JP2003507075A

JP2003507075A - Ｄ−グルコノラクトンオキシダーゼ遺伝子および組換えｄ−グルコノラクトンオキシダーゼの製造方法

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Publication number: JP2003507075A
Application number: JP2001518885A
Authority: JP
Inventors: アンドレイミアスニコフ、; トゥオマスサルスヤルヴィ、; ヘイッキオヤモ、
Original assignee: ダニスコカルターアメリカ、インコーポレイテッド
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2003-02-25
Also published as: EP1204762A4; AU7062700A; EP1204762A1; CA2381710A1; KR20020040783A; AU776922B2; CN1379822A; WO2001014574A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｄ−グルコノラクトンの変換によるエリソルビン酸の製造に有用な酵素Ｄ−グルコノラクトンオキシダーゼ（Ｄ−ＧＬＯ）をコード化する核酸分子の分離に関する。天然型Ｄ−ＧＬＯの酵素活性を保持するコード化タンパク質や、上記核酸分子の各種変種も本発明に包含される。適切な発現ベクターによって形質転換された各種宿主細胞において、本発明の核酸を利用してＤ−グルコノラクトンオキシダーゼを製造する組換え方法が好ましい。グルコースの変換および特に、Ｄ−グルコノラクトンのエリソルビン酸への変換のプロセスにおいて、本発明のＤ−ＧＬＯを利用する方法も意図されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、エリソルビン酸および関連する塩の製造方法において有用な酵素で
あって、Ｄ−グルコノラクトンオキシダーゼをコード化する新規核酸分子に関す
る。

【０００２】エリソルビン酸はアスコルビン酸のＣ−５エピマーであり、抗酸化活性を含め
て実質的に同一の化学的特性を有する。しかし、エリソルビン酸のビタミンＣ活
性はアスコルビン酸と比べて非常に低く、実際の使用では、ビタミンとは見なさ
れない。エリソルビン酸はＧＲＡＳの地位を有し、食品や他の多くの用途で抗酸
化剤として使用される。エリソルビン酸製造で現在使用されている化学的方法は
、２−ケトグルコン酸のエステル化と、それに続くエステルの塩基性触媒環化に
よりエリソルビン酸ナトリウムを産生することに基づいている。

【０００３】ペニシリウム属に属するある野生種の菌類が、グルコースで培養した場合に少
量のエリソルビン酸を生成することが１９６０年代から知られている［Ｙａｇｉ
Ｊ．ら．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３１（３）３４０−３
４５（１９６７）］。広範な化学的突然変異誘起／選択プログラムを通じて、グ
ルコースを最大４０％の収率でエリソルビン酸に変換可能なペニシリウムナタ
タム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｎｏｔａｔｕｍ）菌株が分離された［Ｓｈｉｍ
ｉｚｕＫ．ら．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ３１（３）３４
６−３５２（１９６７）］。しかし、変換を完了させるのに必要な発酵時間が非
常に長いため（１−２週間）、このプロセスの産業への応用は非実用的であった
。

【０００４】ペニシリウムのグルコース−エリソルビン酸経路の酵素学に関するその後の研
究により、経路が２つの反応より成ることが確認された［Ｔａｋａｈａｓｈｉ
Ｔ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
１１，１１５７−１１７１（１９６９）］。第一の反応は、周知の、グルコー
スオキシダーゼによるグルコースのグルコノラクトンへの酸化である。この経路
における第２の反応は、エリソルビン酸および過酸化水素を生成するＤ−グルコ
ノラクトンの酸素分子による酸化である。この反応は、数個の菌類でのみ検出さ
れる酵素である、Ｄ−グルコノラクトンオキシダーゼ（Ｄ−ＧＬＯ）によって触
媒される。Ｔａｋａｈａｓｈｉと共同研究者［ＴａｋａｈａｓｈｉＴ．らＡ
ｇｒｉｃＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４０，１２１−１２９（１９７６）］は、
ペニシリウムシアネオフルバム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｙａｎｅｏｆｕ
ｌｖｕｍ）の菌株（後にペニシリウムグリセオロゼアム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍｇｒｉｓｅｏｒｏｓｅｕｍ）ＡＴＣＣ１０４３として再分類）由来のＤ
−ＧＬＯの基本的な酵素特性を決定している。

【０００５】経済的に許容可能な値段でグルコースをエリソルビン酸に直接変換することに
関係する問題は、未解決のままである。本発明は、エリソルビン酸およびその塩
を製造するバイオテクノロジープロセスで有用なＤ−ＧＬＯをコード化する、分
離された核酸を提供する。

【０００６】本発明は、エリソルビン酸および関連する塩の製造に有用な酵素Ｄ−グルコノ
ラクトンオキシダーゼ（Ｄ−ＧＬＯ）をコード化する核酸分子の分離および同定
に関する。

【０００７】したがって１つの実施形態において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（ｃ
ＤＮＡ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２（コード化）およびＳＥＱＩＤＮＯ：３
（成熟）によって定義される、新規に分離された核酸分子に関する。本発明はさ
らに、ストリンジェントな条件下で、ＳＥＱＩＤ．ＮＯＳ．１−３のいず
れか１つにハイブリダイズする核酸分子を包含する。

【０００８】本発明の別の実施形態において、本明細書で示す核酸分子のいずれか１つを含
むベクターも、そのようなベクターによって形質転換される宿主細胞と同様に提
供される。Ｄ−ＧＬＯを生成する同定された核酸を用いた組換え方法も本発明に
よって包含される。

【０００９】本発明のさらに別の実施形態は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４によって示されるタン
パク質および７０％以上の配列がＳＥＱＩＤＮＯ：４と同一であるタンパク
質を含む、本明細書で示す核酸分子によってコード化されるＤ−ＧＬＯタンパク
質に関する。

【００１０】本発明の別の実施形態において、本発明のＤ−ＧＬＯを用いたグルコースおよ
び／またはＤ−グルコノラクトンの変換によって、エリソルビン酸および関連す
る塩を製造する方法も提供される。

【００１１】本発明は、菌類起源のＤ−ＧＬＯをコード化する、分離された核酸分子に関す
る。菌類は、たとえばペニシリウムグリセオロゼアム、ペニシリウムナタタ
ム、ペニシリウムシアネウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｙａｎｅｕｍ）お
よびペニシリウムデカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｄｅｃｕｍｂｅｎ
ｓ）などのペニシリウム属である。本明細書で使用されているように「Ｄ−グル
コノラクトンオキシダーゼ」（Ｄ−ＧＬＯ）という語は、菌類Ｄ−ＧＬＯの天然
型または人工型のいずれかの変種に関し、それらを含む。たとえば、菌類Ｄ−Ｇ
ＬＯをコード化する本発明の核酸分子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：２またはＳＥＱＩＤＮＯ：３の配列を持つことが可能である；ま
たはストリンジェントな条件下で、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：２またはＳＥＱＩＤＮＯ：３の配列を持つ、分離された核酸分子にハイ
ブリダイズする配列を持つことが可能である；またはＳＥＱＩＤＮＯ：４で
示されるアミノ酸配列に比較した場合、約７０％以上同一の配列を持つタンパク
質をコード化する配列を持つことが可能である。約７０％以上のアミノ酸配列の
同一性は、プログラムのデフォルトパラメータ（マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２
；ギャップ存在コスト＝１１、ギャップ拡張コスト＝１）を用いた検索で、イン
ターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ／ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ｅｇｉ−ｇｉｎ／ＢＬＡＳＴで実装可能なＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって示
される陽性のパーセンテージとして定義できる。

【００１２】さらに詳細には、本発明の核酸分子は、欠失、挿入、付加および変異などの、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２およびＳＥＱＩＤＮＯ：
３の変形を含み、そのような配列は、天然型Ｄ−ＧＬＯの酵素活性、すなわちＤ
−グルコノラクトンをエリソルビン酸に変換する能力を保持するタンパク質をコ
ード化する。

