JP2000245465A - 高発現ベクタープラスミド用ｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 Aspergillus oryzaeのグルコアミラーゼ
Ｂ遺伝子（ｇｌａＢ）の５′側上流３２４ｂｐより更に
上流３３５ｂｐまでの非翻訳領域からなる１２塩基対の
ＤＮＡ断片。 【効果】 本ＤＮＡ断片は、ｇｌａＢプロモーターの中
心部分をなすものであって、同種及び／又は異種遺伝子
の効率的発現に利用でき、例えば、グルコースオキシダ
ーゼを生産する組み換え株を培養した「麹」を用いるこ
とにより、グルコン酸含量の高い香味に特徴を有する清
酒等各種醸造食品が製造できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、麹菌のグルコアミ
ラーゼ遺伝子Ｂ（ｇｌａＢ）のプロモーター領域及びこ
れを利用した同種又は異種遺伝子発現システムに関す
る。更に詳細には、本発明は、麹菌（Aspergillus oryz
ae）の固体培養で特に多量に発現しているｇｌａＢ遺伝
子のプロモーター領域を利用し、同種又は異種遺伝子を
麹菌で効率的に発現させるシステムの構築に関するもの
であって、有用タンパク質の高出産を可能にするもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】近年の遺伝子組換え技術の発展ととも
に、麹菌を含む糸状菌を宿主としてヒトの有用タンパク
質を生産することが可能となってきた。なかでも黄麹菌
Aspergillus oryzaeは、清酒や味噌など醸造産業上で長
く使用された実績から、異種遺伝子発現への応用に積極
的に利用されている。既にMucor mieheiの酸性プロテア
ーゼなどがA. oryzaeを宿主として、工業生産されてい
る。そしてA. oryzaeのαアミラーゼ遺伝子、グルコア
ミラーゼ遺伝子、αグルコシダーゼ遺伝子などのプロモ
ーターを用いて異種タンパクの生産例が報告されてい
る。しかしながらこれらの蛋白生産の培養方法は、ほと
んど液体培養に限られている。

【０００３】一方A. oryzaeなどの麹菌は、本来は液体
培養より固体培養の方が酵素生産性が高い場合が多く、
また培養方法なども伝統的に確立されている。我々は、
既に麹菌の固体培養に特異的に発現するグルコアミラー
ゼ遺伝子を単離し（特開平１０−８４９６８）、そのプ
ロモーター領域を用いた異種発現システムを発明して出
願を完了している（特願平１０−６６１１４）。このプ
ロモーターは固体培養で高い発現能を有し、異種タンパ
クを発現に有効であることを示した。しかしその発現能
力はさらに上昇する可能性があり、今後、より強力なプ
ロモーターの検索は異種タンパク発現の実用化に急務で
ある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した現
状に鑑み、更に強力なプロモーターを新たに構築する目
的でなされたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、各方面から検討の
結果、本発明者らが行ってきた一連の研究に着目した。

【０００６】すなわち、本発明者等は、固体培養におい
て特異的に大量発現する新しいグルコアミラーゼ遺伝子
（ｇｌａＢ）を発見し、そのプロモーターおよび蛋白質
コード領域の塩基配列を決定した（特開平１０−８４９
６８）。この遺伝子は、既にA. oryzaeからクローニン
グされているグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）とは
異なる新規遺伝子であった。そしてレポーター遺伝子を
用いたプロモーター解析の結果から、このｇｌａＢ遺伝
子のプロモーターはｇｌａＡ遺伝子のプロモーターに比
べて、固体培養で２００倍も強い発現能力を有すること
を明らかにした（特願平１０−５５７７６）。さらに、
このｇｌａＢ遺伝子プロモーター領域の中で、５′側上
流２１３塩基対よりさらに上流３５０塩基対までに固体
培養の高発現に重要である配列が含まれることを明らか
にした（特願平１０−６６１１４）。さらに、その中で
も−３２４〜−３５０塩基対までの２７塩基対が固体培
養での高発現に特に重要な配列であることを示した。

