JP2007050006A - アスペルギルス属の新規プロモーター - Google Patents

Abstract

【課題】アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌の新規プロモーターを提供する。
【解決手段】アスペルギルス・オリゼのピルベート・デカルボキシラーゼ(Pyruvate decarboxylase)遺伝子、フルクトース-６-ビスホフェート・アルドラーゼ(Fructose-bisphosphate aldolase)遺伝子、ピルベート・デヒドロゲナーゼ(Pyruvate dehydrogenase)遺伝子、ピルベート・キナーゼ(Pyruvate kinase)遺伝子、グルコース-６−ホスフェート・イソメラーゼ(Glucose 6-phosphate isomerase)遺伝子又はグリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)遺伝子のプロモーター。
【選択図】図１

Description

本発明は、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌の新規プロモーターに関する。更に詳細には、本発明はアスペルギルス・オリゼ由来の新規プロモーター配列をクローニングし、アスペルギルス属糸状菌を宿主として有用蛋白質およびペプチドを発現させるために必要なＤＮＡ断片を有するプラスミドと、それを用いた有用蛋白質およびペプチドの製造法に関するものである。

糸状菌は、デンプン、蛋白質、脂質、セルロース等を加水分解する各種加水分解酵素をはじめ多くの有用酵素を菌体外に多量に分泌するため、古くよりこれら有用酵素の給源として利用されてきた。従って、糸状菌に関する培養法、生成物蛋白質の分離精製法などの発酵技術の古い歴史と研究成果の裏付けがあり、多くの菌株の安全性が広く認知されている。また、真核生物であるが故に哺乳動物などの高等生物と同様に蛋白質の糖鎖付加機構を有している。

これらの理由により、糸状菌を異種蛋白質の高生産用宿主として利用することが期待されていた。遺伝子工学技術においては、目的とする蛋白質の生産量は、プロモーター、ターミネーターなどの転写に関わる因子、アミノ酸コドンの種類など翻訳に関わる因子、蛋白質への糖鎖付加、発現した蛋白質の細胞内での存在様式（分泌過程における移動も含む）などの翻訳後に関わ
る因子、遺伝子のコピー数の因子、宿主由来のプロテアーゼなど発現蛋白質の安定性に関わる因子など多くの因子により影響を受ける。これらのうちもっとも重要であり制御しやすい因子は、プロモーターの選択である。

この見地から、糸状菌における強力なプロモーターを利用した例は、たとえばアスペルギルス・ニガー由来のグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター［Biotechnology, 5, 368（1987）］、トリコデルマ・リーセイ由来のセロビオハイドロラーゼＩ遺伝子のプロモーター［Biotechnology, 7, 596（1989）］、アスペルギルス・オリゼ由来のα-アミラーゼ遺伝子のプロモーター［Biotechnology, 6,1419（1988）］（特開昭62-272988）、アスペルギルス・ニドランス由来のアルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子のプロモーター［Biotechnology, 5, 713（1987）］、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガーのグリセルアルデヒド−３−ホスフェイト デヒドロゲナーゼ（GAP-DH）のプロモーターを利用して異種蛋白質の製造（特開平3-187392）の場合などがある。

本発明はアスペルギルス・オリゼ由来の新規なプロモーターを得、この発現系を使用して異種蛋白質を製造する方法を提供することにある。

本発明者等は上記目的を達成するために鋭意研究し、アスペルギルス・オリゼから新規なプロモーター配列をクローニングすることに成功し、本発明を完成した。即ち、本発明によりアスペルギルス・オリゼ由来の新規なプロモーターが提供され、それを使用する点で新規なものである。

本発明においては、以下のようにして上記の目的を達することが出来た。例えば、グルコース存在下で強く発現する遺伝子の同定と単離は、以下のようにしてできる。

糸状菌をグルコースを唯一の炭素源とした培地で培養し、得られた菌体からポリＡ付加ＲＮＡを取得する。このポリＡ付加ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、適当なベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを構築する。

