JP3383341B2 - 糸状菌および酵母で使用可能なポリペプチド発現用プラスミドおよびそれを用いたポリペプチドの製造法 - Google Patents
糸状菌および酵母で使用可能なポリペプチド発現用プラスミドおよびそれを用いたポリペプチドの製造法Info
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- JP3383341B2 JP3383341B2 JP06264593A JP6264593A JP3383341B2 JP 3383341 B2 JP3383341 B2 JP 3383341B2 JP 06264593 A JP06264593 A JP 06264593A JP 6264593 A JP6264593 A JP 6264593A JP 3383341 B2 JP3383341 B2 JP 3383341B2
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【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、糸状菌もしくは酵母を
宿主として有用蛋白質およびペプチドを発現させるため
に必要なＤＮＡ断片を有するプラスミドと、それを用い
た有用蛋白質およびペプチドの製造法に関するものであ
る。
宿主として有用蛋白質およびペプチドを発現させるため
に必要なＤＮＡ断片を有するプラスミドと、それを用い
た有用蛋白質およびペプチドの製造法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】糸状菌は、デンプン、蛋白質、脂質、セ
ルロース等を加水分解する各種加水分解酵素をはじめ多
くの有用酵素を菌体外に多量に分泌するため、古くより
これら有用酵素の給源として利用されてきた。従って、
糸状菌に関する培養法、生成物蛋白質の分離精製法など
の発酵技術の古い歴史と研究成果の裏付けがあり、多く
の菌株の安全性が広く認知されている。また、真核生物
であるが故に哺乳動物などの高等生物と同様に蛋白質の
糖鎖付加機構を有している。
ルロース等を加水分解する各種加水分解酵素をはじめ多
くの有用酵素を菌体外に多量に分泌するため、古くより
これら有用酵素の給源として利用されてきた。従って、
糸状菌に関する培養法、生成物蛋白質の分離精製法など
の発酵技術の古い歴史と研究成果の裏付けがあり、多く
の菌株の安全性が広く認知されている。また、真核生物
であるが故に哺乳動物などの高等生物と同様に蛋白質の
糖鎖付加機構を有している。
【０００３】これらの理由により、糸状菌を異種蛋白質
の高生産用宿主として利用することが期待されていた。
遺伝子工学技術においては、目的とする蛋白質の生産量
は、プロモーター、ターミネーターなどの転写に関わる
因子、アミノ酸コドンの種類など翻訳に関わる因子、蛋
白質への糖鎖付加、発現した蛋白質の細胞内での存在様
式（分泌過程における移動も含む）などの翻訳後に関わ
る因子、遺伝子のコピー数の因子、宿主由来のプロテア
ーゼなど発現蛋白質の安定性に関わる因子など多くの因
子により影響を受ける。これらのうちもっとも重要であ
り制御しやすい因子は、プロモーターの選択である。
の高生産用宿主として利用することが期待されていた。
遺伝子工学技術においては、目的とする蛋白質の生産量
は、プロモーター、ターミネーターなどの転写に関わる
因子、アミノ酸コドンの種類など翻訳に関わる因子、蛋
白質への糖鎖付加、発現した蛋白質の細胞内での存在様
式（分泌過程における移動も含む）などの翻訳後に関わ
る因子、遺伝子のコピー数の因子、宿主由来のプロテア
ーゼなど発現蛋白質の安定性に関わる因子など多くの因
子により影響を受ける。これらのうちもっとも重要であ
り制御しやすい因子は、プロモーターの選択である。
【０００４】この見地から、糸状菌における強力なプロ
モーターを利用した例は、たとえばアスペルギルス・ニ
ガー由来のグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター［Bi
otechnology, 5, 368（1987）］、トリコデルマ・リー
セイ由来のセロビオハイドロラーゼＩ遺伝子のプロモー
ター［Biotechnology, 7, 596（1989）］、アスペルギ
ルス・オリゼ由来のα-アミラーゼ遺伝子のプロモータ
ー［Biotechnology, 6,1419（1988）］の場合などがあ
る。
モーターを利用した例は、たとえばアスペルギルス・ニ
ガー由来のグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター［Bi
otechnology, 5, 368（1987）］、トリコデルマ・リー
セイ由来のセロビオハイドロラーゼＩ遺伝子のプロモー
ター［Biotechnology, 7, 596（1989）］、アスペルギ
ルス・オリゼ由来のα-アミラーゼ遺伝子のプロモータ
ー［Biotechnology, 6,1419（1988）］の場合などがあ
る。
【０００５】しかしながらペニシリウム（Penicilliu
m）属由来のプロモーターを異種蛋白質の高発現に利用
した例は従来報告されていない。
m）属由来のプロモーターを異種蛋白質の高発現に利用
した例は従来報告されていない。
【０００６】また、使用する宿主は、一つのプロモータ
ーに対し通常そのプロモーターの供与菌のみが使用でき
るのみであり、一つのプロモーターが複数の糸状菌を宿
主として効率よく機能した例、あるいはさらに糸状菌と
酵母両宿主において利用可能なプロモーターを用いた異
種蛋白質の発現用プラスミドは存在しなかった。
ーに対し通常そのプロモーターの供与菌のみが使用でき
るのみであり、一つのプロモーターが複数の糸状菌を宿
主として効率よく機能した例、あるいはさらに糸状菌と
酵母両宿主において利用可能なプロモーターを用いた異
種蛋白質の発現用プラスミドは存在しなかった。
【０００７】このような複数の糸状菌および酵母を宿主
として利用できる発現プラスミドの利点の一つは、目的
のポリペプチドの種類により宿主を任意に選択できるこ
とである。即ち、それぞれの宿主における目的のポリペ
プチドの生産効率、それぞれの宿主中もしくは培養液中
での目的のポリペプチドの安定性、それぞれの宿主菌体
もしくは培養液からの目的のポリペプチドの精製の容易
性等の要因を鑑み、発現宿主を任意に選択できる。
として利用できる発現プラスミドの利点の一つは、目的
のポリペプチドの種類により宿主を任意に選択できるこ
とである。即ち、それぞれの宿主における目的のポリペ
プチドの生産効率、それぞれの宿主中もしくは培養液中
での目的のポリペプチドの安定性、それぞれの宿主菌体
もしくは培養液からの目的のポリペプチドの精製の容易
性等の要因を鑑み、発現宿主を任意に選択できる。
【０００８】またもう一つの利点は、目的のポリペプチ
ドの構造−機能相関の解明、機能改変を目的とした蛋白
工学の研究手法を、より効率よく短時間で行うことがで
きる点である。
ドの構造−機能相関の解明、機能改変を目的とした蛋白
工学の研究手法を、より効率よく短時間で行うことがで
きる点である。
【０００９】一般に、糸状菌を宿主とした遺伝子操作技
術は、多量の発現・分泌が期待できる反面、生育速度が
遅い、形質転換頻度が低い、多核である、染色体組み込
み型の形質転換であるなどの理由により煩雑であり長期
間を要する。一方、酵母を宿主とした遺伝子操作技術
は、一般に多量の発現量は期待できないものの、生育速
度が速い、形質転換頻度が高い、核外自律複製型ベクタ
ーが利用できるなどの理由により簡便であり短期間で行
うことができる。
術は、多量の発現・分泌が期待できる反面、生育速度が
遅い、形質転換頻度が低い、多核である、染色体組み込
み型の形質転換であるなどの理由により煩雑であり長期
間を要する。一方、酵母を宿主とした遺伝子操作技術
は、一般に多量の発現量は期待できないものの、生育速
度が速い、形質転換頻度が高い、核外自律複製型ベクタ
ーが利用できるなどの理由により簡便であり短期間で行
うことができる。
【００１０】従って、イン・ビトロで部位特異的変異や
ランダム変異を導入し、その変異遺伝子より翻訳される
変異ポリペプチドの性質を調べ、さらにその変異ポリペ
プチドを大量に生産させ、その高次構造を決定する、も
しくは実用に供するといったいわゆる蛋白工学の研究に
おいては、発現宿主として酵母および糸状菌を使い分け
ることにより迅速に行うことが可能である。
ランダム変異を導入し、その変異遺伝子より翻訳される
変異ポリペプチドの性質を調べ、さらにその変異ポリペ
プチドを大量に生産させ、その高次構造を決定する、も
しくは実用に供するといったいわゆる蛋白工学の研究に
おいては、発現宿主として酵母および糸状菌を使い分け
ることにより迅速に行うことが可能である。
【００１１】特にランダム変異の導入および目的の変異
