleid. Ook in bakproeven bleek het geproduceerde xylanase de gewenste eigenschappen te bezitten.
4.4 Analyse van A.niger var, awamori (AW14S-2) en A.niaer var, niger (AB14S-2) "gpdA” transformanten na kweken in rijk medium
Zes AW14S-2 transformanten werden in rijk medium gekweekt (Tabel F). Na twee tot drie dagen werd in het medium van drie transformanten een xylanase activiteit gevonden variërend van 15 000 tot 20 000 U, terwijl de andere drie minder dan de helft produceerden. De wildtype stam produceert geen xylanase in rijk medium. Daarnaast werden tien AB14S-2 transformanten getest. Drie ervan produceerden ca. 11 000 U xylanase na 40 uur, welk niveau minimaal tot 72 uur bleef gehandhaafd. De andere vijf produceerden minder xylanase enzym, terwijl de activiteit in het medium van #21B binnen 24 uur daalde van 9 000 tot 0 U.
Aangetoond werd, dat het produktiemaximum van de best producerende AW14S-2 en AB14S-2 transformanten in het algemeen reproduceerbaar is. Echter, wanneer het mycelium in grote bollen groeit wordt het maximum niet bereikt, terwijl in één duplo cultuur van AB14S-2 #5 een hoger maximum (19 000 in plaats van 11 000 U) werd gevonden. De produktieniveau's zijn vermeld in tabel F.
Uit de resultaten blijkt dat het mogelijk is om met behulp van een translatiefusie van de gpdA promoter en het xylA gen actief xylanase te produceren. De produktie door zowel AW14S-2 als AB14S-2 transformanten onder controle van de gpdA promoter in rijk medium is echter lager dan de xylanase produktie van "xylA" transformanten in medium met xylaan.
Tabel F
Xylanase produktieniveau's (in 103 U/ml) van AW14S-2 en AB14S-2 transformanten na diverse kweekperioden in rijk medium bij 25°C
AW14S-2_24 uren_48 uren_72 uren #1 <1 3 >3 #4122 #10 11 15 13 #22 Δ * 4 20 20 #36 3 7 7 #39 * 10 16 12 AB14S-2 24 uren 40 uren 48 uren 66 uren_7,2-Uren #2 4 4 9 #5 Δ 3 11 11 11 12 duplo 15 16 19 #7 Δ 1 5 5 5 4 #8 4 3 4 #11 <1 <1 1 1 0 #14 223 #16 Δ 3 10 10 11 10 #17 Δ 3 10 11 10 10 #18 1 5 8 10 8 #21B 48900 Δ maxima, gevonden bij herhaling van de kweek; een duplo kweek van AB14S-2 #5 gaf een hoger maximum. In rijk medium produceren h. niger var. awamori en transformant AW14S #4 geen xylanase.
4.5 Analyse van Asoergillus niaer var, awamori (AW14S-3) en Asperaillus nicrer var, niger (AB14S-3) "glaA” transformanten na kweken in medium met zetmeel als inductor
Enkele AW14S-3 transformanten en de A.niger var. awamori wildtype stam werden gekweekt in zetmeelmedium (Tabel G). Na 90 uur kweken werd in het medium van één transformant een xylanase activiteit gevonden van 67 000 U/ml, terwijl twee andere transformanten tot 36 000 U/ml produceerden. Het produk-tiemaximum van zes geanalyseerde AB14S-3 transformanten ligt een dag eerder dan dat van AW14S-3 transformanten. Na 63 uur kweken werd in het medium van één transformant een activiteit gevonden van 51 000 U/ml, twee andere produceerden ongeveer 43 000 U/ml. Uit de resultaten blijkt, dat de translatiefusie tussen de glaA promoter en het xylA gen op de juiste wijze tot stand is gebracht. Zowel AW14S-3 als AB14S-3 transformanten produceren in zetmeelmedium onder controle van de glaA promoter vrijwel.even veel xylanase enzym als ”xylA” transformanten in medium met xylaan.
T.ab.sJ._Q
Xylanase produktieniveau's (in 103 U/ml) van ”glaA" transformanten AW14S-3 en AB14S-3 na diverse kweekperioden (uren) in zetmeelmedium, 25°C
_40 uur_63 uur_90 uur AW14S-3 #1 37 37 #2 4 14 15 #4 8 31 36 #7 16 49 67 AB14S-3 #4 23 51 29 #5 19 37 21 #7 23 44 18 #8 17 28 32 #14 21 43 19 #16 6 21 10 4.6 Analyse van "xylA" transformanten na kweken in medium met tarwezemelen
Uit de resultaten (Tabellen H en I) blijkt, dat voor AW14S #4 het produktieniveau, waargenomen bij kweken in medium met tarwezemelen, hoger is dan dat in xylaan medium. Een hoog produktieniveau werd bereikt met AB4.1-14S (#1 en #44) en AB14S (#5 en #14) transformanten. De hiermee bereikte xylanase activiteit bedroeg tot 140 000 U/ml. Dit betekent een aanzienlijke verhoging ten opzichte van de produktie in xylaan-medium (30 000 U/ml). Verder blijkt, dat het produktieniveau van deze Aspergillus niger var. niger transformanten ook bij een verlenging van de kweekperiode gehandhaafd blijft, zoals eerder met A.niger var. awamori "xylA" transformanten in xylaan-medium was gevonden.
4.7 Analyse van "gpdA” transformanten na kweken in medium met tarwezemelen AW14S-2 #22 en #39 produceren tot 28 000 U/ml xylanase. De AB14S-2 #5 en #17 transformanten produceren relatief weinig xylanase (activiteit tot 15 000 U/ml) met tarwezemelen, zoals ook in rijk medium was gevonden. De produktieniveau1s zijn vermeld in de tabellen H en I.
4.8 Analyse van ”crlaA" transformanten na kweken in medium met tarwezemelen
De onderzochte AW14S-3 (#1 en #7) transformanten produceren in medium met tarwezemelen tot resp. 25 000 en 45 000 U/ml xylanase, hetgeen voor beide ca. 60-65% is van de in zetmeel gevonden waarden (Tabel I). Met AB14S-3 (#4 en #14) transformanten, daarentegen, werd met tarwezemelen een hogere produktie vastgesteld dan in zetmeel. De bepaalde produktie-niveau’s liggen 1,5 keer zo hoog als in zetmeel. Met AB14S-3 werd een produktie van 72 000 U/ml bereikt. Met AB14S-3 #14 werd een waarde van 66 000 U/ml gevonden (tabel I).
Tabel H
Xylanase produktieniveau's (in 103 U/ml) van enkele AW en AB "xylA" en "apdA" transformanten na diverse kweekperioden in zemelen bevattend medium bij 25°C
_40 uren 63 uren_4_dag£n_7 dagen 12 dagen
Aw wt 1 2 16 17 AW14S #4 8 20 27 61 80 AB14S #14 6 74 114 126 122 AB4.1-14S #1 17 87 123 135 145 AW14S-2 #22 17 22 22 34 33 AW14S-2 #39 18 22 21 24 20 AB14S-2 #5 13 15 11 8 8 AB14S-2 #17 9 13 11 7 7
Tabel I
Xylanase produktieniveau's (in 103 U/ml) van AW en AB transformanten na diverse kweekperioden in tarwezemelen medium bij 25°C
_2 dagen 3 dagen_4 dagen_7 dagen_9 dagen 14 dacren
Aw wt 28 10 11 N402 wt 421
AW14S
#1A 18 39 51 #4 34 67 76 76
AB14S
#5 45 80 100 111 109 118 #14 45 77 79 100 92
AB4.1-14S
#1 95 90 73 #44 121 144 148 145 AW14S-2 #22 22 29 29 #39 17 26 28 AB14S-2 #5 15 14 12 #17 10 11 9 - AW14S-3 #1 18 26 25 #7 37 45 45 41 AB14S-3 #4 72 54 44 23 17 #14 64 66 69 55 55 55 4.9 Evaluatie van de resultaten
Uit de resultaten, zoals samengevat in Tabel A, blijkt dat multicopy transformanten van A.niger var. awamori (AW14S) en A.niger var. niger (AB14S) in staat zijn tot overproduktie van actief xylanase na inductie van de eigen xylA promoter met resp. xylaan en tarwezemelen als inductor. Expressie van xylanase door multicopy transformanten van A.niqer var. awamori en A.niger var. niger N402 met het xylA gen onder controle van de gpdA promoter (resp. AW14S-2 en AB14S-2) en de glaA promoter (resp. AW14S-3 en AB14S-3) geven aan dat xylanase op een breed scala van substraten geproduceerd kan worden. Variabiliteit in de produktiviteiten tussen de verschillende transformanten kan mogelijk een gevolg zijn van verschillen in kopiegetal en/of van verschillen in de plaats van integratie in het genoom. Uiteraard kunnen ook de proefomstandigheden een significante invloed hebben op de xylanase produktie. Voor optimalisatie van de produktie zal men niettemin bij voorkeur uitgaan van stammen die een relatief hoge produktiviteit vertonen.