このライブラリーの中から独立したクローンを無作為に多数、例えば500個選別（約8,000遺伝子で構成されている麹菌であれば約500個で推定できると考えられる。）し、プラスミドＤＮＡを抽出して約800bpの塩基配列を解析する。

こうして得られた塩基配列は、各ｃＤＮＡのコード領域を５’末端領域の塩基配列を含み、ＤＮＡ塩基配列データベースに対して相同性解析を行うことにより、含まれる遺伝子を推定する。さらに、全ての塩基配列間で総当たりで相同性検索を行うことにより、それぞれのｃＤＮＡの頻度解析を行い、培地中のグルコース存在下で強く発現している遺伝子を同定することができる。

次に、この様にして同定したグルコース存在下で強く発現している遺伝子のプロモーターの単離は、通常よく用いられる方法、即ち上記で得られた各ｃＤＮＡをプローブにして遺伝子ライブラリーからスクリーニングすること等により成し遂げられるし、或いはＰＣＲ（Polymerase chain reaction）を用いる方法によっても成し遂げられる。

ＰＣＲを用いる方法の一例として、以下の方法を用いることが出来る。糸状菌からゲノムＤＮＡを抽出してＥｃｏＲＶ、ＳｃａＩ、ＤｒａＩ、ＰｖｕＩＩあるいはＳｓｐＩ等の６ｂｐを認識して平滑末端に切断するそれぞれの制限酵素で完全消化し、そのゲノムＤＮＡ断片の両端に適当なアダプターを連結する。

この両端にアダプターが連結されたゲノムＤＮＡ断片を鋳型として、ｃＤＮＡの塩基配列から合成したプライマーおよびアダプターの一本鎖部分の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行う。増幅産物を電気泳動で確認して１〜２ｋｂｐ程度の長さを有するＤＮＡ断片を電気泳動によって単離・精製し、適当なクローニングベクターに連結して大腸菌にクローニングする。

数個の独立したクローンからプラスミドを調製してクローニングしたＤＮＡ断片の両末端の塩基配列を解析し、ｃＤＮＡと相同な塩基配列を有しｃＤＮＡの上流に位置するＤＮＡ断片をこのｃＤＮＡ由来の遺伝子のプロモーターと判断する。

プロモーター領域を有するＤＮＡ断片のうち、翻訳開始コドンより上流１ｋｂｐ程度以上を有するＤＮＡ断片を選別し、全塩基配列を決定し、グルコース存在下で強く発現している遺伝子のプロモーターの単離を行うことが出来る。上述した工程を図１に示す。

本発明のプロモーターは上述のようにして決定された塩基配列に対してストリンジェントな条件、例えば、0.1％ SDS（60℃、0.3mol NaCl、0.03Ｍ クエン酸ソーダ）でハイブリダイズする塩基配列をも包含する。

本発明のプロモーターは、その下流に、所望の有用タンパク質遺伝子を連結してベクターを構築し、該ベクターで宿主を形質転換し、それを培養することにより、有用タンパク質を著量生産させることができる。

宿主としては、アスペルギルス・オリゼをはじめ、その他のアスペルギルス属、ノイロスポラ属、ペニシリウム属、トリコデルマ属などの微生物が使用できる。特に、発現効率の点から、宿主として、アスペルギルス・オリゼを用いることが好ましい。

得られたプロモーターへの有用タンパク質遺伝子の連結、ベクターへの挿入は、それ自体公知の方法で行うことができる。有用タンパク質遺伝子としては、特に限定するものではない。また、ベクターとしては、アルギニン要求性などの栄養要求性相補遺伝子、アセトアミド資化などの炭素、窒素源資化遺伝子、オリゴマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。

宿主の形質転換も自体公知の方法で行うことができる。また、該形質転換体の培養も常法に従って、所望のタンパク質に適した培地、培養条件を適宜選択することにより行うことができ、得られたタンパク質の採取、精製も公知の方法で行うことができる。