遺伝子のスクリーニングを企図する場合、糸状菌のみを
宿主として用いることは実質的に不可能であり、形質転
換頻度が高く、核外自律複製型ベクターを利用できる宿
主を用いることは必須である。
遺伝子のスクリーニングを企図する場合、糸状菌のみを
宿主として用いることは実質的に不可能であり、形質転
換頻度が高く、核外自律複製型ベクターを利用できる宿
主を用いることは必須である。
【００１２】ビリルビンオキシダーゼ（以下、ＢＯとい
う）は国際生化学連合（I.U.B）酵素委員会により、酵
素番号EC 1.3.3.5として分類される酵素である。ＢＯは
ミロセシウム（Myrothecium）属、トリコデルマ（Trich
oderma）属及びコプリナス（Coprinas）属等の微生物が
産生することが報告されている酵素であり、ビリルビン
に作用してビリベルジンを経てほぼ無色の生成物に変化
せしめる反応を触媒する酵素である。即ち、460nm付近
に吸収極大を有するビリルビンに作用し、ビリベルジン
を経てほぼ無色の生成物に変化せしめる反応を触媒する
酵素であり、特にミロセシウム属由来の酵素はその物理
化学的、酵素化学的性質が詳細に明かにされている（特
公昭60-12032）。
う）は国際生化学連合（I.U.B）酵素委員会により、酵
素番号EC 1.3.3.5として分類される酵素である。ＢＯは
ミロセシウム（Myrothecium）属、トリコデルマ（Trich
oderma）属及びコプリナス（Coprinas）属等の微生物が
産生することが報告されている酵素であり、ビリルビン
に作用してビリベルジンを経てほぼ無色の生成物に変化
せしめる反応を触媒する酵素である。即ち、460nm付近
に吸収極大を有するビリルビンに作用し、ビリベルジン
を経てほぼ無色の生成物に変化せしめる反応を触媒する
酵素であり、特にミロセシウム属由来の酵素はその物理
化学的、酵素化学的性質が詳細に明かにされている（特
公昭60-12032）。
【００１３】ＢＯは、体液中のビリルビンの定量に用い
られ肝疾患等の診断用試薬として広く用いられている。
あるいは血清を用いて各種生化学検査を行う際に問題と
なるビリルビンの干渉作用を解決するため、血清中のビ
リルビンの消去用としても用いられている。さらには医
薬、洗剤、排水処理等への応用も図られている。
られ肝疾患等の診断用試薬として広く用いられている。
あるいは血清を用いて各種生化学検査を行う際に問題と
なるビリルビンの干渉作用を解決するため、血清中のビ
リルビンの消去用としても用いられている。さらには医
薬、洗剤、排水処理等への応用も図られている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】このように発現宿主と
して酵母および糸状菌の何れにも適用可能な形質転換用
プラスミドが必要とされていた。さらに、現在産業界で
広く利用されている重要な酵素、例えばＢＯ等はその生
産性において改善すべき点が多々あった。また一方で、
機能改変したＢＯの創製は、将来更なる用途を拡大する
ものとして大いに期待されているのが現状である。
して酵母および糸状菌の何れにも適用可能な形質転換用
プラスミドが必要とされていた。さらに、現在産業界で
広く利用されている重要な酵素、例えばＢＯ等はその生
産性において改善すべき点が多々あった。また一方で、
機能改変したＢＯの創製は、将来更なる用途を拡大する
ものとして大いに期待されているのが現状である。
【００１５】本発明者らは、ペニシリウム・カマンベル
チィーのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝
子のプロモーターが、本菌株中においてのみならず他の
糸状菌および酵母中において強力に機能することを見い
だし、有用蛋白質およびペプチドをこれらの宿主におい
て発現せしめるための新規発現プラスミドを構築した。
またその発現プラスミドを用いて目的の有用蛋白質（例
えばＢＯ）およびペプチドを糸状菌および酵母により生
産させることに成功し、本発明を完成させた。
チィーのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝
子のプロモーターが、本菌株中においてのみならず他の
糸状菌および酵母中において強力に機能することを見い
だし、有用蛋白質およびペプチドをこれらの宿主におい
て発現せしめるための新規発現プラスミドを構築した。
またその発現プラスミドを用いて目的の有用蛋白質（例
えばＢＯ）およびペプチドを糸状菌および酵母により生
産させることに成功し、本発明を完成させた。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明の新規発現プラス
ミドは、糸状菌および酵母において機能するプロモータ
ー、ターミネーターさらには大腸菌で複製および選択可
能なＤＮＡ領域を有するものである。
ミドは、糸状菌および酵母において機能するプロモータ
ー、ターミネーターさらには大腸菌で複製および選択可
能なＤＮＡ領域を有するものである。
【００１７】プロモーターは、糸状菌および酵母におい
て機能するものであればよいが、具体的には、アスペル
ギルス・ニガーのβ−グルコシダーゼ遺伝子［Mol. Ge
n. Gent., 194, 494（1984）］、リゾプス・ニベウスの
グルコアミラーゼ遺伝子［Agric. Biol. Chem., 50, 95
7（1986）］、リゾプス・ニベウスのアスパルティック
・プロテイナーゼ遺伝子［Agric. Biol. Chem., 54, 17
71（1990）］、ペニシリウム・カマンベルティーのモノ
およびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子［Gene, 10
3, 61（1991）］のプロモーターが挙げられる。
て機能するものであればよいが、具体的には、アスペル
ギルス・ニガーのβ−グルコシダーゼ遺伝子［Mol. Ge
n. Gent., 194, 494（1984）］、リゾプス・ニベウスの
グルコアミラーゼ遺伝子［Agric. Biol. Chem., 50, 95
7（1986）］、リゾプス・ニベウスのアスパルティック
・プロテイナーゼ遺伝子［Agric. Biol. Chem., 54, 17
71（1990）］、ペニシリウム・カマンベルティーのモノ
およびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子［Gene, 10
3, 61（1991）］のプロモーターが挙げられる。
【００１８】より好適には、ペニシリウム・カマンベル
ティーのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝
子のプロモーターが挙げられる。
ティーのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝
子のプロモーターが挙げられる。
【００１９】またターミネーターは、プロモーターほど
厳密に選択されるべきものではないが、具体的にはペニ
シリウム・カマンベルティーのモノおよびジアシルグリ
セロールリパーゼ遺伝子のターミネーターが好適に用い
られる。
厳密に選択されるべきものではないが、具体的にはペニ
シリウム・カマンベルティーのモノおよびジアシルグリ
セロールリパーゼ遺伝子のターミネーターが好適に用い
られる。
【００２０】さらに具体的な１例としては、図１の制限
酵素地図で表されるプラスミドpY1を示すことができ
る。
酵素地図で表されるプラスミドpY1を示すことができ
る。
【００２１】本プラスミドにおいては、発現させるべき
目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片をプロモー
ターとターミネーターの間に挿入するのを容易にするた
め、プロモーターとターミネーターの接続部に２つの制
限酵素認識部位を導入してある。また、目的のポリペプ
チドを挿入したのちの、［プロモーター−目的のポリペ
プチドをコードするＤＮＡ断片−ターミネーター］から
なる発現カセットを、発現宿主として選択した菌株に対
する形質転換プラスミドに挿入するのを容易にするた
め、さらに別の制限酵素認識部位を導入してある。
目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片をプロモー
ターとターミネーターの間に挿入するのを容易にするた
め、プロモーターとターミネーターの接続部に２つの制
限酵素認識部位を導入してある。また、目的のポリペプ
チドを挿入したのちの、［プロモーター−目的のポリペ
プチドをコードするＤＮＡ断片−ターミネーター］から
なる発現カセットを、発現宿主として選択した菌株に対
する形質転換プラスミドに挿入するのを容易にするた
め、さらに別の制限酵素認識部位を導入してある。
【００２２】本プラスミドの構築は例えば以下の様にし