【００１３】本発明のそのような核酸分子を含むベクターおよび形質転換宿主細胞または遺
伝子導入生物も、本発明の範囲内に含まれる。「ベクターまたは発現ベクター」
とは、これに限定されるわけではないが、原核若しくは真核細胞または生物での
発現を目的とする調節要素またはレポータ遺伝子を含む核酸分子またはウィルス
を意味する。「形質転換宿主細胞」とは、分子生物学的技法によって好ましくは
菌類源から、最も好ましくはペニシリウム属からＤ−ＧＬＯをコード化する核酸
が導入された宿主細胞（若しくは、その祖先において導入がなされた宿主細胞）
を意味する。細胞内に導入された後、この核酸は染色体外に存在するか、宿主ゲ
ノム内に組込まれる。広範にわたる宿主細胞において、本発明の核酸分子によっ
てコード化されるＤ−ＧＬＯタンパク質を発現および分泌させるために、本発明
の核酸分子が望ましいプロモータに作動可能に結合されて配置された発現ベクタ
ーを作成することは、当業者には日常的である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら，（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄＭａｎｉ
ａｔｉｓ，Ｔ．，第２版（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）。

【００１４】本発明を実施するのに有用な宿主細胞は、形質転換手順に適した入手可能など
の宿主細胞でもよい。たとえば、エッシェリシア、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉ
ａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸菌
またはシュードモナス属に属する細菌などの、細菌細胞は使用できる。酵母も宿
主細胞として使用可能であり、たとえばサッカロマイセス、クリュイベロマイセ
ス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピッチア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ、
カンジダ菌、シュワンニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属に属す
る酵母も用い得る。

【００１５】たとえばシネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ）、クラミドモナス
およびユーグレナ属などの単細胞藻類も使用できる。それより高等な植物細胞も
、本発明の分離された核酸によって形質転換できる。そのままのＤＮＡによって
、または外来遺伝子に作動可能に結合して植物中で機能するプロモータを含むベ
クターによって植物細胞を形質転換する方法は、当業界で周知である。植物の例
としては、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、サトウダイコンなどが
挙げられる。哺乳類細胞も宿主細胞として使用できる。発現ＧＬＯは培地、また
は空胞、葉緑体、ミクロソーム、ペルオキシソームなどの細胞小器官の１つを指
向することが好ましい。

【００１６】「核酸または核酸分子」という語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成（た
とえば化学合成または修飾）ＤＮＡを含む、ＲＮＡとＤＮＡの両方を意図する。
本発明の核酸分子は、二重鎖でも単鎖でもよい。単鎖の場合、核酸はセンス鎖ま
たはアンチセンス鎖でもよい。「分離された核酸」という語は、プラスミドまた
はウィルスなどの非天然型配列によってフランキングされる核酸も指す。したが
って核酸は、コード化配列に隣接している５’非コード化（たとえばプロモータ
）配列を含まないか、一部またはすべてを含むことがある。したがってこの語は
たとえば、自律的複製プラスミド若しくはウィルスを含むベクター内に組み込ま
れるか、またはペニシリウム以外の原核若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に組
み込まれるか、あるいは他の配列とは無関係な独立分子（たとえばｃＤＮＡ、ま
たはＰＣＲ若しくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されたゲノムＤＮ
Ａフラグメント）として存在する組換えＤＮＡを含む。この語は、付加的なポリ
ペプチド配列もコード化するハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡまた
はＲＮＡも含む。さらにこの語は、フラグメントとして天然には産出せず、自然
状態では発見されない核酸フラグメントを含むことになっている。

【００１７】これらの組換え核酸はさらに、各種の組換え宿主におけるＤ−ＧＬＯコード化
配列の転写を増進、調節または修飾する各種の配列；すなわち構造性または調節
プロモータ、転写エンハンサ及びターミネータ、並びに転写抑制因子の結合、ア
テニアーションまたはアンチアテニエーションなどの既知の機構によってＤ−Ｇ
ＬＯの発現を調節する他の配列を含むことがある。

【００１８】「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、厳密と見なされ、
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら，（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｅ．Ｆ．，ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，第２版（１９８９）Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）で述
べられているような低塩および高温の条件下で、溶液または固体担体中で核酸が
ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはＳＥＱＩＤＮＯ：
３の核酸と安定で、配列特異的な非共有結合を形成する条件を意味する。たとえ
ば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１などの参照核酸はニトロセルロースフィルタに固定
化することが可能であり、０．２ｘＳＳＣ（１．７５ｇ／ｌＮａＣｌ、０
．８８ｇ／ｌクエン酸ナトリウムニ水和物；ｐＨ７．０）および０．１％（ｗ
／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムの存在下で、６８℃において、固定化参照核酸に
特異的且つ非共有的に結合される他の核酸は、ストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズされると見なされる。

【００１９】本発明の核酸分子によって形質転換された宿主細胞から得られるＧＬＯ調製物
またはＤ−ＧＬＯタンパク質も、本発明の範囲内に含まれる。本発明の核酸分子
によって形質転換される宿主細胞は培養可能であり、Ｄ−ＧＬＯは培養細胞から
回収し得る。Ｄ−ＧＬＯは分泌または宿主細胞内で発現される；Ｄ−ＧＬＯコー
ド化領域全体またはコード化領域の一部は、追加の修飾を行わずに、または開始
コドン或いはオリゴヒスチジン配列などの各種のＣ−およびＮ−末端延長を加え
た後に、発現可能である。Ｄ−ＧＬＯの酵素活性を保持するような、Ｄ−ＧＬＯ
と他のタンパク質との融合体は、本明細書で示すＤ−ＧＬＯ関連タンパク質すべ
ての変異形と同様に、本発明の範囲内である。これらの変異形はランダムまたは
指向性突然変異誘起によって得られる。Ｄ−ＧＬＯを活性を持つ、そのようなタ
ンパク質の調製物は、粗生成物のまま、または精製して溶液中で使用するか、当
業界で既知の各種担体に固定される。同様に、前記タンパク質を発現する組換え
宿主細胞を用いて、宿主の発酵中に、あるいは宿主の休止状態においてさえ、Ｄ
−グルコノラクトンのエリソルビン酸への変換を触媒することができる。特筆す
べきは、本発明の殺された組換え宿主細胞も、グルコースおよび／またはＤ−グ
ルコノラクトンのエリソルビン酸への変換におけるＤ−グルコノラクトン酸化の
触媒として使用できる。詳細には、グルコースは、グルコースオキシダーゼまた
はグルコースデヒドロゲナーゼの存在下でＤ−グルコノラクトンに変換すること
ができる；Ｄ−グルコノラクトンは次に、エリソルビン酸生成に十分な時間と条
件下で、Ｄ−グルコノラクトン基質を本発明のＤ−ＧＬＯと接触させることによ
って、エリソルビン酸に変換することができる。Ｄ−グルコノラクトンは、本発
明のＤ−ＧＬＯの基質として、グルコン酸の化学変換によって、またはグルコー
スオキシダーゼ若しくはグルコースデヒドロゲナーゼによるグルコースの変換に
よって調製できる。それゆえＤ−グルコノラクトンは、エリソルビン酸生成に十
分な条件下で十分な時間、該基質をＤ−ＧＬＯに接触させることによってエリソ
ルビン酸に変換される。