以下、実施例を参照しながら本発明を詳細に説明するが、実施例に使用したプラスミドなどは一例として挙げたものであり、本発明に使用できるものであればこれらに限定されるものではない。

グルコース存在下で高発現する遺伝子の同定
(1) 菌体の取得
アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ATCC 42149を以下の培養条件で培養した。ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％及びグルコース２％よりなる培地（pH6.0）に本菌株を接種し、30℃において22時間通気攪拌培養し、菌体をろ過して得た。得られた湿菌体４ｇを液体窒素中で凍結し、そのまま、液体窒素及び海砂を入れた乳鉢に移し、乳棒で微細な粉末とした。

(2) ｃＤＮＡライブラリーの作製シグイン（Chigwin）等の方法〔バイオケミストリー（Biochemistry）、18巻、5294頁（1979）〕に従って4.6mgの全ＲＮＡを得た。その後、オリゴ（dT）セルロース・カラム（ファルマシア社）に供し、1.4mgの全ＲＮＡから30μgのポリＡ付加ＲＮＡ画分を得た。

このポリＡ付加ＲＮＡを用いて、ＮｏｔＩ制限酵素切断部位を含むプライマー（5'-TTCTAGAATTCAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'：ここでVはA,C,Gの混合、NはA,C,G,Tの混合を表す）及びMMLVリバーストランスクリプターゼ(RNaseH-)（クロンテック）[逆転写酵素]を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、さらにE.coli DNA polymerase I（クロンテック）、E.coli DNA ligase（クロンテック）およびE.coli RNase H（クロンテック）により、両端が平滑化された二本鎖のｃＤＮＡとした。

ｃＤＮＡ分離用カラム（クロンテック）を用いたゲル濾過により短鎖ｃＤＮＡを除去した後、ＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を含むアダプター（5'-AATTCGGCACGAGG-3'及び5'-CCTCGTGCCG-3'）を連結した。

こうして得られたｃＤＮＡ断片は、ＮｏｔＩ制限酵素で完全消化した後、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化したプラスミドベクターｐＵＣ１９に連結した。このプラスミドを大腸菌に形質転換することにより、ほぼ完全長のｃＤＮＡを含む大腸菌ｃＤＮＡライブラリーを構築した。

(3) 高発現する遺伝子の探索
このライブラリーの中から独立したクローンを無作為に５００個選別し、プラスミドＤＮＡを抽出して、Ｍ１３ユニバーサルプライマー（5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3'）、Taq ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー社）、ＤＮＡサーマル・サイクラー（パーキン・エルマー社）及びＤＮＡシークエンサー（ＬＩ−ＣＯＲ社、モデル4000L）を用いたサイクル・シークエンス法により約800bpの塩基配列を解析した。

こうして得られた塩基配列は、各ｃＤＮＡの５’末端領域の塩基配列を含んでいる。GenBank ＤＮＡ塩基配列データベースに対して、BLASTXを用いて相同性解析を行うことにより、含まれる遺伝子を推定した。

さらに、Sequencher（GeneCodes社）を用いて全ての塩基配列間で総当たりで相同性検索を行うことにより、それぞれのｃＤＮＡの頻度解析を行い、培地中のグルコース存在下で強く発現している遺伝子のリストを作製した。

表中においては、以下のように示す。
score ：ランタ゛ムに選んだ500のcDNA配列解析での出現頻度
Source ：GenBankデータベースに対するホモロジーサーチでヒットしたもの
Sc=Saccharomyces cerevisiae
Ao=Aspergillus oryzae
An=Aspergillus nidulans
Sp=Schizosaccharomyces pombe