て行うことができる。遺伝子のプロモーター領域、ター
ミネーター領域それぞれの両端に部位特異的変異導入法
［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 488（1985）］
により適当な制限酵素認識部位を導入後、プロモーター
領域、ターミネーター領域を制限酵素により切り出し、
ＤＮＡ断片として単離し、両断片をもとの遺伝子と同じ
順序で、大腸菌のベクターたとえばpUC19に挿入して得
られる。
て行うことができる。遺伝子のプロモーター領域、ター
ミネーター領域それぞれの両端に部位特異的変異導入法
［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 488（1985）］
により適当な制限酵素認識部位を導入後、プロモーター
領域、ターミネーター領域を制限酵素により切り出し、
ＤＮＡ断片として単離し、両断片をもとの遺伝子と同じ
順序で、大腸菌のベクターたとえばpUC19に挿入して得
られる。
【００２３】プロモーター領域、ターミネーター領域の
ＤＮＡ断片は、ＰＣＲ法［Science,230, 1350（198
5）］により増幅し得ることも可能である。
ＤＮＡ断片は、ＰＣＲ法［Science,230, 1350（198
5）］により増幅し得ることも可能である。
【００２４】本発明は、さらに酵素、ホルモン、生理活
性ペプチドもしくは蛋白質を、糸状菌および酵母を宿主
として製造する方法をも開示するものである。これは例
えば次のステップにより成し遂げられる。
性ペプチドもしくは蛋白質を、糸状菌および酵母を宿主
として製造する方法をも開示するものである。これは例
えば次のステップにより成し遂げられる。
【００２５】(1) 発現カセットの構築（プラスミドpY1
への目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片の挿
入） (2) 形質転換-発現プラスミドの構築（発現カセットの
形質転換ベクターへの挿入） (3) 形質転換−発現プラスミドの宿主菌株への導入 (4) 形質転換体の培養 以下に順を追って説明する。
への目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片の挿
入） (2) 形質転換-発現プラスミドの構築（発現カセットの
形質転換ベクターへの挿入） (3) 形質転換−発現プラスミドの宿主菌株への導入 (4) 形質転換体の培養 以下に順を追って説明する。
【００２６】(1) 発現カセットの構築
目的のポリペプチドをコードするＤＮＡの開始コドンの
上流に制限酵素XbaI部位、終止コドンの下流に制限酵素
BamHI部位を、部位特異的変異法もしくはＰＣＲ法によ
りそれぞれ導入し、これらの制限酵素付着部位を両端に
もつＤＮＡ断片を、プラスミドpY1のXbaI、BamHI部位に
挿入する。目的のポリペプチドをコードするＤＮＡは、
クローニングにより得られた遺伝子もしくはｃＤＮＡで
あっても、化学合成により得られたものであってもよ
い。またイントロンを含む遺伝子であっても、そのイン
トロン中に宿主中でスプライシングが起こる様な配列を
有するものであれば使用可能である。
上流に制限酵素XbaI部位、終止コドンの下流に制限酵素
BamHI部位を、部位特異的変異法もしくはＰＣＲ法によ
りそれぞれ導入し、これらの制限酵素付着部位を両端に
もつＤＮＡ断片を、プラスミドpY1のXbaI、BamHI部位に
挿入する。目的のポリペプチドをコードするＤＮＡは、
クローニングにより得られた遺伝子もしくはｃＤＮＡで
あっても、化学合成により得られたものであってもよ
い。またイントロンを含む遺伝子であっても、そのイン
トロン中に宿主中でスプライシングが起こる様な配列を
有するものであれば使用可能である。
【００２７】(2) 形質転換−発現プラスミドの構築
(1)で構築した発現カセットを宿主糸状菌もしくは酵母
細胞中へ導入するため、形質転換体の選択に必要なマー
カー遺伝子を有するプラスミドすなわち形質転換ベクタ
ーに、発現カセットを挿入する。形質転換ベクターはそ
れぞれの宿主に応じて適宜選択する。糸状菌の場合、コ
−トランスホーメーション（Co-transformation）が可
能であるので、糸状菌を宿主とする場合は必ずしもこの
ステップは必要としない。
細胞中へ導入するため、形質転換体の選択に必要なマー
カー遺伝子を有するプラスミドすなわち形質転換ベクタ
ーに、発現カセットを挿入する。形質転換ベクターはそ
れぞれの宿主に応じて適宜選択する。糸状菌の場合、コ
−トランスホーメーション（Co-transformation）が可
能であるので、糸状菌を宿主とする場合は必ずしもこの
ステップは必要としない。
【００２８】
(3) 形質転換−発現プラスミドの宿主菌株への導入
(2)で得られた形質転換−発現プラスミドを用いて、公
知の方法で糸状菌［例えば Mol. Gen. Gent., 218, 99
（1989）］もしくは酵母［例えばJ. Bacteriol., 153,
163（1983）］を形質転換する。
知の方法で糸状菌［例えば Mol. Gen. Gent., 218, 99
（1989）］もしくは酵母［例えばJ. Bacteriol., 153,
163（1983）］を形質転換する。
【００２９】コ−トランスホーメーションを行う場合
は、形質転換-発現プラスミドの代わりに(1)で得られた
発現カセットのＤＮＡ断片もしくは発現カセットを有す
るプラスミドと形質転換プラスミドの混合液を用いる。
は、形質転換-発現プラスミドの代わりに(1)で得られた
発現カセットのＤＮＡ断片もしくは発現カセットを有す
るプラスミドと形質転換プラスミドの混合液を用いる。
【００３０】(4) 形質転換体の培養
(3)で得られた形質転換体を、適当な培地・培養条件で
培養し目的のポリペプチドを生産させる。この場合、プ
ロモーターが最も機能する培地・培養条件で培養を行う
のが好ましい。生産された組換え型の目的のポリペプチ
ドは、適当な方法で定性、定量し、また必要に応じて単
離・精製される。
培養し目的のポリペプチドを生産させる。この場合、プ
ロモーターが最も機能する培地・培養条件で培養を行う
のが好ましい。生産された組換え型の目的のポリペプチ
ドは、適当な方法で定性、定量し、また必要に応じて単
離・精製される。
【００３１】目的のポリペプチドは、いかなるものであ
ってもよいが例えばミロセシウム・ベルカリアMT-1由来
のＢＯが挙げられる。
ってもよいが例えばミロセシウム・ベルカリアMT-1由来
のＢＯが挙げられる。
【００３２】以下に実施例を用いて、本発明を詳細に説
明する。尚、本明細書においては、遺伝子操作手法は特
に記載しない限り成書［例えば「モレキュラー・クロー
ニング」第２版、サンブルック、フリッシュ、マニアチ
ス編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
ズ出版（1989）］に従って行った。
明する。尚、本明細書においては、遺伝子操作手法は特
に記載しない限り成書［例えば「モレキュラー・クロー
ニング」第２版、サンブルック、フリッシュ、マニアチ
ス編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
ズ出版（1989）］に従って行った。
【００３３】
実施例１ プラスミドpY1の構築
ペニシリウム・エスピーU-150株（FERM P-10452：本菌
株は寄託後ペニシリウム・カマンベルチィーと同定され
た。以後ペニシリウム・カマンベルチィーと示す）のモ
ノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子、2.0-kb
HindIII断片を大腸菌ベクターpUC19［東洋紡社製、Gen
e, 33, 103（1985）］のHindIII部位に挿入したプラス
ミドpLGG300およびpLGG100［Gene, 103, 61（1991）］
を材料に用いた。これら両プラスミドは、2.0-kb HindI
II断片が互いに逆方向に挿入されている。
株は寄託後ペニシリウム・カマンベルチィーと同定され
た。以後ペニシリウム・カマンベルチィーと示す）のモ
ノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子、2.0-kb
HindIII断片を大腸菌ベクターpUC19［東洋紡社製、Gen
e, 33, 103（1985）］のHindIII部位に挿入したプラス
ミドpLGG300およびpLGG100［Gene, 103, 61（1991）］
を材料に用いた。これら両プラスミドは、2.0-kb HindI
II断片が互いに逆方向に挿入されている。
【００３４】このモノおよびジアシルグリセロールリパ
ーゼ遺伝子は、ペニシリウム・カマンベルチィーより公
知の方法［Gene, 103, 61（1991）］により取得するこ
