CN1379822A

CN1379822A - D－葡糖酸内酯氧化酶基因以及生产重组d－葡糖酸内酯氧化酶的方法

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Publication number: CN1379822A
Application number: CN00814350A
Authority: CN
Inventors: A·米亚斯尼科夫; T·萨卢斯亚维; H·奥亚莫
Original assignee: Danisco Cultor America Inc
Current assignee: Danisco Cultor America Inc
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2002-11-13
Also published as: KR20020040783A; AU776922B2; EP1204762A4; EP1204762A1; CA2381710A1; AU7062700A; JP2003507075A; WO2001014574A1

Abstract

本发明的目的在于分离编码D－葡糖酸内酯氧化酶(D－GLO)的核酸分子,所述D－葡糖酸内酯氧化酶用于通过转化D－葡糖酸内酯而生产异抗坏血酸。设想了对所述核酸分子的各种改进,包括保持天然D－GLO的酶促活性的编码蛋白。优选利用本发明核酸以合适表达载体转化的各种宿主细胞产生D－葡糖酸内酯氧化酶的重组方法。还设想了在转化葡萄糖、尤其是转化D－葡糖酸内酯成为异抗坏血酸的过程中利用本发明的D－GLO的方法。

Description

D-葡糖酸内酯氧化酶基因以及生产重组D-葡糖酸内酯氧化酶的方法

本发明涉及编码葡糖酸内酯氧化酶的新型核酸分子，所述酶可用于生产异抗坏血酸及相关盐的方法。

异抗坏血酸是抗坏血酸的C-5表异构物，具有基本相同的化学特性，如抗氧化剂活性。然而，与抗坏血酸的维生素C活性相比，异抗坏血酸的维生素C活性非常低，因此在实际应用中人们并不认为异抗坏血酸是维生素。异抗坏血酸属于GRAS情况，在许多食品和其它应用中用作抗氧化剂。目前用于生产异抗坏血酸的化学方法以下面所述反应为基础：酯化2-酮葡糖酸，然后碱催化该酯环化产生异抗坏血酸钠。

自六十年代起，人们就知道：某些属于青霉属(Penicillium)的野生型真菌当在葡萄糖上培养时产生少量异抗坏血酸[Yagi J.等.Agric.Biol.Chem.31(3)340-345(1967)]。通过广泛化学诱变/选择程序，已经分离出能够转化葡萄糖为异抗坏血酸的产率达40％的特异青霉(Penicillium notatum)菌株[Shimizu K.等，Agric.Biol.Chem 31(3)346-352(1967)]。然而，需要完成所述转化的发酵时间非常长(1-2周)，这使该生产方法不能工业化。

随后对青霉属中从葡萄糖到异抗坏血酸途径的酶学研究确定：该途径由两个反应组成[Takahashi T.Biotechnology and Bioengineering11，1157-1171(1969)]。第一个反应是众所周知的，由葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化为葡糖酸内酯。该途径的第二个反应是分子氧将D-葡糖酸内酯氧化，形成异抗坏血酸和过氧化氢。该反应由D-葡糖酸内酯氧化酶(D-GLO)催化，该酶仅在几种真菌中检测到。Takahashi及其合作者[Takahashi T.等，Agric.Biol.Chem.40，121-129(1976)]已经阐明了一种蓝棕青霉(Penicillium cyaneofulvum)(随后重新分类为Penicillium griseoroseum ATCC 1043)菌株的D-GLO基本酶学特性。

以经济上可接受的速率使葡萄糖直接转化为异抗坏血酸的有关难题仍然没有得到解决。本发明提供编码D-GLO的分离核酸，其中所述D-GLO可用于生产异抗坏血酸及其盐的生物技术方法。

本发明涉及分离和鉴定编码用于生产异抗坏血酸及相关盐的D-葡糖酸内酯氧化酶(D-GLO)的核酸分子。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及SEQ ID NO：1(cDNA)、SEQ ID NO：2(编码)和SEQ ID NO：3(成熟)定义的新分离的核酸分子。本发明还考虑了在严格条件下与SEQ.ID.NOS.1-3中的任一种杂交的核酸分子。

在本发明的另一实施方案中，还提供包含本文鉴定的任何一种核酸分子的载体以及用这种载体转化的宿主细胞。本发明还考虑了使用所鉴定的核酸分子产生D-GLO的重组方法。

本发明的再一实施方案涉及由本文鉴定的核酸分子所编码的D-GLO蛋白，其中包括SEQ ID NO：4表示的蛋白和与SEQ ID NO：4具有至少70％序列同一性的蛋白。

在本发明的又一实施方案中，还提供使用本发明的D-GLO转化葡萄糖和/或D-葡糖酸内酯生产异抗坏血酸和相关盐的方法。

图1图解说明编码P.Griseoroseum GLO的MFα1前原肽(prepropepetide)和成熟部分的质粒pGTY(GLO)。

图2图解说明未转化的啤酒酵母(S.cerevisiae)和pGTY(GLO)转化的啤酒酵母的细胞密度和GLO活性。

图3图解说明利用葡萄糖氧化酶和D-GLO使葡萄糖转化为D-异抗坏血酸。

图4图解说明利用葡萄糖脱氢酶和D-GLO使葡萄糖转化为D-异抗坏血酸。

图5图解说明包含巴斯德毕赤酵母启动子控制下的D-GLO基因完整编码区的质粒pPIC3.5K(GLO)。

本发明涉及编码真菌来源的D-GLO的分离的核酸分子。所述真菌最好属于青霉属，如Penicillium griseoroseum、特异青霉、蓝青霉(Penicillium cyaneum)和斜卧青霉(Penicillium decumbens)。本文所用的术语“D-葡糖酸内酯氧化酶”(D-GLO)是指并且包括任何天然或人造的真菌D-GLO变异体。例如，编码真菌D-GLO的本发明核酸分子可以具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的序列；或者具有这样的序列：在严格条件下与具有SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的分离的核酸分子杂交的序列；或者具有编码这样的蛋白的序列：所述蛋白当与SEQ ID NO：4氨基酸序列比较时，具有约70％或更高的序列同一性。约70％或更高的氨基酸同一性可以定义为：根据在国际互联网站点http：//www.ncbi.n/m.nih.gov/egi-bin/BLAST/上执行的BLASTP算法，使用该程序的默认参数(矩阵(Matrix)＝Blosum 62；缺口罚分(Gap existence cost)＝11；缺口延伸罚分(Gap extension cost)＝1)进行搜索的正百分率。

更具体地说，本发明的核酸分子包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的变异形式，如缺失、插入、添加和突变，其中这样的序列编码保持天然D-GLO的酶促活性的蛋白，即所编码的蛋白能够转化D-葡糖酸内酯成为异抗坏血酸。

包含本发明所述核酸分子的载体以及转化宿主细胞或转基因生物也包括在本发明的范围内。“载体或表达载体”是指包含用于包括但不限于在原核或真核细胞或生物中表达的调节元件或报道基因的任何核酸分子或病毒。“转化宿主细胞”是指其中已经通过分子生物学技术引入编码D-GLO的核酸的宿主细胞，其中所述核酸最好来自真菌，最优选来自青霉属真菌。在将所述核酸引入所述细胞后，所述核酸可以在染色体外存在或整合入宿主基因组。对于本领域内的技术人员来说，下列操作是常规性的：构建其中本发明的核酸分子与所需启动子有效连接的表达载体，以便在各种宿主中表达和分泌所述核酸分子编码的D-GLO蛋白。Sambrook，等(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。

可用于实施本发明的宿主细胞可以是任何适用于转化程序的可获得宿主细胞。例如，可以使用细菌细胞，例如属于埃希氏菌属(Eschericha)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)或假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌。也可以使用酵母细胞作为宿主细胞，例如属于酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)和许旺酵母属(Schwanniomyces)的酵母。也可以使用单细胞藻类，例如集胞藻属(Synechosystis)、衣藻属(Chlamydomonas)和裸藻属(Euglena)的单细胞藻类。也可以用本发明的分离的核酸转化高等植物细胞。用裸DNA或用包含与异源基因有效连接、在植物中起作用的启动子的载体转化植物细胞的方法是本领域内众所周知的。代表性的植物包括大豆、玉米、马铃薯、番茄、甜菜等等。也可以使用哺乳动物细胞作为宿主细胞。表达的GLO最好靶向培养基或一种细胞器，例如液泡、叶绿体、微粒体、过氧化物酶体等等。