【００２０】全長Ｄ−ＧＬＯコード化配列は、修飾なしで使用されるか、当業界で周知の方
法によって修飾して使用される。たとえば、Ｎ−またはＣ−末端アミノ酸配列は
削除されるか、適切な宿主におけるＤ−ＧＬＯの分泌を改良する各種の既知のプ
レ−またはプレプロ−ペプチド（シグナルペプチド）によって置換される。Ｄ−
ＧＬＯポリペプチドのソーティングおよびターゲティングを調節する他の各種ア
ミノ酸配列は、全長Ｄ−ＧＬＯまたはＧＬＯ活性を有するＤ−ＧＬＯコード化配
列の一部に融合できる。

【００２１】本発明のＤ−ＧＬＯも、融合タンパク質として発現させることができる。特に
、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼなどの、補助および／または関連酵素活
性などを提供するタンパク質ドメインに融合することができる。

【００２２】同様にＤ−ＧＬＯは、特定のリガンドに対する高い親和性（たとえばストレプ
トアビジン、マルトース結合タンパク質、セルロースおよび他の多糖類結合ドメ
イン）、または融合タンパク質の向上した安定性および／または溶解性など（た
とえばスーパーオキシドディスムターゼまたはグルタチオニンＳ−トランスフェ
ラーゼ）の、他の既知の有用な機能を提供するドメインに融合することができる
。

【００２３】エリソルビン酸は、好ましくは糸状菌類（たとえばアスペルギルスまたはペニ
シリウム属に属する菌類）、または高い分泌能力を持つ酵母種（たとえばＰｉｃ
ｈｉａまたはハンセヌラに属する酵母）などの適切な宿主細胞内での、グルコー
スをエリソルビン酸に変換する酵素プロセスにおいて、本発明の組換えＤ−ＧＬ
Ｏを主要な要素として用いて製造できる。Ｄ−ＧＬＯ以外に、このようなプロセ
スは、好ましくはグルコースオキシダーゼ（または、グルコースデヒドロゲナー
ゼ、ヘキソースオキシダーゼまたはピラノースオキシダーゼなどの、重複特異性
を持つ酵素）およびカタラーゼを含む２個以上の他の酵素を含み得る。グルコー
スオキシダーゼおよびＧＬＯに基づくプロセスの基礎を成す化学反応のシーケン
スを図３に示す。簡潔に言えば、グルコースは分子状酸素によってＤ−グルコノ
−δ−ラクトンに酸化される。この反応はグルコースオキシダーゼ（またはヘキ
ソースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼな
ど）によって触媒され、副生成物として過酸化水素を生成する。Ｄ−ＧＬＯは続
いて、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンのエリソルビン酸への変換を触媒する。この
反応でも分子状酸素が消費され、過酸化水素が形成される。水溶液中のＤ−グル
コノ−δ−ラクトンは、グルコン酸およびＤ−グルコノ−γ−ラクトンと平衡状
態にあることが既知である。Ｄ−グルコノ−γ−ラクトンも、Ｄ−ＧＬＯの基質
である。両方のＤ−グルコノラクトンはＧＬＯによって同じ生成物、すなわちエ
リソルビン酸に酸化される。グルコノラクトン加水分解の自発的反応は比較的遅
く、反応混合物中のＧＬＯおよび分子状酸素の濃度が十分に高い場合、該加水分
解反応は最小限になる。さらに、本反応は可逆的であるため、グルコン酸は最終
的に、エリソルビン酸に酸化することが可能なラクトンを生成する。グルコース
オキシダーゼが触媒する反応とＤ−ＧＬＯが触媒する反応はどちらも、副生成物
として過酸化水素を生成する。過酸化水素は反応性の高い物質で、プロセスに関
与する酵素を不活性化することができる。したがって、過酸化水素は反応混合物
から連続的に除去する必要がある。過酸化水素を除去する好ましい方法は、カタ
ラーゼの使用による。スーパーオキシドディスムターゼなどの、各種の活性酸素
種を除去する他の既知の捕捉剤の使用も本発明の実施に有利である。

【００２４】グルコースデヒドロゲナーゼをグルコースのグルコラクトンへの変換を触媒す
るのに使用する場合、過酸化水素の除去は、グルコースデヒドロゲナーゼ触媒反
応で消費されるＮＡＤ＋の再生に結びつけることができる。図４は、本発明のこ
の特定の実施の反応方式全体を示す。本発明によるグルコースのエリソルビン酸
への好ましい変換方法は、１個の反応器内で、グルコースの酸化およびグルコノ
ラクトンの酸化が同時に進行するプロセス全体を実施することである。しかし、
グルコースのグルコノラクトンへの変換およびグルコノラクトンのエリソルビン
酸への変換が個別に行われるような実施も許容できる。本発明の組換えＤ−ＧＬ
Ｏを用いたエリソルビン酸の製造に、グルコノラクトン、グルコン酸またはその
２つの混合物を開始物質として使用することも申し分ない。

【００２５】本発明のＤ−ＧＬＯ核酸は、グルコースをグルコノラクトンにすでに変換する
ことのできる宿主内で発現させることも可能である。当業界では、このような微
生物宿主が多数知られている。通常、そのような微生物（たとえばアスペルギル
スおよびペニシリウム属に属する多くの菌類種）はグルコースオキシダーゼまた
はグルコースデヒドロゲナーゼを用いて、グルコースをグルコノラクトンに酸化
する。膜結合グルコースデヒドロゲナーゼを生成する複数の属に属する多くの細
菌種が適している。十分に高レベルのカタラーゼも発現する宿主を選択するのも
有利である。ＧＬＯを発現するそのような組換え宿主を、グルコース含有培地上
で発酵させると、エリソルビン酸がグルコースから直接得られる。

【００２６】さらに、本発明の組換えＤ−ＧＬＯ発現宿主は、グルコースオキシダーゼ、グ
ルコースデヒドロゲナーゼおよび／またはカタラーゼを発現する異なった宿主と
共培養することができる。本実施形態において、エリソルビン酸は１ステップ混
合発酵で製造できる。

【００２７】グルコースのエリソルビン酸への直接発酵には、２種類の組換え宿主、すなわ
ち酵母と糸状菌類が特に適している。

【００２８】この点に関して、実施例９はＤ−ＧＬＯ遺伝子がピッチアパストリス（Ｐｉ
ｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母内で効率的に発現されることを示して
いる。外来タンパク質の十分な分泌をサポートすることが知られている他の酵母
宿主、たとえばハンセヌラポリモルファまたはクリュイベロマイセスマルキ
アナス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ）も使用できる。実
施例９で使用される発現系は、グルコース抑制プロモータに基づいているため、
グルコースをエリソルビン酸に発酵させる組換え宿主の作成にはあまり適してい
ない。しかし、グルコースによって抑制されない強力なプロモータに基づくＰ．
ｐａｓｔｏｒｉｓの同様に有効な発現系、たとえばＳｔｒａｔａｇｅｎｅの発
現ｐＧＡＰＺベクターシリーズに基づく発現系などが知られており、そのような
宿主の作成に使用し得る。解糖遺伝子の他のプロモータも使用できる。

【００２９】ＧＬＯ遺伝子の発現に加えて、本発酵プロセスで使用される組換え酵母宿主も
、グルコースオキシダーゼを発現し、たとえばアスペルギルスニガー由来のグ
ルコースオキシダーゼは酵母内で効率的に発現することが知られている（Ｄｅ
ＢａｅｔｓｅｌｉｅｒＡ．ら，Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆａｙｅ
ａｓｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎＡ．ｎｉｇｅｒｇｌｕｃｏｓｅｏｘｉｄａ
ｔｅ．．．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９，５５９−５６１（１９９１）。
また、優先的に分泌されるカタラーゼの遺伝子の過剰発現は、グルコースをエリ
ソルビン酸に発酵させる酵母宿主の、非常に有用なもう１つの遺伝的な形質であ
る。