【０００７】そして、上記のように本発明者らが見いだ
したｇｌａＢ遺伝子のプロモーター領域の中の重要な配
列から、さらに固体培養の高発現に重要な領域を更に限
定すればより強力なプロモーターを構築することが可能
であるとの観点にたち、このような領域を更につきとめ
るために、本発明者らは、ｇｌａＢ遺伝子のプロモータ
ー領域を種々の方法にて解析した結果、固体培養での高
発現に必要な領域を特定するのに成功し、更に研究の結
果、本発明の完成に至ったものである。

【０００８】この領域は、固体培養において発現を誘導
する正の転写活性化因子と考えられ、この領域を利用す
れば以下のことが可能となる。この領域を他の遺伝子
のプロモーター領域に挿入することにより、プロモータ
ー活性（特に固体培養での）を上昇させることができ
る。この領域を複数連結してｇｌａＢプロモーターに
挿入することにより、ｇｌａＢプロモーターの発現量を
さらに上昇させることができる。以下、本発明について
詳述する。

【０００９】まず、プロモーター解析を行うについて
は、ｇｌａＢ遺伝子プロモーターの下流域にレポーター
遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子産物の活性をプ
ロモーター発現の指標とする方法を採用した。

【００１０】具体的には、図１に示すような、形質転換
用マーカーであるA. oryzae（硝酸還元酵素欠損変異
株）のｎｉａＤ遺伝子（S.Unklesら、Mol. Gen. Gene
t., 218,p.99-104, 1989）と、レポーター遺伝子である
大腸菌のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする
ｕｉｄＡ遺伝子（R. A. Jeffersonら、Proc. Natl. Aca
d.Sci., p.8447-8451, 1986）を含むベクターｐＮＧＵ
Ｓを作製した。そして、ｕｉｄＡ遺伝子の上流域に、ｇ
ｌａＢ遺伝子のプロモーター領域あるいはその一部分を
挿入して、プロモーター解析用プラスミドを構築した。

【００１１】このプラスミドによりA. oryzae（Aspergi
llus oryzae GLB-01：本菌株は、工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５８２６として寄託さ
れている）のｎｉａＤ変異株（亜硝酸を資化できない変
異株：Nitrate Reductase欠損株）を形質転換し、導入
プラスミドが宿主染色体のｎｉａＤ ｌｏｃｉで１コピ
ーだけ導入された形質転換体を選択した。

【００１２】これらの形質転換体のＧＵＳ活性を測定す
ることにより、プロモーター活性の指標とした。まずプ
ロモーター領域の上流から順次欠失したＤＮＡ断片を調
製し、固体培養と液体培養でプロモーター活性を比較し
た。その結果、−３５６まで欠失しても、固体培養での
高いプロモーター活性は変化がないが、さらに−２１３
まで欠失させるとその活性は急激に低下した。したがっ
てこの−３５５から−２１３の間に、固体培養での高発
現に重要な領域が含まれていると考えられた。次にこの
領域をｇｌａＡプロモーターに挿入し固体培養でのプロ
モーター活性を検討した。その結果、本来固体培養では
ほとんど発現しないｇｌａＡプロモーターが、この領域
を挿入することにより固体培養でｇｌａＢとほとんど同
程度の発現量をしめすようになった。

【００１３】そこで、さらにこの−３５５から−２１３
の領域の中で、高発現に必要な領域の限定を試みた。そ
の結果、−３５０から−３２４の２７塩基対の欠失だけ
でも固体培養での発現が大きく低下することが明らかと
なった。また、この領域を含む−３５０から−２５４の
９７塩基対及び−３５０から−２１３の１３８塩基対を
ｇｌａＡプロモーター領域に挿入した場合、いずれにお
いても、固体培養での発現能力を飛躍的に上昇させるこ
とができた。したがって、上記２７塩基対はｇｌａＢプ
ロモーターのコアサイトまたは少なくともコアサイト関
連領域と認められ、このコアサイト領域を含む９７塩基
対も高発現に関与する重要な領域と認められた。