5 Materialen en methoden 5.1 Stammen en plasmiden
In de experimenten werden de volgende stammen en plasmiden gebruikt: - Asoergillus niqer var. awamori stam CBS 115.52, ATCC11358; - Asoeraillus niqer var. niqer stam N402, een cspAI (korte conidiophoren) mutant van A.niqer var. niqer ATCC9029, CBS 120.49; - Asoergillus niqer var. niger AB4.1, een pyrG mutant van A.niqer var. niger N402, beschreven door Van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 206, 71-75, 1987; - Escherichia coli stam JM109 (voor plasmide isolatie, zie Yanisch-Perron et al., Gene 33. 103-119, 1985); - Escherichia coli stam NM539 (voor constructie en amplificatie van de λ-genenbank); - plasmide pGW325, dat het amdS gen van &. nidulans bevat, zie K. Wernars, "DNA-mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus nidulans", Thesis, Landbouw Hogeschool Wageningen, 1986; - plasmide pAB4.1, dat het pvrG gen van A.niqer var. niqer N402 bevat, zie Van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 206, 71-75, 1987; - plasmide pAN52-l, beschreven door Punt et al., Gene 56, 117-124, 1987; en plasmide pAN52-6, beschreven door P.J. Punt, J. Biotechn., in press; - vector X-EMBL3 (voor constructie van een A.niger var. awamori genenbank), verkrijgbaar bij Promega Biotec.
Een Escherichia coli JM109 stam, bevattende het plasmide pAW14B, is op 31 mei 1990 gedeponeerd bij het Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) te Baarn, Nederland, onder nummer CBS 237.90.
5.2 Asoerqillus transformatie.
A.niqer var. awamori protoplasten werden gemaakt uit mycelium met behulp van Novozym 234 (NOVO). De opbrengst aan protoplasten was 1-5 x 107/g mycelium en de levensvatbaarheid ("viability") was 3-8%. Per transformatie werden 3-8 x 105 levensvatbare protoplasten geïncubeerd met 5, 10 of 20 μg/ twee keer CsCl gezuiverd, plasmide DNA. Getransformeerde protoplasten werden uitgeplaat op osmotisch gestabiliseerde selectie-platen (aceetamide als stikstofbron) en geïncubeerd bij 25°C.
Na 6-10 dagen werden kolonies zichtbaar. Transformatie van resp. A.nicrer var. niqer N402 en A.niqer var. niqer AB4.1 werd in principe uitgevoerd als hierboven omschreven. In het geval van A.niqer var. niqer pyrG AB4.1 werd echter uridine aan het medium toegevoegd. Bij de cotransformatie van A.niqer var. niger AB4.1 werden pAWl4S en pAB4.1 DNA gemengd in een gewichtsverhouding van 4:1; transformanten werden geselecteerd op resp. aceetamide-platen met uridine (êmd£.-selectie), zonder uridine (amdS en pyrG selectie) en op minimaal medium platen met nitraat (pyrG selectie). Na 4-5 dagen waren kolonies zichtbaar. (Co)transformanten werden twee keer reingestreken op aceetamide-platen. Sporen van de tweede reinstrijk werden, ter verkrijging van grote hoeveelheden sporen, doorgestreken op platen met rijk medium en 5-6 dagen geïncubeerd bij 25-28°C. De verkregen sporen werden als suspensie (108-109 sporen/ml) bewaard of geadsorbeerd aan silicagel teneinde de sporen voor lange tijd te kunnen bewaren.
5.3 Constructie van A.niqer var, awamori qenenbank
Chromosomaal DNA werd geïsoleerd uit mycelium van A.niqer var. awamori. Het hoogmoleculaire DNA werd partiëel geknipt met Sau3AIf waarna fragmenten van 13-17 kb werden geïsoleerd na elektroforese op een 0,4% agarose gel. Van deze fragmenten werd 0,4 μg geligeerd met 1,2 μg X-EMBL3 DNA, dat geknipt was met BamHI en EcoRI. Het ligatiemengsel werd met behulp van een in vitro inpaksysteem (Amersham) voorzien van faagmantels. Door transductie naar £. coli NM539 werd een genenbank verkregen van ca. 154 000 plaques. Deze vertegenwoordigden ca. 75 x het genoom van A.niger var. awamori. Er werden 65 000 plaques overgebracht op nitrocellulose filters (in duplo).
5.4 Hybridisatie experimenten
Southern blot analyse: hybridisatie van digesten van chromosomaal A. nicer var. awamori DNA met radioactief gemerkte oligonucleotidenmengsels Xyl04 en Xyl06 (47-meren) werd uitgevoerd in 6 x SSC bij resp. 68°C, 62°C en 56°C; voor XylOl en Xyl05 (23-meren) werd een hybridisatietemperatuur van 41°C gebruikt. De gekozen hybridisatietemperatuur lag minimaal 5°C beneden de berekende smelttemperatuur. Blots werden gewassen bij de hybridisatietemperatuur met resp. 5 x en 3 x SSC. Hybridisatie werd uitgevoerd bij 68°C in 6 x SSC, terwijl de laatste wasstappen bij dezelfde temperatuur werden uitgevoerd met resp. 2 x en 0,4 x SSC.
Northern blot analyse: totaal, niet-geïnduceerd RNA van A. nicrer var. awamori werd geïsoleerd uit mycelium van rijk medium cultures (na 3 dagen kweken bij 25°C) . Geïnduceerd RNA was afkomstig van cultures, waarbij 1% xylaan of 4% tarwezemelen als inductor werd gebruikt. Uit de laatstgenoemde cultures werd mycelium verzameld na diverse kweekperioden. Na resp. 3 en 6 dagen werd mycelium geïsoleerd uit medium met tarwezemelen. Mycelium van xylaanmedium werd na resp. 6 en 11 dagen kweken verzameld. Hybridisatiecondities waren gelijk aan die bij de Southern blot analyse.
5.5 Kweekomstandiaheden
Media: xylaanmedium bevat 1% xylaan, 0,67% gistextract zonder aminozuren (Difco) en 0,1% cas. aminozuren. Medium met tarwezemelen bestaat uit 4 g tarwezemelen in 50 ml leidingwater, waaraan 50 ml van een zoutoplossing (pH 5,0) is toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5% (NH4)2SC>4, 0,15% KH2PO4, 0,025% MgSC>4 en 0,025% KC1. Rijk medium voor expressieproeven is minimaal medium (0,05% MgS04, 0,6% NaNC>3, 0,05% KC1, 0,15% KH2PO4 en spore-elementen), met 1% glucose, 0,2% trypticase (BBL), 0,5% gistextract, 0,1% cas. aminozuren en vitamine.