【００３０】酵母宿主に対して、多くの野生種糸状菌類は高レベルのグルコースオキシダー
ゼおよびカタラーゼを発現する。したがって、これら２つの酵素をコード化する
遺伝子の遺伝子組換えによる過剰発現は、酵母宿主の場合ほど必須ではない。Ｄ
−ＧＬＯの（過剰）発現の場合、高度に発現される解糖遺伝子のプロモータが適
している。たとえば菌類ＴＥＦ１プロモータなどの、グルコースでの培養中に高
い活性を保持する他のプロモータも使用できる。

【００３１】酵母とは異なり、多くの糸状菌類はグルコノラクトナーゼを生成する。たとえ
ば通気の良い状態で培養したアスペルギルスニガーでは、グルコノラクトナー
ゼレベルはきわめて高い（ＷｈｔｔｅｖｅｅｎＣ．Ｆ．Ｂ．，ら．Ｉｎ
ｄｕｃｔｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｅｏｘｉｄａｔｅ，ｃａｔａｌａｓｅ
ａｎｄｌａｃｔｏｓｅｉｎＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ，Ｃ
ｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２４，４０８−４１６（１９９３））。グルコノ
ラクトナーゼは共通の基質であるグルコノ−δ−ラクトンに対してＧＬＯと競合
し、そのためにグルコースのエリソルビン酸への変換を阻害する。したがってグ
ルコノラクトナーゼは不活性化されることが望ましい。不活性化は、グルコノラ
クトナーゼ遺伝子の突然変異による遺伝子的手段によって、あるいはＧＬＯでは
なくグルコノラクトナーゼを選択的に阻害する発酵状態を選択することによって
行える。不活性化を実施する１つの好ましい方法は、グルコノラクトナーゼの選
択的阻害剤を発酵培養液に加えることである。

【００３２】本発明の別の実施形態において、エリソルビン酸は、グルコノラクトン、グル
コン酸またはこれら２つの基質の混合物から、十分に高いレベルの組換えＤ−Ｇ
ＬＯを発現する微生物宿主を用いてそれぞれを発酵させることによって製造され
る。

【００３３】本発明は、これに限定されるわけではないが、以下の例によってさらに説明さ
れる。

【００３４】（実施例１）Ｇｌｏ活性ＧＬＯの活性は、基質としてグルコノ−δ−ラクトン、グルコノ−γ−ラクト
ン（Ｄ−グルコノラクトン）およびグルコン酸の平衡混合物を用いて測定した。
この混合物は、結晶性グルコノ−δ−ラクトンを水に５０％の濃度（ｗ／ｖ）に
溶解し、５０℃にて数日放置して調製した。反応は、２ｍＭのヒドロキシキノリ
ン、１２μＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノールおよび７０ｍＭの
基質を含む、５０ｍＭバイフタル酸カリウム緩衝液、ｐＨ５．６中で行った。２
，６−ジクロロフェノールインドフェノールおよび基質は両方とも、測定の直前
に原液の形で反応溶液に加えた。実験で使用される基質溶液のアリコートは、ま
た、使用直前にｐＨ５．８に迅速に調整した。酵素反応に続いて、エリソルビン
酸による２，６−ジクロロフェノールインドフェノールの減少によって引き起こ
された６００ｎｍにおける吸収の時間経過を記録した。検定前に酵素溶液を２分
間煮沸させた点だけが反応溶液と異なる対照も含めた。反応で生じたエリソルビ
ン酸の量は、既知量のエリソルビン酸を反応混合物に加えて求めた検量線を用い
て計算した。活性は上述の条件下で、３０℃にて１分間に生成されたエリソルビ
ン酸のμｍｏｌｅとして表した。

【００３５】（実施例２）Ｐ．グリセオロゼアムによる均質なＧＬＯの精製Ｐ．グリセオロゼアム菌株ＡＴＣＣ１０４３１由来のＧＬＯは、以前発表さ
れた方法（ＴａｋａｈａｓｈｉＴ，らＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．４０，１２１−１２９（１９７６））に似た手順を用いて均質になるまで
精製した。

【００３６】複数個の２リットルエルレンマイヤーフラスコに２００ｍｌづつＹＥＰＤ培
地（２％バクト−ペプトン、１％酵母エキス、２％グルコース）を入れ、ポテト
デキストロース寒天（Ｄｉｆｃｏ）プレートで１週間培養したＰ．グリセオロ
ゼアムの胞子の懸濁液２ｍｌを播種した。培養液は回転振盪器で３０℃にて１８
０ｒｐｍで２日間培養し、この培養物の０．５ｌを用いて１５ｌの発酵槽内の１
０ｌの誘発培地（８％グルコース、０．２％ＫＨ_２ＰＯ_４、０．１％（ＮＨ_４） _２ＳＯ_４、０．１％（ＮＨ_２）_２ＣＯ、０．１％ＮａＮＯ_３、０．１％ＭｇＳＯ _４・７Ｈ_２Ｏ、１％ＭｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００１％ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ
、０．５％ＣａＣＯ_３、ｐＨ５．５）に接種した。細菌汚染の危険を防止するた
めに、クロラムフェニコール（２．５ｍｇ／ｌ）およびテトラサイクリン（３ｍ
ｇ／ｌ）を一部の発酵で用いた。発酵は３０℃にて６０時間進行させた（通気−
５ｌ／分、撹拌−３００ｒｐｍ）。

【００３７】菌糸は焼結ガラスフィルタで濾過して収集し、水と緩衝液Ａ（１０ｍＭリン酸
緩衝液、ｐＨ６．５、０．１ｍＭＥＤＴＡを含む）で洗浄した。細胞は、１ｍ
Ｍフッ化フェニルメチルスルホニルを含む同じ緩衝液中でガラスビーズミルを用
いて破砕した。破砕プロセスはサイクル的に行い、サイクル間とサイクル中に氷
水冷却を用いた。サイクルの長さは、懸濁液の温度を４℃−２２℃の範囲に維持
するように調整し、サイクル数は細胞破壊が９０％以上（顕微鏡による評価）と
なるように調整した。得られたホモジネートは１９０００ｘｇにて３０分間遠心
分離を行い、上清を酵素の精製に使用した。

【００３８】細胞抽出物１リットル当たり約８０ｍｌのＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ
Ｆ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を加え、懸濁液は静かに撹拌しながら４℃にて一晩イ
ンキュベートした。濾過によって樹脂を除去し、濾液は同じ条件下で新しいＤＥ
ＡＥ−ＳＥｐｈａｒａｏｓｅによって処理した。この処理によって、余計なタン
パク質が高い割合で除去されたが、樹脂に吸収されたＧＬＯはわずかな量であっ
た。ＧＬＯは硫酸アンモニウム（６０−１００％飽和）を用いて濾液から沈殿さ
せた。硫酸アンモニウム沈殿物を、緩衝液Ａを数回交換して透析した。透析した
酵素溶液を十分な緩衝液Ａを用いて希釈し、伝導率を１．２５ｍＳとし、同じ緩
衝液を用いて平衡にしたＤＥＤＡ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦのカラム（サンプ
ル１ｍｌ当たり約５ｍｌのカラム床体積）に供した。カラムは緩衝液Ａを用いて
、２８０ｎｍにおける吸収がバックグラウンド値に低下するまで０．１５床体積
／時間にて溶出させ、次いで緩衝液Ａ中のＮａＣｌの直線濃度勾配を用いて溶出
させた（０−１００ｍＭＮａＣｌ、勾配総体積＝２カラム床体積）。有効ピー
ク画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過装置およびＸＭ５０膜を用いて濃縮し
、緩衝液Ａを用いて平衡にしたＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００ＨＲ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）の２００ｃｍカラム上部に供した。カラムは０．５ｃｍ／分の線速
度で溶出させた。ゲル濾過カラムによる有効画分を収集し、緩衝液Ａを用いて平
衡にしたヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−ＧｅｌＨＴ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ
）の上部に加えた。カラム床体積はサンプル体積の０．１３であり、溶出速度は
１分当たり０．１床体積であった。ＧＬＯは緩衝液Ａ中の硫酸アンモニウムの直
線濃度勾配（０−７．５％）を用いてカラムから溶出させた。勾配の総体積は約
３６カラム床体積であった。ＧＬＯの最高活性を有する画分をプールし、プール
をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。見かけの分子量６０−８
０ｋＤａに相当する１個の強力な拡散バンドと約３４ｋＤａにおける非常に弱い
バンドが確認された。代表的な精製実験の結果を表１にまとめる。