术语“核酸或核酸分子”包括RNA和DNA，其中包括cDNA、基因组DNA和合成(如化学合成或修饰)DNA。本发明的核酸分子可以是双链或单链核酸分子。当所述核酸是单链时，所述核酸可以是有义链或反义链。术语“分离的核酸”是指可以侧接非天然序列的核酸，例如质粒或病毒核酸。因此，所述核酸可以不包括5′非编码序列(如启动子)、包括部分或全部紧接编码序列的5′非编码序列(如启动子)。因此，该术语包括例如掺入包括自主复制的质粒或病毒的载体的重组DNA，或掺入原核细胞基因组DNA或除青霉属以外的真核细胞基因组DNA的重组DNA，或作为独立于其它序列的单独分子(如cDNA或通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生的基因组DNA片段)存在的重组DNA。该术语还包括作为编码额外多肽序列的杂合基因组成部分的重组DNA或RNA。此外，该术语还包括不作为片段天然存在和不见于天然状态的核酸片段。

这些重组核酸分子还可以包括增强、调节或改进所述D-GLO编码序列在各种重组宿主中转录的各种序列中的任何一种；即组成型或调节型启动子、转录增强子和转录终止子以及其它通过各种已知机制(如转录阻抑物结合、减弱或抗终止作用)调节D-GLO的表达的序列。

“在严格条件下杂交”是指这样的条件：在人们认为严格而且在Sambrook等(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T..第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press)给出的低盐和高温条件下，核酸与在溶液中或在固体支持物上的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核酸分子形成稳定、序列特异性、非共价结合的条件。例如，可以将参考序列如SEQ ID NO：1固定在硝酸纤维素膜上，而在0.2×SSC(1.75g/l NaCl，0.88g/l二水合柠檬酸钠；pH7.0)和0.1％(w//v)十二烷基硫酸钠存在下于68℃与所述固定参考核酸特异性非共价结合的任何其它核酸被认为是在严格条件下进行杂交。

从用本发明的核酸分子转化的宿主细胞中获得的GLO制剂或D-GLO蛋白也包括在本发明的范围内。可以培养本发明核酸分子转化的宿主细胞并从所培养的细胞回收D-GLO。所述D-GLO可以分泌出来或表达在宿主细胞内；完整的D-GLO编码区或部分所述编码区可以没有任何其它修饰性表达，或者可以在添加各种C末端和N末端延伸物如起始密码子或寡组氨酸序列后表达。仍然保持D-GLO活性的D-GLO与其它蛋白的融合物以及本文鉴定的所有D-GLO相关蛋白的突变形式都包括在本发明的范围内。这些突变形式可以通过随机诱变或定向诱变获得。具有D-GLO活性的所述蛋白制剂可以是粗制或纯化制剂，可以溶液使用或固定在本领域内已知的各种载体上。同样，可以使用表达所述蛋白的重组宿主细胞在所述宿主的发酵过程中、甚至在所述宿主静止状态下催化D-葡糖酸内酯转化为异抗坏血酸。值得注意的是，本发明的死亡重组宿主细胞也可用作葡萄糖和/或D-葡糖酸内酯转化为异抗坏血酸中的D-葡糖酸内酯氧化催化剂。具体来说，在葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶的存在下葡萄糖可转化为D-葡糖酸内酯；然后通过使所述D-葡糖酸内酯底物与本发明的D-GLO在产生异抗坏血酸的充分条件下接触一段时间，从而使所述D-葡糖酸内酯转化为异抗坏血酸。D-葡糖酸内酯作为本发明D-GLO的底物，可以通过化学转化葡糖酸制备，或者通过葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶转化葡萄糖制备。因此，通过使D-葡糖酸内酯与D-GLO在足以产生异抗坏血酸的条件下接触一段时间，使所述底物转化为异抗坏血酸。

全长D-GLO编码序列可以不进行任何修饰而使用，或可以通过本领域内众所周知的方法进行修饰。例如，可以缺失N末端或C末端氨基酸序列，或用各种已知的改善D-GLO在合适宿主中的分泌的前肽(pre-peptide)或前原肽(信号肽)取代所述氨基酸序列。可以将调节所述D-GLO多肽的分类和靶向的各种其它氨基酸序列与全长D-GLO或保留GLO活性的部分D-GLO编码序列融合。

本发明的D-GLO也可以表达为融合蛋白。尤其是本发明的D-GLO可以融合到提供辅助酶活性和/或相关酶促活性例如葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶等等的蛋白质结构域。同样，可以将D-GLO融合到提供其它已知有用功能的结构域，例如对特异性配体的高亲合性(如链霉抗生物素蛋白、麦芽糖结合蛋白、纤维素和其它多糖结合结构域)或者改善所述融合蛋白的稳定性和/或溶解度(如超氧化物歧化酶或谷胱甘肽S-转移酶)。

可以如下产生异抗坏血酸：使用本发明的重组D-GLO作为酶促过程中的关键成分，最好是在有效宿主如丝状真菌(如属于曲霉属或青霉属的真菌)、或具有高度分泌潜力的酵母物种(如属于毕赤酵母属或汉逊酵母属的酵母物种)中，使葡萄糖转化为异抗坏血酸。除D-GLO外，这样的过程至少加入两种其它的酶，最好包括葡萄糖氧化酶(或具有重叠特异性的酶，如葡萄糖脱氢酶、己糖氧化酶或吡喃糖氧化酶)以及过氧化氢酶。图3图解说明了构成所述基于葡萄糖氧化酶和GLO的过程的基础的化学反应的顺序。简要地说，分子氧将葡萄糖氧化成为D-葡糖酸-d-内酯。该反应由葡萄糖氧化酶(或己糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶等等)催化，产生副产物过氧化氢。D-GLO随后催化D-葡糖酸-d-内酯转化为异抗坏血酸。在该反应中，同样消耗分子氧并形成过氧化氢。已知D-葡糖酸-d-内酯在水溶液中与葡糖酸和D-葡糖酸-γ-内酯形成平衡。D-葡糖酸-γ-内酯也是D-GLO的底物。这两种D-葡糖酸内酯都被GLO氧化形成相同产物异抗坏血酸。D-葡糖酸内酯水解的自发反应相当慢，并且假如所述反应混合物中存在足够高浓度的GLO和分子氧，该水解反应可能降低到最低程度。此外，由于该反应的可逆性，葡糖酸最终形成可以被氧化成异抗坏血酸的内酯。葡萄糖氧化酶催化的反应和D-GLO催化的反应都产生副产物过氧化氢。过氧化氢是高度活性物质，可使参与该过程的酶失活。因此，必须不断地从所述反应混合物中去除过氧化氢。去除过氧化氢的优选方法是利用过氧化氢酶。使用其它已知的去除各种活性氧的清除剂(如超氧化物酶)在实施本发明时也是有利的。

假如使用葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖转化为葡糖酸内酯，就可以将过氧化氢的去除与在葡萄糖脱氢酶催化的反应中消耗的NAD+的再生偶联起来。图4图解说明具体实施本发明的整个反应流程。按照本发明转化葡萄糖成为异抗坏血酸的优选方法是在单个反应器中进行整个过程，在所述反应器中同时进行葡萄糖氧化与葡糖酸内酯氧化。然而，分别进行葡萄糖转化为葡糖酸内酯以及葡糖酸内酯转化为异抗坏血酸的实施方案也是可以接受的。使用本发明的重组D-GLO，用葡糖酸内酯、葡糖酸或二者的混合物作为产生异抗坏血酸的原料也是令人满意的。

也可以在已经能够将葡萄糖转化为葡糖酸内酯的宿主内表达本发明的D-GLO核酸。许多这样的微生物宿主是本领域已知的。通常这样的微生物使用葡萄糖氧化酶(如许多属于曲霉属和青霉属的真菌物种)或葡萄糖脱氢酶将葡萄糖氧化为葡糖酸内酯。许多属于产生膜结合葡萄糖脱氢酶的细菌属的细菌物种是合适的。选择还表达足够高水平过氧化氢酶的宿主是有利的。当在含有葡萄糖的培养基中发酵这样的表达GLO的重组宿主时，可以从葡萄糖直接获得异抗坏血酸。

此外，本发明的表达D-GLO的重组宿主可以与表达葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶和/或过氧化氢酶的不同宿主共同培养。在本实施方案中，可以在一步混合发酵中产生异抗坏血酸。