Zetmeelmedium bevat 5% zetmeel en 0,1% glucose in minimaal medium. Media werden 30 min bij 120°C gesteriliseerd. Medium (100 ml in een kolf van 500 ml) werd beent met 2 x 105 sporen/ml, waarna bij 25°C in een lucht incubator (300 rpm) werd gekweekt gedurende diverse perioden. Cultures met tarwezemelen als inductor (tabel I) werden met 4 x 105 sporen/ml beent.
5.6 Bepaling xylanase activiteit in medium van Asperqillus cultures
De xylanase activiteit werd vastgesteld door het bepalen van de vorming van reducerende suikers. Procedure: aan 125 μΐ 2% xylaan (Sigma) in 0,5 M Na-acetaat pH 5,0 werd bij 40°C een (verdund) medium-monster toegevoegd, waarna het reactiemengsel gedurende 30 min bij 40°C werd geïncubeerd. De reactie werd onmiddellijk gestopt met 0,5 ml 2-hydroxy-3,5-dinitro-benzoëzuur (DNS-) reagens, waarna het volume met water werd aangevuld tot 1 ml. Het reactiemengsel werd 5 min bij 100°C verhit en afgekoeld tot kamertemperatuur. De OD werd bepaald bij 534 nm tegen een blanco. De xylanase-activiteitsbepaling van één monster werd ten minste twee keer uitgevoerd. Voor het verdunnen van de media werd 0,5 M Na-acetaat pH 5,0 gebruikt.
5.7 Selectie van transformanten
Bij de analyse van de vele transformanten werden de gast-heerstammen en ca. 6 transformanten uit één reeks gekweekt in rijk of selectief medium, waarna het xylanase-produktieniveau werd bepaald. Twee transformanten uit elke reeks, met de hoogste xylanase produktie, werden opnieuw geanalyseerd in hetzelfde medium. Daarnaast werd van deze transformanten het produktieniveau in medium met tarwezemelen bepaald.
5.8 Constructie van expressievectoren pAW14S (met de A.niger var. niaer xylA promoter): de expressievector pAW14S (fig.4) werd geconstrueerd door insertie van een 5,0 kb EcoRI fragment van plasmide pGW325, waarop het Asperqillus nidulans amdS gen is gelegen, in de EcoRI site van de polylinker van pAWl4B (fig.3). In pAW14S hebben het amdS en xylA gen dezelfde transcriptierichting.
pAW14S-2 (met de A. nidulans gpdA promoter): het lineaire 1,8 kb Stul-Ncol fragment van pAN52-l, waarop de nidulans gpdA-promoter (tot het ATG triplet) is gelegen, werd geligeerd met het 7,2 kb NcoI*-SmaI fragment van pAW14B, verkregen door partiële Ncol- en volledige Smal-digestie. Transformatie van £. coli JM109 resulteerde in isolatie van het plasmide pAW14B-l (9,0 kb). Het 7,2 kb NruI*-NcoI* fragment van pAW14B-l, verkregen door partiële Ncol- en volledige Nrul-digestie, werd geligeerd met een synthetisch fragment (79 bp, nucleotiden nrs. 350-428 van de coderende streng en nucleotiden nrs. 354-428 van de templaat streng), bestaande uit xylA sequenties vanaf het ATG triplet, hetgeen resulteerde in pAW14B-2 (fig.5). In de unieke EcoRI-site van pAW14B-2 werd het 5,0 kb EcoRI fragment van pGW325 (A. nidulans amdS gen) geplaatst, resulterend in pAW14S-2 (fig.6) . In dit plasmide hebben het amdS en het xylA gen dezelfde oriëntatie. Door middel van DNA sequentie-analyse werd de aansluiting van de qpdA promoter op het ATG codon van het xylA gen geverifiëerd evenals de sequentie van het synthetische fragment.
pAW14S-3 (met de A.niaer var. niqer N402 qlaA promoter): pAN52-6 werd partiëel geknipt met XmnI (3 sites). Het lineaire 7,5 kb fragment, waarop de A.niqer var. niqer N402 qlaA promoter is gelegen, werd geïsoleerd. Na knippen van dit fragment met BssHII werd een 7,35 kb BssHFII-XmnI fragment geligeerd met een synthetisch DNA-fragment (ca. 150 bp), dat het 3' uiteinde van de glaA promoter bevat tot het ATG triplet, gevolgd door het xylA gen vanaf het ATG triplet tot de in het gen gelegen Nrul-site met daarachter een BssHII-uiteinde. Het aldus verkregen plasmide, pAN52-6.URL, werd geknipt met Ncol en met Nrul, na opvullen van de Ncol site. De DNA sequentie van het synthetisch fragment in pAN52-6.URL werd gecontroleerd. De qlaA promoter werd voor het xylA gen geplaatst door ligatie van het 2,5 kb "opgevulde Ncol"-Nrul fragment uit pAN52-6.URL met het ca. 10 kb Nrul fragment van pAW14S. Insertie van dit fragment in de juiste oriëntatie resulteerde in pAW14S-3 (fig.7).
VOORBEELD TI
BAKPROEVEN
De broodverbeterende werking van het xylanase, verkregen na isolatie uit fermentatievloeistof, werd getest door de volume vermeerdering te meten van Belgische pistolets gebakken na toevoeging van oplopende hoeveelheden enzym en deeg. Het xylanase was als volgt geïsoleerd.
Asoergillus niaer var. awamori transformant AW14S.1A werd 7 dagen gekweekt op medium met 4% tarwezemelen in een fermentor met een werkvolume van 8 liter. De xylanase produktie bedroeg ca. 85 000 ü/ml. De schimmelcellen werden verwijderd door een filtratie over doek. Aan 6 liter filtraat werd vervolgens, onder roeren, ammoniumsulfaat toegevoegd tot 50 gew.%. Het precipitaat werd afgecentrifugeerd in een Sorvall GSA rotor bij 10 OOOg gedurende 20 minuten. Het pellet werd opgenomen in 500 ml aqua dest. en vervolgens weer gecentrifugeerd bij 10 OOOg. Het supernatant werd vervolgens geconcentreerd door ultrafiltratie m.b.v. een Amicon PM10 ultrafiltratiemenbraan tot een volume van 60 ml. Om de ammoniumsulfaat te verwijderen werd de ultrafiltratie tweemaal herhaald na verdunnen met aqua dest. tot resp. 300 en 600 ml. Het uiteindelijk verkregen materiaal aanwezig in een volume van 50 ml werd vervolgens gevriesdroogd. De opbrengst bedroeg 4,8 gram met een specifieke activiteit van 60 000 ü/mg (56% overall). Ten behoeve van de toepassing in bakproeven werd het xylanase gemengd met zetmeel tot een concentratie van 240 ü/mg.
Aan 1000 gram tarwebloem Banket Extra (van Wessanen) werd toegevoegd 600 ml water, 20 gram zout, 20 gram suiker (sucrose), 50 gram gist (koningsgist van Gist Brocades) en 0, 50, 100 of 200 mg/kg xylanase (240 U/mg). De degen werden tien minuten gekneed in een Eberhardt kneder met een deegtemperatuur van 24 °C. Na 20 minuten fermentatie bij 28°C werd het deeg doorgeslagen, in kleine deegporties verdeeld van ca. 50 gram, en nogmaals 60 minuten gefermenteerd in een rijskast bij 35°C tot 38°C. De deegporties werden vervolgens gebakken bij 230°C gedurende 20 minuten. De specifieke volumes (in ml/g) werden bepaald door het volume (in ml), bepaald m.b.v. de zaadverplaatsingsmethode, te delen door het gewicht (in gram).