【００３９】（実施例３）ＧＬＯのアミノ酸配列分析分析は、ヘルシンキのバイオテクノロジー研究所のタンパク質分析実験室の商
用サービスとして行われた。実施例２の精製ＧＬＯ調製物は、Ｎ−末端配列分析
によって均一であることがわかった。以下のＮ−末端配列が見つかった：Ｔｙｒ
ＡｒｇＴｒｐＰｈｅＡｓｎＴｒｐＧｌｎＰｈｅＧｌｕＶａｌ
ＴｈｒＮｎｎＧｌｎＳｅｒＡｓｐＡｌａＴｙｒＩｌｅＡｌａ
ＰｒｏＨｉｓＡｓｎＧｌｕＨｉｓ．．．（ＳＥＱＩＤＮｏ．：５
）（「Ｎｎｎ」はこの位置に解釈可能な信号が見られなかったことを意味し、こ
のことは非誘導体化されたシステイン残基またはグリコシル化アミノ酸残基の存
在によって最も確実に説明される）。タンパク質はさらに４−ビニルピリジンに
よってアルキル化し、Ｌｙｓ−Ｃ−プロテアーゼによって消化し、逆相ＨＰＬＣ
を用いて消化物から複数のペプチドを分離した。質量分析法によって、以下のペ
プチド配列が決定された：ペプチド１−ＧｌｕＨｉｓＡｓｐＡｒｇＭｅｔＴｈｒＶａｌＣｙ
ｓＧｌｙＰｒｏＨｉｓＰｈｅＡｓｐＴｙｒＡｓｎＡｌａＬｙ
ｓ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）ペプチド２−ＧｌｕＴｙｒＩｌｅＣｙｓＴｙｒＡｓｐＧｌｕＶａ
ｌＴｈｒＡｓｐＡｌａＡｌａＳｅｒＣｙｓＳｅｒＰｒｏＧｌ
ｎＧｌｙＶａｌＶａｌ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）ペプチド３−ＣｙｓＧｌｎＰｈｅＶａｌＡｓｎＧｌｕＰｈｅＬｅ
ｕＶａｌＧｌｕＧｌｎＬｅｕＧｌｙＩｌｅＴｈｒＡｒｇ（ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：８）（実施例４）Ｐ．グリセオロゼアム染色体ＤＮＡの分離Ｐ．グリセオロゼアムは実施例２で述べたように、ＹＥＰＤ培地で培養した
。菌糸は水と緩衝液Ａ（実施例２）で洗浄し、凍結乾燥した。約５０ｇの乾燥菌
糸を液体窒素下の乳鉢で破砕した。細かく破砕した菌糸を５００μｌの抽出緩衝
液（２５０ｍＭＮａＣｌ、２５ｍＭＥＤＴＡ、２００ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ
、ｐＨ８．５、０．５％ＳＤＳ）中で懸濁させ、３５０μｌのフェノールを加え
て、混合物を振盪して均質な懸濁液を生成させた。１５０μｌのクロロホルムを
懸濁液に加えた後、１時間高速で遠心分離にかけた（卓上小型遠心分離機で１３
５００ｒｐｍ）。水相を新しい試験管に移し、１０μｌの１０％リボヌクレアー
ゼＡ溶液を加えた。混合物を３７℃にて１時間インキュベートした。インキュベ
ーション後、１／１０量の５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）を溶液に加
えた後、０．６倍量のイソプロパノールを加えた。ＤＮＡを遠心分離によって回
収し（１０分、１３５００ｒｐｍ）、７０％エタノールで２回洗浄し、真空乾燥
して、１００μｌの水に溶解させた。

【００４０】（実施例５）ＧＬＯをコード化する染色体ＤＮＡのフラグメントのクローニングＧＬＯＳＥＱＩＤＮＯ：５−ＳＥＱＩＤＮＯ：８の部分アミノ酸配
列に基づいて、多数のオリゴヌクレオチドを合成し、テンプレートとしてＰ．
グリセオロゼアムの染色体ＤＮＡ（実施例４）を用いたＰＣＲでプライマーとし
て試験した。

【００４１】ＰＣＲは以下のプログラムを用いて、ＰＴＣ−２５５ＤＮＡＥｎｇｉｎｅ
装置（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ．，米国マサチューセッツ州）で行っ
た；９４℃で２分；１０サイクルの（９４℃で３０秒；５０℃で４５秒；７２℃
で３分）の後、３０サイクルの（９４℃で３０秒；６０℃で４５秒；７２℃で３
分）。各反応は、約２５ｎｇのテンプレートＤＮＡ、０．７５単位のＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム）、０．７５μＭの各オリゴヌクレ
オチドプライマー、２００μＭの４種類それぞれのデオキシヌクレオシド三リン
酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１．５μｌの１０ｘ緩衝
液濃縮物（Ｔａｑポリメラーゼの製造者から供給）を含む１５μｌの溶液中で行
った。ＰＣＲの生成物は、従来技法を用いたアガロースゲル電気泳動によって分
析した［Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃ
ｌｏｎｉｎｇＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
］。

【００４２】１対のオリゴヌクレオチドプライマーから最良の結果が得られた。センスオリ
ゴヌクレオチドＴＡＹＣＧＩＴＧＧＴＴＹＡＡＹＴＧＧＣＡ（ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：９）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドＣＣＩＡＲＹＴＧＹＴＣＩＡＣ
ＩＡＲＲＡＡＹＴＣＲＴＴＩＡＣＲＡＡＹＴＧＲＣＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１
０）。これらの配列において、「Ｉ」はイノシンリン酸残基を、Ｒはアデノシン
およびグアノシンリン酸残基の混合物を、Ｙはチミジンおよびシトシンリン酸残
基の混合物を表す。このオリゴヌクレオチド対によって得られたＰＣＲ生成物（
約１．２ｋｂ）を、アガロースゲル電気泳動によって精製し、ｐＣＲ２．１−Ｔ
ＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に同じ製造者から供給されたＴＯＰ
ＯＴＡクローニングキットを用いてクローニングして、プラスミドｐＣＲ（Ｇ
ＬＯ）を得た。

【００４３】（実施例６）Ｐ．グリセオロゼアムｃＤＮＡライブラリの作成ＧＬＯ生成を誘起する条件（実施例２）下にて無機培地で培養したＰ．グリ
セオロゼアム菌糸から総ＲＮＡを分離した。菌糸（−７０℃にて凍結保存）を液
体窒素下の乳鉢で破砕した。３ｇの細かく破砕した菌糸を１０ｍｌの氷冷ＲＮＡ
抽出緩衝液（４Ｍグアニジンチオシアネート、０．５％ラウリルサルコシンナト
リウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭβ−メルカプトエタノール）
中で激しく振盪して懸濁させた。混合物を４℃にて１００００ｒｐｍ（ＳＳ−３
４ロータ、Ｓｏｒｖａｌｌ）で６分間遠心分離にかけた。１０ｍｌの上澄を新し
い試験管に移し、４ｇのＣｓＣｌを加えた。次のステップで使用するすべての溶
液は、ジエチルピロカーボネート処理水とガラス器具を用いて調製した。ＲＮＡ
含有溶液を１．２ｍｌの５．７ＭＣｓＣｌ、０．１ＭＥＤＴＡ、ｐＨ７の上
に加え、１５℃、３３０００ｒｐｍにて約２０時間遠心分離にかけた。沈殿物を
少量の水で迅速にすすぎ、１００μｌの水に溶解させた。ＯｌｉｇｏｔｅｘＭ
ｉｄｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示どおりに使用して、ｍＲＮＡを
この調製物から分離した。ｃＤＮＡライブラリは、ＳｔｒａｔａｇｅｎのｃＤＮ
Ａ合成キットおよびλＺＡＰ−ｃＤＮＡＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩＧｏｌｄ
クローニングキットを、これらのキットに添付された製造者の指示どおりに使用
して、Ｐ．グリセオロゼアムｍＲＮＡから調製した。

