JPH07222591A

JPH07222591A - 発現系、組込みベクター及びその組込みベクターで形質転換された細胞

Info

Publication number: JPH07222591A
Application number: JP7011429A
Authority: JP
Inventors: Dirk Carrez; カレーディルク; Joeel Roos; ロースジョエル
Original assignee: Solvay SA
Current assignee: Solvay SA
Priority date: 1994-01-28
Filing date: 1995-01-27
Publication date: 1995-08-22
Also published as: FI950321A; BE1008737A3; CA2140698A1; AU1027995A; FI950321A0; BR9500368A; US5783414A; EP0665291A1

Abstract

(57)【要約】【目的】発現系を含む形質転換糸状菌株によってグル
コースオキシダーゼの発現及び有効な分泌を得ることを
可能にする発現系の提供。【構成】グルコースオキシダーゼの細胞外生産に使用
できる発現系であって、プロモーター配列、グルコース
オキシダーゼ分泌シグナル配列、成熟グルコースオキシ
ダーゼ配列、及びターミネーター配列を含むことを特徴
とする発現系を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、グルコースオキシダー
ゼの生産に使用できる発現系に関し、更に詳細には、グ
ルコースオキシダーゼの細胞外生産を達成することがで
きる発現系に関する。本発明は、また、その発現系を含
む組込みベクター及びその組込みベクターで形質転換さ
れた細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】グルコースオキシダーゼは、国際方式に
おいて参照 E.C.1.1.3.4. 又はβ−Ｄ−グルコース：酸
素１−オキシドレダクターゼとして分類されている。こ
の酵素は、β−Ｄ−グルコースの、その後グルコン酸に
加水分解されるＤ−グルコノ−δ−ラクトンへの酸化反
応を触媒する。この反応は、野生型アスペルギルス株に
よって産生されるカタラーゼの作用によって酸素と水に
変換される過酸化水素を生成する。グルコースオキシダ
ーゼは、糸状菌株、特にアスペルギルス(Aspergillus)
株によって天然に産生される。残念ながら、これらのア
スペルギルス株によって産生されたグルコースオキシダ
ーゼはこれらの菌株の培養基にほとんど分泌されず、グ
ルコースオキシダーゼは細胞壁を通過しない(WITTE-VEE
N C.F.B.ら, Applied and Environmental Microbiolog
y, 1992, 58 (4), p. 1190-1194) 。従って、工業的に
は、グルコースオキシダーゼは細胞内酵素として処理さ
れる。アスペルギルス細胞は、グルコースオキシダーゼ
の回収及び精製前に切断されなければならない。収集が
拘束を課す前の細胞切断の追加段階は工業的に実施が困
難であり、更に、収量の著しい低下を生じる。実際に、
細胞の切断後、得られた水性懸濁液はグルコースオキシ
ダーゼを溶解したものを他の酵素及びポリペプチドと共
に、多少可溶性の多くの細胞も共に含んでいる。従っ
て、純粋な又は工業的に使用できるグルコースオキシダ
ーゼを得るためには、いくつかの分離操作を必要とする
精製段階が不可欠である。このために、グルコースオキ
シダーゼの細胞外生産、即ち、酵素の培養基への分泌が
長い間探索されてきた。

【０００３】更に、カタラーゼが培地中に最少量でしか
存在しないグルコースオキシダーゼの生産方法が長い間
探索されてきた。この目的は、グルコースオキシダーゼ
触媒反応で形成された過酸化水素が培地中に存在するカ
タラーゼによって酸素と水に分解されないように防止す
るためである。このような関係において、酵母をプラス
ミドで形質転換する提案が国際特許出願第 89/12,675号
でなされている。このプラスミドは、酵母デヒドロゲナ
ーゼ（ＡＤＨ２−ＧＡＰ）のプロモーター配列、アスペ
ルギルス・ニガー(Aspergillusniger) グルコースオキ
シダーゼ分泌シグナル配列又はサッカロミセス・セレビ
シエ(Saccharomyces cerevisiae)α交配因子分泌シグナ
ル配列、アスペルギルス・ニガーグルコースオキシダ
ーゼ成熟配列及び酵母デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）のタ
ーミネーターを含んでいる。形質転換酵母（サッカロミ
セス・セレビシエ）は、グルコースオキシダーゼを分泌
する。欧州特許出願第 0,357,127号には、ウシキモシン
の生産に使用できる発現系が記載されている。この発現
系は、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼプロ
モーター配列、アスペルギルス・ニガーグルコアミラ
ーゼシクナルペプチド配列、ウシキモシンコード配列及
びアスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼターミネ
ーター配列を含んでいる。この発現系を含む形質転換ア
スペルギルス・ニガー株は、ウシキモシンを得ることを
可能にする。現在、発現系を含む形質転換糸状菌株によ
ってグルコースオキシダーゼの発現及び有効な分泌を得
ることを可能にする発現系は知られていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の主な目的は、
発現系を含む形質転換株が培養される培養基中でグルコ
ースオキシダーゼを得ることを可能にする発現系を提供
することである。本発現系は、グルコースオキシダーゼ
の実質的な細胞外生産を得ることを可能にする。更に、
本発現系は、カタラーゼをほとんど含まずにグルコース
オキシダーゼを含む酵素組成物を得ることを可能にす
る。グルコースオキシダーゼは、β−Ｄ−グルコース
の、その後グルコン酸に加水分解されるＤ−グルコノ−
δ−ラクトンへの酸化反応を触媒する酵素を意味すると
理解されるものである。この酵素は、国際方式において
参照 E.C.1.1.3.4. 又はβ−Ｄ−グルコース：酸素１−
オキシドレダクターゼとして分類されている。この定義
には、天然酵素及びヌクレオチド又はアミノ酸配列が遺
伝子工学手法又は突然変異誘発手法によって修飾された
酵素のような修飾酵素が含まれる。本発明の目的は、ま
た、組込みベクター及び上記の発現系を含むプラスミド
を提供することである。本発明の目的は、また、グルコ
ースオキシダーゼを発現するとともにその培養基に高レ
ベルの生産性で分泌する上記の組込みベクター又はプラ
スミドによって形質転換された菌株、特に形質転換アス
ペルギルス株、特に形質転換アスペルギルス・ホエチダ
ス(Aspergillus foetidus)株を提供することである。本
形質転換株によるグルコースオキシダーゼの分泌は、実
質的に細胞外である。本発明の目的は、また、大量のグ
ルコースオキシダーゼを産生するとともにそれをほとん
ど完全に細胞外に分泌する糸状菌株を用いるグルコース
オキシダーゼの生産方法を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】これを目的として、本発
明は、グルコースオキシダーゼの細胞外生産に使用でき
る発現系であって、少なくともプロモーター配列、グル
コースオキシダーゼ分泌シグナル配列、及びグルコース
オキシダーゼ成熟配列、を含むことを特徴とする発現系
に関する。一般に、発現系は、更に、ターミネーター配
列を含む。好ましい態様においては、プロモーター配列
はグルコアミラーゼプロモーター配列である。本発明
は、グルコースオキシダーゼの細胞外生産に使用できる
発現系であって、少なくともアスペルギルス・ホエチダ
スグルコアミラーゼプロモーター配列、アスペルギル
ス・ホエチダスグルコースオキシダーゼ分泌シグナル
配列、アスペルギルス・ホエチダスグルコースオキシ
ダーゼ成熟配列、及びアスペルギルス・ホエチダスグ
ルコアミラーゼターミネーター配列、を含むことを特徴
とする発現系に関する。