【００１４】そして更に、上記したのと同様に、ｇｌａ
Ｂプロモーター下流にレポーター遺伝子であるＧＵＳ遺
伝子を連結したプロモーター解析プラスミドを用いて、
この２７塩基対の欠失、置換変異体のプロモーター活性
を測定した。その結果、２７塩基対の中でも−３３５か
ら−３２４の１２塩基対が特に重要であることが示され
た。この１２塩基対だけを欠失させることにより固体培
養での発現能が低下し、１２塩基対を異なる配列に置換
するとプロモーター活性が消失した。

【００１５】プロモーター領域の一部分を欠失した時、
プロモーター活性の低下が認められることがあるが、こ
れはその領域の配列が重要な場合と、欠失することによ
って生じるプロモーター領域の立体構造の変化など２次
的な要因による場合とが考えられる。ここで示した１２
塩基対に関しては塩基配列を置換するだけでプロモータ
ー活性が消失することから、この１２塩基対の配列その
ものが、固体培養の高発現に重要であることを示すもの
である。このようにして、この１２塩基対が高発現に関
与する特に重要な領域と認め、コアサイト領域（２７塩
基対）における活性領域と認めた。

【００１６】このようにして、麹菌（A. oryzae）のグ
ルコアミラーゼＢ遺伝子（ｇｌａＢ）の５′側上流３２
４塩基対よりさらに上流３３５塩基対までの非翻訳領域
からなる１２塩基対のＤＮＡ断片：ggcggcacgggcを特定
するのに成功し、そして更に、麹菌（A. oryzae）のグ
ルコアミラーゼＢ遺伝子（ｇｌａＢ）の５′側上流３２
４塩基対よりさらに上流３３５塩基対までの非翻訳領域
からなる１２塩基対のＤＮＡ断片を含むことを特徴とす
る麹菌発現プラスミドの作成にも成功した。

【００１７】このように、このｇｌａＢプロモーター内
の転写活性を誘導する領域は、麹菌での高発現プロモー
ターの構築に有用で、広く外来遺伝子の発現に活用され
うるものである。なお、本発明に係るコアサイト活性領
域、及びコアサイト、この領域を含む９７塩基対及び１
３８塩基対からなる重要領域は、実際の製麹に使用され
る野生株であるAspergillus oryzaeが有するｇｌａＢ遺
伝子（特開平１０−８４９６８：その塩基配列を図３に
示す）に含まれているので、そこから切り出して使用し
てもよいし（野生株の１例としては、A. oryzae GLB-01
(FERM P-15826）が例示される）、常法にしたがって合
成してもよい。また、該コアサイト活性領域を含む高発
現ベクタープラスミドも本発明に包含されるものであ
る。

【００１８】次に、このｇｌａＢプロモーターを利用し
た異種タンパク発現について検討した。ｇｌａＢプロモ
ーター（全長１ｋｂ）下流にアスペルギルス・ニガー由
来のグルコースオキシダーゼ遺伝子を連結し、固体培養
でグルコースオキシダーゼの大量生産を成功させた。こ
のようにA. oryzaeを宿主として生産されたグルコース
オキシダーゼは、本来のニガー菌の酵素に比べて、非常
に多量の糖鎖が付加されていた。その結果酵素の熱安定
性や、溶解度の向上が認められた。このように麹菌の固
体培養を用いた異種タンパク生産は、生産量が高いだけ
でなく、酵素の熱安定性などの蛋白機能の向上も期待で
きる。