有两种重组宿主对于直接发酵葡萄糖生成异抗坏血酸特别合适，即酵母和丝状真菌。

在这一方面，实施例9证实，可以在酵母如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中有效表达D-GLO基因。也可以使用任何其它已知支持异源蛋白有效分泌的酵母宿主，例如多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。实施例9中使用的表达系统基于葡萄糖阻遏型启动子，因此不适于构建发酵葡萄糖生成异抗坏血酸的重组宿主。然而，已知有基于不受葡萄糖阻遏的强启动子的用于巴斯德毕赤酵母的同样有效的表达系统，例如基于Stratagene的表达pGAPZ载体系列的表达系统，这些系统可以用于构建这样的宿主。也可以使用其它糖酵解基因启动子。

除表达所述GLO基因外，在该发酵过程中使用的重组酵母宿主还应当表达葡萄糖氧化酶，如已知黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶能够在酵母中有效表达(De Baetselier A.等Fermentation of ayeast producing A.niger glucose oxidate...Bio/Technology 9，559-561(1991).)。此外，过量表达优选分泌型过氧化氢酶基因是发酵葡萄糖生成异抗坏血酸的酵母宿主的非常有用的附加遗传性状。

与酵母宿主不同，许多野生型丝状真菌表达高水平的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。因此，不象酵母宿主时必需遗传工程化过量表达编码这两种酶的基因。对于(过量)表达D-GLO，高度表达糖酵解基因的启动子是合适的。也可以使用在葡萄糖中培养时保持高活性的其它启动子，例如真菌TEF1启动子。

与酵母不同，许多丝状真菌产生葡糖酸内酯酶。例如，在高通气条件下培养的黑曲霉中，葡糖酸内酯酶的水平极高(Whtteveen C.F.B.等，对黑曲霉葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和内酯酶的诱导，Curr.Genetics 24，408-416(1993))。葡糖酸内酯酶与GLO竞争共同的底物葡糖酸-δ-内酯，并因此干扰葡萄糖转化为异抗坏血酸。因此，最好应当使葡糖酸内酯酶失活。或者通过对葡糖酸内酯酶基因进行突变的遗传方法，或者通过选择选择性抑制葡糖酸内酯酶而不抑制GLO的发酵条件，可以完成所述失活。完成失活的一个优选方法是在发酵液中加入葡糖酸内酯酶的选择性抑制剂。

在本发明的另一实施方案中，通过用表达足够高水平重组D-GLO的微生物宿主发酵葡糖酸内酯、葡糖酸或这两种底物的混合物，由所述底物产生异抗坏血酸。

本发明将在下面的实施例中进一步举例说明，但本发明不受下面的实施例的限制。

实施例1

Glo活性

使用葡糖酸-δ-内酯、葡糖酸-γ-内酯(D-葡糖酸内酯)和葡糖酸的平衡混合物作为底物，测量GLO的活性。如下制备所述混合物：将晶体葡糖酸-δ-内酯以50％(w/v)的浓度溶于水中，并使该溶液在50℃静置几天。所述反应在含有2mM羟基喹啉、12μM 2，6-二氯酚靛酚和70mM底物的50mM苯二甲酸氢钾缓冲液，pH5.6中进行。2，6-二氯酚靛酚和底物都是紧接在测量前以贮液形式加入所述反应混合物中。此外，在所述实验中使用的等份底物溶液在快速调整到pH5.8后立即使用。通过记录由于异抗坏血酸还原2，6-二氯酚靛酚引起的在600nm处光吸收时程，跟踪所述酶促反应。还包括一个对照，对照与所述反应混合物的唯一不同之处是在所述测定前煮沸酶溶液2分钟。使用通过在所述反应混合物中加入已知量异抗坏血酸而获得的校准曲线，计算在所述反应中产生的异抗坏血酸的量。活性表示为在上述条件下、在30℃下每分钟产生的异抗坏血酸微摩尔数。

实施例2

从P.griseoroseum纯化均一GLO

使用与较早前Takahashi T等Agric.Biol.Chem.40，121-129(1976)公开的方法相似的程序，从P.griseoroseum菌株ATCC 10431纯化GLO至均一。

用在马铃薯-葡萄糖琼脂(Difco)平板上培养一周的2ml P.griseoroseum孢子悬浮液接种在数个2升锥形瓶中的200ml YEPD培养基(2％细菌培养用蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)中。所述培养物在30℃，180rpm下在旋转式摇床上培养2天，然后用0.5 l所述培养物接种在15 l发酵罐中的10 l诱导培养基(8％葡萄糖，0.2％KH₂PO₄，0.1％(NH₄)₂SO₄，0.1％(NH₄)₂CO，0.1％ NaNO₃，0.1％MgSO₄.7H₂O，1％ MnSO₄.7H₂O，0.001％ ZnSO₄.7H₂O，0.5％ CaCO₃，pH5.5)中。在一些发酵过程中使用氯霉素(2.5mg/l)和四环素(3mg/l)以避免细菌污染的危险。发酵在30℃进行60小时(通气-5 l/min，搅拌-300rpm)。

通过在烧结的玻璃滤器上过滤而收集菌丝体，用水和缓冲液A(10mM磷酸缓冲液，pH6.5，含有0.1mM EDTA)进行洗涤。在含有1mM苯甲基磺酰氟的同样缓冲液中，使用玻璃珠磨破碎细胞。循环进行所述破碎过程，并在所述循环之间和循环期间用冰水冷却。调整每个循环的长度，使得所述悬浮液的温度处于4℃-22℃的范围内，并调整循环的次数，达到至少90％的细胞破碎(在显微镜下评估)。将所述匀浆在19000xg离心30分钟，并使用上清液来纯化所述酶。

在每升细胞提取物中加入约80ml DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)，并在温和搅拌下使所述悬浮液在4℃温育过夜。通过过滤除去树脂，并在相同条件下用新鲜DEAE-Sepharose处理所述滤出液。该处理除去了大部分渣滓蛋白，同时仅少量GLO吸附到树脂上。用硫酸铵(60-100％饱和)从所述滤出液沉淀出GLO。几次更换缓冲液A，透析所述硫酸铵沉淀物。透析后的酶溶液用足量缓冲液A稀释，将该溶液的电导率降到1.25mS，然后将该溶液加样到用同样缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF柱(约5ml柱床体积/ml样品)。用缓冲液A以0.15柱床体积/小时洗脱该柱，直到在280nm处的吸收降到背景值，然后用线性梯度NaCl的缓冲液A(0-100mM NaCl，总梯度体积＝2倍柱床体积)洗脱该柱。合并活性峰流分，用Amicon超滤装置和XM50膜浓缩，然后加样到200cm的用缓冲液A平衡的Sephacryl S-300 HR柱(Pharmacia)。以0.5cm/min的线性速率洗脱该柱。收集所述凝胶过滤柱的活性流分，将其加样到用缓冲液A平衡的羟磷灰石柱(Bio-Gel HT，Bio-Rad)的顶端。柱床体积是所述样品体积的0.13倍，洗脱速率是每分钟0.1倍柱床体积。用线性梯度硫酸铵(0-75％)的缓冲液A从所述柱上洗脱GLO。梯度的总体积是约36倍柱床体积。合并最高GLO活性的流分，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析所述合并物。观察到对应于表观分子量68-80kDa的单条强分散带(diffuse band)以及约34kDa处一条非常弱的带。表1概述了典型纯化实验结果。

实施例3

GLO的氨基酸序列分析

利用赫尔辛基生物技术学会蛋白分析实验室(Protein AnalysisLaboratory.of the Institute of Biotechnology，Helsinki)的商业化服务完成所述分析。根据N-末端序列分析发现实施例2纯化的GLO制备物是均一的。发现下面的N-末端序列：Tyr Arg Trp Phe Asn Trp Gln PheGlu Val Thr Nnn Gln Ser Asp Ala Tyr Ile Ala Pro His Asn GluHis...(SEQ ID NO.：5)(“Nnn”指在该位置没有发现可解释的信号，对此最可能的解释是存在非衍生化(underivatized)半胱氨酸残基或糖基化氨基酸残基)。所述蛋白进一步用4-乙烯吡啶烷基化、用Lys-C-蛋白酶消化，然后用反相HPLC从消化物中分离出几个肽。用质谱测得下面的肽序列：

肽1-Glu His Asp Arg Met Thr Val Cys Gly Pro His Phe Asp TyrAsn Ala Lys(SEQ ID NO：6)；

肽2-Glu Tyr Ile Cys Tyr Asp Glu Val Thr Asp Ala Ala Ser CysSer Pro Gln Gly Val Val(SEQ ID NO：7)；