Voor een gemiddelde van 10 broodjes werden de volgende resultaten gevonden: enzvmniveau_Q_50 dom 100 dom 200 dpm specifiek volume 6,8 7,9 8,7 8,9
Dezelfde trends kunnen worden vastgesteld indien bovendien andere broodverbeterende ingrediënten zoals vitamine C, vet, emulgatoren en α-amylase worden toegevoegd. Andere eigenschappen zoals deegverwerking en kruimstruktuur worden door toevoeging van het xylanase enzym eveneens positief beïnvloed.
VOORBEELD III
PRODUKTIE VAN ASPERGILLPS NIGER VAR. AWAMORI XYLANASE DOOR SAOOHAROMYCES CEREVISIAE
Als voorbeeld voor de heterologe produktie van Asperqillus nicrer var. awamori xylanase door micro-organismen zijn expressievectoren geconstrueerd voor de expressie van het xylanase in Saccharomyces cerevisiae onder controle van de induceerbare GAL7 promoter (Nogi en Fukasawa, 1983). De GAL7 promoter zorgt voor produktie van enzym onder geïnduceerde condities: groei op medium met galactose als enige koolstof-bron (Hopper en Rowe, 1978). Het gebruik van deze promoter voor geïnduceerde produktie van heterologe eiwitten is reeds beschreven (Tajima et al., 1985). Het schimmelgen coderend voor xylanase is eerst geschikt gemaakt voor de expressie in £. cerevisiae door middel van de verwijdering van het intron (niet coderende sequentie) met behulp van een synthetisch DNA fragment. Met dezelfde techniek is gezorgd voor een correcte aansluiting van het xylanase gen op de ü. cerevisiae GAL7 promoter. Indien gewenst is tevens een ü. cerevisiae signaal-sequentie, de invertase signaalsequentie, geïntroduceerd om uitscheiding van het schimmelenzym xylanase door de gist S.. cerevisiae te verwezenlijken. Bij de produktie van het A. niger var. awamori xylanase door de gist cerevisiae is uitgegaan van autonoom replicerende vectoren alswel (multicopy) integrerende vectoren. Alle kloneringen werden uitgevoerd in E. coli stam JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985) en alle methoden en technieken volgens Maniatis et al. (1982).
Constructie van de vector pUR2901
De eerste tussenconstructie is gericht op de correcte verwijdering van het intron van het xylanase gen, dus zonder de coderende sequentie te veranderen of te verstoren. De synthetische DNA oligo's weergegeven in fig. 8 (BAK 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 23 en 24) zijn geannealed en aan elkaar geligeerd waarbij het fragment BAK1 ontstaat. Het fragment BAK1 is 205 bp groot en omvat het SacI - Kpnl xylanase fragment (bp 535 - bp 777) waaruit het intron is verwijderd. De synthetische DNA oligo's zijn zodanig ontworpen dat bij de verwijdering van het intron een correcte aansluiting van de fragmenten is gemaakt waardoor het open reading frame (coderend voor xylanase) niet verstoord is. Om de vervolgconstructie te vereenvoudigen is de SacI site veranderd in een Xhol site. Aan de 5' kant is het fragment voorzien van een EcoRI site. Het ligeringsmengsel is gedigesteerd met de restrictie-enzymen Kpnl en EcoRI en het correcte 205 bp fragment is geïsoleerd met behulp van agarose gelelektroforese voor de scheiding van het fragment en gel-elutie voor de isolatie van het fragment uit de agarosegel.
Het Kpnl -EcoRI BAK1 fragment is gedoneerd in de Kpnl en de EcoRI site van de vector pTZ19R (verkregen van Pharmacia) resulterend in pBAKl (zie fig. 9). Het geïnserteerde fragment in het geconstrueerde plasmide pBAKl is m.b.v. sequentie-analyse gecontroleerd.
De vervolgconstructies zijn gericht op het verwezenlijken van een correcte aansluiting van het A. niger var. awamori xylanase gen op de Ü. cerevisiae GAL7 promoter. Hiertoe zijn de synthetische DNA oligo's weergegeven in fig. 10 (BAK 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 27 en 28) geannealed en geligeerd resulterend in fragment BAK2. Het fragment BAK2 is 202 bp groot en omvat de synthetische overgang vanaf de SacI site van de GAL7 promoter via de invertase signaalsequentie naar het rijp xylanase gen tot aan de SacI (bp 535) site. Om de vervolgconstructie te vereenvoudigen is de SacI site, identiek als bij de constructie van pBAKl, veranderd in een Xhol site. Aan de 5’ kant van het fragment is een extra EcoRI site aangebracht. Het ligeringsmengsel is gedigesteerd met EcoRI en Xhol en het correcte 202 bp BAK2 fragment is geïsoleerd. Het plasmide pBAKl is gedigesteerd met EcoRI en Xhol en in het vectorfragment is het BAK2 fragment, met dezelfde uiteinden, gedoneerd resulterend in plasmide pBAK21 (zie fig. 11). Het geïnserteerde BAK2 fragment is middels sequentie analyse gecontroleerd. In het plasmide pBAK2l is de aansluiting van de fragmenten BAK1 en BAK2 met de Xhol site zodanig uitgevoerd dat er het open reading frame, coderend voor xylanase, op een correcte wijze hersteld is. Het plasmide pBAK21 bevat dus de £. cerevisiae GAL7 promoterovergang vanaf de SacI site, de cerevisiae invertase signaalsequentie (inclusief een ATG startcodon) en het A. niaer var. awamori xylanase (coderend voor rijp xylanase) waaruit het schimmel-intron (niet coderende sequentie) op een correcte wijze verwijderd is tot aan de Kpnl site (het 5' gedeelte van het xylanase gen).
Het plasmide pAW14B is gedigesteerd met Kpnl en BamHI en het 327 bp Kpnl - BamHI fragment, het 3’ gedeelte van het xylanase gen bevattend, is geïsoleerd. Het plasmide pBAK21 is eveneens gedigesteerd met Kpnl en BamHI en het vectorfragment is geïsoleerd. Het geïsoleerde 327 bp fragment en het vector-fragment zijn aan elkaar geligeerd resulterend in plasmide PÜR2901 (zie fig. 12). Het plasmide pUR2901 is gecontroleerd door middel van restrictie enzym analyse. Het plasmide pUR2901 bevat de cerevisiae GAL7 promoterovergang vanaf de SacI site, de &. cerevisiae invertase signaalsequentie (inclusief een ATG startcodon) en het gehele A. nioer var. awamori xylanase gen (coderend voor rijp xylanase) waaruit het schimmelintron (niet coderende sequentie) op een correcte wijze verwijderd is.