【００１９】さらにこの組換え体の麹を用いれば、清
酒、味噌、醤油などの様々な醸造食品を製造することが
できる。例えばこれを清酒醸造に用いると、グルコース
オキシダーゼによって生産されるグルコン酸を多量に含
む香味に特徴のある清酒が醸造できる。このように固体
培養での組み換え蛋白の生産は、酵素生産性が高いだけ
でなく、培養物をそのまま醸造原料として利用すること
により、容易に組み換え蛋白を含む醸造食品を製造する
ことができる。以下、本発明の実施例について述べる。

【００２０】

【実施例１：プロモーター領域の重要領域の特定】特願
平１０−６６１１４号において、本発明者らは、ｇｌａ
Ｂ遺伝子プロモーター領域の中で、固体培養での高発現
には、−３５０から−３２７の２７塩基対（コアサイ
ト）が重要であることを明らかにしたが、本実施例にお
いては、この２７塩基対の配列決定、及び、この２７塩
基対（コアサイト）の中で、固体培養において更に重要
な配列（コアサイト活性領域配列）を特定することとし
た。

【００２１】（１）ｇｌａＢ遺伝子の開始コドン（ＡＴ
Ｇ）から５′上流の非翻訳領域の１１２８塩基対を、プ
ロモーター解析用プラスミドｐＮＧＵＳ（図１）のＰｓ
ｔＩ、ＳａｌＩサイトに挿入した。次に、この１１２８
塩基対の５′上流側から、順次欠失したＤＮＡ断片を調
製し、それぞれ同様にｐＮＧＵＳに挿入した。得られた
プラスミドにてA. oryzaeを形質転換後、導入したプラ
スミドが宿主染色体上で単一コピーで相同組換えした形
質転換体を選択した。これらの形質転換体を、デンプン
を炭素源としたツァペック−ドックス培地による液体培
養と７０％精白米を用いた固体培養（米麹培養）を行
い、生産されるＧＵＳ活性を測定した。その結果、１１
２８塩基対すべてを含むものと比べて、５′側上流３５
６塩基対まで欠失させても、固体培養でのＧＵＳ活性は
ほとんど低下しなかった。しかし、−２７２まで欠失し
たものでは、固体培養でのＧＵＳ活性が大きく減少し
た。したがって、この−３５５から−２７２の間に、固
体培養での高発現に関与する領域が存在すると考えられ
た。

【００２２】（２）ｇｌａＢプロモーターの中で−３５
５〜２７２ｂｐ付近に、固体培養での高発現に必要な領
域があることを確認するため、さらに、部位特異的欠失
プロモーターでの解析を行った。ｇｌａＢプロモーター
領域（１１２８塩基対）のなかから、ある一定の領域だ
けを欠失した変異プロモーターを調製し、液体培養と固
体培養での発現能を検討した。ｇｌａＢプロモーターの
中で、−９３４〜−７０５の領域、−７０４〜−５７２
の領域、−５７１〜３５６の領域、いずれの領域を欠失
させても、固体培養での発現能は低下しなかった。とこ
ろが−３５５〜２１３の領域を欠失させると、固体培養
での発現がほとんど確認することができなかった。以上
の結果より、この−３５５〜−２１３の領域に固体培養
での高発現に必要な領域が存在することが確認された。

【００２３】（３）次に−３５０から−２５４の領域を
ｇｌａＡプロモーターに挿入し、その固体培養での発現
能を検討した。ｇｌａＡのプロモーターの−２０５の
５′末端側に、ＰＣＲ法にて調製したｇｌａＢプロモー
ター（−３５０〜−２５４）領域を挿入し、キメラプロ
モーターを調整後、ｇｌａＡおよびｇｌａＢプロモータ
ーとその発現能を比較した。ｇｌａＡプロモーターは固
体培養でほとんどプロモーター活性が検出されないが、
先のｇｌａＢプロモーター領域（−３５０〜−２５４）
を挿入することで、固体培養での活性が４０倍に上昇し
た。このようにこのプロモーター領域（−３５０〜−２
５４）は、プロモーターから欠失させると転写誘導活性
が低下させるだけでなく、この領域の付加により固体培
養での転写誘導活性を付与することも可能であることが
判明した。したがって、−３５０〜−２５４の領域（９
７ｂｐ）は重要領域ということができる。その配列を図
２上に示す。また、この領域を包含する−３５０〜−２
１３の領域（１３８ｂｐ）も重要領域であり、その配列
を図２Ｆに示す。