【００４４】（実施例７）Ｐ．グリセオロゼアムｃＤＮＡライブラリからの全長ＧＬＯｃＤＮＡの分離
染色体ＧＬＯ遺伝子の一部を含む１．２ｋｂのＤＮＡフラグメントは、Ｅｃｏ
ＲＩ制限および分取アガロースゲル電気泳動によって、プラスミドｐＣＲ（ＧＬ
Ｏ）（実施例５）から分離した。制限酵素消化、プラスミドＤＮＡおよびＤＮＡ
フラグメントの分離などは、標準遺伝子組換え技法を用いた［Ｍａｎｉａｔｉｓ
，Ｔ．ら．（１９８２）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ］。このフラグメントに、
ＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｄＤＮＡ標識キット（ベーリンガー・マンハイム）
および［αＰ^３２］−ｄＣＴＰを用いて、放射線標識を付けた。

【００４５】実施例６のλ−ファージライブラリをプレーティングし、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅによってλＺＡＰ−ｃＤＮＡＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩＧｏｌｄクローニン
グキットとともに提供されたマニュアルに従って、標識１．２ｋｂフラグメント
を用いてＤＮＡハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。多数の陽
性プラークが同定され、そのうち２０個の組換えファージを精製し、同じマニュ
アルのプロトコルに従ってプラスミド形に変換した。これら２０個のプラスミド
をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いた制限によって分析すると、異なるサイズの
挿入物を持つことがわかった。１個の小型ＤＮＡフラグメントはすべてのプラス
ミドに存在し、このことはすべてのｃＤＮＡクローンが同じ遺伝子に由来するこ
とを示唆した。最大のプラスミド（ｐＧＬＯ１．８と命名）は、約１．８ｋｂサ
イズの挿入物を含んでいた。挿入物全体は、ＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃＢｅｌ．
Ｓ．Ａ．（ベルギー）の商用サービスを用いて配列決定した。配列分析によっ
て、プラスミドｐＧＬＯ１．８の挿入物が、ＧＬＯｃＤＮＡの完全なコード
化領域（１４４３ｂｐ、停止コドンを含む）、７０ｂｐの５’−未翻訳配列およ
び２６１ｂｐの３’−未翻訳配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を含むことが明ら
かになった。この配列は、４８０個のアミノ酸残基のタンパク質をコード化した
（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）。

【００４６】インターネットでＧｅｎＢａｎｋが提供するＢＬＡＳＴサービス（ｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ
／ｎｐｈ−ｎｅｗｂｌａｓｔ？Ｊｆｏｒｍ＝０）を用いて、Ｐ．グリセオロゼ
アムＧＬＯの推定アミノ酸配列を既知のタンパク質アミノ酸配列と比較した。
多数の相同タンパク質配列が同定された。設定された機能を持つタンパク質のみ
を考慮する場合、カンジダ・アルビカンス由来のＤ−アラビノノラクトンオキシ
ダーゼやラット由来のＬ−グロノラクトンオキシダーゼなどの、他のラクトンオ
キシダーゼと最も高い相同性が確認された。

【００４７】Ｐ．グリセオロゼアム（実施例３、ＳＥＱＩＤＮＯ：５）からの精製ＧＬ
Ｏを用いて決定されたＮ−末端アミノ酸配列は、アミノ酸残基２１から開始する
ＧＬＯの推定配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）と同一である。この観察結果と、
翻訳ＧＬＯコード化配列の領域１−２０内の疎水性アミノ酸残基の優勢によって
、Ｐ．グリセオロゼアムＧＬＯがＮ−末端シグナルペプチドを含むことが強く
示唆される。ＧＬＯ内にシグナルペプチドが存在することは、他のラクトンオキ
シダーゼがシグナルペプチドを持たず、分泌することが知られていないため、予
想外であった。さらに、Ｐ．グリセオロゼアムＧＬＯの推定配列は８個の仮想
結合グリコシル化部位を含む。分離ＧＬＯはポリアクリルアミドゲル上に拡散バ
ンドとして現れ、このことはそれが確かに糖タンパク質であることを示唆してい
る。しかし、我々はＰ．グリセオロゼアムの細胞抽出物からＧＬＯを分離してい
る。その本来の宿主においては、ＧＬＯはゴルジ体から細胞内細胞小器官の１つ
に誘導されているか、分泌されているかのどちらかであるが、細胞と結合したま
まであることが考えられる。

【００４８】（実施例８）異種宿主におけるＰ．グリセオロゼアムＧＬＯ遺伝子の発現ＧＬＯの推定配列が分泌タンパク質の多くの特徴を示したため、酵母分泌発現
はクローン化ＧＬＯｃＤＮＡの機能の試験に最も適していると思われる。ＧＬ
Ｏの発現に用いる発現ベクターは、周知の酵母−Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクター
ｐＪＤＢ２０７に基づいている［Ｂｅｇｇｓ．Ｊ．Ｄ．、Ｗｉｌｉａｍｓ
ｏｎＲ．，（編）ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ２，Ａｃａｄ
ｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８１）より］。発現ベクターの作成は２つのステッ
プで行った。最初に、３個のＤＮＡフラグメントを同時に連結してｐＡＣ１０９
を作成した：（１）サッカロマイセスセレヴィシエＰＨＯ５遺伝子のプロ
モータ領域由来０．４５ｋｂＢａｍＨＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩフラグメント（
２）ＭＦα１遺伝子の３’−非コード化領域の１１６ｂｐと、該酵母α因子前
駆体タンパク質のプレプロペプチド（Ｍｆα１−プレプロペプチド）の配列に相
当するコード化領域の一部を含む、サッカロマイセスセレヴィシエＭＦα１
遺伝子由来０．３８ｋｂＨａｅＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（３）
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる制限によって得られたｐＪＤＢ２０７
の約６．５ｋｂフラグメント。第２に、合成ポリリンカをｐＡＣ１０９のＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位に挿入する。

【００４９】ポリリンカは２個のオリゴヌクレオチドから構成された：上部鎖ヌクレオチド
ＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）お
よび下部鎖ヌクレオチドＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧ（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１２）。ＨｉｎｄＩＩＩ部位がＭｆα１プレプロ領域に近接して
配置される方向でポリリンカが挿入されたプラスミドを選択し、ｐＧＴＹと命名
した。

【００５０】テンプレートとしてのプラスミドｐＧＬＯ１．８と、２個のオリゴヌクレオチ
ドプライマー、すなわち「センス」プライマー：ＧＡＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧ
ＧＴＧＧＴＴＣＡＡＴＴＧＧＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１
３）およびＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１４）を用いてＰＣＲを実施し、ＧＬＯ遺伝子のベクター下流で
アニーリングして、クローン化ＧＬＯ遺伝子のＤＮＡ配列をＭｆ α１−プレプ
ロペプチドとの融合を作成するのに適した形に修飾した。このステップで、修飾
はＧＬＯ遺伝子内に導入した。すべての５’−非コード化配列と推定ＧＬＯコー
ド化配列のアミノ酸残基１−２０に相当する配列は削除され、Ｍｆα１−プレプ
ロペプチドおよび成熟ＧＬＯの枠内融合を可能にする位置にＨｉｎｄＩＩＩ部
位が導入された。このＰＣＲ反応の生成物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで
消化し、同じ制限酵素対で消化されたｐＧＴＹを用いて連結した。