Constructie van de S. cerevisiae exoressievector pUR2904
Bij de constructie van de expressievector pUR2904 is uitgegaan van het plasmide pUR2740. Het plasmide pUR2740 is een afgeleide van pUR2730 dat gebruikt is voor de produktie van α-galactosidase in S. cerevisiae. Het plasmide pUR2740 is niet wezenlijk verschillend van pUR2730, enkele overbodige sequenties in het niet functionele gedeelte van de vector zijn verwijderd. Het plasmide pUR2740 is een E. coli/S. cerevisiae shuttle vector. Voor de replicatie in &. cerevisiae wordt gebruik gemaakt van de 2 μιη origin of replication en als selectiegen dient het &. cerevisiae LEU2 gen. Het plasmide PÜR2740 is gedigesteerd met SacI en HindlII en het vector-fragment is geïsoleerd. Ten gevolge van deze digestie is het α-galactosidase gen verwijderd. Het plasmide pUR2901 is eveneens gedigesteerd met SacI en HindlII en het 730 bp fragment omvattend de £L. cerevisiae GAL7 promoterovergang vanaf de SacI site, de S. cerevisiae invertase signaalsequentie (inclusief een ATG startcodon) en het gehele niger var. awamori xylanase gen (coderend voor rijp xylanase) is geïsoleerd. Het pUR2740 vectorfragment en het 730 bp fragment van pUR2901 zijn aan elkaar geligeerd, resulterend in pUR2904 (zie fig. 13). Het plasmide pUR2904 is gecontroleerd door middel van restrictie enzym analyse. Het plasmide pUR2904 is de expressievector voor de produktie van het A. niqer var. awamori xylanase door de gist f>. cerevisiae. Het plasmide püR2904 is een £. coli/S. cerevisiae shuttle vector. Het bevat de DNA sequentie coderend voor xylanase met daaraan gefuseerd de invertase signaalsequentie; de invertase signaalsequentie zal zorgen voor de secretie van het xylanase. De DNA sequentie in pUR2904 codeert voor exact hetzelfde xylanase als de wildtype A. nicrer var. awamori stam. Tijdens de secretie zal in principe het ontstane fusie-eiwit processing ondergaan door het &· cerevisiae signaal peptidase resulterend in uitgescheiden rijp xylanase enzym. De expressie van het xylanase staat onder controle van de £. cerevisiae galactose induceerbare GAL7 promoter.
Analyse van de oroduktie van A. niqer var, awamori xylanase door S. cerevisiae
Gistcellen van de Saccharomvces stam SU10 (oc, leu2. ura3. his3. cir+; gedeponeerd bij het Centraalbureau voor Schimmelcultures, Postbus 273, 3740 AG Baarn, Nederland, onder nummer CBS 323.87) werden getransformeerd met het plasmide pUR2904 volgens de spheroplast methode (Beggs, 1978). De resulterende leu+ getransformeerde gistcellen werden geanalyseerd voor de aanwezigheid van xylanase. De gistcellen werden tweemaal overnacht gegroeid op MM medium (0,67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 2% glucose) gesupplementeerd met uracil en histidine. Vervolgens werden de gistcellen overgebracht in een tienmaal groter volume YPG medium (1% Yeast Extract, 2% Bacto pepton, 5% galactose) en gegroeid tot de gistcellen de stationaire fase hadden bereikt. Het kweken van de gistcellen geschiedde schuddend bij 30 °C. De gistcellen werden gescheiden van het medium door middel van centrifugatie. Het medium werd geanalyseerd op aanwezigheid van het xylanase met de enzymassay zoals beschreven in voorbeeld I. Het expressie-niveau van xylanase was ongeveer 1000 units in 1 ml medium. Door middel van iso-elektrische focussering (zie voorbeeld I) werd aangetoond dat het xylanase, geproduceerd door £.
cerevisiae. identiek is aan het xylanase, geproduceerd door wildtype A. niqer var. awamori. De functionaliteit van het xylanase, geproduceerd en uitgescheiden door cerevisiae, werd aangetoond in bakproeven, uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld II. De hierboven beschreven resultaten tonen aan dat de gist cerevisiae in staat is om efficiënt A. niqer var. awamori xylanase te produceren en uit te scheiden.
Referenties
Beggs, J.D. (1978), Nature 275: 104-109.
Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982), Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory. Tajima, M., Nogi, Y. and Fukasawa, T. (1985), Yeast, 1:67-77. Nogi, Y. and Fukasawa, T. (1983), Nuclaic Acids Res., 11:8555-8568.
Hopper, J.E. and Rowe, L.B. (1978), J. Biol. Chem. 253:7566-7569.
Yanisch-Perron, C., Viera, J. and Messing, J. (1985) Gene, 33:103-119.
VOORBEELD IV
PRODUKTTE VAN ASPERGILLIIS NIGER VAR. AWAMORI XYLANASE DOOR BACILLUS SUBTTLIS
Als voorbeeld voor de heterologe produktie van Asoergillus niqer var. awamori xylanase door een prokaryoot micro-organisme zijn expressievectoren geconstrueerd voor de produktie van xylanase door Bacillus subtilus. Hierbij wordt uitgegaan van plasmiden geconstrueerd in voorbeeld III, omdat de verwijdering van het intron van het xylanase gen essentieel is voor de expressie in £. subtilis. Dit is essentieel, omdat een prokaryoot micro-organisme zoals B. subtilis niet in staat is, in tegenstelling tot de schimmel A. niqer var. awamori. om introns middels een proces genaamd splicing te verwijderen.
Constructie van vector pUR2950
De synthetische DNA oligo's weergegeven in fig. 14 (BAK 15, 18, 26, 27, 41 en 42) zijn geannealed en aan elkaar geligeerd waarbij het fragment BAK4 onstaat. Het fragment BAK4 is 107 bp groot en omvat de DNA sequentie, coderend voor rijp xylanase tot aan de SacI site (bp 535). Om de vervolg-constructie te vereenvoudigen is de SacI site veranderd in een Xhol site zonder daarbij de afgeleide aminozuursequentie te veranderen. Tevens is om in de vervolgconstructie een correcte aansluiting te verkrijgen van het rijp xylanase aan de B. subtilis α-amylase signaalsequentie het eerste codon, coderend voor alanine, van het rijp xylanase veranderd. Het codon GCT is veranderd in GCC, eveneens coderend voor alanine. Hiermee is aan de 5' kant van het BAK4 fragment een SacII site gemaakt. Aansluitend aan deze SacII site is het BAK4 fragment voorzien van een EcoRI site. Het ligeringsmengsel is gedigesteerd met EcoRI en Xhol en het 107 bp EcoRI - Xhol fragment is geïsoleerd. Het plasmide pBAKl (zie voorbeeld III) is gedigesteerd met EcoRI en Xhol en in het vectorfragment is het BAK4 fragment, met dezelfde restrictie enzym uiteinden gedoneerd resulterend in pBAK41. Het geïnserteerde fragment BAK4 in pBAK41 is door middel van sequentie analyse gecontroleerd. In het plasmide pBAK41 is de aansluiting van fragment BAK4 en BAKl middels de Xhol site zodanig uitgevoerd dat het open reading frame, coderend voor het 5' gedeelte van xylanase, op een correcte wijze is hersteld. Tevens is zoals beschreven in voorbeeld III het intron van het xylanase gen op een correcte wijze verwijderd. Het plasmide pBAK41 bevat dus de DNA sequentie vanaf het eerste alanine codon van rijp xylanase, waarbij op die plaats een SacII site is gemaakt, tot aan de Kpnl site van het het xylanase gen.
Het plasmide pAW14B is gedigesteerd met Kpnl en BamHI en het 327 bp Kpnl - BamHI fragment, dat het 3' gedeelte van het xylanase gen bevat, is geïsoleerd. Het plasmide pBAK41 is eveneens gedigesteerd met Kpnl en BamHI en het vectorfragment is geïsoleerd. Het geïsoleerde 327 bp fragment en het vectorfragment zijn aan elkaar geligeerd resulterend in plasmide pUR2950. Het plasmide pUR2950 is gecontroleerd door middel van restrictie enzym analyse. Het plasmide pUR2950 bevat dus de DNA sequentie vanaf het eerste alanine codon van rijp xylanase, waarbij op die plaats een SacII site is gemaakt is en het A. niqer var. awamori xylanase coderend voor rijp xylanase waaruit het schimmelintron (een niet coderende sequentie) op een correcte wijze verwijderd is.