【００２４】（４）ｇｌａＢプロモーター中の固体培養
での高発現に関与する領域をさらに限定させるため、
（−３５０〜−２１３）に対してさらに詳細な欠失変異
プロモーターを作成した。その結果、−３５０から−３
２４のわずか２７塩基対の欠失で、固体培養での発現が
大きく低下することが明らかとなった。したがって、こ
の２７塩基対の配列およびその近傍に、転写活性因子が
存在すると考えられた。

【００２５】このｇｌａＢプロモーターのコアサイトと
認められる２７ｂｐの塩基配列は、配列番号２に示さ
れ、次のとおりである：gagaactaagagaatggcggcacgggc

【００２６】（５）２７塩基対（コアサイト）の中で、
固体培養に重要な配列を更に特定するために、塩基置換
法による解析を行った（図４）。２７塩基対（ｇｌａ
Ｂ）の上流側１５塩基対を欠失させた場合（欠失１）、
固体培養でのプロモーター活性はほとんど変わらなかっ
た。一方下流側（−３５５から−３２４）の１２塩基対
を欠失させた場合に、固体培養での発現能が低下し、液
体培養での発現能が上昇した。さらに、この１２塩基対
を全く別の塩基配列に置換した場合は、固体培養、液体
培養ともに発現能が大幅に低下した。従って、この１２
塩基対が、本プロモーターの固体培養高発現に関するコ
アサイト（２７塩基対）の活性領域と認められる。その
塩基配列は、配列番号１に示され、次のとおりである：
ggcggcacgggc

【００２７】

【実施例２：ｇｌａＢ遺伝子プロモーターを用いた異種
蛋白の発現】（１）ｇｌａＢ遺伝子のプロモーター領域
を用いて、異種蛋白の発現を試みた。異種蛋白遺伝子と
してはアスペルギルス・ニガーのグルコースオキシダー
ゼ遺伝子（ＧＯＤ）を用いた。まずｇｌａＢ遺伝子のプ
ロモーター領域（１ｋｂ）とその下流のｇｌａＢ遺伝子
のコーディング領域の内シグナル配列と考えられる領域
までをＰＣＲ法にて単離、ｎｉａＤマーカーの入った麹
菌発現ベクターｐＮＩＡ２にサブクローニングした。次
にアスペルギルス・ニガーのグルコースオキシダーゼ遺
伝子のコーディング領域の内、シグナル配列を除いた領
域を同じくＰＣＲ法にて単離し、先のｇｌａＢプロモー
ター＋シグナル領域の下流に連結した。そしてＧＯＤ遺
伝子の下流に、ＰＣＲ法にて調製したｇｌａＢのターミ
ネーター部分を連結して、異種蛋白発現用プラスミドｐ
ＧＯＧＸを作成した（図５）。

【００２８】（２）次に、このプラスミドを常法に従
い、アスペルギルス・オリゼーに移入し、プラスミドが
導入された形質転換体を数株（ＧＯＤ５−９株）を得
た。これらの形質転換体を用いて、米麹を作成し、グル
コアミラーゼ（ＧＡ）および異種蛋白であるグルコース
オキシダーゼ（ＧＯＤ）の活性を測定した。結果を表１
に示す。

【００２９】 （表１） ─────────────────────────── 株 GOD^*活性 GA^**活性 (U/g-koji) (U/g-koji) ─────────────────────────── コントロール N.D. 453 形質転換体 48.3 203 ─────────────────────────── * グルコースオキシダーゼ ** グルコアミラーゼ