【００５１】生じたプラスミドｐＧＴＹ（ＧＬＯ）（図１）は、Ｍｆα１プレプロペプチ
ドおよびＰ．グリセオロゼアムＧＬＯの推定成熟部分（ＳＥＱＩＤＮＯ：１
５）より成る融合タンパク質をコード化する。

【００５２】サッカロマイセスセレヴィシエ菌株ＧＲＦ１８（ＡＴＣＣ６４６６７、遺
伝子型：ＭＡＴα、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ
３−１１、ｈｉｓ３−１５）を、「リチウム」形質転換法を用いてロイシン原栄
養株に形質転換した［ＳｈｅｒｍａｎＦ．ら．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌｆｏｒＭｅｔｈｏｄｓｉｎＹｅａｓｔＧ
ｅｎｅｔｉｃｓｐｐ１２１−１２２，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８６）］。

【００５３】形質転換クローンの１つは、対照として用いるレシピエント菌株と同様に、０
．３ｌＳＣ−ｈｉｓ培地（０．６７％酵母窒素ベースｗ／ｏアミノ酸、Ｄｉｆ
ｃｏ、２％グルコース、１００ｍｇ／１ヒスチジン；非形質転換対照菌株には、
１００ｍｇ／ｌのロイシンも加えた）中で初期定常相（回転振盪器、１８０ｒｐ
ｍ、３０℃）まで培養した。これらの培養物による酵母細胞を用いて、それぞれ
１０ｌの低リン酸塩（ＰＥＰ）培地を含む２つの同一の１５ｌ発酵槽に播種した
。ＰＥＰ培地を調製するために、バクト−ペプトン（Ｄｉｆｃｏ）の８％溶液を
ＣａＣｌ_２（０．４Ｍの濃度まで添加）を用いて、ｐＨ１１および１００℃にて
５分間処理した。ペプトン溶液を室温まで冷却して、ｐＨ５．５に調整し、濾紙
と０．４μｍ孔径の膜で濾過して、リン酸塩枯渇ペプトン原液として使用した。
ＰＥＰ培地は２％のリン酸塩枯渇ペプトン原液と、５％グルコースを含んでいた
。発酵条件は次のとおりであった：撹拌−３００ｒｐｍ、通気−５ｌ／分、ｐＨ
は４ＭＮａＯＨを加えて５．５に維持。培養液のサンプルは適切な間隔で採取
した。細胞密度は、６００ｎｍにおける吸収を測定して追跡した。ＧＬＯ活性は
、遠心分離によって細胞を除去し、セントリプラス膜（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて
培地のサンプルを約５００倍に濃縮して、使い捨てのＥｃｏｎｏＰａｃｋ１０
ＤＧミニカラム（ＢｉｏＲａｄ）を用いたゲル濾過によって発酵培地の低分子
量成分を除去した後に測定した。ＧＬＯのピークレベル（約２．４ｍＵ／ｍｌ）
は、発酵の約６０−７０時間後に検出された。未形質転換レシピエント菌株の対
照発酵には、ＧＬＯ活性は見られなかった。

【００５４】この実験の結果は結論として、プラスミドｐＧＬＯ１．８内のＧＬＯ遺伝子の
ｃＤＮＡクローンが確かに機能していることを示している。サッカロマイセス
セレヴィシエは、外来タンパク質の分泌に関しては比較的非効率的な宿主である
ことが知られている。したがって、ＧＬＯ遺伝子を他の菌類種−より高い分泌可
能性を持つ糸状菌類または他の酵母に導入すれば、組換えＧＬＯがはるかに高い
レベルで発現することが予想される。

【００５５】（実施例９）メタノール資化性酵母におけるＧＬＯ遺伝子の発現ＧＬＯ遺伝子のコード化領域は、オリゴヌクレオチドプライマー：ＣＡＡＡＧ
ＣＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＣＡＣＴＣＡＴＡＴＣＡＣＡＴＣ（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１４）およびＣＣＡＡＣＡＡＴＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＴＡ
ＡＧＣＣＧＧＣＴＴＴＣＣＴＧＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）を用いてＰＣＲ
によって増幅した。生じたＤＮＡフラグメントは制限エンドヌクレアーセＸｂａ
ｌおよびＭｆｅＩによって消化し、ＡｖｒＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化し
たプラスミドｐＰＩＣ３．５Ｋ（Ｍｕｌｔｉ−ＣｏｐｙＰｉｃｈｉａＥｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．）に連結した。
生じたプラスミドｐＰＩＣ３．５Ｋ（ＧＬＯ５１−３）は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓＡＯＸＩプロモータに制御されたＧＬＯ遺伝子の完全なコード化領域を含む
（図５）。

【００５６】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ菌株ＧＳ１１５は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎが推奨する方
法を用いて、ｐＰＩＣ３．５Ｋ（ＧＬＯ５１−３）によって形質転換した。

【００５７】独立に得られた複数の形質転換クローンは、ＢＭＧＹ（酵母エキス−１％ペプ
トン−２％リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０−１００ｍＭ、１％グリセロール
、１．３４％酵母窒素ベース（Ｄｉｆｃｏ）、０．４ｍｇ／ｌビオチン）中で回
転振盪器（３０℃、２００ｒｐｍ）を用いて培養した。初期定常相に達した後、
細胞を低速（４０００ｒｐｍ）遠心分離によって収集し、グリセロールの代わり
に０．５％メタノールを用いたことを除きＢＭＧＹと同一である同体積のＢＭＭ
Ｙ中で再懸濁させ、一晩培養した。

【００５８】これらの実験において培養上澄中で測定された最高のＧＬＯ発現レベルは約０
．４−０．５Ｕ／ｍｌであった。

【００５９】この値は、サッカロマイセスセレヴィシエにおけるＧＬＯ発現レベルより約
２００倍高い。

【００６０】（実施例１０）Ｐ．パストリスにより生産された組み換えＧＬＯの精製組換えＧＬＯの分取分離のため、実質的に（Ｋ．Ｓｒｅｃｋｒｉｓｈｎａ，
ら．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９，２８，４１１７−４１２５
）で述べたような供給バッチ方式を用いて、組換えＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ菌株Ｇ
Ｓ１１５：ｐＰＩＣ３．５（ＧＬＯ５１−３）を１０１発酵槽で培養した。

【００６１】培養後、細胞を遠心分離によって分離し、澄んだ培地のｐＨを６．５に調整し
、５００ｍｌのＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦを加えた。懸濁液を４℃に
て一晩撹拌した後、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅを沈殿によって回収してカラ
ムに詰め、１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
５）中のＮａＣｌの０−０．２Ｍ勾配を用いて溶出させた。

【００６２】ＧＬＯの最高活性を含む画分をプールし、実施例２で述べた条件下でヒドロキ
シアパタイトクロマトグラフィーにかけた。ＧＬＯの最高活性を含む画分は、ア
クリルアミドゲル電気泳動によって分析し、ほぼ均質のＧＬＯ調製物を含むこと
がわかった（ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅＧ２５０染
色の強度から判断して、約８０−９０％の純度）。