Constructie van B. subtilis expressievector PÜR2951
Plasmide pMS48 (Kok et al., 1985, EP-A-0 157 441; blz 51 - 57) is gebruikt als basis voor de constructie waarin het rijp A. niqer var. awamori xylanase, aanwezig in plasmide PÜR2950, is gefuseerd aan de α-amylase signaalsequentie voor uitscheiding van het te produceren enzym, terwijl dit fusiegen onder controle staat van de SP02 promoter (fig. 15). Plasmide pMS48 is gedigesteerd met SacII en HindlII en het vectorfragment met de SP02 promoter en de α-amylase signaalsequentie is geïsoleerd. Het SacII - HindlII fragment van pUR2950 met het rijp xylanase gen is geïsoleerd en geligeerd aan het pMS48 vectorfragment, waarbij de α-amylase signaalsequentie op precies de juiste wijze is gefuseerd aan het rijp xylanase gen, resulterend in plasmide pUR2951. Het ligatiemengsel is getransformeerd naar de B. subtilis stam DB104 (Kawamuri en Doi, 1984) gebruik makend van de protoplast methode (Kok et al., 1985, blz 52) met neomycine als selectie. Het plasmide PÜR2951 is gecontroleerd met restrictie enzym analyse en de SacII fusie is gecontroleerd met sequentie analyse.
Analyse van de oroduktie van A. niqer var, awamori xylanase door B. subtilis.
De produktie van xylanase kan op de volgende wijze worden aangetoond:
Het is bekend van Bacillus dat de produktie van heterologe eiwitten alleen kan worden gedetecteerd in een specifieke groeifase van de cellen (Grandi et al., 1986). De B. subtilis stam met pUR2951 kan overnacht gegroeid worden in Luria medium met neomycine (20 μg/ml), 1 op 50 verdund worden en vervolgens moet de xylanase activiteit op verschillende tijdstippen worden geanalyseerd. Mogelijk neemt de extracellulaire produktie van xylanase met het toenemen van de cultuurtijd en de biomassa af als gevolg van protease produktie. De produktie van xylanase kan geoptimaliseerd worden door te groeien in een fermentor op een zodanige wijze dat door de juiste keuze van het groeimedium en de procescondities de protease produktie onderdrukt wordt. Een dergelijk proces is voor de extracellulaire produktie van guar a-galactosidase in B. subtilis reeds beschreven.

Claims (25)

1. Recombinant DNA materiaal, omvattende DNA met een nucleotidensequentie, welke codeert voor een rijpingsvorm van een xylanase van schimmel oorsprong.
2. Recombinant DNA materiaal, omvattende DNA met een nucleotidensequentie, welke codeert voor een rijpingsvorm van een xylanase van Asperaillus oorsprong.
3. Recombinant DNA materiaal, omvattende DNA met een nucleotidensequentie, welke codeert voor een rijpingsvorm van een xylanase van Asperaillus niaer oorsprong.
4. Recombinant DNA materiaal, omvattende DNA met een nucleotidensequentie, welke codeert voor een rijpingsvorm van een xylanase van Aspergillus niger var. awamori oorsprong.
5. Recombinant DNA materiaal, omvattende DNA met een nucleotidensequentie, coderend voor een rijp xylanase of een pre(pro)-xylanase met een aminozuurvolgorde zoals weergegeven in figuur 1.
6. Recombinant DNA materiaal, omvattende DNA met een voor een rijp xylanase of een pre(pro)-xylanase coderende nucleotidensequentie zoals weergegeven in figuur 1.
7. Cel, welke van recombinant DNA materiaal volgens een van de conclusies 1-6 afgeleid genetisch materiaal bevat.
8. Cel, welke van recombinant DNA materiaal volgens een van de conclusies 1-6 afgeleid genetisch materiaal bevat en tot expressie van de xylanase rijpingsvorm, gecodeerd op het recombinant DNA materiaal, in staat is.
9. Cel volgens conclusie 7 of 8, gekozen uit de groep bestaande uit een bacteriecel, een schimmelcel, een gistcel en een plantecel.
10. Cel volgens conclusie 9, bestaande uit een schimmelcel van een van de families Aspercrillus en Trichoderma.
11. Cel volgens conclusie 10, bestaande uit een schimmelcel van een van de soorten Asperaillus niaer var. awamori. Asperoillus niger var. niger. Aspergillus nidulans en Aspergillus oryzae.
12. Cel volgens conclusie 9, bestaande uit een gistcel van een van de families Saccharomyces, Kluyveromvces, Hansenula en Pichia.
13. Cel volgens conclusie 12, bestaande uit een gistcel van een van de soorten Saccharomyces cerevisiae, Saccharomvces carlsbergensis. Kluyveromyces lactis. Kluyveromyces marxianus. Hansenula polymorpha en Pichia pastoris.
14. Cel volgens conclusie 9, bestaande uit een plantecel van een plantenfamilie, gekozen uit de groep bestaande uit tarwe, gerst, haver, maïs, erwt, aardappel en tabak.
15. Cel volgens conclusie 9, bestaande uit een bacterie-cel van een van de bacteriefamilies Bacillus. Lactobacillus en Streptococcus.
16. Rijpingsvorm van een xylanase van schimmel, i.h.b. Asperaillus oorsprong, welke verkregen is door expressie van recombinant DNA materiaal volgens een van de conclusies 1-6.
17. Rijp xylanase met een aminozuurvolgorde zoals weergegeven in figuur 1.
18. Pre(pro)-xylanase met een aminozuurvolgorde zoals weergegeven in figuur 1.
19. Werkwijze voor het produceren van een rijpingsvorm van een xylanase van schimmel, i.h.b. Aspergillus oorsprong, omvattende het kweken in een geschikt voedingsmedium van een cel volgens een van de conclusies 8-15, en eventueel het isoleren van de gevormde xylanase rijpingsvorm.
20. Broodverbeteraarsamenstelling, omvattende een rijp xylanase van schimmel, i.h.b. van Aspergillus oorsprong, dat verkregen is door expressie van recombinant DNA materiaal volgens een van de conclusies 1-6.
21. Meelsamenstelling, omvattende een rijp xylanase van schimmel, i.h.b. Aspergillus oorsprong, dat verkregen is door expressie van recombinant DNA materiaal volgens een van de conclusies 1-6.
22. Deegsamenstelling, omvattende een rijp xylanase van schimmel, i.h.b. Asperqillus oorsprong, dat verkregen is door expressie van recombinant DNA materiaal volgens een van de conclusies 1-6.
23. Bakkerijprodukt, verkregen onder toepassing van een meelsamenstelling volgens conclusie 21 of een deegsamen-stelling volgens conclusie 22.
24. Werkwijze voor het bereiden van een bakkerijprodukt, waarbij een deegsamenstelling wordt toegepast, waarin een rijp xylanase van schimmel, i.h.b. Asoercrillus oorsprong, verkregen door expressie van recombinant DNA materiaal volgens een van de conclusies 1-6, is opgenomen.
25. Gebruik van een rijpingsvorm van een xylanase van schimmel, i.h.b. Asoeraillus oorsprong, verkregen door expressie van recombinant DNA materiaal volgens een van de conclusies 1-6, in werkwijzen, waarbij een cellulosehoudende grondstof wordt toegepast, zoals werkwijzen voor het bereiden van bier, papier, zetmeel, gluten, e.d., en werkwijzen voor het afbreken van cellulosehoudend afval, zoals landbouwafval, afval van papierfabrieken, e.d.
NL9001388A 1990-06-19 1990-06-19 Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan. NL9001388A (nl)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL9001388A NL9001388A (nl) 1990-06-19 1990-06-19 Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan.
DE69132422T DE69132422T3 (de) 1990-06-19 1991-06-18 Xylanaseproduktion
CA002085232A CA2085232C (en) 1990-06-19 1991-06-18 Xylanase production
DK91910872T DK0600865T3 (da) 1990-06-19 1991-06-18 Xylanase produktion
PCT/EP1991/001135 WO1991019782A1 (en) 1990-06-19 1991-06-18 Xylanase production
AT91910872T ATE196501T1 (de) 1990-06-19 1991-06-18 Xylanaseproduktion
US07/955,726 US6586209B1 (en) 1990-06-19 1991-06-18 Xylanase production
DK91910872K DK0600865T4 (da) 1990-06-19 1991-06-18 Xylanaseproduktion
AU80668/91A AU689436C (en) 1990-06-19 1991-06-18 Xylanase production
JP03510717A JP3142134B2 (ja) 1990-06-19 1991-06-18 キシラナーゼ生産法
EP91910872A EP0600865B2 (en) 1990-06-19 1991-06-18 Xylanase production
ES91910872T ES2152217T5 (es) 1990-06-19 1991-06-18 Produccion de xilanasa.