【００３０】上記表（得られた形質転換体の酵素活性）
の結果から明らかなように、コントロール（ＯＳＩ １
０１３株）と形質転換株（ＧＯＤ７株）を比較すると、
固体培養においてコントロールはＧＯＤ活性が検出され
なかったのに対し、形質転換体では４８．３と高い値を
示した。これは蛋白量に換算すると、４８．３(Ｕ／ｇ
麹)を示す株の場合、麹グラム当り約０．２ｍｇものＧ
ＯＤを生産していた。

【００３１】表に示すように、形質転換体は異種蛋白で
あるグルコースオキシダーゼを著量に生度することが示
された。またグルコアミラーゼをはじめとする、清酒醸
造に重要な酵素については、宿主菌とほぼ同程度の生産
性を示した。また形質転換体で調製した米麹の抽出液の
蛋白質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析を行った。形質
転換体では、組換えグルコースオキシダーゼを考えられ
る蛋白バンドが明確に認められ、全タンパク質の中で５
０％程度占めていた。

【００３２】

【実施例３：組み換え蛋白の安定性】アスペルギルス・
オリゼーで生産したアスペルギルス・ニガーの組換えグ
ルコースオキシダーゼの安定性を検討した。まず組換え
グルコースオキシダーゼは、ニガー菌が本来生産するグ
ルコースオキシダーゼに比べて非常に多量の糖鎖が付加
されていた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析からではニガー菌
本来のものは１０％以下であるのに対して、組換え蛋白
は５０％程度の糖が含まれると考えられる。そのため組
換え蛋白は水に対する溶解性が顕著に上昇した。

【００３３】例えば硫安塩析の実験では、ニガー菌本来
のグルコースオキシダーゼは硫安濃度が２．５Ｍで、ほ
とんどの蛋白が沈殿したのに対して、組換えグルコース
オキシダーゼでは硫安３．５Ｍでも８０％以上の活性が
上清中に認められた。これは組換え蛋白に付着した糖鎖
により、蛋白の溶解性が飛躍的に向上したものと考えら
れる。

【００３４】次に両蛋白の熱安定性について検討した
（図６）。ニガー菌のグルコースオキシダーゼの９０％
以上が失活する６０℃の処理においても、組換え蛋白は
５０％以上の活性が残存していた。種々の温度での熱安
定性実験の結果より、組換えグルコースオキシダーゼは
ニガー菌本来の酵素よりも熱安定性が５℃以上も上昇し
ていることが明らかとなった。

【００３５】

【実施例４：形質転換体の米麹からの清酒醸造】異種蛋
白であるＧＯＤを生産する形質転換体（ＧＯＤ株）の米
麹を用いて、グルコン酸の多い爽やかな酒質を目指して
清酒醸造を行った。総米５００ｇ、精米歩合７０％、Ｋ
７酵母を使用し、１５℃一定とし、仕込みを行った。成
酒の分析結果を表２に示す。

【００３６】 （表２） ──────────────────────────────────── 菌 株 日本酒度 アルコール度 総酸量 グルコン酸濃度 （％） （ml） （％） ──────────────────────────────────── 対 照 +4.7 18.3 4.3 N.D. 形質転換体 -17.2 15.8 9.7 0.85 ────────────────────────────────────

【００３７】上記した上槽酒の成分分析値の結果から明
らかなように、形質転換体の米麹で醸造した上槽酒は、
対照の仕込みに比べて、最終アルコール生成量は低いも
のの、通常の上槽酒に認められない非常に高い酸度を示
した。これは組換えグルコースオキシダーゼによって醪
中のグルコースが酸化されて生成するグルコン酸の影響
であることがわかった。このようにグルコースオキシダ
ーゼを生産する形質転換体を用いることにより、パネル
テストの結果、従来の清酒醸造方法では製造が困難な非
常に酸度の高いワイン風味の清酒を醸造することができ
た。