とが可能である。
ーゼ遺伝子は、ペニシリウム・カマンベルチィーより公
知の方法［Gene, 103, 61（1991）］により取得するこ
とが可能である。
【００３５】プロモーター領域は、pLGG300を鋳型とし
てＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応のための上流プ
ライマーとして、
てＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応のための上流プ
ライマーとして、
【００３６】
M4': 5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA-3'
下流プライマーとして、
【００３７】
Xba: 5'-AGACGCATGATGTCTAGAGGTCAATGGC-3'
【００３８】をサイクロンプラスＤＮＡ合成機（ミリジ
ェン・バイオサーチ社製）を用いて合成した。ＰＣＲ反
応は、Gene AmpTM kit（パーキンエルマージャパン社
製）を用い、同社のサーマル・サイクラー（ＤＮＡ増幅
装置）により行った。反応溶液の組成は以下の通りであ
る。
ェン・バイオサーチ社製）を用いて合成した。ＰＣＲ反
応は、Gene AmpTM kit（パーキンエルマージャパン社
製）を用い、同社のサーマル・サイクラー（ＤＮＡ増幅
装置）により行った。反応溶液の組成は以下の通りであ
る。
【００３９】
H2O 63.0 μl
[10x] Reaction buffer 10.0 μl
dNTPs, Mix., 1.25 mM 16.0 μl
上流プライマーLGP-a, 20 μM 5.0 μl
下流プライマーLGP-b, 20 μM 5.0 μl
pLGG300, 2 ng/μl 0.5 μl
AmpliTaqTMDNAポリメラーゼ 0.5 μl
【００４０】サーマル・サイクラーの条件は、以下の通
りである。 94 ℃ 0.5 分 55 ℃ 2.0 分 72 ℃ 0.5 分 この条件下で反応を50サイクル行った後、さらに72℃で
７分間インキュベートした。
りである。 94 ℃ 0.5 分 55 ℃ 2.0 分 72 ℃ 0.5 分 この条件下で反応を50サイクル行った後、さらに72℃で
７分間インキュベートした。
【００４１】反応液を1.0％低融点アガロース電気泳動
に供し、増幅された約0.6-kbのＤＮＡ断片を単離・精製
した。このＤＮＡ断片を制限酵素HindIIIおよびXbaIで
処理し、同じく両酵素で処理したpUC19にクローニング
し、pPXbaを得た。
に供し、増幅された約0.6-kbのＤＮＡ断片を単離・精製
した。このＤＮＡ断片を制限酵素HindIIIおよびXbaIで
処理し、同じく両酵素で処理したpUC19にクローニング
し、pPXbaを得た。
【００４２】次にターミネーター領域のクローニングを
行った。pLGG100を制限酵素DraIおよびHincIIで処理
後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供
し、ターミネーター領域である約0.48-kb DraI/HincII
断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片をpUC9のSmaI部
位にクローニングし、pT7を得た。
行った。pLGG100を制限酵素DraIおよびHincIIで処理
後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供
し、ターミネーター領域である約0.48-kb DraI/HincII
断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片をpUC9のSmaI部
位にクローニングし、pT7を得た。
【００４３】次にプロモーター、ターミネーター領域の
連結を行った。pT7を制限酵素BamHIおよびEcoRIで処理
後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供
し、ターミネーター領域である約0.49-kb BamHI/EcoRI
断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片を同じく制限酵
素BamHIおよびEcoRIで処理したpPXbaにクローニング
し、pY1を得た（図２）。
連結を行った。pT7を制限酵素BamHIおよびEcoRIで処理
後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供
し、ターミネーター領域である約0.49-kb BamHI/EcoRI
断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片を同じく制限酵
素BamHIおよびEcoRIで処理したpPXbaにクローニング
し、pY1を得た（図２）。
【００４４】実施例２ ミロセシウム・ベルカリアMT-1
のＢＯ発現カセットの構築 ミロセシウム・ベルカリMT-1アのＢＯ cDNAを有するプ
ラスミドpUC-BO（特願平4-34126）を材料として用い
た。このＢＯのcDNAは、ミロセシウム・ベルカリアMT-1
（微工研条寄第653号）より公知の方法により取得する
ことができる。本cDNAをpY1のプロモーターとターミネ
ーターの間に挿入するのを容易にするため、翻訳開始コ
ドンの5bp上流に制限酵素XbaI部位をPCR法を用いて導入
した。ＰＣＲ反応のための上流プライマーとして、
のＢＯ発現カセットの構築 ミロセシウム・ベルカリMT-1アのＢＯ cDNAを有するプ
ラスミドpUC-BO（特願平4-34126）を材料として用い
た。このＢＯのcDNAは、ミロセシウム・ベルカリアMT-1
（微工研条寄第653号）より公知の方法により取得する
ことができる。本cDNAをpY1のプロモーターとターミネ
ーターの間に挿入するのを容易にするため、翻訳開始コ
ドンの5bp上流に制限酵素XbaI部位をPCR法を用いて導入
した。ＰＣＲ反応のための上流プライマーとして、
【００４５】
B-a: 5'-ATTTTCTAGACATCATGTTCAAACACACACTTGG-3'
下流プライマーとして、
【００４６】
B-c: 5'-CACCTTGAAGTCGACAAGATGGATG-3'
【００４７】をサイクロンプラスＤＮＡ合成機（ミリジ
ェン・バイオサーチ社製）を用いて合成した。ＰＣＲ反
応は、Gene AmpTM kit（パーキンエルマージャパン社
製）を用い、同社のサーマル・サイクラー（ＤＮＡ増幅
装置）により行った。反応溶液の組成は以下の通りであ
る。
ェン・バイオサーチ社製）を用いて合成した。ＰＣＲ反
応は、Gene AmpTM kit（パーキンエルマージャパン社
製）を用い、同社のサーマル・サイクラー（ＤＮＡ増幅
装置）により行った。反応溶液の組成は以下の通りであ
る。
【００４８】
H2O 63.0 μl
[10x] Reaction buffer 10.0 μl
dNTPs, Mix., 1.25 mM 16.0 μl
上流プライマー B-a, 20 μM 5.0 μl
下流プライマー B-c, 20 μM 5.0 μl
pUC-BO, 2 ng/μl 0.5 μl
AmpliTaqTMDNAポリメラーゼ 0.5 μl
【００４９】サーマル・サイクラーの条件は、以下の通
りである。 93 ℃ 1.0 分 50 ℃ 1.0 分 72 ℃ 1.0 分 この条件下で反応を50サイクル行った後、さらに72℃で
7分間インキュベートした。
りである。 93 ℃ 1.0 分 50 ℃ 1.0 分 72 ℃ 1.0 分 この条件下で反応を50サイクル行った後、さらに72℃で
7分間インキュベートした。
【００５０】反応液を1.0％低融点アガロース電気泳動
に供し、増幅された約1.4-kbのＤＮＡ断片を単離・精製
した。このＤＮＡ断片を制限酵素XbaIおよびSalIで処理
し、同じく両酵素で処理したpUC19にクローニングし、p
BXS1を得た。
に供し、増幅された約1.4-kbのＤＮＡ断片を単離・精製
した。このＤＮＡ断片を制限酵素XbaIおよびSalIで処理
し、同じく両酵素で処理したpUC19にクローニングし、p
BXS1を得た。
【００５１】次にpBXS1およびpUC-BOを制限酵素EcoRIお
よびNcoIで処理後、分解混合液を1.0％低融点アガロー
ス電気泳動に供し、pBXS1由来の約0.98-kbのEcoRI/NcoI
断片およびpUC-BO由来の約3.6kbのEcoRI/NcoI断片を単
離・精製した。得られた２つのDNA断片をライゲーショ
ンすることにより、ＢＯ発現カセットを含むプラスミド
pBXba1を得た（図３）。
よびNcoIで処理後、分解混合液を1.0％低融点アガロー
ス電気泳動に供し、pBXS1由来の約0.98-kbのEcoRI/NcoI