【０００６】発現系は、糸状菌のゲノムに組込まれかつ
この菌にグルコースオキシダーゼの生合成に必要とされ
る遺伝情報を与えることができる分子単位を意味すると
理解されるものである。プロモーターは、転写プロモー
ターを意味すると理解されるものである。強力な転写活
性を示すＤＮＡ配列からなるプロモーターは、転写を促
進するＤＮＡ配列、例えば『エンハンサー』又は『上流
活性化配列』の名称で知られる配列が先行する。プロモ
ーターは、融合コードＤＮＡの発現に影響する転写調節
配列を含む。遺伝子プロモーター配列は、転写を調節し
かつ遺伝子発現で関与する配列を含む。

【０００７】一般に、プロモーター配列は糸状菌に由来
する。通常はアスペルギルス株に由来する。好ましく
は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 、ア
スペルギルス・ホエチダス(Aspergillus foetidus)、ア
スペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori) 又はア
スペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)株に由来す
る。特に好ましくは、アスペルギルス・ニガー株又はア
スペルギルス・ホエチダス株に由来する。グルコアミラ
ーゼプロモーター配列が由来するアスペルギルス・ニガ
ー株及びアスペルギルス・ホエチダス株は、例えばアス
ペルギルス・ニガー株ＮＲＲＬ３（アグリカルチュラル
・リサーチ・サービス・カルチュア・コレクション（Ｎ
ＲＲＬ）,1815 ノースユニバーシティストリート, ペオ
リア, イリノイ 61604, 米国) 、アスペルギルス・ニガ
ー株ＡＴＣＣ１３４９６（アメリカン・タイプ・カルチ
ュア・コレクション, 12301 パークラウンドライブ，ロ
ックビル，メリーランド 20852-1776,米国) 、アスペル
ギルス・ニガー株ＡＴＣＣ２２３４３、アスペルギルス
・ニガー株ＡＴＣＣ４６８９０、アスペルギルス・ホエ
チダス株ＡＴＣＣ１０２５４及びアスペルギルス・ホエ
チダス株ＡＴＣＣ１４９１６が既知である。好ましく
は、グルコアミラーゼプロモーター配列はアスペルギル
ス・ホエチダス株に由来する。特に好ましくは、アスペ
ルギルス・ホエチダス株ＳＥ４に由来する。配列番号７
のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、アスペルギル
ス・ホエチダス株ＳＥ４プロモーターをコードする。

【０００８】本発明は、また、アスペルギルス・ホエチ
ダスグルコアミラーゼプロモーターに関する。更に詳
細には、本発明は、アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４
グルコアミラーゼプロモーターをコードする配列番号７
のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子に関する。グルコ
ースオキシダーゼ分泌シグナル配列は、勿論グルコース
オキシダーゼ成熟配列のアミノ末端に操作的に結合され
るアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を意味すると理解
されるものである。グルコースオキシダーゼをコードす
る遺伝子はクローン化及び配列決定されており、この研
究から推論されたアミノ酸配列はより複雑である以外は
シグナルペプチドの特徴を有する前配列の存在を示して
いる (WHITTINGTON H.ら, Curr. Genet., 18 (1990),
p. 531-536)。このために、本明細書においては、仮定
のシグナルペプチドをコードする構造遺伝子部分を『グ
ルコースオキシダーゼ分泌シグナル配列』と称し、グル
コースオキシダーゼだけをコードする構造遺伝子部分を
『グルコースオキシダーゼ成熟配列』と称する。

【０００９】一般に、グルコースオキシダーゼ分泌シグ
ナル配列は糸状菌株に由来する。通常はアスペルギルス
株又はペニシリウム株に由来する。好ましくは、アスペ
ルギルス株、特にアスペルギルス・ニガー、アスペルギ
ルス・ホエチダス、アスペルギルス・アワモリ又はアス
ペルギルス・オリゼ株に由来する。特に好ましくは、ア
スペルギルス・ニガー株又はアスペルギルス・ホエチダ
ス株に由来する。アスペルギルス・ニガー株ＮＲＲＬ３
（アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチュ
ア・コレクション（ＮＲＲＬ）,1815 ノースユニバーシ
ティストリート, ペオリア, イリノイ 61604, 米国) の
グルコースオキシダーゼ分泌シグナル配列を用いて良好
な結果が得られた。この配列は、The Journal of Biolo
gical Chemistry, 1990, 265 (7), p.3793-3802 に発表
されている。アスペルギルス・ホエチダス株ＡＴＣＣ１
４９１６（アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクシ
ョン 12301パークラウンドライブ, ロックビル, メリー
ランド 20852-1776,米国)のグルコースオキシダーゼ分
泌シグナル配列でも良好な結果が得られた。

【００１０】本発明による発現系は、グルコースオキシ
ダーゼ成熟配列を含んでいる。グルコースオキシダーゼ
成熟配列は、活性タンパク質、即ち、分泌シグナル配列
なしのグルコースオキシダーゼ構造遺伝子に対応するグ
ルコースオキシダーゼコード配列に翻訳される配列部分
を意味すると理解されるものである。コード配列（構造
遺伝子）は、分泌シグナル配列とグルコースオキシダー
ゼ成熟配列を含む。一般に、グルコースオキシダーゼ成
熟配列は糸状菌株に由来する。通常は、アスペルギルス
株又はペニシリウム株に由来する。好ましくは、アスペ
ルギルス株、特にアスペルギルス・ニガー、アスペルギ
ルス・ホエチダス、アスペルギルス・アワモリ又はアス
ペルギルス・オリゼ株に由来する。特に好ましくは、ア
スペルギルス・ニガー株又はアスペルギルス・ホエチダ
ス株に由来する。アスペルギルス・ニガー株ＮＲＲＬ３
のグルコースオキシダーゼ成熟配列を用いて良好な結果
が得られた。この配列は、The Journal of Biological
Chemistry, 1990, 265(7), p.3793-3802 に発表されて
いる。アスペルギルス・ホエチダス株ＡＴＣＣ１４９１
６（アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション）
のグルコースオキシダーゼ成熟配列でも良好な結果が得
られた。

【００１１】本発明の好ましい態様においては、グルコ
ースオキシダーゼ分泌シグナル配列とグルコースオキシ
ダーゼ成熟配列は同一糸状菌に由来する。アスペルギル
ス・ホエチダス株ＡＴＣＣ１４９１６のグルコースオキ
シダーゼ分泌シグナル配列及びアスペルギルス株ＡＴＣ
Ｃ１４９１６のグルコースオキシダーゼ成熟配列を含む
本発明による発現系を用いて優れた結果が得られた。ア
スペルギルス・ニガー株ＮＲＲＬ３のグルコースオキシ
ダーゼ分泌シグナル配列及びアスペルギルス・ニガー株
ＮＲＲＬ３のグルコースオキシダーゼ成熟配列を含む本
発明による発現系でも優れた結果が得られた。ターミネ
ーターは、転写ターミネーターであると理解されるもの
である。遺伝子のターミネーター配列は、この遺伝子の
転写を終結するように作用するＤＮＡ配列である。ター
ミネーターは、ｍＲＮＡを安定化するポリアデニル化シ
グナルも含む。