その結果、グルコース存在下で強く発現している遺伝子としてピルベート・デカルボキシラーゼ(Pyrvate decarboxylase)遺伝子、フルクトース-６-ビスホスェート・アルドラーゼ(Fructose-bisphosphate aldolase)遺伝子、ピルベート・デヒドロゲナーゼ(Pyrvate dehydrogenase)遺伝子、ピルベート・キナーゼ(Pyrvat
e kinase)遺伝子、グルコース-６−ホスフェート・イソメラーゼ(Glucose 6-phosphate isomerase)遺伝子、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)遺伝子を新たに発見した。

ピルベート・デカルボキシラーゼのｃＤＮＡに対応するのプロモーター領域の取得Aspergillus oryzae RIB-40株（ATCC 42149）からティンバレークとバーナード（Timberlake and Bernard）の方法に従って得たゲノムＤＮＡを、６ｂｐを認識して平滑末端に切断するＤｒａＩで完全消化し、(P)5'-ACCTGCCC-3'(NH2)および5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC
CGCCCGGGCAGGT-3'からなるアダプターを連結した。

このゲノムＤＮＡ断片を鋳型とし、センスプラーマーとしてアダプターの一本鎖部分の配列を有するプライマーＡＤ（5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'）を、アンチセンスプライマーとしてピルベート・デカルボキシラーゼｃＤＮＡの塩基配列から合成したプライマー＃１（5'-TCTGTCGCCATTGTAAGGACTCAG-3'）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、Expand HF（ベーリンガー・マンハイム社）を用い、ＤＮＡサーマル・サイクラー（パーキン・エルマー社）により行った。反応溶液の組成は以下の通りである。

（終濃度）
H2O 20.25 μｌ
[10×]Reaction buffer 2.5 μｌ ［１×］
dNTPs, Mix 10 mM 0.5 μｌ 200 μＭ
センスプライマー(フ゜ライマーAD) 0.25 μｌ 5 μＭ
アンチセンスプライマー(フ゜ライマー#1) 0.25 μｌ 5 μＭ
＊template(DNA 0.2μg) 1 μｌ
Expand HF DNAポリメラーゼミックス 0.25 μｌ 1.25ｕ／TEST
25 μｌ
＊EcoRV分解したＤＮＡを0.2μg／10μｌになるようにＴＥでとかしたもの

上記の反応液25μｌを0.2ｍｌ反応チューブ中で混合してＤＮＡ Thermal Cyclerにセットし、以下のような温度設定によりステップダウンＰＣＲを行った。

95℃、1分 1サイクル
95℃、30秒 74℃、15秒 70℃、3分 3サイクル
95℃、30秒 70℃、15秒 70℃、3分 3サイクル
95℃、30秒 66℃、15秒 70℃、3分 3サイクル
95℃、30秒 62℃、15秒 70℃、3分 3サイクル
95℃、30秒 58℃、15秒 70℃、3分 3サイクル
95℃、30秒 54℃、15秒 70℃、3分 20サイクル

増幅産物を1.5％アガロース・ゲル電気泳動で確認して1.6ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をアガロース・ゲル中より単離・精製し、ＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社）に連結して大腸菌にクローニングした。

そのクローンからプラスミドを調製してクローニングしたＤＮＡ断片の両末端の塩基配列を解析し、本ＤＮＡ断片がピルベート・デカルボキシラーゼｃＤＮＡと相同な塩基配列及びその上流に翻訳開始コドンより上流1588bpのＤＮＡ領域を含むことを確認した。

この様にして、1588bpのピルベート・デカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーターを取得した。その全塩基配列を決定し、配列番号：１に示す。

フルクトース-６-ビスホフェート・アルドラーゼのｃＤＮＡに対応するのプロモーター領域の取得実施例２と同様にして、フルクトース-６-ビスホフェート・アルドラーゼ遺伝子のプロモーターを取得した。この場合、アスペルギルスオリゼのゲノムＤＮＡを完全消化する際に、６ｂｐを認識して平滑末端に切断する制限酵素としてＳｃａＩを用いた。