断片およびpUC-BO由来の約3.6kbのEcoRI/NcoI断片を単
離・精製した。得られた２つのDNA断片をライゲーショ
ンすることにより、ＢＯ発現カセットを含むプラスミド
pBXba1を得た（図３）。
【００５２】更にpBXba1を制限酵素Xba1で処理後、分解
混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供し、約1.9
-kbのXba1断片を単離・精製した。このDNA断片をpY1のX
baI部位にクローニングし、pBC1を得た（図３）。
混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供し、約1.9
-kbのXba1断片を単離・精製した。このDNA断片をpY1のX
baI部位にクローニングし、pBC1を得た（図３）。
【００５３】実施例３ ミロセシウム・ベルカリアMT-1
のＢＯのアスペルギルス・オリゼでの発現 形質転換ベクターへのＢＯ発現カセットの導入を容易に
するため、アスペルギルス・オリゼに対する形質転換ベ
クターpSTA14［Mol. Gen. Genet., 218, 99-104（198
9）］を以下のように改変しpN3およびpN4を作製した。
のＢＯのアスペルギルス・オリゼでの発現 形質転換ベクターへのＢＯ発現カセットの導入を容易に
するため、アスペルギルス・オリゼに対する形質転換ベ
クターpSTA14［Mol. Gen. Genet., 218, 99-104（198
9）］を以下のように改変しpN3およびpN4を作製した。
【００５４】pSTA14を制限酵素HindIIIで処理後、分解
混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供し、niaD
遺伝子を含む約5.5-kb HindIII断片を単離・精製した。
このＤＮＡ断片をＤＮＡブランチング・キット（宝酒造
社製）を用いて両末端を平滑化した後、pUC19の制限酵
素SmaI部位にサブクローニングし、pN3およびpN4を得た
（図４）。これら両プラスミドは、約5.5-kb HindIII断
片が互いに逆方向に挿入されている。
混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供し、niaD
遺伝子を含む約5.5-kb HindIII断片を単離・精製した。
このＤＮＡ断片をＤＮＡブランチング・キット（宝酒造
社製）を用いて両末端を平滑化した後、pUC19の制限酵
素SmaI部位にサブクローニングし、pN3およびpN4を得た
（図４）。これら両プラスミドは、約5.5-kb HindIII断
片が互いに逆方向に挿入されている。
【００５５】次に形質転換−発現プラスミドを構築する
ため、pBC1を制限酵素HindIIIで処理後、分解混合液を
1.0％低融点アガロース電気泳動に供し、ＢＯ発現カセ
ットである約2.9-kb HindIII断片を単離・精製した。こ
のＤＮＡ断片をpN3のHindIII部位にクローニングし、pN
BC1を得た（図４）。
ため、pBC1を制限酵素HindIIIで処理後、分解混合液を
1.0％低融点アガロース電気泳動に供し、ＢＯ発現カセ
ットである約2.9-kb HindIII断片を単離・精製した。こ
のＤＮＡ断片をpN3のHindIII部位にクローニングし、pN
BC1を得た（図４）。
【００５６】次にこのpNBC1を用いて、アスペルギルス
・オリゼAO1.1株［Mol. Gen. Genet., 218, 99-104（19
89）］を、アンクルスらの方法［Mol. Gen. Genet., 21
8, 99-104（1989）］に準じて形質転換した。選択培地
に生育してきた形質転換体10株（PNB-1〜PNB-10）をラ
ンダムにピック・アップし、それぞれ100mlの大豆油培
地（3％大豆油、0.5％酵母エキス、0.3％ NaNO3、0.1％
K2HPO4、0.05％ KCl、0.05％ MgSO4・7H2O、0.003％ Cu
SO4・5H2O、0.001％ FeSO4・12H20）に接種し、30℃で4日
間もしくは10日間振とう培養し、得られた培養物を∂過
し菌体を除去した。
・オリゼAO1.1株［Mol. Gen. Genet., 218, 99-104（19
89）］を、アンクルスらの方法［Mol. Gen. Genet., 21
8, 99-104（1989）］に準じて形質転換した。選択培地
に生育してきた形質転換体10株（PNB-1〜PNB-10）をラ
ンダムにピック・アップし、それぞれ100mlの大豆油培
地（3％大豆油、0.5％酵母エキス、0.3％ NaNO3、0.1％
K2HPO4、0.05％ KCl、0.05％ MgSO4・7H2O、0.003％ Cu
SO4・5H2O、0.001％ FeSO4・12H20）に接種し、30℃で4日
間もしくは10日間振とう培養し、得られた培養物を∂過
し菌体を除去した。
【００５７】得られた培養液について、以下に示す方法
でＢＯ活性を測定し、その結果を表１に示す。
でＢＯ活性を測定し、その結果を表１に示す。
【００５８】ＢＯ活性測定法
エチレンジアミン四酢酸１mMを含む0.2Ｍ−トリス塩酸
緩衝液250mlに試薬ビリルビン（和光純薬工業製）５mg
を溶解し、この２mlと酵素液0.2mlを37℃で反応させ440
nmの吸光度の減少を測定する。
緩衝液250mlに試薬ビリルビン（和光純薬工業製）５mg
を溶解し、この２mlと酵素液0.2mlを37℃で反応させ440
nmの吸光度の減少を測定する。
【００５９】
【表１】
【００６０】尚ここでA-1株は、形質転換ベクターpN3を
用いて得られた形質転換体である。ミロセシウム・ベル
カリアMT-1の培養は、特公昭60-12031に準じてＢＯ生産
に対して最適の条件で行った。
用いて得られた形質転換体である。ミロセシウム・ベル
カリアMT-1の培養は、特公昭60-12031に準じてＢＯ生産
に対して最適の条件で行った。
【００６１】この様に、pN3による形質転換体はほとん
どＢＯを生産しないのに対し、pNBC1による形質転換体1
0株のうち6株は明かに多量のＢＯを生産しているのがわ
かる。最も生産性の高い株は、これまでのＢＯ生産菌ミ
ロセシウム・ベルカリアMT-1の約２倍の生産性を示し
た。
どＢＯを生産しないのに対し、pNBC1による形質転換体1
0株のうち6株は明かに多量のＢＯを生産しているのがわ
かる。最も生産性の高い株は、これまでのＢＯ生産菌ミ
ロセシウム・ベルカリアMT-1の約２倍の生産性を示し
た。
【００６２】また、これらの形質転換体の培養ろ液につ
いて、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ミ
ロセシウム・ベルカリアMT-1のＢＯと同様の分子量の蛋
白質が分泌されていることを確認した。さらにウエスタ
ン・ブロッティング解析により、この蛋白質がミロセシ
ウム・ベルカリアMT-1のＢＯに対する抗体と反応するこ
とを確認した。
いて、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ミ
ロセシウム・ベルカリアMT-1のＢＯと同様の分子量の蛋
白質が分泌されていることを確認した。さらにウエスタ
ン・ブロッティング解析により、この蛋白質がミロセシ
ウム・ベルカリアMT-1のＢＯに対する抗体と反応するこ
とを確認した。
【００６３】実施例４ ミロセシウム・ベルカリアMT-1
のＢＯのペニシリウム・カマンベルチイーでの発現 ペニシリウム・カマンベルチィーに対する形質転換−発
現プラスミドを構築するため、pBC1を制限酵素HindIII
で処理後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳
動に供し、ＢＯ発現カセットである約2.9-kb HindIII断
片を単離・精製した。このＤＮＡ断片を以下に記載する
ペニシリウム・カマンベルチィーに対する形質転換ベク
ターpH4のHindIII部位にクローニングし、pHBC1を得た
（図５）。
のＢＯのペニシリウム・カマンベルチイーでの発現 ペニシリウム・カマンベルチィーに対する形質転換−発
現プラスミドを構築するため、pBC1を制限酵素HindIII
で処理後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳
動に供し、ＢＯ発現カセットである約2.9-kb HindIII断
片を単離・精製した。このＤＮＡ断片を以下に記載する
ペニシリウム・カマンベルチィーに対する形質転換ベク
ターpH4のHindIII部位にクローニングし、pHBC1を得た
（図５）。
【００６４】 形質転換プラスミドpH1の構築
実施例１に記載した、プラスミドpLGG300およびpLGG100
［Gene, 103, 61（1991）］の両プラスミドは、約2.0-k
b HindIII断片が互いに逆方向に挿入されている。この
モノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子は、ペ
ニシリウム・カマンベルチィーより公知の方法［Gene,
103, 61（1991）］により取得することが可能である。
また薬剤耐性マーカー遺伝子としては大腸菌のハイグロ
マイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有するプ
ラスミドpHph0（ベーリンガー・マンハイム社製）を用
いた。
［Gene, 103, 61（1991）］の両プラスミドは、約2.0-k
b HindIII断片が互いに逆方向に挿入されている。この
モノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子は、ペ
ニシリウム・カマンベルチィーより公知の方法［Gene,
103, 61（1991）］により取得することが可能である。
また薬剤耐性マーカー遺伝子としては大腸菌のハイグロ
マイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有するプ
ラスミドpHph0（ベーリンガー・マンハイム社製）を用
いた。
【００６５】モノおよびジアシルグリセロールリパーゼ
遺伝子のプロモーター領域および翻訳開始コドンから７
アミノ酸残基目までを含むＤＮＡ断片は、pLGG300を鋳
型としてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応のための
上流プライマーとして、
遺伝子のプロモーター領域および翻訳開始コドンから７
アミノ酸残基目までを含むＤＮＡ断片は、pLGG300を鋳
型としてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応のための
上流プライマーとして、
【００６６】
LGP-a: 5'-CAAGCTTCCGGGAGTAAATTTTC-3'
下流プライマーとして、
LGP-b: 5'-TGTCGACCTGTGAAGAAAGAGAGACGCAT-3'
【００６７】をサイクロンプラスＤＮＡ合成機（ミリジ
ェン・バイオサーチ社製）を用いて合成した。ＰＣＲ反
応は、Gene AmpTM kit（パーキンエルマージャパン社
製）を用い、同社のサーマル・サイクラー（ＤＮＡ増幅
装置）により行った。反応溶液の組成は以下の通りであ
る。
ェン・バイオサーチ社製）を用いて合成した。ＰＣＲ反
応は、Gene AmpTM kit（パーキンエルマージャパン社
製）を用い、同社のサーマル・サイクラー（ＤＮＡ増幅
装置）により行った。反応溶液の組成は以下の通りであ
る。
【００６８】
H2O 62.5 μl
[10x] Reaction buffer 10.0 μl
dNTPs, Mix., 1.25 mM 16.0 μl
上流プライマーLGP-a, 20 μM 5.0 μl
下流プライマーLGP-b, 20 μM 5.0 μl
pLGG300, 2 ng/μl 1.0 μl
AmpliTaqTMDNAポリメラーゼ 0.5 μl
【００６９】サーマル・サイクラーの条件は、以下の通
りである。 93 ℃ 1.0 分 55 ℃ 1.0 分 72 ℃ 1.0 分
りである。 93 ℃ 1.0 分 55 ℃ 1.0 分 72 ℃ 1.0 分
【００７０】この条件下で反応を50サイクル行った後、
さらに72℃で7分間インキュベートした。
さらに72℃で7分間インキュベートした。
【００７１】反応液を1.0％低融点アガロース電気泳動
に供し、増幅された約0.6-kbのＤＮＡ断片を単離・精製
した。このＤＮＡ断片を制限酵素HindIIIおよびSalIで
処理し、同じく両酵素で処理したpUC19にクローニング
し、pP2を得た。
に供し、増幅された約0.6-kbのＤＮＡ断片を単離・精製
した。このＤＮＡ断片を制限酵素HindIIIおよびSalIで
処理し、同じく両酵素で処理したpUC19にクローニング
し、pP2を得た。
【００７２】次にターミネーター領域を、以下のように
してpHph0のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子の下流にクローニングした。
してpHph0のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子の下流にクローニングした。
【００７３】pLGG100を制限酵素DraIおよびHincIIで処
理後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に
供し、ターミネーター領域である約0.48-kb DraI/HincI
I断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片をのpHph0のSm
aI部位にクローニングし、pT6を得た。
理後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に
供し、ターミネーター領域である約0.48-kb DraI/HincI
I断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片をのpHph0のSm
aI部位にクローニングし、pT6を得た。
【００７４】次にモノおよびジアシルグリセロールリパ
ーゼ遺伝子のプロモーター領域および翻訳開始コドンか
ら７アミノ酸残基目までを含むＤＮＡ断片を、以下のよ
うにしてpT6のハイグロマイシンＢホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子中の蛋白質のＮ末端コーディング領域に存
在する制限酵素部位にクローニングした。
ーゼ遺伝子のプロモーター領域および翻訳開始コドンか
ら７アミノ酸残基目までを含むＤＮＡ断片を、以下のよ
うにしてpT6のハイグロマイシンＢホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子中の蛋白質のＮ末端コーディング領域に存
在する制限酵素部位にクローニングした。
【００７５】pP2を制限酵素HinndIIIおよびSalIで処理
後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供
し、約0.57-kb HindIII/SalI断片を単離・精製した。こ
のＤＮＡ断片を同じく制限酵素HindIIIおよびSalIで処
理したpT6にクローニングし、pH1を得た。
後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供
し、約0.57-kb HindIII/SalI断片を単離・精製した。こ
のＤＮＡ断片を同じく制限酵素HindIIIおよびSalIで処
理したpT6にクローニングし、pH1を得た。
【００７６】この様にして得られたpH1は、pHph0がコー
ドしていたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラー
ゼ蛋白質の翻訳開始コドンから10残基目までのアミノ酸
配列が、モノおよびジアシルグリセロールリパーゼの翻
訳開始コドンから７残基目までのアミノ酸配列と置き変
わった融合型のハイグロマイシンＢホスホトランスフェ
ラーゼ蛋白質をコードするＤＮＡを有している。そして
この融合型のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ蛋白質をコードするＤＮＡの上流および下流にペニ
シリウム・カマンベルチィーのモノおよびジアシルグリ
セロールリパーゼ遺伝子のプロモーター、ターミネータ
ーがそれぞれ配置されている。
ドしていたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラー
ゼ蛋白質の翻訳開始コドンから10残基目までのアミノ酸
配列が、モノおよびジアシルグリセロールリパーゼの翻
訳開始コドンから７残基目までのアミノ酸配列と置き変
わった融合型のハイグロマイシンＢホスホトランスフェ
ラーゼ蛋白質をコードするＤＮＡを有している。そして
この融合型のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ蛋白質をコードするＤＮＡの上流および下流にペニ
シリウム・カマンベルチィーのモノおよびジアシルグリ
セロールリパーゼ遺伝子のプロモーター、ターミネータ
ーがそれぞれ配置されている。
【００７７】 形質転換プラスミドpH4の構築
pH1へのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝
子の挿入を容易にするため、以下のようにしてpH1を改
変し、pH4を作製した。pH1を制限酵素HindIIIで処理
後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供