【００１２】一般に、ターミネーターは糸状菌に由来す
る。本出願においては、糸状菌内で機能するターミネー
ターが適している。ターミネーターは当業者に既知であ
る。菌類由来の既知のターミネーターの例としては、ｔ
ｒｐＣターミネーター、グルコアミラーゼターミネータ
ー、アミラーゼターミネーター、α−アミラーゼターミ
ネーター、アスパラギン酸プロテアーゼターミネータ
ー、酸ホスファターゼターミネーター、リパーゼターミ
ネーター、セルラーゼターミネーター、解糖酵素ターミ
ネーター、グルカナーゼターミネーター、ヒドロラーゼ
ターミネーター及びデヒドロゲナーゼターミネーター、
特にアスペルギルス・ニドュランス(Aspergillus nidul
ans)ｔｒｐＣターミネーター、アスペルギルス・ニガー
グルコアミラーゼターミネーター、アスペルギルス・
ニガー α−アミラーゼターミネーター、ムコール・ミ
エヘイ(Mucor miehei)アスパラギン酸プロテアーゼター
ミネーター、アスペルギルス・ニガー酸ホスファター
ゼターミネーター及びアスペルギルス・ニドュランス
アルコールデヒドロゲナーゼターミネーターが言及され
る。通常、ターミネーター配列はアスペルギルス株に由
来する。好ましくは、アスペルギルス・ニガー、アスペ
ルギルス・ホエチダス、アスペルギルス・アワモリ又は
アスペルギルス・オリゼ株に由来する。特に好ましく
は、アスペルギルス・ニガー株又はアスペルギルス・ホ
エチダス株に由来する。好ましい態様においては、ター
ミネーター配列はグルコアミラーゼターミネーター配列
である。好ましくは、グルコアミラーゼターミネーター
配列はアスペルギルス・ホエチダス株に由来する。特に
好ましくは、アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４に由
来する。配列番号８のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分
子は、アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４ターミネー
ターをコードする。

【００１３】本発明は、また、アスペルギルス・ホエチ
ダスグルコアミラーゼターミネーターに関する。更に
詳細には、本発明は、アスペルギルス・ホエチダスＳＥ
４グルコアミラーゼターミネーターをコードする配列番
号８のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子に関する。本
発明の好ましい態様においては、グルコアミラーゼプロ
モーター配列とグルコアミラーゼターミネーター配列は
同一糸状菌に由来する。アスペルギルス・ホエチダス株
グルコアミラーゼプロモーター配列及びアスペルギルス
・ホエチダス株グルコアミラーゼターミネーター配列を
含む本発明による発現系を用いて、良好な結果が得られ
た。アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４グルコアミラ
ーゼプロモーター配列及びアスペルギルス・ホエチダス
株ＳＥ４グルコアミラーゼターミネーター配列を含む本
発明による発現系を用いて、優れた結果が得られた。本
発明の発現系においては、プロモーター配列は、成熟配
列の上流に位置する分泌シグナル配列の上流に位置する
ことが好ましく、この成熟配列はターミネーター配列の
上流に位置する。これらの位置は、適切な条件下、転写
シグナル、即ちプロモーター及びターミネーターの調節
によってグルコースオキシダーゼを発現させるようにし
て選択される。

【００１４】発現系に含められる配列は操作的に結合さ
れることが好ましい。プロモーター配列は、グルコース
オキシダーゼ分泌シグナル配列に操作的に結合される。
グルコースオキシダーゼ分泌シグナル配列は、グルコー
スオキシダーゼ成熟配列に操作的に結合される。グルコ
ースオキシダーゼ成熟配列は、ターミネーター配列に操
作的に結合される。本発明は、また、少なくともプロモ
ーター配列、グルコースオキシダーゼ分泌シグナル配
列、グルコースオキシダーゼ成熟配列及びターミネータ
ー配列を含む発現系の調製方法に関する。本方法は下記
のことを含んでいる。グルコースオキシダーゼを産生す
る微生物のゲノムＤＮＡからグルコースオキシダーゼ分
泌シグナル配列及びグルコースオキシダーゼ成熟配列を
単離し、グルコースオキシダーゼ分泌シグナル配列及び
グルコースオキシダーゼ成熟配列をプロモーター配列及
びターミネーター配列を含むベクター内に導入する、な
お、この導入は配列の配置が該プロモーター及び該ター
ミネーターの調節によってグルコースオキシダーゼを発
現させるようにして選択された位置に行われる。

【００１５】本発明は、また、上記で定義された発現系
を含みかつグルコースオキシダーゼを発現させることが
できる組込みベクターに関する。本発明の原理は、ま
た、上記で定義された発現系を含みかつグルコースオキ
シダーゼを発現させることができる発現ベクターに適用
される。組込みベクターは、完全遺伝子発現単位を含む
ＤＮＡ配列を意味すると理解されるものである。完全遺
伝子発現単位は、構造遺伝子及びプロモーター領域及び
転写及び翻訳に必要とされる調節領域を意味すると理解
されるものである。構造遺伝子は、ＲＮＡへの転写に用
いられかつ宿主がタンパク質を合成することを可能にす
るコード配列を意味すると理解されるものである。本組
込みベクターはプラスミドであることが好ましい。プラ
スミドｐＦＧＯＤを用いて良好な結果が得られた。本発
明は、また、上記で定義された組込みベクターによって
形質転換された形質転換細胞（宿主細胞）に関する。本
形質転換細胞は、発現系に含められたプロモーター配列
及びターミネーター配列が本形質転換細胞によって認識
される、即ち、それらが本形質転換細胞に適合及び機能
するようにして選択され、発現系に含められたプロモー
ター配列及びターミネーター配列が形質転換細胞の各々
プロモーター及びターミネーターとしてそれらの各転写
シグナル機能を行う。

【００１６】通常、形質転換細胞は糸状菌の細胞であ
る。一般に、形質転換細胞はアスペルギルス細胞に由来
する。特に好ましくは、形質転換細胞はアスペルギルス
・ニガー、アスペルギルス・ホエチダス、アスペルギル
ス・アワモリ又はアスペルギルス・オリゼ細胞に由来す
る。形質転換アスペルギルス・ニガー細胞、特に形質転
換アスペルギルス・ニガー株ＮＲＲＬ３細胞を用いて良
好な結果が得られた。形質転換アスペルギルス・ホエチ
ダス細胞、特に形質転換アスペルギルス・ホエチダス株
ＳＥ４細胞を用いて優れた結果が得られた。本発明の好
ましい態様においては、組込みベクターによって形質転
換された細胞はプロモーター配列及び／又はターミネー
ター配列、発現系に含められた配列が由来する菌株に由
来する。形質転換アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４
細胞を用いて優れた結果が得られた。組込みベクターに
よって形質転換されたその細胞は本発明による発現系を
含み、その発現系はアスペルギルス・ホエチダスＳＥ４
プロモーター配列及びアスペルギルス・ホエチダスＳＥ
４ターミネーター配列、特にアスペルギルス・ホエチダ
スＳＥ４グルコアミラーゼプロモーター配列及びアスペ
ルギルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミラーゼターミネ
ーター配列を含んでいる。組込みベクターｐＦＧＯＤに
よって形質転換された細胞を用いて最良の結果が得られ
た。