肽3-Cys Gln Phe Val Asn Glu Phe Leu Val Glu Gln Leu Gly IleThr Arg(SEQ ID NO：8)。

实施例4

分离P.griseoroseum染色体DNA

如实施例2所述在YEPD培养基上培养P.griseoroseum。用水和缓冲液A(实施例2)洗涤菌丝体并将其冻干。在液氮中用研钵研磨约50mg所述干菌丝体。将磨细的菌丝体悬浮于500μl提取缓冲液(250mM NaCl，25mM EDTA，200mM Tris HCl，pH8.5，0.5％ SDS)中，加入350μl苯酚，并振荡该混合物至形成均一悬浮液。在所述悬浮液中加入150μl氯仿，然后高速离心一小时(13500rpm，台式微型离心机)。将水相转移到新的试管中，加入10μl 10％核糖核酸酶A溶液。将所述混合物在37℃温育1小时。在所述溶液中加入1/10倍温育体积的5M乙酸钠缓冲液(pH5.4)后，加入0.6倍体积的异丙醇。通过离心回收DNA(10分钟，13500rpm)，用70％乙醇洗2次，真空干燥并溶解于100μl水中。

实施例5

克隆编码GLO的染色体DNA片段

根据GLO SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：8的部分氨基酸序列，合成多种不同的寡核苷酸，并在使用P.griseoroseum染色体DNA(实施例4)作为模板的PCR中，将所述寡核苷酸作为引物进行测试。

在一台PTC-255 DNA Engine仪器(MJ Research Inc.，MA，USA)中，使用以下程序进行PCR：94℃2分钟；10个循环的(94℃30秒；50℃45秒；72℃3分钟)，然后是30个循环的(94℃30秒；60℃45秒；72℃3分钟)。每个反应在包含以下成分的15μl溶液中进行：约25ng模板DNA，0.75单位Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)，每种寡核苷酸引物各0.75μM，四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)各200μM，1.5μl的10X浓缩缓冲液(由Taq聚合酶生产厂家提供)。使用常规技术，通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。[Maniatis，T.等(1982)Molecular cloning.Cold Spring Harbor Laboratory]。

一对寡核苷酸引物获得最佳结果：有义寡核苷酸TAYCGITGGTTYAAYTGGCA(SEQ ID NO：9)以及反义寡核苷酸CCIARYTGYTCIACIARRAAYTCRTTIACRAAYTGRCA (SEQ IDNO：10)。在两个序列中，“I”代表肌苷磷酸残基，R-腺苷磷酸残基和鸟苷磷酸残基的混合物，而Y是胸苷磷酸残基和胞苷磷酸残基的混合物。通过琼脂糖凝胶电泳纯化用这对寡核苷酸获得的PCR产物(约1.2kb)，使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将所述PCR产物克隆进由同一生产厂家提供的pCR2.1-TOPO载体，得到质粒pCR(GLO)。

实施例6

构建P.griseoroseum cDNA文库

从在诱导GLO产生的条件(实施例2)下在矿物质培养基上培养的P.griseoroseum菌丝体分离总RNA。在液氮下将所述菌丝体(在-70℃冻存)在研钵中研磨。在剧烈搅拌下，将3g磨细的菌丝体悬浮在10ml冰冷的RNA提取缓冲液(4M硫氰酸胍，0.5％月桂基肌氨酸钠，25mM柠檬酸钠，100mM β-巯基乙醇)中。将所述混合物在4℃下于10000rpm(SS-34转子，Sorvall)离心6分钟。将10ml上清液转移到一支新试管并在其中加入4g CsCl。在随后步骤中使用的所有溶液都用焦碳酸二乙酯处理水以及玻璃器皿制备。将所述包含RNA的溶液加到1.2ml 5.7M CsCl，0.1M EDTA，pH7的上层，并在15℃于33000rpm离心约20小时。所述沉淀用少量水快速清洗，并溶解于100μl水中。使用Oligotex Midi试剂盒(Qiagen)，按照生产厂家的指导，从该制备物分离mRNA。使用Stratagen的cDNA合成试剂盒和λZAP-eDNA Gipapack III Gold Cloning试剂盒，按照随同这些试剂盒提供的指导，由P.griseoroseum mRNA制备cDNA文库。

实施例7

从P.griseoroseum cDNA文库分离全长GLO cDNA

通过EcoRI限制性消化和制备性琼脂糖凝胶电泳从质粒pCR(GLO)(实施例5)分离包含部分染色体GLO基因的1.2kb DNA片段。使用标准遗传工程技术进行限制酶消化、质粒DNA和DNA片段分离等[Maniatis，T.等(1982)Molecular cloning.Cold Spring HarborLaboratory]。使用Random Primed DNA标记试剂盒(BoehringerMannheim)和[αP³²]-dCTP放射性标记所述片段。

将实施例6的λ噬菌体文库接种到平板上，并使用所述标记的1.2kb片段，按照随同λZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning试剂盒由Stratagene提供的手册，通过DNA杂交筛选所述λ噬菌体文库。按照相同手册的方法，鉴定出许多阳性噬菌斑，从其中二十个噬菌斑中纯化出重组噬菌体，并将所述重组噬菌体转化成为质粒形式。通过用EcoRI和XhoI限制性消化分析这二十个质粒，发现这二十个质粒含有不同大小的插入片段。有一个小DNA片段在所有质粒中都存在，暗示所有这些cDNA克隆都来自同一个基因。最大的质粒(称为pGLO 1.8)含有约1.8kb大小的插入片段。利用Eurogentec Bel.S.A.(Belgium)的商业化服务对所述整个插入片段进行测序。序列分析揭示：质粒pGLO 1.8的所述插入片段包含GLO cDNA的完整编码区(1443bp，包括终止密码子)、70bp的5′-非翻译序列和261bp的3′-非翻译序列(SEQ ID NO：1)。所述序列编码480个氨基酸残基的蛋白(SEQ ID NO：4)。

使用由GenBank在互联网上提供的BLAST服务(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast？Jform＝0)，将P.griseoroseum GLO的推导氨基酸序列与已知的蛋白氨基酸序列相比较。鉴定出许多同源蛋白序列。假如只考虑具有确定功能的蛋白，则在其它内酯氧化酶观察到最高的同源性，所述内酯氧化酶例如白假丝酵母(Candida albicans)的D-阿拉伯糖酸内酯氧化酶和大鼠的L-古洛糖酸内酯氧化酶。

使用由P.griseoroseum纯化的GLO测定的N-末端氨基酸序列(实施例3，SEQ ID NO：5)与从氨基酸残基21开始的GLO推导序列(SEQID NO：4)相同。这项观察结果以及在翻译GLO编码序列1-20区域中疏水氨基酸残基占优势有力说明：P.griseoroseum GLO包含N-末端信号肽。GLO中存在信号肽是未曾预料到的，因为其它内酯氧化酶没有信号肽，并且已知是不分泌的。此外，P.griseoroseum GLO的推导序列包含8个推测性连接的糖基化位点。分离的GLO在聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为一条分散带，提示它确实是一种糖蛋白。然而，我们已经从P.griseoroseum的细胞提取物中分离了GLO。可以推测GLO在其天然宿主中或者从高尔基体导向其中一种细胞内细胞器，或者分泌但仍保持与细胞结合。

实施例8

P.griseoroseum GLO基因在异源宿主中表达

由于GLO推导序列显示出分泌蛋白的许多特征，因此看起来酵母分泌表达最适于测试所克隆的GLO cDNA的功能性。用于表达GLO的表达载体基于众所周知的酵母-大肠杆菌穿梭载体pJDB207[Beggs.J.D-，见Wiliamson R.(编著)Genetic Engineering 2，Academic Press(1981)]。分两个阶段完成所述表达载体的构建。首先，通过同时连接三个DNA片段构建pAC109：(1)得自啤酒酵母PHO5基因启动子区的0.45kb BamHI-Eco47III片段；(2)得自啤酒酵母MFα1基因的0.38kb HaeIII-HindIII片段，所述片段包含MFα1基因的116bp的3′-非编码区域以及对应于酵母α因子前体蛋白的前原肽(MFα1-前原肽)序列的编码区部分；(3)通过BamHI和HindIII限制性消化获得的约6.5kb pJDB207片段。第二步，在pAC109的HindIII位点插入合成多接头。

所述多接头包括两个寡核苷酸：上面的核苷酸链AGCTCTCGAGATCTCCCGGGA(SEQ ID NO：11)和下面的核苷酸链AGCTTCCCGGGAGATCTCGAG(SEQ ID NO：12)。选出所述多接头插入的取向使得所述HindIII位点位于所述Mfα1前原肽区附近的质粒，并将该质粒命名为pGTY。