ZA914714A ZA914714B (en) 1990-06-19 1991-06-19 A cell having a certain function in a process,containing recombinant dna encoding at least one enzyme,recombinant dna,enzyme for which the recombinant dna encodes and uses thereof
FI925730A FI111549B (fi) 1990-06-19 1992-12-17 Rekombinantti-DNA-materiaali, joka koodaa ksylanaasin kypsyvää muotoa, ja isäntäsolu

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL9001388A NL9001388A (nl) 1990-06-19 1990-06-19 Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan.
NL9001388 1990-06-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL9001388A true NL9001388A (nl) 1992-01-16

Family

ID=19857272

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL9001388A NL9001388A (nl) 1990-06-19 1990-06-19 Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan.

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6586209B1 (nl)
EP (1) EP0600865B2 (nl)
JP (1) JP3142134B2 (nl)
AT (1) ATE196501T1 (nl)
AU (1) AU689436C (nl)
CA (1) CA2085232C (nl)
DE (1) DE69132422T3 (nl)
DK (2) DK0600865T4 (nl)
ES (1) ES2152217T5 (nl)
FI (1) FI111549B (nl)
NL (1) NL9001388A (nl)
WO (1) WO1991019782A1 (nl)
ZA (1) ZA914714B (nl)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837515A (en) * 1990-05-16 1998-11-17 Alko-Yhtiot Oy Enzyme preparations and methods for their production
IE912582A1 (en) * 1990-07-24 1992-01-29 Gist Brocades Nv Cloning and expression of xylanase genes from fungal origin
EP0672149B1 (en) * 1991-12-09 2001-08-08 Unilever Plc PROCESS FOR PRODUCING/SECRETING A PROTEIN BY A TRANSFORMED MOULD USING EXPRESSION/SECRETION REGULATING REGIONS DERIVED FROM AN $i(ASPERGILLUS) ENDOXYLANASE II GENE
WO1993025693A1 (en) * 1992-06-17 1993-12-23 The Agricultural And Food Research Council Recombinant xylanases
WO1993025671A1 (en) * 1992-06-17 1993-12-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Recombinant xylanase
ATE412048T1 (de) 1993-03-10 2008-11-15 Novozymes As Enzyme mit xylanaseaktivität aus aspergillus aculeatus
DE69533473T2 (de) * 1994-03-02 2005-01-20 Novozymes A/S Verarbeitung von pflantzlichem material mit xylanase
CO4520252A1 (es) * 1995-06-07 1997-10-15 Bioteknologisk Inst Hexosa oxidasa recombinante
US8178090B2 (en) 1995-06-07 2012-05-15 Danisco A/S Recombinant hexose oxidase
US7745599B1 (en) 1995-06-07 2010-06-29 Danisco A/S Hexose oxidase-encoding DNAs and methods of use thereof
AU1437597A (en) * 1996-01-22 1997-08-20 Novo Nordisk A/S An enzyme with xylanase activity
ES2111495B1 (es) * 1996-07-19 1998-11-01 Consejo Superior Investigacion Cepa de levadura de panaderia cect10868 y cepa de panaderia cect10869. su metodo de obtencion por tecnicas de adn recombinante y su aplicacion como levaduras de panaderia.
US6031155A (en) * 1997-06-05 2000-02-29 Cameron-Mills; Verena Arabinoxylan degradation
AU1052701A (en) * 1999-11-05 2001-06-06 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Transgenic non-human mammals for monitoring change in calcium ion concentration in cells
WO2001066711A1 (en) 2000-03-08 2001-09-13 Danisco A/S Xylanase variants having altered sensitivity to xylanase inhibitors
WO2002003805A1 (en) 2000-07-06 2002-01-17 Novozymes A/S Method of preparing a dough or a baked product made from a dough, with addition of lipolytic enzymes
US7514110B1 (en) 2000-09-21 2009-04-07 Basf Aktiengesellschaft Talaromyces xylanases
DK2270139T3 (en) 2003-05-09 2016-11-07 Novozymes As Lipolytic Enzyme Variants
BRPI0412279A (pt) 2003-07-02 2006-09-19 Diversa Corp glucanases, ácidos nucléicos codificando as mesmas e métodos para preparar e aplicar os mesmos
CN101389645B (zh) 2004-02-12 2016-08-03 诺维信股份有限公司 具有木聚糖酶活性的多肽和编码它的多核苷酸
KR100620495B1 (ko) 2004-08-02 2006-09-08 학교법인 동의학원 재조합 엔도자일라나제를 이용한 자일로올리고당의 제조방법
CN106222185B (zh) 2006-08-04 2021-12-03 维莱尼姆公司 葡聚糖酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
JP5762683B2 (ja) * 2006-12-01 2015-08-12 ラクレード，インコーポレーテッド 耳内のバイオフィルムを溶解するための加水分解酵素及び酸化酵素の使用
EP2106215B1 (en) 2007-01-16 2020-09-02 Puratos N.V. Bread with increased arabinoxylo-oligosaccharide content
KR20100014954A (ko) 2007-03-09 2010-02-11 다니스코 유에스 인크. 호알칼리성 바실러스 종 α-아밀라아제 변이체, α-아밀라아제 변이체를 함유하는 조성물 및 사용 방법
CA2680611C (en) 2007-03-14 2016-01-12 Danisco Us Inc. Trichoderma reesei .alpha.-amylase is a maltogenic enzyme
DK2554666T3 (en) 2008-01-02 2015-11-02 Danisco Us Inc PROCEDURE FOR OBTAINING ETHANOL WITHOUT glucoamylase USING PSEUDOMONAS saccharophila G4 amylase AND VARIATIONS THEREOF
CA2722889A1 (en) 2008-04-30 2009-11-05 Danisco Us Inc. New chimeric alpha-amylase variants
EP2291526B1 (en) 2008-06-06 2014-08-13 Danisco US Inc. Saccharification enzyme composition with Bacillus subtilis alpha-amylase
EP2698434A1 (en) 2008-06-06 2014-02-19 Danisco US Inc. Uses of an alpha-amylase from Bacillus subtilis
US9090887B2 (en) 2008-06-06 2015-07-28 Danisco Us Inc. Variant alpha-amylases from Bacillus subtilis and methods of use, thereof
MX360447B (es) 2009-01-16 2018-11-01 Dupont Nutrition Biosci Aps Generacion enzimatica de oligosacaridos a partir de cereales o bi-corrientes de cereal.