【００１７】糸状菌は、真菌植物門の糸状体をすべて含
む真菌微生物を意味すると理解されるものである。この
門においては、接合菌類、子嚢菌類、担子菌類及び叢生
菌類のような不完全菌類群が含まれる。その定義には次
の属：アスペルギルス属、トリコデルマ(Trichoderma)
属、ニューロスポラ(Neurospora)属、ポドスポラ(Podos
pora) 属、エンドチア(Endothia)属、ムコール(Mucor)
属、コキオボラス(Cochiobolus) 属、ピリキュラリア(P
yricularia) 属、ペニシリウム(Penicillium)属及びフ
ミコーラ(Humicola)属が含まれる。本発明は、また、精
製及び単離アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４ｔｒに
関する。本形質転換株ＳＥ４ｔｒは株ＳＥ４から得られ
る。これは、ゲノムに組込まれたプラスミドｐＦＧＯＤ
を１コピー以上含む点でその株ＳＥ４と異なる。アスペ
ルギルス・ホエチダスＳＥ４は、アスペルギルス・ホエ
チダス株ＡＴＣＣ１４９１６から突然変異誘発によって
得られ、改良されたグルコアミラーゼ生産に基づいて選
ばれる。アスペルギルス・ホエチダスの名称は、アスペ
ルギルス・シトリカス(Aspergillus citricus)（アメリ
カン・タイプ・カルチュア・コレクションによって発表
された工業的菌類のＡＴＣＣ名, 1994, p.120)と同義で
ある。

【００１８】本発明は、また、グルコースオキシダーゼ
の細胞外生産方法であって、下記工程：グルコースオキ
シダーゼを発現及び分泌させる条件下、上記で定義され
た発現系を含む組込みベクターで細胞を形質転換する工
程、形質転換細胞を適切な培養基中で培養する工程、及
び分泌グルコースオキシダーゼを回収する工程を含むこ
とを特徴とする方法に関する。形質転換細胞を培養した
後得られた発酵培地は、ほとんどのグルコースオキシダ
ーゼを含んでいる。実際に、グルコースオキシダーゼは
実質的に形質転換株によって培養基に分泌される。本発
明の方法によって得られたグルコースオキシダーゼは細
胞外である。形質転換細胞を培養した後得られた発酵培
地は、カタラーゼをほとんど含まない。これは、実質的
にカタラーゼなしでグルコースオキシダーゼを含む酵素
組成物が得られることを可能にする。本発明は、また、
上記で定義された形質転換細胞によって産生されたグル
コースオキシダーゼに関する。

【００１９】グルコースオキシダーゼは、例えば、食品
工業、医薬工業及び化学工業において多くの工業的応用
がある。特に、血液グルコースレベルを測定するのに用
いられ、その適用の場合診断用キットに組込まれる。本
発明により得られたグルコースオキシダーゼは、カタラ
ーゼで汚染されないので、その適用において有利であ
る。グルコース及び酸素濃度を測定するために、グルコ
ースオキシダーゼを用いることができる。グルコースオ
キシダーゼは、特に食品又は飲料において酸素又はグル
コースを除去するために酸化防止剤として用いられる。
グルコースオキシダーゼは、また、むし歯を予防するた
めに錬歯磨に加えられる。グルコースオキシダーゼは、
腐食を防止するために塗料に混合されてきた。本発明の
図面において用いられる記号及び略号を表１に説明す
る。

【００２０】

【表１】表１記号略号意味 ──────────────────────────────────── AMPR アンピシリン耐性を与える遺伝子 ORI 大腸菌中の複製起点 GOD アスペルギルス・ホエチダス ATCC 14916 グルコースオキシダーゼコード配列 5′GA アスペルギルス・ホエチダス SE4 グルコーアミラーゼプロモーター 3′GA アスペルギルス・ホエチダス SE4 グルコーアミラーゼターミネーター GA アスペルギルス・ホエチダス SE4 グルコーアミラーゼコード配列 ────────────────────────────────────

【００２１】本発明は、下記実施例によって具体的に説
明される。

【００２２】

【実施例１】アスペルギルス・ホエチダスＡＴＣＣ１４９１６グルコ
ースオキシダーゼコード配列の単離麦芽エキス２％（重量／容量）、ペプトン(DIFCO) 0.１
％（重量／容量）及びグルコース２％（重量／容量）を
含有するＡＣＭ("アスペルギルス完全培地")液体栄養培
地上でアスペルギルス・ホエチダスＡＴＣＣ１４９１６
培養を調製する。３２℃で４８時間インキュベートした
後、菌糸体を収集する。GARBER, R.C.,YODER, O.L., An
al. Biochem. 135 (1983), p.416-422 に記載されてい
る方法に従って、アスペルギルス・ホエチダスＡＴＣＣ
１４９１６ゲノムＤＮＡを単離する。下記混合液を調製
する。蒸留水 62 μl ＰＣＲバッファー（１０×） 10 μl ｄＮＴＰｓ（各2.５mM） 8 μl オリゴヌクレオチド配列番号１（２０μM) 5 μl オリゴヌクレオチド配列番号２（２０μM) 5 μl ゲノムＤＮＡ（１０^-1〜１０^-4希釈液) 10 μl Ｔａｑポリメラーゼ（５U/μl) 0.2 μl

【００２３】"(１０×）反応バッファー組成物”と呼ば
れるＰＣＲバッファー、ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰをすべて意味する略号ｄＮＴ
Ｐｓ及び産物Ｔａｑポリメラーゼは、名称"GENEAMP DNA
AMPLIFICATION REAGENT KITwith AMPLITAQ Recombinan
t Taq DNA Polymerase"(PERKIN ELMER CETUS)として販
売されているキットの小冊子に記載されている。アスペ
ルギルス・ホエチダス株ＡＴＣＣ１４９１６から単離さ
れたゲノムＤＮＡは、その混合液中１μg/μl の濃度で
用いられる。アスペルギルス・ホエチダスＡＴＣＣ１４
９１６グルコースオキシダーゼコード配列は、ＰＣＲ法
(SAIKI, R.K.ら, SCIENCE, 239 (1988), p.487-491に記
載されている“ポリメラーゼ連鎖反応" 法) に従って単
離した。本実験において用いられた合成オリゴヌクレオ
チド配列は次の通りである。

【００２４】配列番号１ 5′-TGATGATCAGGATCCG GCGGCCGCACCTCAGCAATGCAGACTCTCCTTGTGAGCTCGCTT BamHI NotI GTG- 3′ 配列番号２ 5′-TCGATGAAGCTTCACTCACTGCATGGAAGCATAATCTTCCAAGATAGCATC - 3′ 配列番号３ 5′-GATGCTATCTTGGAAGATTATGCTTCCATGCAGTGAGTGAAGCTTCATCGA - 3′ HindIII 配列番号２の配列は、配列番号３の配列の補体である。
配列番号１のオリゴヌクレオチド配列は、ＢａｍＨＩ及
びＮｏｔＩ制限部位の情報、アスペルギルス・ホエチダ
スＳＥ４グルコアミラーゼの５′非翻訳領域及びグルコ
ースオキシダーゼコード配列の開始の情報を含む。配列
番号２のオリゴヌクレオチド配列及びその補体、配列番
号３のオリゴヌクレオチド配列は、グルコースオキシダ
ーゼコード配列の末端に対応するヌクレオチド及びＨｉ
ｎｄＩＩＩ制限部位の追加情報を含む。β−シアノエチ
ルホスホルアミダイトを用いてバイオサーチサイクロン
シンセサイザー装置で合成オリゴヌクレオチドを構築す
るために用いられる方法は、BEAUCAGE, S.L.ら (1981),
Tetrahedron Letters, 22, p.1859-1882 に記載されて
いる。