【００３８】

【発明の効果】本発明により、固体培養で著量に発現す
るグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＢ）のプロモーター
領域の中で、その高発現に重要な領域がさらに限定する
ことができた。さらに、ｇｌａＢプロモーター下流に異
種遺伝子であるニガーのグルコースオキシダーゼ遺伝子
を連結して、アスペルギルス・オリゼーを宿主として熱
安定性の上昇した組換え酵素の生産に成功し、本プロモ
ーターの異種蛋白生産の実用性を示した。

【００３９】このように固体培養での異種蛋白生産は、
糖鎖が多量に付加されることにより、蛋白の熱安定性が
上昇したり、溶解度が飛躍的に上昇する現象が認められ
る。これは固体培養での組換え蛋白生産が、異種蛋白を
大量に発現させるだけでなく、その蛋白の性能も向上さ
せうる可能性を示すもので、物質生産に対して新しい手
法を提供するものである。

【００４０】また麹のような醸造原料で異種蛋白を生産
することが可能であれば、これを用いて清酒、味噌、醤
油などの醸造食品を製造することにより、有用蛋白を含
む醸造食品が簡単に製造が可能である。これにより有用
な蛋白を食品と同時に摂取することができ、組換え食品
の製造に大きく貢献する技術であると考えられる。

【００４１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING 〈110〉 Gekkeikan Inc., Ltd. 〈120〉 DNA Fragmant for High Expression Vector Plasmid 〈130〉 6119 〈141〉 1999-2-25 〈160〉 2 〈210〉 1 〈211〉 12 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 1 ggcggcacgg gc 〈210〉 2 〈211〉 27 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 2 gagaactaag agaatggcgg cacgggc

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＮＧＵＳの制限酵素地図を示す。

【図２】ｇｌａＢの高発現に重要なプロモーター領域
（９７ｂｐ）及びそれを含む領域（１３８ｂｐ）を上段
及び下段にそれぞれ示す。

【図３】アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ
遺伝子（ｇｌａＢ）の塩基配列を示す。

【図４】ｇｌａＢプロモーターのｃｉｓ因子の同定を示
す。

【図５】異種タンパク質発現用プラスミドを示す。

【図６】組換え酵素の熱安定性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 市川 英治 京都府宇治市琵琶台２丁目５−１ (72)発明者 川戸 章嗣 京都府宇治市木幡熊小路１−32 (72)発明者 安部 康久 京都府宇治市宇治大谷29番地の41 (72)発明者 杉並 孝二 京都府城陽市寺田宮の谷５−52 (72)発明者 今安 聰 京都市伏見区桃山筑前台町６ Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA20 DA11 EA04 FA02 FA07 FA18 FA20 GA11 GA19 4B065 AA62Y AA63X AA63Y AB01 AC14 AC15 AC20 BA02 BA25 BC01 BC31 BD50 CA42

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に示すＤＮＡ。
2. 【請求項２】 該ＤＮＡが、麹菌（Aspergillus oryza
   e）のグルコアミラーゼＢ遺伝子（ｇｌａＢ）の５′側
   上流３２４塩基対よりさらに上流３３５塩基対までの非
   翻訳領域からなる１２塩基対のＤＮＡ断片であること、
   を特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 麹菌がAspergillus oryzae GLB-01(FERM
   P-15826）であること、を特徴とする請求項２に記載の
   ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡを含んでなること、を特徴とする麹菌発現プラスミ
   ド。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のプラスミドを麹菌に移
   入してなる形質転換体。
6. 【請求項６】 請求項１〜３のいずれか１項に記載する
   ＤＮＡを少なくとも含むＤＮＡをプロモーターとして利
   用し、麹菌において同種又は異種遺伝子を発現せしめる
   方法。
7. 【請求項７】 麹菌を固体培養すること、を特徴とする
   請求項６に記載の発現方法。
8. 【請求項８】 請求項５に記載の形質転換体を使用して
   製造してなる醸造食品。
9. 【請求項９】 醸造食品が清酒であること、を特徴とす
   る請求項８に記載の醸造食品。