如下将所克隆的GLO基因的DNA序列修饰成为适于与Mfα1前原肽构建融合体的形式：使用质粒pGLO 1.8作为模板，并使用两个在所述GLO基因下游载体上退火的寡核苷酸引物进行PCR，其中“有义”引物是：GAAGAAGCTTACCGGTGGTTCAATTGGCAGTTTTTGGT(SEQ IDNO：13)和“反义”引物是：CACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG(SEQ ID NO：14)。在该步骤中，在所述GLO基因中引入修饰。缺失所有5′-非编码序列以及相当于推定GLO编码序列的氨基酸残基1-20的序列，并在允许所述Mfα1-前原肽与成熟GLO按读框融合的位置引入HindIII位点。该PCR反应的产物用HindIII和XhoI消化，并与用同一对限制酶消化的pGTY连接。

所得到的质粒pGTY(GLO)(图1)编码融合蛋白，所述融合蛋白由MFα1前原肽以及P.griseoroseum GLO的推定成熟部分(SEQ IDNO：15)组成。

使用“锂”转化法[Sherman F.等，Laboratory Course Manual forMethods in Yeast Genetics，第121-122页，Cold Spring HarborLaboratory(1986)]，将啤酒酵母菌株GRF18(ATCC 64667，基因型：MATα，leu2-3，leu2-112，his3-11，his3-15)转化为亮氨酸原养型。

在0.3 l SC-his培养基(0.67％ Yeast Nitrogen Base w/o氨基酸(Difco)，2％葡萄糖，100mg/l组氨酸；对于未转化的对照菌株，另外以100mg/l加入亮氨酸)中，培养其中一种转化克隆以及用作对照的接受体菌株直到早期静止期(旋转式摇床，180rpm，30℃)。使用来自这些培养物的酵母细胞接种两个相同的15 l发酵罐，每个发酵罐内含有10 l低磷酸(PEP)培养基。为了制备PEP培养基，8％的细菌培养用蛋白胨(Difco)用CaCl₂(加至0.4M浓度)在pH11、100℃下处理5分钟。使所述蛋白胨溶液冷却到室温，调整到pH5.5，通过纸和0.4μm孔径滤膜过滤，以用作脱磷酸蛋白胨的贮液。PEP培养基含有2％脱磷酸蛋白胨和5％葡萄糖。发酵条件如下：搅拌-300rpm，通气-5 l/min，加入4M NaOH维持pH-5.5。以合适间隔取培养物样品。通过在600nm处测定吸光度，确定细胞密度。离心去除细胞，用Centriplus膜(Amicon)浓缩培养基样品约500倍，用一次性EconoPack 10 DG微型柱(BioRad)通过凝胶过滤去除所述发酵培养基的低分子量成分后，测定GLO活性。在发酵约60-70小时后检测到GLO的峰水平(约2.4mU/ml)。在所述未转化接受体菌株的对照发酵中未检测到GLO活性。

本实验的结果确凿证实：质粒pGLO 1.8中的GLO基因的cDNA克隆确实是有功能的。已知啤酒酵母是分泌异源蛋白相对无效的宿主。因此，当将所述GLO基因引入其它真菌菌种(丝状真菌或其它具有更高分泌潜力的酵母)中时，预期重组GLO表达水平会高得多。

实施例9

GLO基因在甲基营养酵母中的表达

使用下列寡核苷酸引物通过PCR扩增所述GLO基因的编码区：CAAAGCTTCTAGAGCCTCAGACCACTCATATCACATC (SEQ IDNO：14)和CCAACAATTGATGCTGAGCCCTAAGCCGGCTTTCCTGC(SEQ ID NO：16)。得到的DNA片段用限制性内切核酸酶XbaI和MfeI消化，并与用Avr II和EcoRI消化的质粒pPIC3.5K(Multi-Copy PichiaExpression Kit，Invitrogen Corp.)连接。得到的质粒PPIC3.5K(GLO 51-3)包含处于巴斯德毕赤酵母AOXI启动子控制下的所述GLO基因的完整编码区(图5)。

使用Invitrogen推荐的方法，用PPIC3.5K(GLO 51-3)转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115。

在BMGY(酵母提取物-1％蛋白胨-2％磷酸钾缓冲液，pH6.0-100mM，1％甘油，1.34％ Yeast Nitrogen Base(Difco)，0.4mg/l生物素)中，在旋转式摇床上培养数个独立获得的转化克隆(30℃，200rpm)。在达到早期静止期后，通过低速(4000rpm)离心收集细胞，重悬浮并在等体积的BMMY中培养过夜，BMMY与BMGY相同，只是用0.5％甲醇取代了甘油。

这些实验中在培养物上清中检测到的最高GLO表达水平是约0.4-0.5U/ml。该值是啤酒酵母中的GLO表达水平的约200倍。

实施例10

纯化巴斯德毕赤酵母产生的重组GLO

为了制备性分离重组GLO，使用基本如(K.Sreckrishna等Biochemistry，1989，28，4117-4125)中所述的分批模式，在10 l发酵罐中培养重组巴斯德毕赤酵母菌株GS115∷pPIC3.5(GLO 51-3)。

培养完成后，离心分离细胞，将澄清后的培养基的pH调到6.5，并加入500ml DEAE Sepharose FF。所述悬浮液在4℃下搅拌过夜，然后通过沉降收集DEAE Sepharose，将所述悬浮液加载到柱子上，用0-0.2M NaCl梯度的含有1mM EDTA的10mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)进行洗脱。

汇集含有最高GLO活性的流分，在实施例2所述的条件下进行羟磷灰石层析。通过丙烯酰胺凝胶电泳分析含有最高GLO活性的流分，发现其含有近乎均一的GLO制备物(根据考马斯亮蓝G250染色的强度判断，约80-90％纯度)。

该制备物的比活是约24U/mg蛋白，即比从蓝棕青霉纯化的均一GLO比活高约四倍。

实施例11

固定重组GLO

将1ml N-羟基琥珀酰亚胺活化的Sepharose 4 FF(Pharmacia)与0.5ml 0.35mg/ml依照实施例10纯化的GLO溶液温育，并调整到pH8.0。按照树脂生产厂家的说明书进行偶联反应和随后的处理。

使用轻微改变的我们的标准测定(实施例1)，测定固定GLO的活性。1ml GLO-Sepharose与10ml底物溶液(实施例1)温和搅拌30分钟，通过沉降分离树脂，并在使用2，6-二氯酚靛酚的反应中测量形成的异抗坏血酸的量。

发现GLO活性即固定GLO的活性(约2.5U/ml树脂)与残余的未结合GLO活性大致(5.5U)与在所述反应中使用的酶量相当。因此，在GLO固定在N-羟基琥珀酰亚胺活化的Sepharose上后，GLO保持大部分酶活。因此，固定GLO可以用于从葡糖酸内酯生产异抗坏血酸。

实施例12

葡萄糖酶促转化为异抗坏血酸

将120μl在100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)中含有600U/ml葡萄糖氧化酶，1.2U/ml过氧化氢酶和1％葡萄糖的反应混合物在35℃温育1小时。这时，加入120μl邻苯二甲酸钾缓冲液pH5.6以及100μl含有约0.8活性单位的纯化重组GLO溶液(实施例10)，并使反应再进行1小时。通过冰冻终止反应，并通过HPLC(使用L.W.Doner，K.Hicks，Anal.Biochem.115，225-230(1981)所述的条件)测量2，6-二氯酚靛酚的减少分析异抗坏血酸。发现所述反应混合物含有约1.5mg/ml异抗坏血酸，相当于产率约40％。

在另一个实验中，在开放的试管中使1ml在0.1M磷酸钾缓冲液中含有0.1mg/ml葡萄糖，0.06U/ml glo，24U/ml过氧化氢酶和800U/ml葡萄糖氧化酶的反应混合物于室温下温育。形成约0.3mg/ml异抗坏血酸，相当于约30％的产率。