【００６３】この調製物の特異活性は約２４Ｕ／ｍｇタンパク質、すなわちＰ．シアネオ−
フルバスから精製された均質ＧＬＯの特異活性の約４倍以上であった。

【００６４】（実施例１１）組換えＧＬＯの固定化１ｍｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、実施例１０に従って精製し、ｐＨを８．０に調整し
た０．３５ｍｇ／ｍｌＧＬＯ溶液０．５ｍｌとともにインキュベートした。結
合反応と、それに続く処理は樹脂の製造者の指示に従って実施した。

【００６５】固定化ＧＬＯの活性は、我々の標準検定法（実施例１）を少し変更して測定し
た。１ｍｌのＧＬＯ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを１０ｍｌの基質溶液（実施例１）と
ともに３０分間静かに振盪し、沈殿によって樹脂を分離し、２，６−ジクロロフ
ェノールインドフェノールとの反応で、生成されたエリソルビン酸を測定した。

【００６６】ＧＬＯ、固定ＧＬＯの活性（約２．５Ｕ／ｍｌ樹脂）および未結合のままのＧ
ＬＯ活性（５．５Ｕ）は、反応で使用された酵素の量にほぼ一致した。したがっ
て、ＧＬＯは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの固
定化後にその酵素活性の大半を維持している。それゆえ、固定化ＧＬＯはグルコ
ノラクトンからのエリソルビン酸の製造に使用できる。

【００６７】（実施例１２）グルコースのエリソルビン酸への酵素変換６００Ｕ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、１．２Ｕ／ｍｌカタラーゼ、１％グ
ルコースを１００ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液、ｐＨ６．０に含む、１２０μｌ
の反応混合物を３５℃にて１時間インキュベートした。この点で、１２０μｌの
フタル酸カリウム緩衝液、ｐＨ５．６と、１００μｌの、約０．８活性単位を含
む精製組換えＧＬＯ溶液（実施例１０）を加え、反応をさらに１時間進行させた
。凍結により反応を終了させ、（Ｌ．Ｗ．Ｄｏｎｅｒ，Ｋ．Ｈｉｃｋｓ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１５，２２５−２３０（１９８１）で述
べた条件を用いて）エリソルビン酸をＨＰＬＣによって、または２，６−ジクロ
ロフェノールインドフェノールの減少を測定して分析した。反応混合物中には約
１．５ｍｇ／ｍｌのエリソルビン酸があり、これは約４０％の収率に相当した。

【００６８】別の実験では、０．１ｍｇ／ｍｌグルコース、０．０６Ｕ／ｍｌＧＬＯ、２
４Ｕ／ＭＬカタラーゼ、８００Ｕ／ｍｌグルコースオキシダーゼを０．１Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液中に含む１ｍｌの反応混合物を、蓋のない試験管で室温にて
インキュベートした。約０．３ｍｇ／ｍｌのエリソルビン酸が生成し、これは約
３０％の収率に相当した。

【００６９】変換収率を最適にするための試みは、明らかに、これらの実験では行わなかっ
た。たとえば、エリソルビン酸の収率は、自動ｐＨ制御および当業者に周知の他
のプロトコルを導入することによってさらに向上するであろう。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＭＦα１プレプロペプチドおよびＰ．グリセオロゼアムＧＬＯの成
熟部分をコード化するプラスミドｐＧＴＹ（ＧＬＯ）の図示である。

【図２】図２は、未形質転換サッカロマイセスセレヴィシエおよびｐＧＴＹ（ＧＬＯ
）によって形質転換されたサッカロマイセスセレヴィシエの細胞密度およびＧ
ＬＯ活性をグラフで示す。

【図３】図３は、グルコースオキシダーゼおよびＤ−ＧＬＯを用いた、グルコースのＤ
−エリソルビン酸への変換の略図である。

【図４】図４は、グルコースデヒドロゲナーゼおよびＤ−ＧＬＯを用いた、グルコース
のＤ−エリソルビン酸への変換の略図である。

【図５】図５は、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）プロモータの制御下にある
Ｄ−ＧＬＯ遺伝子の完全なコード化領域を含む、プラスミドｐＰＩＣ３．５Ｋ（
ＧＬＯ）の図示である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 7/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者オヤモ、ヘイッキフィンランド国エフアイエヌ−08100 ローヤクルレルヴォンカトゥ４Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA80 CA01 DA11 DA12 GA11 GA16 HA20 4B050 CC03 DD03 EE10 LL05 4B064 AD40 CA05 CA06 CA19 CC24 CD09 DA10 4B065 AA58X AA67Y AA72X AB01 AC14 BA02 BB15 CA10 CA28 CA41

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｄ−グルコノラクトンオキシダーゼをコード化する分離され
た核酸分子。
【請求項２】菌類から分離された、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】ペニシリウム属から分離された、請求項２に記載の核酸分子
。
【請求項４】ペニシリウムグリセオロゼアム、ペニシリウムナタタム
、ペニシリウムシアネウムまたはペニシリウムデカムベンの種から分離され
た、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】ペニシリウムグリセオロゼアムの種から分離された、請求
項４に記載の核酸分子。
【請求項６】ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはＳ
ＥＱＩＤＮＯ：３を含む分離された核酸分子。
【請求項７】ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と比較した場合に約
７０％以上の配列同一性を有するタンパク質をコード化する分離された核酸分子
。
【請求項８】ストリンジェントな条件下で、請求項６に記載の核酸のいず
れか１つにハイブリダイズする分離された核酸分子。
【請求項９】請求項１から８のいずれか１つに記載の核酸分子を含む発現
ベクター。
【請求項１０】請求項９の発現ベクターを含む形質転換宿主細胞。
【請求項１１】１以上の付加、欠失、挿入または変異をさらに含む請求項
６に記載の分離された核酸分子であって、酵素学的に活性なＤ−グルコノラクト
ンオキシダーゼをコード化する核酸分子。
【請求項１２】請求項１から８および１１のいずれか１つに記載の核酸分
子によってコード化されるＤ−グルコノラクトンオキシダーゼタンパク質。
【請求項１３】請求項１０の細胞を培養すること及び、該培養物からＤ−
グルコノラクトンオキシダーゼを回収することを含む、Ｄ−グルコノラクトンオ
キシダーゼの製造方法。
【請求項１４】ＳＥＱＩＤＮＯ：４を有するＤ−グルコノラクトンオ
キシダーゼ。
【請求項１５】Ｄ−グルコノラクトンを生成するためにグルコースをグル
コースオキシダーゼに接触させること及び、前記Ｄ−グルコノラクトンを、請求
項１から８および１１に記載の核酸によってコード化されたＤ−グルコノラクト
ンオキシダーゼに、エリソルビン酸を製造するのに十分な時間と条件で接触させ
ることを含む、グルコースをエリソルビン酸に変換する方法。
【請求項１６】Ｄ−グルコノラクトンをエリソルビン酸に変換する方法で
あって、該Ｄ−グルコノラクトンを請求項１から８および１１に記載のＤ−グル
コノラクトンオキシダーゼに、エリソルビン酸を製造するのに十分な時間と条件
で接触させることを含む方法。
【請求項１７】さらにエリソルビン酸を回収することを含む、請求項１５
に記載の方法。
【請求項１８】さらにエリソルビン酸を回収することを含む、請求項１６
に記載の方法。
【請求項１９】請求項１５に記載の方法によって製造されたエリソルビン
酸。
【請求項２０】請求項１６に記載の方法によって製造されたエリソルビン
酸。
【請求項２１】前記グルコースを前記グルコースオキシダーゼに、カタラ
ーゼの存在下で接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】さらにグルコースオキシダーゼを発現する遺伝子を含む、
請求項１０に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項２３】さらにカタラーゼを発現する遺伝子を含む、請求項２０に
記載の形質転換宿主細胞。
【請求項２４】宿主細胞が酵母である、請求項１０に記載の形質転換宿主
細胞。
【請求項２５】宿主細胞が糸状菌類である、請求項１０に記載の形質転換
宿主細胞。