し、融合薬剤耐性遺伝子を含む約2.2-kb HindIII断片を
単離・精製した。
子の挿入を容易にするため、以下のようにしてpH1を改
変し、pH4を作製した。pH1を制限酵素HindIIIで処理
後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供
し、融合薬剤耐性遺伝子を含む約2.2-kb HindIII断片を
単離・精製した。
【００７８】このＤＮＡ断片をＤＮＡブランチング・キ
ット（宝酒造社製）を用いて両末端を平滑化した後、pU
C19の制限酵素SmaI部位にサブクローニングし、pH4を得
た。
ット（宝酒造社製）を用いて両末端を平滑化した後、pU
C19の制限酵素SmaI部位にサブクローニングし、pH4を得
た。
【００７９】このプラスミドは、約2.2-kb HindIII断片
が互いに逆方向に挿入されている。またpH1において２
ヶ所存在した制限酵素HindIII部位が１ヶ所になってい
る。
が互いに逆方向に挿入されている。またpH1において２
ヶ所存在した制限酵素HindIII部位が１ヶ所になってい
る。
【００８０】
【００８１】次にこのpHBC1を用いて、ペニシリウム・
カマンベルチィーを、以下に示す方法で形質転換した。
カマンベルチィーを、以下に示す方法で形質転換した。
【００８２】ペニシリウム・カマンベルチィーの胞子懸
濁液（２×108/ml）100μlを100mlのぶどう糖・ペプト
ン培地（栄研化学社製）に接種し30℃で48時間振とう培
養後、培養物をろ過し菌体を集めた。この菌体を10 ml
のプロトプラスト化バッファー［0.8M NaCl、10mM りん
酸緩衝液（pH6.0）］に懸濁しろ過することにより、洗
浄菌体を集めた。この洗浄菌体を、５mg/mlのライジン
グ・エンザイム（SigmaProduct number L-2265、シグマ
社製）を含むプロトプラスト化バッファーに懸濁し、30
℃で２時間振とう後、ガラスフィルター3G2でろ過し、
ろ液を2000rpm、5分の遠心分離に供し、プロトプラスト
を沈澱物として得た。
濁液（２×108/ml）100μlを100mlのぶどう糖・ペプト
ン培地（栄研化学社製）に接種し30℃で48時間振とう培
養後、培養物をろ過し菌体を集めた。この菌体を10 ml
のプロトプラスト化バッファー［0.8M NaCl、10mM りん
酸緩衝液（pH6.0）］に懸濁しろ過することにより、洗
浄菌体を集めた。この洗浄菌体を、５mg/mlのライジン
グ・エンザイム（SigmaProduct number L-2265、シグマ
社製）を含むプロトプラスト化バッファーに懸濁し、30
℃で２時間振とう後、ガラスフィルター3G2でろ過し、
ろ液を2000rpm、5分の遠心分離に供し、プロトプラスト
を沈澱物として得た。
【００８３】この沈澱物を10mlのソルビトール溶液［1.
2M ソルビトール、50mM CaCl2、10mM トリス塩酸緩衝液
（pH7.5）］に懸濁し、2000rpm、５分の遠心分離し沈澱
物を集めた。この操作を再度繰り返した後、沈澱物を２
×108/mlとなるようソルビトール溶液に懸濁し、プロト
プラスト溶液を得た。次にプロトプラスト溶液50μl
に、4μlのpH1溶液（１μg/μl）、6.75μlのPEG溶液
［50％ PEG4000、50mM CaCl2、10mM トリス塩酸緩衝液
（pH7.5）］を加え混合後、氷上に30分静置した。
2M ソルビトール、50mM CaCl2、10mM トリス塩酸緩衝液
（pH7.5）］に懸濁し、2000rpm、５分の遠心分離し沈澱
物を集めた。この操作を再度繰り返した後、沈澱物を２
×108/mlとなるようソルビトール溶液に懸濁し、プロト
プラスト溶液を得た。次にプロトプラスト溶液50μl
に、4μlのpH1溶液（１μg/μl）、6.75μlのPEG溶液
［50％ PEG4000、50mM CaCl2、10mM トリス塩酸緩衝液
（pH7.5）］を加え混合後、氷上に30分静置した。
【００８４】次に0.5mlのPEG溶液を加え混合し、さらに
1.0mlのソルビトール溶液を加え混合した。この混合液3
00μlを、17mlの1.5％アガロースを含むPDS［0.25％ 大
豆油、0.25％ モノオレイン、1.2M ソルビトール、2.4
％ ポテト・デキストロース・ブロス（Difco社製）］か
らなるプレート上に載せ、さらに予め48℃に保温してお
いた0.7％アガロースを含むPDS 3.0mlを注ぎ、混合後固
化させた。
1.0mlのソルビトール溶液を加え混合した。この混合液3
00μlを、17mlの1.5％アガロースを含むPDS［0.25％ 大
豆油、0.25％ モノオレイン、1.2M ソルビトール、2.4
％ ポテト・デキストロース・ブロス（Difco社製）］か
らなるプレート上に載せ、さらに予め48℃に保温してお
いた0.7％アガロースを含むPDS 3.0mlを注ぎ、混合後固
化させた。
【００８５】30℃で24時間放置後、613μg/mlのハイグ
ロマイシンＢ（シグマ社製）、0.7％アガロースを含むP
DS 3.0mlを重層し、30℃で４日間放置し、プレート上に
出現したコロニー12株（PHB-1〜PHB-10）をランダムに
ピック・アップし、それぞれ100mlの大豆油培地（3％大
豆油、0.5％酵母エキス、0.3％ NaNO3、0.1％ K2HPO4、
0.05％ KCl、0.05％ MgSO4・7H2O、0.003％ CuSO4・5H
2O、0.001％ FeSO4・12H20）に接種し、30℃で7日間もし
くは10日間振とう培養し、得られた培養物をろ過し菌体
を除去した。
ロマイシンＢ（シグマ社製）、0.7％アガロースを含むP
DS 3.0mlを重層し、30℃で４日間放置し、プレート上に
出現したコロニー12株（PHB-1〜PHB-10）をランダムに
ピック・アップし、それぞれ100mlの大豆油培地（3％大
豆油、0.5％酵母エキス、0.3％ NaNO3、0.1％ K2HPO4、
0.05％ KCl、0.05％ MgSO4・7H2O、0.003％ CuSO4・5H
2O、0.001％ FeSO4・12H20）に接種し、30℃で7日間もし
くは10日間振とう培養し、得られた培養物をろ過し菌体
を除去した。
【００８６】得られた培養液について、ＢＯ活性を測定
した結果を表２に示す。
した結果を表２に示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】尚ここでH-1株は、形質転換ベクターpH4を
用いて得られた形質転換体である。この様に、pH4によ
る形質転換体はほとんどビリルビン・オキシダーゼを生
産しないのに対し、pHBC1による形質転換体12株のうち
ほとんどの株は明かに多量のビリルビン・オキシダーゼ
を生産しているのがわかる。最も生産性の高い株は、こ
れまでのビリルビン・オキシダーゼ生産菌ミロセシウム
・ベルカリアMT-1の約5.4倍の生産性を示した。
用いて得られた形質転換体である。この様に、pH4によ
る形質転換体はほとんどビリルビン・オキシダーゼを生
産しないのに対し、pHBC1による形質転換体12株のうち
ほとんどの株は明かに多量のビリルビン・オキシダーゼ
を生産しているのがわかる。最も生産性の高い株は、こ
れまでのビリルビン・オキシダーゼ生産菌ミロセシウム
・ベルカリアMT-1の約5.4倍の生産性を示した。
【００８９】また、これらの形質転換体の培養ろ液につ
いて、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ミ
ロセシウム・ベルカリアMT-1のビリルビン・オキシダー
ゼと同様の分子量の蛋白質が分泌されていることを確認
した。さらにウエスタン・ブロッティング解析により、
この蛋白質がミロセシウム・ベルカリアMT-1のビリルビ
ン・オキシダーゼに対する抗体と反応することを確認し
た。
いて、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ミ
ロセシウム・ベルカリアMT-1のビリルビン・オキシダー
ゼと同様の分子量の蛋白質が分泌されていることを確認
した。さらにウエスタン・ブロッティング解析により、
この蛋白質がミロセシウム・ベルカリアMT-1のビリルビ
ン・オキシダーゼに対する抗体と反応することを確認し
た。
【００９０】実施例５ ミロセシウム・ベルカリアMT-1
のＢＯの酵母サッカロマイセス・セレビシエでの発現 酵母サッカロマイセス・セレビシエに対する形質転換−
発現プラスミドを構築するため、pBC1を制限酵素HindII
Iで処理後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳
動に供し、ＢＯ発現カセットである約2.9-kb HindIII断
片を単離・精製した。このＤＮＡ断片をサッカロマイセ
ス・セレビシエに対する形質転換ベクターpL1［Biosci.