值得注意的是，在这些实验中没有试图优化转化产率。例如，可以通过引入自动pH控制以及本领域内技术人员众所周知的其它方法进一步提高异抗坏血酸的产率。

说明书的核苷酸和氨基酸序列表

序列表<110>丹尼斯科卡尔特美国有限公司(Danisco Cultor America，Inc.)<120>D-葡糖酸内酯氧化酶基因以及生产重组D-葡糖酸内酯氧化酶的方法<130>Andrei Miasnikov等<140><141><160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1774<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述：青霉属(Penicillium)D-萄糖酸内酯cDNA<400>1gactattgca ggaatttatc ttgtgagacg atcttgttca tagtttgagc attcctattc 60ctatatcaaa atgctgagcc ctaagccggc tttcctgctg ttgctgctgc acgcagtgtt 120cggctcggcc taccgctggt tcaactggca gtttgaggtc acttgccagt ctgatgccta 180tattgctcct cataatgagc atgccgccgc cgagttcctc aaggaacagt accctaagag 240ctcccatatc aaagttgttg ggaatggtca tggatttggt aacctcacta cctgtgtcga 300caatgctctc actgagaagc ccacctacat cgtttctctc accaacctga agaagctcca 360tatcgataag aagaacttga ccgtcacctt tggtgccggc tgggatgtcg atgaccttat 420ccaagagctc aaggccaacg acttgtcctt cagcaatctc ggtgttgagc gtgttcagaa 480ctttgtgggt gctgcctcca caggtaccca cggttctgga tccgacctcg ggaatatcgc 540aacccagatt atcgggctgc gtgtattgga ctcacaggga ggcctgcgtg tcatcaacga 600gaagcacaat gcggaagaat tgaaggcttt ccgtatcagt cttggtgccc tcggtttaat 660cacggagttg actatcaagg tccagcctac ccaactcctg aagaagacca ccaaggtctt 720gaatgccacg tccgactatt caaagatgta caatgagctt gcccagctgt acaaggagca 780cgaccgcatg actgtctggg gtcctcactt cgactggaat gcaaagtctc agagctggga 840ccttgagcct acttacttcc tctcttactg ggagccaacc aactacaccg gtgttcgcaa 900ctgcaccctc aattactgcg ccaacggctg cggtgactgc aagaaggagt acatttgcta 960cgacgaagtc actgatgcgg cgtcctgctc tcctcaaggt gtctgttccc ggggcttcta 1020cgccgagatc gagcacttcc ttcctataga atatttcgcg gaagccgcca ccaactacac 1080tattttccaa cagggccaga cgtctcgcat gaaggcaccc tacaacaagc agatggtcat 1140gcagcaccgt tcgctcaagg gtgatgatac atacttgtcc ccagttaaca cctacaacct 1200tggcccagac cttagcggtg tttttggagt catcgagatt gactggatcc aagaatacaa 1260caacttcacc actctctggc agaaccagga attggcccat gaattcctcc ctcagtttgg 1320tgaaacctac aacgctcgct cgcactggaa caagatgagc gctcctaatg ccacttatac 1380cctggagaaa ttccccaagc tgcccgagtt cttggccatc cagaagcgtc aggaccccaa 1440gtgccagttc gttaacgaat tcctggttga gcagcttgga attacgcgct gtgcaaacta 1500tatctctgta taagatgtga tatgagtggt ctgaggcact cttttctttt cttttttgtc 1560agaggtgatg tggtcgtcaa tatgtcagtt ggcaaacacc ttttccaccg caacttttgt 1620cctaagaatt tttgagtgga atgggtcatt gaatgagctt cgtgtcggac ttggtggcac 1680ctcttggtgg gtttcctagt tatgtacata tatagtttct gagatagctt catgaccaat 1740tcatctacca ccagttaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1774<210>2<211>1443<212>DNA<213>未知生物<220><221>CDS<222>(1)..(1440)<220><223>未知生物描述：青霉属D-萄糖酸内酯cDNA<400>2atg ctg agc cct aag ccg gct ttc ctg ctg ttg ctg ctg cac gca gtg 48Met Leu Ser Pro Lys Pro Ala Phe Leu Leu Leu Leu Leu His Ala Val 1 5 10 15ttc ggc tcg gcc tac cgc tgg ttc aac tgg cag ttt gag gtc act tgc 96Phe Gly Ser Ala Tyr Arg Trp Phe Asn Trp Gln Phe Glu Val Thr Cys

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20 25 30gaa cag tac cct aag agc tcc cat atc aaa gtt gtt ggg aat ggt cat 144Glu Gln Tyr Pro Lys Ser Ser His Ile Lys Val Val Gly Asn Gly His

35 40 45gga ttt ggt aac ctc act acc tgt gtc gac aat gct ctc act gag aag 192Gly Phe Gly Asn Leu Thr Thr Cys Val Asp Asn Ala Leu Thr Glu Lys

50 55 60ccc acc tac atc gtt tct ctc acc aac ctg aag aag ctc cat atc gat 240Pro Thr Tyr Ile Val Ser Leu Thr Asn Leu Lys Lys Leu His Ile Asp65 70 75 80aag aag aac ttg acc gtc acc ttt ggt gcc ggc tgg gat gtc gat gac 288Lys Lys Asn Leu Thr Val Thr Phe Gly Ala Gly Trp Asp Val Asp Asp

85 90 95ctt atc caa gag ctc aag gcc aac gac ttg tcc ttc agc aat ctc ggt 336Leu Ile Gln Glu Leu Lys Ala Asn Asp Leu Ser Phe Ser Asn Leu Gly

100 105 110gtt gag cgt gtt cag aac ttt gtg ggt gct gcc tcc aca ggt acc cac 384Val Glu Arg Val Gln Asn Phe Val Gly Ala Ala Ser Thr Gly Thr His

115 120 125ggt tct gga tcc gac ctc ggg aat atc gca acc cag att atc ggg ctg 432Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Asn Ile Ala Thr Gln Ile Ile Gly Leu

130 135 140cgt gta ttg gac tca cag gga ggc ctg cgt gtc atc aac gag aag cac 480Arg Val Leu Asp Ser Gln Gly Gly Leu Arg Val Ile Asn Glu Lys His145 150 155 160aat gcg gaa gaa ttg aag gct ttc cgt atc agt ctt ggt gcc ctc ggt 528Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Phe Arg Ile Ser Leu Gly Ala Leu Gly

165 170 175tta atc acg gag ttg act atc aag gtc cag cct acc caa ctc ctg aag 576Leu Ile Thr Glu Leu Thr Ile Lys Val Gln Pro Thr Gln Leu Leu Lys

180 185 190aag acc acc aag gtc ttg aat gcc acg tcc gac tat tca aag atg tac 624Lys Thr Thr Lys Val Leu Asn Ala Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Met Tyr

195 200 205aat gag ctt gcc cag ctg tac aag gag cac gac cgc atg act gtc tgg 672Asn Glu Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Glu His Asp Arg Met Thr Val Trp

210 215 220ggt cct cac ttc gac tgg aat gca aag tct cag agc tgg gac ctt gag 720Gly Pro His Phe Asp Trp Asn Ala Lys Ser Gln Ser Trp Asp Leu Glu225 230 235 240cct act tac ttc ctc tct tac tgg gag cca acc aac tac acc ggt gtt 768Pro Thr Tyr Phe Leu Ser Tyr Trp Glu Pro Thr Asn Tyr Thr Gly Val

245 250 255cgc aac tgc acc ctc aat tac tgc gcc aac ggc tgc ggt gac tgc aag 816Arg Asn Cys Thr Leu Asn Tyr Cys Ala Asn Gly Cys Gly Asp Cys Lys

260 265 270aag gag tac att tgc tac gac gaa gtc act gat gcg gcg tcc tgc tct 864Lys Glu Tyr Ile Cys Tyr Asp Glu Val Thr Asp Ala Ala Ser Cys Ser

275 280 285cct caa ggt gtc tgt tcc cgg ggc ttc tac gcc gag atc gag cac ttc 912Pro Gln Gly Val Cys Ser Arg Gly Phe Tyr Ala Glu Ile Glu His Phe

290 295 300ctt cct ata gaa tat ttc gcg gaa gcc gcc acc aac tac act att ttc 960Leu Pro Ile Glu Tyr Phe Ala Glu Ala Ala Thr Asn Tyr Thr Ile Phe305 310 315 320caa cag ggc cag acg tct cgc atg aag gca ccc tac aac aag cag atg 1008Gln Gln Gly Gln Thr Ser Arg Met Lys Ala Pro Tyr Asn Lys Gln Met

325 330 335gtc atg cag cac cgt tcg ctc aag ggt gat gat aca tac ttg tcc cca 1056Val Met Gln His Arg Ser Leu Lys Gly Asp Asp Thr Tyr Leu Ser Pro

340 345 350gtt aac acc tac aac ctt ggc cca gac ctt agc ggt gtt ttt gga gtc 1104Val Asn Thr Tyr Asn Leu Gly Pro Asp Leu Ser Gly Val Phe Gly Val