【００２５】ＰＣＲに伴う条件は次の通りである：９５
℃で２分、次に９５℃で１分、６０℃で１分及び７２℃
で２分を含む連続３０サイクル、次に７２℃で１０分、
次に２０℃の温度が維持される。このＰＣＲに用いられ
る他のパラメーターはすべて名称"GENEAMP DNA AMPLIFI
CATION REAGENT KIT with AMPLITAQ Recombinant TaqDN
A Polymerase"(PERKIN ELMER CETUS)として販売されて
いるキットの小冊子に記載されているものに対応する。
約1.８kbのＤＮＡ断片（１kg＝１０００塩基対）を上記
のように単離した。これをThe Journal of Biological
Chemistry, 1990, 265 (7), p.3793-3802 に発表されて
いる配列と制限分析法(Molecular Cloning - a laborat
ory manual - MANIATIS ら, (Cold Spring Harbor Labo
ratory) 1982, p.374-379 に記載されている分析) を用
いて比較した。本質的な差異は見出されなかった。得ら
れたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化し、次いで前もってＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位で消化されたプラスミドｐＵＣ１８(CLONTECH
Laboratories, No. 6110-1) とMolecular Cloning - a
laboratolry manual - SAMBROOK ら, 2 ed., 1989, p.
1.68-1.69に記載されている連結法に従って連結する。
そのことによりベクターｐＵＣＧＯＤ（図１）が得られ
る。

【００２６】

【実施例２】プラスミドｐＦＧＡ２ＭＵＴの構築プラスミドｐＦＧＡ２ＭＵＴ（図４）は、ＮｏｔＩクロ
ーン化部位がグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーターと
コード部分との間に作成され、ＨｉｎｄＩＩＩクローン
化部位がグルコアミラーゼ遺伝子のコード部分とターミ
ネーターとの間に作成されているアスペルギルス・ホエ
チダスＳＥ４グルコアミラーゼ遺伝子を含む。これらの
２つのクローン化部位、ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩは
下記のように突然変異誘発によって作成される。下記の
説明に従って、アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４グル
コアミラーゼ遺伝子を単離する。実施例１で記載したGA
RBERらの方法に従って、アスペルギルス・ホエチダス株
ＳＥ４染色体ＤＮＡを単離する。この単離染色体ＤＮＡ
を制限酵素ＳａｕＩＩＩＡで部分的に消化し、サイズが
８〜１０kbの断片を AUSUBEL, F.M.ら (1989), Current
Protocols in Molecular Biology (John WILLEY & Son
s), p.5.3.2-5.3.8 に記載されている方法に従ってショ
糖勾配を用いて単離及び精製する。これらの単離及び精
製断片を、前もって制限酵素ＢａｍＨＩで消化されたプ
ラスミドｐＢＲ３２２ (CLONTECH LABORATORIES カタロ
グ No.6210-1) に導入する。次いで大腸菌株ＤＨ５α(H
ANAHAN, D., J. Mol. Biol. (1983) 166, p.557-580 に
記載され、BETHESDA RESEARCH LABORATORIES (BRL), B.
R.L. Focus (1986) 8, p.9で販売されている) を形質転
換する。

【００２７】約１5,０００の形質転換大腸菌クローン
を、下記合成オリゴヌクレオチド（配列番号４）を用い
てハイブリッド形成法 (SAMBROOKら, p.9.52-9.55)によ
ってスクリーンする。 5′-GATTCATGGTTGAGCAACGAAGCGA - 3′ 選択は、BOELら, EMBO J. 3 (1984), p.1097-1102 に発
表されたグルコアミラーゼヌクレオチド配列に基づく。
このオリゴヌクレオチドを用いてハイブリッド形成する
コロニーを単離する。制限部位を分析し、この株が完全
グルコアミラーゼ遺伝子、即ちプロモーター、ターミネ
ーター及びコード領域並びに分泌シグナルを含むことが
わかる。8.７kbの断片をＢａｍＨＩ部位のプラスミドｐ
ＢＲ３２２に上記のように導入した。そのことにより、
8.７kbのアスペルギルスＤＮＡ挿入断片を含むベクター
ｐＦＧＡ１（図２）が作成される。この挿入断片はプラ
スミドｐＢＲ３２２とベクターｐＦＧＡ１との間の唯一
の相違である。

【００２８】ベクターｐＦＧＡ１由来でありかつベクタ
ーｐＦＧＡ１より小さな挿入断片を含むプラスミドは次
のように構築される。ベクターｐＦＧＡ１を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで消化し、次いでこの消化物からアスペルギル
ス・ホエチダスＳＥ４グルコアミラーゼプロモーター、
コード領域及びターミネーターを含むサイズが約５kbの
ＥｃｏＲＩ断片を ZHUら, 1985によって記載された方法
に従って単離する。次いでこのＥｃｏＲＩ断片を、前も
って制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＵＣ１
８に挿入する。そのことによりベクターｐＦＧＡ２（図
３）が作成される。アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４
グルコアミラーゼプロモーター及びターミネーターのヌ
クレオチド配列をSANGERら (1977) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74, p.5463-5467のジデオキシヌクレオチド鎖
終結法によって求めた。この配列の分析により、プロモ
ーター及びターミネーターの存在が示される。アスペル
ギルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミラーゼプロモター
をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）が同定さ
れる。アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミラ
ーゼターミネーターをコードするヌクレオチド配列（配
列番号８）が同定される。

【００２９】図６及び図７は、アスペルギルス・ホエチ
ダスＳＥ４グルコアミラーゼプロモターをコードするヌ
クレオチド配列を示すものである。図８は、アスペルギ
ルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミラーゼターミネータ
ーをコードするヌクレオチド配列を示すものである。Ｔ
７ＤＮＡポリメラーゼによる伸長配列を開始するために
用いられる合成オリゴヌクレオチドは、BEAUCAGEら (19
81) Tetrahedron letters 22, p.1859-1882の方法によ
って合成された。配列決定は、配列決定キット(PHARMAC
IA) の供給会社によって作成されたプロトコールに従っ
て行い、ＮａＯＨ処理によって二本鎖ＤＮＡの変性を行
った。配列決定法は、SAMBROOK, 1989, p.13.15 & 13.1
7 に記載されている。SAMBROOK, 1989, p.13.45-13.58
に記載されている方法に従ってポリアクリルアミド配列
決定ゲルを調製した。

【００３０】プラスミドｐＦＧＡ２に由来しかつプロモ
ーター及びターミネーターがＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉ制限部位によってコード部分から離れているアスペル
ギルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミラーゼ遺伝子を含
むプラスミドを下記のように構築する。そのことによ
り、プロモーターとターミネーターを含むプラスミドｐ
ＦＧＡ２内に２つの制限部位、ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩ
ＩＩが作成される。アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４
グルコアミラーゼプロモーター及びターミネーターは、
突然変異誘発キット(BIORAD)"MUTA-GENE PHAGEMID in v
itro MutagenesisKit" の技術的小冊子に記載されてい
る手順による２つの特定突然変異誘発によって作成され
たＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によって分けら
れる。この手順で用いられる合成オリゴヌクレオチド
は、各々次の配列番号５及び配列番号６である。 5′- GCCTGAGCTTCATCCCCAGCGCGGCCGCATCATTACACCTCAGCAATGT - 3′ NotI 5′- TGACTGACACCTGGCGGTGAAAGCTTCAATCAATCCATTTCGCTATAGTT - 3′ HindIII そのことにより、グルコアミラーゼ遺伝子の５′非翻訳
領域の始めにＮｏｔＩ制限部位及び停止コドンの後かつ
グルコアミラーゼの３′非翻訳領域にＨｉｎｄＩＩＩ切
断部位を含むベクターｐＦＧＡ２ＭＵＴが得られる。