Biotech. Biochem., 56, 315-319（1992）］のHindIII
部位にクローニングし、pLBC2を得た（図６）。
のＢＯの酵母サッカロマイセス・セレビシエでの発現 酵母サッカロマイセス・セレビシエに対する形質転換−
発現プラスミドを構築するため、pBC1を制限酵素HindII
Iで処理後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳
動に供し、ＢＯ発現カセットである約2.9-kb HindIII断
片を単離・精製した。このＤＮＡ断片をサッカロマイセ
ス・セレビシエに対する形質転換ベクターpL1［Biosci.
Biotech. Biochem., 56, 315-319（1992）］のHindIII
部位にクローニングし、pLBC2を得た（図６）。
【００９１】次にこのｐＬＢＣ２を用いて、サッカロマ
イセス・セレビシエＳＨＹ２（ＡＴＣＣ ４４７７０）
を、伊藤らの方法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５
３，１６３−１６８（１９８３）］で形質転換した。選
択培地に生育してきた形質転換体１株をピック．アップ
し、２０ｍｇ／Ｌのウラシル、２０ｍｇ／Ｌのトリプト
ファン、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジンを含む最小培地［２
％グルコース、０．６７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅ
ｎｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ（Ｄｉ
ｆｃｏ）］５０ｍｌに接種し、３０℃で２４時間振とう
培養した。得られた培養液１ｍｌを、０．００３％のＣ
ｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含むＹＰＧａｌ培地（２％ガラク
トース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）５０ｍｌ
に接種し、３０℃で４８時間振とう培養し、得られた培
養物を遠心分離し菌体を除去した。
イセス・セレビシエＳＨＹ２（ＡＴＣＣ ４４７７０）
を、伊藤らの方法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５
３，１６３−１６８（１９８３）］で形質転換した。選
択培地に生育してきた形質転換体１株をピック．アップ
し、２０ｍｇ／Ｌのウラシル、２０ｍｇ／Ｌのトリプト
ファン、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジンを含む最小培地［２
％グルコース、０．６７％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅ
ｎｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ（Ｄｉ
ｆｃｏ）］５０ｍｌに接種し、３０℃で２４時間振とう
培養した。得られた培養液１ｍｌを、０．００３％のＣ
ｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含むＹＰＧａｌ培地（２％ガラク
トース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）５０ｍｌ
に接種し、３０℃で４８時間振とう培養し、得られた培
養物を遠心分離し菌体を除去した。
【００９２】得られた培養液について、ＢＯ活性を測定
した結果、プラスミドpLBC2を有する形質転換体の場合
0.032 U/mlであった。対照としてpL1を有するサッカロ
マイセス・セレビシエSHY2株を用い、上記と同様にして
培養し、ＢＯ活性を測定したところ、0.004U/mlであっ
た。
した結果、プラスミドpLBC2を有する形質転換体の場合
0.032 U/mlであった。対照としてpL1を有するサッカロ
マイセス・セレビシエSHY2株を用い、上記と同様にして
培養し、ＢＯ活性を測定したところ、0.004U/mlであっ
た。
【００９３】この様に、pL1による形質転換体はほとん
どＢＯを生産しないのに対し、pLBC2による形質転換体
は明かにＢＯを生産しているのがわかる。また、この形
質転換体の培養ろ液についてウエスタン・ブロッティン
グ解析を行ったところ、この蛋白質がミロセシウム・ベ
ルカリアMT-1のＢＯと同様の分子量を示す位置にバンド
が検出された。
どＢＯを生産しないのに対し、pLBC2による形質転換体
は明かにＢＯを生産しているのがわかる。また、この形
質転換体の培養ろ液についてウエスタン・ブロッティン
グ解析を行ったところ、この蛋白質がミロセシウム・ベ
ルカリアMT-1のＢＯと同様の分子量を示す位置にバンド
が検出された。
【００９４】
【発明の効果】本発明によれば、産業上有用な酵素、ホ
ルモン、生理活性ペプチドもしくは蛋白質を糸状菌によ
り大量に製造することが可能となった。また、同時に酵
母によっても発現せしめることができ、機能改変ポリペ
プチドの創製を企図する蛋白工学的手法の適用が容易と
なり、産業上寄与するところ大である。
ルモン、生理活性ペプチドもしくは蛋白質を糸状菌によ
り大量に製造することが可能となった。また、同時に酵
母によっても発現せしめることができ、機能改変ポリペ
プチドの創製を企図する蛋白工学的手法の適用が容易と
なり、産業上寄与するところ大である。
【図１】プラスミドpY1の制限酵素地図を示す。
【図２】プラスミドpY1の構築手順を示す。
【図３】プラスミドpBC1の構築手順を示す
【図４】プラスミドpNBC1の構築手順を示す。
【図５】プラスミドpHBC1の構築手順を示す。
【図６】プラスミドpLBC2の構築手順を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (4)
- 【請求項１】糸状菌および酵母で機能するペニシリウム
・カマンベルチィー（ＦＥＲＭ Ｐ−１０４５２）のモ
ノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子のプロモ
ーターを有し、ターミネーターとして、ペニシリウム・
カマンベルチィー（ＦＥＲＭ Ｐ−１０４５２）のモノ
およびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子のターミネ
ーターを有し、大腸菌で複製および選択可能なＤＮＡ領
域を有する糸状菌および酵母で使用可能なポリペプチド
発現用プラスミド。 - 【請求項２】 ポリペプチドをコードするＤＮＡをプロ
モーター及びターミネーターの間に有する請求項１記載
のプラスミド。 - 【請求項３】ポリペプチドがビリルビン・オキシダーゼ
である請求項２記載のプラスミド。 - 【請求項４】請求項２記載のプラスミドを、形質転換ベ
クターを用いて糸状菌もしくは酵母に導入し、得られた
形質転換体を培養することよりなるポリペプチドの製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06264593A JP3383341B2 (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | 糸状菌および酵母で使用可能なポリペプチド発現用プラスミドおよびそれを用いたポリペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06264593A JP3383341B2 (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | 糸状菌および酵母で使用可能なポリペプチド発現用プラスミドおよびそれを用いたポリペプチドの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06245777A JPH06245777A (ja) | 1994-09-06 |
| JP3383341B2 true JP3383341B2 (ja) | 2003-03-04 |
Family
ID=13206283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06264593A Expired - Fee Related JP3383341B2 (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | 糸状菌および酵母で使用可能なポリペプチド発現用プラスミドおよびそれを用いたポリペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3383341B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1499709B1 (en) * | 2002-04-22 | 2012-01-04 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Promoter and plasmid system for genetic engineering |
-
1993
- 1993-02-26 JP JP06264593A patent/JP3383341B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06245777A (ja) | 1994-09-06 |
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