355 360 365atc gag att gac tgg atc caa gaa tac aac aac ttc acc act ctc tgg 1152Ile Glu Ile Asp Trp Ile Gln Glu Tyr Asn Asn Phe Thr Thr Leu Trp

370 375 380cag aac cag gaa ttg gcc cat gaa ttc ctc cct cag ttt ggt gaa acc 1200Gln Asn Gln Glu Leu Ala His Glu Phe Leu Pro Gln Phe Gly Glu Thr385 390 395 400tac aac gct cgc tcg cac tgg aac aag atg agc gct cct aat gcc act 1248Tyr Asn Ala Arg Ser His Trp Asn Lys Met Ser Ala Pro Asn Ala Thr

405 410 415tat acc ctg gag aaa ttc ccc aag ctg ccc gag ttc ttg gcc atc cag 1296Tyr Thr Leu Glu Lys Phe Pro Lys Leu Pro Glu Phe Leu Ala Ile Gln

420 425 430aag cgt cag gac ccc aag tgc cag ttc gtt aac gaa ttc ctg gtt gag 1344Lys Arg Gln Asp Pro Lys Cys Gln Phe Val Asn Glu Phe Leu Val Glu

435 440 445cag ctt gga att acg cgc tgt gca aac tat atc tct gta taa 1386Gln Leu Gly Ile Thr Arg Cys Ala Asn Tyr Ile Ser Val

450 455 460<210>5<211>461<212>PRT<213>未知生物<220><223>未知生物描述：青霉属D-萄糖酸内酯成熟蛋白<400>5Met Tyr Arg Trp Phe Asn Trp Gln Phe Glu Val Thr Cys Gln Ser Asp1 5 10 15Ala Tyr Ile Ala Pro His Asn Glu His Ala Ala Ala Glu Phe Leu Lys

20 25 30Glu Gln Tyr Pro Lys Ser Ser His Ile Lys Val Val Gly Asn Gly His

35 40 45Gly Phe Gly Asn Leu Thr Thr Cys Val Asp Asn Ala Leu Thr Glu Lys

50 55 60Pro Thr Tyr Ile Val Ser Leu Thr Asn Leu Lys Lys Leu His Ile Asp65 70 75 80Lys Lys Asn Leu Thr Val Thr Phe Gly Ala Gly Trp Asp Val Asp Asp

85 90 95Leu Ile Gln Glu Leu Lys Ala Asn Asp Leu Ser Phe Ser Asn Leu Gly

100 105 110Val Glu Arg Val Gln Asn Phe Val Gly Ala Ala Ser Thr Gly Thr His

115 120 125Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Asn Ile Ala Thr Gln Ile Ile Gly Leu

130 135 140Arg Val Leu Asp Ser Gln Gly Gly Leu Arg Val Ile Asn Glu Lys His145 150 155 160Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Phe Arg Ile Ser Leu Gly Ala Leu Gly

165 170 175Leu Ile Thr Glu Leu Thr Ile Lys Val Gln Pro Thr Gln Leu Leu Lys

180 185 190Lys Thr Thr Lys Val Leu Asn Ala Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Met Tyr

195 200 205Asn Glu Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Glu His Asp Arg Met Thr Val Trp

210 215 220Gly Pro His Phe Asp Trp Asn Ala Lys Ser Gln Ser Trp Asp Leu Glu225 230 235 240Pro Thr Tyr Phe Leu Ser Tyr Trp Glu Pro Thr Asn Tyr Thr Gly Val

245 250 255Arg Asn Cys Thr Leu Asn Tyr Cys Ala Asn Gly Cys Gly Asp Cys Lys

260 265 270Lys Glu Tyr Ile Cys Tyr Asp Glu Val Thr Asp Ala Ala Ser Cys Ser

275 280 285Pro Gln Gly Val Cys Ser Arg Gly Phe Tyr Ala Glu Ile Glu His Phe

290 295 300Leu Pro Ile Glu Tyr Phe Ala Glu Ala Ala Thr Asn Tyr Thr Ile Phe305 310 315 320Gln Gln Gly Gln Thr Ser Arg Met Lys Ala Pro Tyr Asn Lys Gln Met

325 330 335Val Met Gln His Arg Ser Leu Lys Gly Asp Asp Thr Tyr Leu Ser Pro

340 345 350Val Asn Thr Tyr Asn Leu Gly Pro Asp Leu Ser Gly Val Phe Gly Val

355 360 365Ile Glu Ile Asp Trp Ile Gln Glu Tyr Asn Asn Phe Thr Thr Leu Trp

370 375 380Gln Asn Gln Glu Leu Ala His Glu Phe Leu Pro Gln Phe Gly Glu Thr385 390 395 400Tyr Asn Ala Arg Ser His Trp Asn Lys Met Ser Ala Pro Asn Ala Thr

405 410 415Tyr Thr Leu Glu Lys Phe Pro Lys Leu Pro Glu Phe Leu Ala Ile Gln

420 425 430Lys Arg Gln Asp Pro Lys Cys Gln Phe Val Asn Glu Phe Leu Val Glu

435 440 445Gln Leu Gly Ile Thr Arg Cys Ala Asn Tyr Ile Ser Val

450 455 460<210>6<211>480<212>PRT<213>未知生物<220><223>未知生物描述：青霉属D-萄糖酸内酯蛋白<400>6Met Leu Ser Pro Lys Pro Ala Phe Leu Leu Leu Leu Leu His Ala Val1 5 10 15Phe Gly Ser Ala Tyr Arg Trp Phe Asn Trp Gln Phe Glu Val Thr Cys

20 25 30Gln Ser Asp Ala Tyr Ile Ala Pro His Asn Glu His Ala Ala Ala Glu

35 40 45Phe Leu Lys Glu Gln Tyr Pro Lys Ser Ser His Ile Lys Val Val Gly

85 90 95His Ile Asp Lys Lys Asn Leu Thr Val Thr Phe Gly Ala Gly Trp Asp

100 105 110Val Asp Asp Leu Ile Gln Glu Leu Lys Ala Asn Asp Leu Ser Phe Ser

115 120 125Asn Leu Gly Val Glu Arg Val Gln Asn Phe Val Gly Ala Ala Ser Thr

165 170 175Glu Lys His Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Phe Arg Ile Ser Leu Gly

180 185 190Ala Leu Gly Leu Ile Thr Glu Leu Thr Ile Lys Val Gln Pro Thr Gln

195 200 205Leu Leu Lys Lys Thr Thr Lys Val Leu Asn Ala Thr Ser Asp Tyr Ser

245 250 255Asp Leu Glu Pro Thr Tyr Phe Leu Ser Tyr Trp Glu Pro Thr Asn Tyr

260 265 270Thr Gly Val Arg Asn Cys Thr Leu Asn Tyr Cys Ala Asn Gly Cys Gly

275 280 285Asp Cys Lys Lys Glu Tyr Ile Cys Tyr Asp Glu Val Thr Asp Ala Ala

325 330 335Thr Ile Phe Gln Gln Gly Gln Thr Ser Arg Met Lys Ala Pro Tyr Asn

340 345 350Lys Gln Met Val Met Gln His Arg Ser Leu Lys Gly Asp Asp Thr Tyr

355 360 365Leu Ser Pro Val Asn Thr Tyr Asn Leu Gly Pro Asp Leu Ser Gly Val

405 410 415Gly Glu Thr Tyr Asn Ala Arg Ser His Trp Asn Lys Met Ser Ala Pro

420 425 430Asn Ala Thr Tyr Thr Leu Glu Lys Phe Pro Lys Leu Pro Glu Phe Leu

435 440 445Ala Ile Gln Lys Arg Gln Asp Pro Lys Cys Gln Phe Val Asn Glu Phe

450 455 460Leu Val Glu Gln Leu Gly Ile Thr Arg Cys Ala Asn Tyr Ile Ser Val465 470 475 480<210>7<211>24<212>PRT<213>未知生物<220><223>未知生物描述：青霉属D-萄糖酸内酯肽<220><221>不确定<222>(12)<223>位置12的Xaa是半胱氨酸或任何糖基化氨基酸残基<400>7Tyr Arg Trp Phe Asn Trp Gln Phe Glu Val Thr Xaa Gln Ser Asp Ala1 5 10 15Tyr Ile Ala Pro His Asn Glu His