【００３１】

【実施例３】組込みベクターの構築実施例１で得られたプラスミドｐＵＣＧＯＤを２つの制
限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、グル
コースオキシダーゼコード配列及びアスペルギルス・ホ
エチダスＳＥ４グルコアミラーゼ遺伝子の５′非翻訳領
域を含む断片をZHU, J.D.ら, BIO/TECHNOLOGY, 3, 198
5, p.1014-1016に記載されている方法に従って単離す
る。制限酵素によるプラスミドの部分及び完全消化は、
SAMROOKら, 1989, Chap.5.28-5.32 に記載されている
方法に従って行った。この断片を実施例２で得られたプ
ラスミドｐＦＧＡ２ＭＵＴのＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
クローン化部位に導入する。このプラスミドは、特定部
位突然変異誘発で作成されたＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉクローン化部位によって分かれたアスペルギルス・ホ
エチダスＳＥ４グルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター
とターミネーターを含む。従って、グルコアミラーゼコ
ード部分はグルコースオキシダーゼコード部分に置き換
わる。

【００３２】そのことにより、ベクターｐＦＧＯＤ（図
５）が得られる。このベクターｐＦＧＯＤは、アスペル
ギルス・ホエチダスグルコアミラーゼ転写シグナルの調
節によって、それ自体の分泌シグナルを含むグルコース
オキシダーゼコード配列を含んでいる。このベクターは
下記配列を含む発現系を含んでいる。アスペルギルス・
ホエチダスＳＥ４グルコアミラーゼプロモーター配列、
アスペルギルス・ホエチダスＡＴＣＣ１４９１６グルコ
ースオキシダーゼ分泌シグナル配列、成熟アスペルギル
ス・ホエチダスＡＴＣＣ１４９１６グルコースオキシダ
ーゼ配列、及びアスペルギルス・ホエチダスＳＥ４グル
コアミラーゼターミネーター配列。

【００３３】

【実施例４】アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４の形質転換アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４は、アスペルギル
ス・ホエチダス株ＡＴＣＣ１４９１６に由来する。アス
ペルギルス・ホエチダス株ＡＴＣＣ１４９１６をまず P
ONTECORVO, G., ROPER, J.A., HEMMONS, L.M., MACDONA
LD, K.D., BUFTON, A.W.J., Advances inGenetics 5 (1
953), p.141-238に記載されている方法に従って紫外線
による突然変異誘発処理に供する。デンプン（５％重量
／容量）を加えた寒天栄養培地 POTATO DEXTROSE AGAR
(DIFCO)上にこの処理株を播く。３２℃で４８時間イン
キュベートした後、デンプン加水分解の最大ハロを示す
コロニーを取り出し、寒天栄養培地で継代培養する。大
量のグルコアミラーゼを生産する菌株を単離する。ＳＥ
４と称するこの菌株は薄茶色の分生子を有する。次い
で、ベクターｐＦＧＯＤを、CARREZら, GENE, 94 (199
0), p.147-154に記載されている方法による共形質転換
でアスペルギルス・ホエチダスＳＥ４に導入する。アス
ペルギルス・ニドゥランスアセトアミダーゼ遺伝子
（ａｍｄＳ）を含むプラスミドｐ３ＳＲ２を選択マーカ
ーとして用いる。

【００３４】プラスミドｐ３ＳＲ２は、Hynes, M.J., C
orrick, C.M., King, J.A., Mol. Cell. Biol., 3 (198
3), p.1430-1439 に記載されている。形質転換は、KELL
Y, J.M., HYNES, M.J., EMBO J. 4 (1985), p.475-479
に記載されている方法に従ってこのプラスミドを用いて
行われる。アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４を等モ
ル量のプラスミドｐ３ＳＲ２及びｐＦＧＯＤで形質転換
した。約３５０の形質転換株が得られる。これらの形質
転換株をＡＢＴＳ(BOEHRINGER)を含有する寒天培地Ａに
選択してグルコースオキシダーゼの生産を検出する。グ
ルコースオキシダーゼを培養基に分泌する形質転換株の
コロニーは、３２℃で２時間インキュベートした後、グ
リーンハロに囲まれている。培地Ａは、グルコース１０
％（重量／容量）、ＡＢＴＳ（2,２′−アジノビス（３
−エチルベンズチアゾリンスルホネート))(BOEHRINGER)
0.０５％（重量／容量）及びホースラディッシュペルオ
キシダーゼ（プルプロガリン４６単位／mg,SIGMA)を加
える CZAPEK DOX AGAR培地(DIFCO) から構成されてい
る。約４０％の形質転換株がグルコースオキシダーゼを
分泌する。従って、それらのゲノムに選択しうるベクタ
ーｐ３ＳＲ２及び組込みベクターｐＦＧＯＤが組込まれ
た。

【００３５】

【実施例５】形質転換株の単離及び精製最大ハロを示す形質転換株を単離し、寒天培地 POTATO
DEXTROSE AGAR(DIFCO)上で継代培養する。胞子形成が行
われるまでこの培地上３２℃で５０の形質転換株を培養
する。胞子を収集し、生理的溶液に希釈し、次いで個々
のコロニーが得られるようにして寒天培地Ａ上に播く。
単一胞子に由来しかつ幅広いハロを示すコロニーを寒天
培地 POTATO DEXTROSE AGAR 上で継代培養する。これら
のコロニーを、胞子形成が行われるまでこの寒天培地上
３２℃で培養する。形質転換株の精製分生子を回収及び
保存する。これらのアスペルギルス・ホエチダス形質転
換株をＳＥ４ｔｒと称する。

【００３６】

【実施例６】形質転換部アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４ｔｒによ
るグルコースオキシダーゼの生産実施例５で得られた精製分生子を麦芽エキス(DIFCO)(２
重量％）、ペプトン(DIFCO)(0.１重量％）、加水分解デ
ンプン（１０重量％）及び炭酸カルシウム（3.５重量
％）を含有する豊富な液体培地中で培養する。培養基の
ｐＨをアンモニアを加えてｐＨ６に調整する。３２℃で
攪拌しながら培養し、５日間モニターする。次いで、得
られた培養を5,０００rpm で１５分間遠心する(BECKMAN
JA-10) 。細胞を液体窒素で凍結したバイオマスを粉砕
することにより破壊及び切断した後のバイオマス（いわ
ゆる細胞内生産）及び上清（いわゆる細胞外生産）につ
いてFIEDUREK, J.ら, Enzyme Microb. Technol. 8 (198
6), p.734-736 に記載されている方法に従って酵素（グ
ルコースオキシダーゼ）活性を測定する。

【００３７】得られた酵素活性の結果をアスペルギルス
・ホエチダス（ＳＥ４株）の非形質転換株と比較する。
形質転換株（ＳＥ４株）の細胞内グルコースオキシダー
ゼ生産は非形質転換株（ＳＥ４株）と比べて５〜１０倍
であり、細胞外生産は５０００〜１0,０００倍である。
細胞外グルコースオキシダーゼ生産の大きな増加が認め
られる。実際に、形質転換株は培養基に産生するグルコ
ースオキシダーゼのほとんど全部を分泌する。非形質転
換株によって産生されたグルコースオキシダーゼは、ほ
とんど培養基に分泌されない。即ち、非形質転換株の細
胞の切断段階はグルコースオキシダーゼを回収するため
に必須であるが、本発明による形質転換株にとっては必
要でない。形質転換株ＳＥ４ｔｒによるグルコースオキ
シダーゼ生産は、実質的に細胞外である。更に、形質転
換株ＳＥ４ｔｒを培養した後に得られた発酵培地の上清
にはカタラーゼがほとんど検出されない。