また、アンチセンスプライマーとして、フルクトース-６-ビスホフェート・アルドラーゼｃＤＮＡの塩基配列から合成したプライマー＃２（5'-ATGACACCAGTCTTGCGGGAAAGC-3'）を用いた。こうして得られた1092bpのフルクトース-６-ビスホフェート・アルドラーゼ遺伝子のプロモーターの全塩基配列を配列番号：２に示す。

ピルベート・デヒドロゲナーゼのｃＤＮＡに対応するのプロモーター領域の取得実施例２と同様にして、ピルベート・デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターを取得した。この場合、アスペルギルスオリゼのゲノムＤＮＡを完全消化する際に、６ｂｐを認識して平滑末端に切断する制限酵素としてＰｖｕＩＩを用いた。

また、アンチセンスプライマーとして、ピルベート・デヒドロゲナーゼｃＤＮＡの塩基配列から合成したプライマー＃３（5'-CACCACCTTCCGTAGCATAGCCCC-3'）を用いた。こうして得られた2572bpのピルベート・デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの全塩基配列を配列番号：３に示す。

ピルベート・キナーゼのｃＤＮＡに対応するのプロモーター領域の取得実施例２と同様にして、ピルベート・キナーゼ遺伝子のプロモーターを取得した。この場合、アスペルギルスオリゼのゲノムＤＮＡを完全消化する際に、６ｂｐを認識して平滑末端に切断する制限酵素としてＳｃａＩを用いた。

また、アンチセンスプライマーとして、ピルベート・キナーゼｃＤＮＡの塩基配列から合成したプライマー＃４（5'-CCCCGACCGATGAACGAGGCAAAG-3'）を用いた。こうして得られた845bpのピルベート・キナーゼ遺伝子のプロモーターの全塩基配列を配列番号：４に示
す。

グルコース-６−ホスフェート・イソメラーゼのｃＤＮＡに対応するのプロモーター領域の取得実施例２と同様にして、グルコース-６−ホスフェート・イソメラーゼ遺伝子のプロモーターを取得した。この場合、アスペルギルスオリゼのゲノムＤＮＡを完全消化する際に、６ｂｐを認識して平滑末端に切断する制限酵素としてＤｒａＩを用いた。

また、アンチセンスプライマーとして、グルコース-６−ホスフェート・イソメラーゼｃＤＮＡの塩基配列から合成したプライマー＃５（5'-GAGGAGAGCAGAGTGGTAAACAGC-3'）を用いた。こうして得られた1717bpのグルコース-６−ホスフェート・イソメラーゼ遺伝子のプロモーターの全塩基配列を配列番号：５に示す。

グリセロアルデヒド-３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼのｃＤＮＡに対応するのプロモーター領域の取得実施例２と同様にして、グリセロアルデヒド-３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターを取得した。この場合、アスペルギルスオリゼのゲノムＤＮＡを完全消化する際に、６ｂｐを認識して平滑末端に切断する制限酵素としてＳｓｐＩを用いた。

また、アンチセンスプライマーとして、グリセロアルデヒド-３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼｃＤＮＡの塩基配列から合成したプライマー＃６（5'-ATCTTCTTGCCGTTGACGATGAGG-3'）を用いた。こうして得られた1042bpのグリセロアルデヒド-３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの全塩基配列を配列番号：６に示す。

ピルベート・デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターによる大腸菌由来β-グルクロニダーゼのアスペルギルス・オリゼでの発現
(1) 大腸菌由来β-グルクロニダーゼ遺伝子発現カセットの構築
実施例２で取得した1.6 kbのDNA断片を鋳型にして、PCRによりピルベート・デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターを含む1.0 kbのDNA断片を得た。PCR反応に用いたプライマーは、
センスプライマー：5'-GTCGACATGCCAGCTTTGCCATTTTGAT-3'
アンチセンスプライーマー：5'-GTCGACTGTAAGGACTCAGTAAGAGG-3'
であった。