20<210>8<211>17<212>PRT<213>未知生物<220><223>未知生物描述：青霉属D-萄糖酸内酯肽<400>8Glu His Asp Arg Met Thr Val Cys Gly Pro His Phe Asp Tyr Asn Ala1 5 10 15Lys<210>9<211>20<212>PRT<2l3>未知生物<220><223>未知生物描述：青霉属D-萄糖酸内酯肽<400>9Glu Tyr Ile Cys Tyr Asp Glu Val Thr Asp Ala Ala Ser Cys Ser Pro1 5 10 15Gln Gly Val Val

20<210>10<211>16<212>PRT<213>未知生物<220><223>未知生物描述：青霉属D-萄糖酸内酯肽<400>10Cys Gln Phe Val Asn Glu Phe Leu Val Glu Gln Leu Gly I1e Thr Arg1 5 10 15<210>11<211>20<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述：D-萄糖酸内酯寡核苷酸<220><221>不确定<222>(3)<223>位置3的Y是T和C的混合物<220><221>不确定<222>(12)<223>位置12的Y是T和C的混合物<220><221>不确定<222>(15)<223>位置15的Y是T和C的混合物<220><221>不确定<222>(6)<223>位置6的N是肌苷磷酸残基<400>11taycgntggt tyaaytggca 20<210>12<211>38<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述：D-萄糖酸内酯寡核苷酸<220><221>不确定<222>(6)<223>位置6的Y是T和C的混合物<220><221>不确定<222>(9)<223>位置9的Y是T和C的混合物<220><221>不确定<222>(21)<223>位置21的Y是T和C的混合物<220><221>不确定<222>(33)<223>位置33的Y是T和C的混合物<220><221>不确定<222>(3)<223>位置3的N是肌苷磷酸残基<220><221>不确定<222>(12)<223>位置12的N是肌苷磷酸残基<220><221>不确定<222>(15)<223>位置15的N是肌苷磷酸残基<220><221>不确定<222>(27)<223>位置27的N是肌苷磷酸残基<400>12ccnarytgyt cnacnarraa ytcrttnacr aaytgrca 38<210>13<211>21<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述：D-萄糖酸内酯寡核苷酸<400>13agctctcgag atctcccggg a 21<210>14<211>21<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述：D-萄糖酸内酯寡核苷酸<400>14agcttcccgg gagatctcga g 21<210>15<211>38<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述：D-萄糖酸内酯寡核苷酸有义引物<400>15gaagaagctt accggtggtt caattggcag tttttggt 38<210>16<211>37<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述：D-萄糖酸内酯寡核苷酸反义引物<400>16caaagcttct agagcctcag accactcata tcacatc 37<210>17<211>549<212>PRT<213>未知生物<220><223>未知生物描述：D-萄糖酸内酯融合蛋白<400>17Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65 70 75 80Ser Leu Asp Lys Arg Glu Ala Glu Ala Tyr Arg Trp Phe Asn Trp Gln

85 90 95Phe Leu Val Thr Cys Gln Ser Asp Ala Tyr Ile Ala Pro His Asn Glu

100 105 110His Ala Ala Ala Glu Phe Leu Lys Glu Gln Tyr Pro Lys Ser Ser His

115 120 125Ile Lys Val Val Gly Asn Gly His Gly Phe Gly Asn Leu Thr Thr Cys

130 135 140Val Asp Asn Ala Leu Thr Glu Lys Pro Thr Tyr Ile Val Ser Leu Thr145 150 155 160Asn Leu Lys Lys Leu His Ile Asp Lys Lys Asn Leu Thr Val Thr Phe

165 170 175Gly Ala Gly Trp Asp Val Asp Asp Leu Ile Gln Glu Leu Lys Ala Asn

180 185 190Asp Leu Ser Phe Ser Asn Leu Gly Val Glu Arg Val Gln Asn Phe Val

195 200 205Gly Ala Ala Ser Thr Gly Thr His Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Asn

210 215 220Ile Ala Thr Gln Ile Ile Gly Leu Arg Val Leu Asp Ser Gln Gly Gly225 230 235 240Leu Arg Val Ile Asn Glu Lys His Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Phe

245 250 255Arg Ile Ser Leu Gly Ala Leu Gly Leu Ile Thr Glu Leu Thr Ile Lys

260 265 270Val Gln Pro Thr Gln Leu Leu Lys Lys Thr Thr Lys Val Leu Asn Ala

275 280 285Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Met Tyr Asn Glu Leu Ala Gln Leu Tyr Lys

290 295 300Glu His Asp Arg Met Thr Val Trp Gly Pro His Phe Asp Trp Asn Ala305 310 315 320Lys Ser Gln Ser Trp Asp Leu Glu Pro Thr Tyr Phe Leu Ser Tyr Trp

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370 375 380Phe Tyr Ala Glu Ile Glu His Phe Leu Pro Ile Glu Tyr Phe Ala Glu385 390 395 400Ala Ala Thr Asn Tyr Thr Ile Phe Gln Gln Gly Gln Thr Ser Arg Met

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435 440 445Asp Leu Ser Gly Val Phe Gly Val Ile Glu Ile Asp Trp Ile Gln Glu

450 455 460Tyr Asn Asn Phe Thr Thr Leu Trp Gln Asn Gln Glu Leu Ala His Glu465 470 475 480Phe Leu Pro Gln Phe Gly Glu Thr Tyr Asn Ala Arg Ser His Trp Asn

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530 535 540Asn Tyr Ile Ser Val545<210>18<211>38<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物描述：D-萄糖酸内酯寡核苷酸<400>18ccaacaattg atgctgagcc ctaagccggc tttcctgc 38

Claims

1.一种分离的核酸分子，该核酸分子编码D-葡糖酸内酯氧化酶。

2.权利要求1的核酸分子，所述核酸分子分离自真菌。

3.权利要求2的核酸分子，所述核酸分子分离自青霉属(Pencicillium)真菌。

4.权利要求3的核酸分子，所述核酸分子分离自Penicilliumgriseoroseum、特异青霉(Pencillium notatum)、蓝青霉(Penicilliumcyaneum)或斜卧青霉(Penicillium decumbens)。

5.权利要求4的核酸分子，所述核酸分子分离自Penicilliumgriseoroseum。

6.一种分离的核酸分子，该核酸分子包括SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3。

7.一种分离的核酸分子，当与SEQ ID NO：4的氨基酸序列比较时，所述核酸分子编码蛋白具有至少约70％序列同一性。

8.一种分离的核酸分子，该核酸分子在严格条件下与权利要求6中的任一种核酸杂交。

9.一种表达载体，它包含权利要求1-8中任一项的核酸分子。

10.一种转化宿主细胞，该宿主细胞包含权利要求9的表达载体。

11.权利要求6的分离的核酸分子，它还存在至少一种添加、缺失、插入或突变，其中所述核酸分子编码具有酶促活性的D-葡糖酸内酯氧化酶。

12.一种D-葡糖酸内酯氧化酶蛋白，它是由权利要求1-8和11中任一项的核酸分子编码的D-葡糖酸内酯氧化酶蛋白。

13.一种生产D-葡糖酸内酯氧化酶的方法，该方法包括培养权利要求10的细胞，以及从所述培养物回收D-葡糖酸内酯氧化酶。

14.一种D-葡糖酸内酯氧化酶，该氧化酶具有SEQ ID NO：4。

15.一种转化葡萄糖成为异抗坏血酸的方法，该方法包括使葡萄糖与葡萄糖氧化酶接触形成D-葡糖酸内酯，然后使所述D-葡糖酸内酯与由权利要求1-8和11的核酸编码的D-葡糖酸内酯氧化酶在足以产生异抗坏血酸的条件下接触一定时间。

16.一种转化D-葡糖酸内酯成为异抗坏血酸的方法，该方法包括使所述D-葡糖酸内酯与权利要求1-8和11的D-葡糖酸内酯氧化酶在足以产生异抗坏血酸的条件下接触一定时间。

17.权利要求15的方法，所述方法还包括回收所述异抗坏血酸。

18.权利要求16的方法，所述方法还包括回收所述异抗坏血酸。

19.一种异抗坏血酸，它是使用权利要求15的方法生产的异抗坏血酸。

20.一种异抗坏血酸，它是使用权利要求16的方法生产的异抗坏血酸。

21.权利要求15的方法，其中所述葡萄糖与所述葡萄糖氧化酶在过氧化氢酶存在下接触。

22.权利要求10的转化宿主细胞，所述宿主细胞还包含表达葡萄糖氧化酶的基因。

23.权利要求20的转化宿主细胞，所述宿主细胞还包含表达过氧化氢酶的基因。

24.权利要求10的转化宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母。

25.权利要求10的转化宿主细胞，其中所述宿主细胞是丝状真菌。