【００３８】

【実施例７】形質転換株ＳＥ４ｔｒによって産生されたグルコースオ
キシダーゼ活性の、ｐＨの関数としてのプロファイルグルコースオキシダーゼの酵素活性を、バッファー中２
５℃の温度の種々のｐＨ値（3.５〜9.０）で測定する。
適用条件は実施例６で記載したものである。実施例６で
得られた上清を使用する。この上清をｐＨ及び酵素活性
に応じて蒸留水に、次にｐＨ範囲3.５〜5.５の場合0.１
M クエン酸塩／リン酸塩バッファーに及びｐＨ6.０〜9.
０の場合0.１M ＫＨ₂ＰＯ₄/Ｋ₂ＨＰＯ₄バッファーに
希釈する。2.５mlの基質水溶液を５０μl の希釈上清に
２５℃において加える。基質水溶液は、グルコース１０
％（重量／容量）、ＡＢＴＳ0.０５％（重量／容量）及
びホースラディッシュペルオキシダーゼ１２mg/lを含有
する。基質水溶液のｐＨを、ｐＨ範囲3.５〜5.５の場合
0.１M クエン酸塩／リン酸塩バッファーで又はｐＨ6.０
〜9.０の場合0.１M ＫＨ₂ＰＯ₄/Ｋ₂ＨＰＯ₄バッファ
ーで調整する。２分間インキュベートした後、４２０nm
の吸光度を測定する。結果を表２に示す。この試験で、
ｐＨ約5.５及び温度２５℃に置いた試料の最大酵素活性
を測定した。定義上この試料を相対活性１００％とし
た。本実施例は、約4.０〜約7.０のｐＨ範囲において約
２５℃の温度で測定したグルコースオキシダーゼの酵素
活性が最適であることを示すものである。

【００３９】

【表２】表２産生グルコースオキシダーゼの相対活性 % pH 非形質転換株形質転換株 ──────────────────────────────────── 3.5 47 43 4.0 69 66 5.0 98 99 5.5 100 100 6.0 98 98 6.5 88 86 7.0 67 63 8.0 34 30 8.5 14 14 9.0 9 8 ────────────────────────────────────

【００４０】形質転換株によって産生されたグルコース
オキシダーゼ活性の、ｐＨの関数としてのプロファイル
は、非形質転換株によって産生されたグルコースオキシ
ダーゼ、即ち未変性酵素と同じである。

【００４１】

【実施例８】形質転換株ＳＥ４ｔｒによって産生されたグルコースオ
キシダーゼ活性の、温度の関数としてのプロファイルグルコースオキシダーゼの酵素活性を、0.１M ＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄/Ｋ₂ＨＰＯ₄バッファー中ｐＨ6.０において種々の
温度（２０〜５０℃）で測定する。適用条件は実施例６
で記載したものである。実施例６で得られた上清を使用
する。この上清をｐＨ及び酵素活性に応じて蒸留水に、
次に0.１M ＫＨ₂ＰＯ₄/Ｋ₂ＨＰＯ₄バッファーに希釈
する。2.５mlの基質水溶液を５０μl の希釈上清に２５
℃において加える。基質水溶液は、グルコース１０％
（重量／容量）、ＡＢＴＳ0.０５％（重量／容量）及び
ホースラディッシュペルオキシダーゼ１２mg/lを含有す
る。基質水溶液のｐＨを、ｐＨ6.０に0.１M ＫＨ₂ＰＯ
₄/Ｋ₂ＨＰＯ₄バッファーで調整する。混合する前に、
基質水溶液と希釈上清を所望の温度に加熱する。２分間
インキュベートした後、４２０nmの吸光度を測定する。
結果を表３に示す。この試験で、ｐＨ約6.０及び温度３
５℃に置いた試料の最大酵素活性を測定した。定義上こ
の試料を相対活性１００％とした。本実施例は、約２０
〜約５０℃の温度範囲においてｐＨ約6.０で測定したグ
ルコースオキシダーゼの酵素活性が最適であることを示
すものである。

【００４２】

【表３】表３産生グルコースオキシダーゼの相対活性 % 温度非形質転換株形質転換株 ──────────────────────────────────── 20 79 82 30 99 99 35 100 100 40 99 97 50 83 76 ────────────────────────────────────

【００４３】形質転換株によって産生されたグルコース
オキシダーゼ活性の、温度の関数としてのプロファイル
は、非形質転換株によって産生されたグルコースオキシ
ダーゼ、即ち未変性酵素と同じである。実施例７及び８
は、形質転換株によって産生されたグルコースオキシダ
ーゼの特徴が非形質転換株によって産生されたグルコー
スオキシダーゼと同じであることを示すものである。

【００４４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：６３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 TGATGATCAG GATCCGGCGG CCGCACCTCA GCAATGCAGA CTCTCCTTGT GAGCTCGCTT 60 GTG 63

【００４５】配列番号：２配列の長さ：５１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 TCGATGAAGC TTCACTCACT GCATGGAAGC ATAATCTTCC AAGATAGCAT C 51

【００４６】配列番号：３配列の長さ：５１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 GATGCTATCT TGGAAGATTA TGCTTCCATG CAGTGAGTGA AGCTTCATCG A 51

【００４７】配列番号：４配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 GATTCATGGT TGAGCAACGA AGCGA 25

【００４８】配列番号：５配列の長さ：４９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 GCCTGAGCTT CATCCCCAGC GCGGCCGCAT CATTACACCT CAGCAATGT 49

【００４９】配列番号：６配列の長さ：５０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 TGACTGACAC CTGGCGGTGA AAGCTTCAAT CAATCCATTT CGCTATAGTT 50