この断片を制限酵素Sal 消化後、大腸菌由来β-グルクロニダーゼ遺伝子を有するプラスミドpBRJ275（4.5 kb、クロンテック社）のSalI部位に挿入し、転写方向が順方向に挿入されたプラスミドpBRJPP（5.5 kb）を得た。

次に、アスペルギルス・オリゼのエノラーゼ遺伝子を含む2.9-kb BglII断片（Biosci. Biotech. Biochem., 60巻161-163頁,1996）からエノラーゼ遺伝子のターミネーター領域0.6-kb EcoRV-HindIII断片をpBluescript（ストラタジーン社）のEcoRV-HindIII部位にサブクローニングし、プラスミドpBET(3.6 kb)を得た。

プラスミドpBRJPPからピルベート・デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターとそれに続く大腸菌由来β-グルクロニダーゼ遺伝子を含む2.8-kb PstI-EcoRI断片を取得し、これをプラスミドpBETのPstI-EcoRI部位に挿入して、大腸菌由来β-グルクロニダーゼ遺伝子発現カセットを含むプラスミドpBPPETG(6.4 kb)を得た。

(2) 大腸菌由来β-グルクロニダーゼ遺伝
子発現カセットをアスペルギルス・オリゼへ導入するためのプラスミドの構築
プラスミドpBPPETGから制限酵素PstI及びHindIII消化により、3.4-kbの大腸菌由来β-グルクロニダーゼ遺伝子発現カセットを取得して、アスペルギルス・オリゼの形質転換マーカーとしてniaD遺伝子を有するプラスミドpN３（特開昭62-45777）のPstI-HindIII部位に挿入し、本発現カセットをアスペルギルス・オリゼへ導入するためのプラスミドpNPPETG（11.6 kb）を構築した。

(3) 大腸菌由来β-グルクロニダーゼ遺伝
子のアスペルギルス・オリゼでの発現プラスミドpBPPETGをUnkels らの方法（Mol. Gen. Genet., 218巻 99-104頁,1989）に従ってアスペルギルス・オリゼniaD欠損株AO1.1に導入した。得られた形質転換体を３％グルコース及び50μg/ml ５-ブロモ-４-クロロ-３-インドール-β-Ｄ-グルクロニドを含むCzapek-Doxプレート上で30℃で10日間培養したところ、コロニーが青色を呈した。対照として得た形質転換マーカーのみを有するプラスミドpN3由来の形質転換体は青色を呈しなかった。このことは大腸菌由来β-グルクロニダーゼ遺伝子がアスペルギルス・オリゼで発現し、発現したβ-グルクロニダーゼ酵素が基質５-ブロモ-４-クロロ-３-インドール-β-Ｄ-グルクロニドに作用したことを示す。

青色を示した形質転換体の１つを栄養培地で生育させ集めた菌体を洗浄後、３％グルコースを含むCzapek-Dox培地で８時間培養し、得られた菌体の無細胞抽出液中のβ-グルクロニダーゼ活性をJeffersonらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 83巻、8447-8451, 1986年）で測定したところ、比活性は80 nmol p-ニトロフェノール/min/mg-蛋白質であった。これに対し、pN3由来形質転換体は、＞1 nmol p-ニトロフェノール/min/mg-蛋白質であった。

本発明により、アスペルギルス・オリゼ由来の新規なプロモーターが提供され、当該プロモーター配列を含むベクターにより形質転換されたアスペルギルス属糸状菌における外来蛋白質の生産が可能である。

本発明のグルコース存在下で発現するプロモーターの単離法を示す図である。

Claims (4)

1. 配列番号：5に示した塩基配列で示されるＤＮＡ。
2. 請求項１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下（0.1%SDS、0.3mol NaCl、0.03Mクエン酸ソーダ、60℃）でハイブリダイズするＤＮＡ。
3. アスペルギルス属由来である請求項１又は
   請求項２記載のプロモーター。
4. アスペルギルス・オリゼ由来である請求項１又は請求項２記載のプロモーター。

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