EA201170938A1 (ru) 2009-01-16 2012-06-29 Даниско А/С Ферментативное получение функциональных липидов из злаковых или побочных продуктов обработки злаковых
EP2413715B1 (en) 2009-03-31 2017-10-25 DuPont Nutrition Biosciences ApS Prevention of extract darkening and malodor formation during solubilization of plant cell wall material
BRPI1012787A8 (pt) 2009-05-19 2019-11-12 Danisco polipeptídeos de amilase
FR2959515A1 (fr) 2010-05-03 2011-11-04 Puratos Compositions riches en oligosaccharides d'arabinoxylane
JP2012075369A (ja) * 2010-09-30 2012-04-19 Toyota Motor Corp シス作用エレメント及びその利用
US8759041B1 (en) * 2013-02-12 2014-06-24 Novozymes Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
WO2015150372A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Dupont Nutrition Biosciences Aps Method for increasing crude palm oil yields
BR112017013025A2 (pt) 2014-12-19 2018-01-02 Dupont Nutrition Biosci Aps recuperação de óleo da lama de palma
AU2016226359A1 (en) 2015-03-04 2017-08-17 Dupont Nutrition Biosciences Aps Cereal grain processing
GB201522603D0 (en) 2015-12-22 2016-02-03 Dupont Nutrition Biosci Aps Composition
CL2018003617A1 (es) * 2018-12-14 2019-03-22 Univ Santiago Chile Polipéptido con actividad xilanasa, secuencia nucleotídica que lo codifica, ingrediente y proceso que comprende dicho ingrediente para la preparación de un producto alimenticio
US11879255B2 (en) 2020-07-01 2024-01-23 Gebrüder Jaeger GmbH Decoupling mat and floor structure, in particular in a building with a decoupling mat
CN114397392B (zh) * 2022-01-18 2023-08-11 宁波中盛产品检测有限公司 一种化妆品中玻色因有效物的离子色谱分析方法
EP4389906A1 (en) 2022-12-21 2024-06-26 Basf Se Methods for the enzymatic treatment of whole stillage

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI64813C (fi) 1980-12-31 1984-01-10 Ilkka Antero Palva Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer
DK138984A (da) 1983-03-08 1984-09-09 Rikagaku Kenkyusho Plasmid, fremgangsmaade til fremstilling heraf, mikroorganismer indeholdende samme samt fremgangsmaade til dyrkning af mikroorganismen
ATE90387T1 (de) * 1983-03-08 1993-06-15 Rikagaku Kenkyusho Plasmide, verfahren zu ihrer herstellung, sie enthaltende mikroorganismen und methoden zur extrazellulaeren herstellung von xylanase durch zuechten dieser mikroorganismen.
US5238833A (en) * 1983-07-06 1993-08-24 Gist-Brocades, Nv Molecular cloning and expression in industrial Bacillus species
BE901138A (fr) 1983-11-28 1985-05-28 Glaxo Group Ltd Enzyme et composition d'enzymes degradant les pentosanes, leurs procedes d'obtention et d'application.
FI841500A0 (fi) * 1984-04-13 1984-04-13 Valtion Teknillinen Foerfarande foer uppbygnande av cellulolytiska jaeststammar.
IL75210A0 (en) 1984-05-22 1985-09-29 Bioteknika International Yeast vector
JPH0817702B2 (ja) 1984-12-28 1996-02-28 理化学研究所 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物
WO1986007091A1 (en) 1985-05-21 1986-12-04 Biotechnica International, Inc. Yeast expressing glucoamylase
US5024941A (en) * 1985-12-18 1991-06-18 Biotechnica International, Inc. Expression and secretion vector for yeast containing a glucoamylase signal sequence
US4725544A (en) * 1986-04-25 1988-02-16 Tan Larry U Method for purifying xylanase
US5298405A (en) 1986-04-30 1994-03-29 Alko Limited Enzyme preparations with recombinantly-altered cellulose profiles and methods for their production
US4966850A (en) * 1987-01-21 1990-10-30 Forintek Canada Corp. Production of thermostable xylanase and cellulase
EP0311469A3 (en) 1987-09-02 1990-05-30 Plant Genetic Systems N.V. Transformed lactic acid bacteria
US5252726A (en) * 1987-09-04 1993-10-12 Novo Nordisk A/S Promoters for use in aspergillus
FI84970C (fi) 1988-04-22 1992-02-25 Suomen Sokeri Oy Foerfarande foer foerbaettring av degens egenskaper och broedets kvalitet.
CA1341226C (en) 1988-08-16 2001-05-01 Wim Van Hartingsveldt Gene replacement as a tool for the construction of aspergillus strains
GB8906837D0 (en) 1989-03-23 1989-05-10 Unilever Plc Bread improvers
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
IE912582A1 (en) * 1990-07-24 1992-01-29 Gist Brocades Nv Cloning and expression of xylanase genes from fungal origin

Also Published As

Publication number Publication date
FI111549B (fi) 2003-08-15
ES2152217T5 (es) 2007-11-16
DE69132422T2 (de) 2001-04-19
EP0600865A1 (en) 1994-06-15
ES2152217T3 (es) 2001-02-01
JP3142134B2 (ja) 2001-03-07
WO1991019782A1 (en) 1991-12-26
AU689436B2 (en) 1998-04-02
DK0600865T4 (da) 2007-09-17
FI925730A (fi) 1992-12-17
DE69132422D1 (de) 2000-10-26
ZA914714B (en) 1993-02-24
DK0600865T3 (da) 2001-01-29
AU8066891A (en) 1992-01-07
DE69132422T3 (de) 2009-05-14
ATE196501T1 (de) 2000-10-15
JPH05508319A (ja) 1993-11-25
CA2085232A1 (en) 1991-12-20
AU689436C (en) 2002-06-13
EP0600865B1 (en) 2000-09-20
EP0600865B2 (en) 2007-04-04
CA2085232C (en) 2004-04-06
US6586209B1 (en) 2003-07-01
FI925730A0 (fi) 1992-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NL9001388A (nl) Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan.
FI108944B (fi) Sieniperäisten ksylanaasigeenien kloonaus ja ilmentäminen
EP0305216B1 (en) Recombinant Humicola lipase and process for the production of recombinant humicola lipases
CA2015077C (en) A yeast cell of the genus schwanniomyces
WO1990014423A1 (en) Microorganism transformation
JPH07147971A (ja) 選択マーカー遺伝子を含まない組換え体株、その作製方法及びその株の使用
JP2866739B2 (ja) アスペルギルスエンドキシラナーゼ▲ｉｉ▼遺伝子に由来する発現／分泌調節領域を用い、形質転換したカビでタンパク質を産生して分泌させるための方法
EA011452B1 (ru) Способы приготовления выпечного продукта, используемые для этого композиции и выпечной продукт
CA1340101C (en) Amylolytic enzymes producing microorganisms, constructed by recombinant dna technology and their use for fermentation processes
US5529926A (en) Cloning and expression of DNA encoding a ripening form of a polypeptide having sulfhydryl oxidase activity
NO302899B1 (no) Rekombinant DNA-molekyl, transformert vertscelle, anvendelse av rekombinant DNA-molekyl og hybridvektor, og pektinlyasene PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF i ren form
AU710169B2 (en) Endo beta-1,4-glucanase from aspergillus
US5627072A (en) Food-grade vector suitable for transforming a food-grade host cell use of said vector for transforming food-grade host cells and use of said transformed cells in biotransformation processes
JPH09503642A (ja) プロリンイミノペプチダーゼ、その生産方法並びに食品組成物の風味付けに対する使用
WO1996001323A1 (en) Alpha amylase from thermomyces lanuginosus
WO1993000437A1 (fr) Vecteurs de clonage et/ou d&#39;expression, preparation et utilisation
WO1998006858A1 (en) BETA-1,4-ENDOGLUCANASE FROM $i(ASPERGILLUS NIGER)
RU2736441C1 (ru) Штамм дрожжей Komagataella kurtzmanii, продуцирующий бета-глюканазу из Bacillus pumilus и бета-глюканазу из Paenibacillus jamilae
RU2722563C1 (ru) Трансформант дрожжей Komagataella kurtzmanii, продуцирующий бета-глюканазу
Thomsen et al. Genetic engineering of yeast: construction of strains that degrade β-glucans with the aid of a barley gene
CA2277776A1 (en) Expression element
JP2000245465A (ja) 高発現ベクタープラスミド用ｄｎａ断片
MXPA97007112A (en) Endo-beta-1,4-glucanase from aspergil

Legal Events

Date Code Title Description
A1B A search report has been drawn up
BV The patent application has lapsed