【００５０】配列番号：７配列の長さ：２０４５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 配列 GAATTCCCGA CATCGGTCAT TGGCCTCCTC GCTGATCTCC CTTTGGTACA GTCGGCTACC 60 AATGCTCTCG AGGATTGCCT GAACATTGAC ATTCGGCGTC CGGCCGGGAC CACCGCGGAC 120 TCGAAGCTGC CTGTGCTGGT CTGGATCTTT GGCGGAGGCT TTGAACTTGG TTCAAAGGCG 180 ATGTATGATG GTACAACGAT GGTATCATCG TCGATAGACA AGAACATGCC TATCGTGTTT 240 GTAGCAATGA ATTATCGCGT GGGAGGTTTC GGGTTCTTGC CCGGAAAGGA GATCCTGGAG 300 GACGGGTCCG CGAACCTAGG GCTCCTGGAC CAACGCCTTG CCCTGCAGTG GGTTGCCGAC 360 AACATCGAGG CCTTTGGTGG AGACCCGGAC AAGGTGACGA TTTGGGGAGA ATCAGCAGGA 420 GCCATTCGTT TGACTAGATG ACTTGTACGA CGGAAACATC ACTTACAAGG ATAAGCCCTT 480 GTTCCGGGGG GCCATCATGG ACTCCGGTAG TGTTGTTCCC GCAGACCCCG TCGATGGGGT 540 CAAGGGACAG CAAGTATATG ATGCGGTAGT GGAATCTGCA GGCTGTTCCT CTTCTAACGA 600 CACCCTAGCT TGTCTGCGTG AACTAGACTA CACCGACTTC CTCAATGCGG CAAACTCCGT 660 GCCAGGCATT TTAAGCTACC ATTCTGTGGC GTTATCATAT GTGCCTCGAC CGGACGGGAC 720 GGCGTTGTCG GCATCACCGG ACGTTTTGGG CAAAGCAGGG AAATATGCTC GGGTCCCGTT 780 CATCGTGGGC GACCAAGAGG ATGAGGGGAC CTTATTCGCC TTGTTTCAGT CCAACATTAC 840 GACGATCGAC GAGGTGGTCG ACTACCTGGC CTCATACTTC TTCTATGACG CTAGCCGAGA 900 GCAGCTTGAA GAACTAGTGG CCCTGTACCC AGACACCACC ACGTACGGGT CTCCGTTCAG 960 ACAGCGCGGC CAACAACTGG TATCCGCAAT TTAAGCGATT GGCCGCCATT CTCGGCGACT 1020 TGGTCTTCAC CATTACCGGC GGGCATTCCT CTCGTATGCA GAGGAAATCT CCCCTGATCT 1080 TCCGAACTGG TCGTACCTGG CGACCTATGA CTATGGCACC CCAGTTCTGG GGACCTTCCA 1140 CGGAAGTGAC CTGCTGCAGG TGTTCTATGG GATCAAGCCA AACTATGCAG CTAGTTCTAG 1200 CCACACGTAC TATCTGAGCT TTGTGTATAC GCTGGATCCG AACTCCAACC GGGGGGAGTA 1260 CATTGAGTGG CCGCAGTGGA AGGAATCGCG GCAGTTGATG AATTTCGGAG CGAACGACGC 1320 CAGTCTCCTT ACGGATGATT TCCGCAACGG GACATATGAG TTCATCCTGC AGAATACCGC 1380 GGCGTTCCAC ATCTGATGCC ATTGGCGGAG GGGTCCGGAC GGTCAGGAAC TTAGCCTTAT 1440 GAGATGAATG ATGGACGTGT CTGGCCTCGG AAAAGGATAT ATGGGATCAT GATAGTACTA 1500 GCCATATTAA TGAAGGGCAT ATACCACGCG TTGGACCTGC GTTATAGCTT CCCGTTAGTT 1560 ATAGTACCAT CGTTATACCA GCCAATCAAG TCACCACGCA CGACCGGGGA CGGCGAATCC 1620 CCGGGAATTG AAAGAAATTG CATCCCAGGC CAGTGAGGCA GCGATTGGCC ACCTCTCCAA 1680 GGCACAGGGC CATTCTGCAG CGCTGGTGGA TTCATCGCAA TTTCCCCCGG CCCGGCCCGA 1740 CACCGCTATA GGCTGGTTCT CCCACACCAT CGGAGATTCG TCGCCTAATG TCTCGTCCGT 1800 TCACAAGCTG AAGAGCTTGA AGTGGCGAGA TGTCTCTGCA GGAATTCAAG CTAGATGCTA 1860 AGCGATATTG CATGGCAATA TGTGTTGATG CATGTGCTTC TTCCTTCAGC TTCCCCTCGT 1920 GCAGATGAGG TTTGGCTATA AATTGAAGTG GTTGGTCGGG GTTCCGTGAG GGGCTGAAGT 1980 GCTTCCTCCC TTTTAGACGC AACTGAGAGC CTGAGCTTCA TCCCCAGCAT CATTACACCT 2040 CAGCA 2045

【００５１】配列番号：８配列の長さ：１０３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 配列 CAATCAATCC ATTTCGCTAT AGTTAAAGGA TGGGGATGAG GGCAATTGGT TATATGATCA 60 TGTATGTAGT GGGTGTGCAT AATAGTAGTG AAATGGAAGC CAGTCATGTG ATTGTAATCG 120 ACCGACGGAA TTGAGGATAT CCGGAAATAC AGACACCGTG AAAGCCATGG TCTTTCCTTC 180 GTGTAGAAGA CCAGACAGAC AGTCCCTGAT TTACCCTTGC ACAAAGCACT AGAAAATTAG 240 CATTCCATCC TTCTCTGCTT GCTCTGCTGA TATCACTGTC ATTCAATGCA TAGCCATGAG 300 CTCATCTTAG ATCCAAGCAC GTAATTCCAT AGCCGAGGTC CACAGGTGAG CAGCAACATT 360 CCCCATCATT GCTTTCCCAG GGCCTCCCAA CGACTAAATC AAGAGTATAT CTCTACCGTC 420 CAATAGATCG TCTTCGCTTC AAAATCTTTG ACAATTCCAA GAGGGTCCCC ATCCATCAAA 480 CCCAGTTCAA TAATAGCCGA GATGCATGGT GGAGTCAATT AGGCAGTATT GCTGGAATGT 540 CGGGGCCAGT TCCGGTGGTC ATTGGCCGCC TGTGATGCCA TCTGCCACTA AATCCGATCA 600 TTGATCCACC GCCCACGAGG CGCGTCTTTG CTTTTTGCGC GGCGTCCAGG TTCAACTCTC 660 TCTGCAGCTC CAGTCCAACG CTGACTGACT AGTTTACCTA CTGGTCTGAT CGGCTCCATC 720 AGAGCTATGG CGTTATCCCG TGCCGTTGCT GCGCAATCGC TATCTTGATC GCAACCTTGA 780 ACTCACTCTT GTTTTAATAG TGATCTTGGT GACGGAGTGT CGGTGAGTGA CAACCAACAT 840 CGTGCAAGGG AGATTGATAC GGAATTGTCG CTCCCATCAT GATGTTCTTG CCGGCTTTGT 900 TGGCCCTATC GTGGGATCGG ATGCCCTCGC TGTGCAGCAG CAGGTACTGC TGGATGAGGA 960 GCCATCGGTC TCTGCACGCA AACCCAACTT CCTCTTCATT CTCACGGATG ATCAGGATCT 1020 CCGGATGAAG AATTC 1035

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＵＣＧＯＤの制限地図を示す。

【図２】プラスミドｐＦＧＡ１の制限地図を示す。

【図３】プラスミドｐＦＧＡ２の制限地図を示す。

【図４】プラスミドｐＦＧＡ２ＭＵＴの制限地図を示
す。

【図５】プラスミドｐＦＧＯＤＮＯ制限地図を示す。

【図６】アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミ
ラーゼプロモーターをコードするヌクレオチド配列（配
列番号７）を示す。

【図７】アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミ
ラーゼプロモーターをコードするヌクレオチド配列（配
列番号７）の図６のつづきを示す。

【図８】アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミ
ラーゼターミネーターをコードするヌクレオチド配列
（配列番号８）を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:66）Ｃ１２Ｒ 1:66）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グルコースオキシダーゼの細胞外生産に
使用できる発現系であって、プロモーター配列、グルコースオキシダーゼ分泌シグナル配列、グルコースオキシダーゼ成熟配列、及びターミネーター
配列、を含むことを特徴とする発現系。
【請求項２】プロモーター配列がグルコアミラーゼプ
ロモーター配列であり、ターミネーター配列がグルコア
ミラーゼターミネーター配列であり、これらの配列が糸
状菌株に由来することを特徴とする請求項１記載の発現
系。
【請求項３】グルコースオキシダーゼ分泌シグナル配
列及びグルコースオキシダーゼ成熟配列が糸状菌株に由
来することを特徴とする請求項１又は２記載の発現系。
【請求項４】糸状菌株がアスペルギルス(Aspergillu
s) 株であることを特徴とする請求項２又は３記載の発
現系。
【請求項５】アスペルギルス株がアスペルギルス・ホ
エチダス(Aspergillus foetidus)株であることを特徴と
する請求項４記載の発現系。
【請求項６】グルコアミラーゼプロモーター配列及び
グルコアミラーゼターミネーター配列がアスペルギルス
・ホエチダス株ＳＥ４に由来することを特徴とする請求
項１記載の発現系。
【請求項７】グルコースオキシダーゼ分泌シグナル配
列及びグルコースオキシダーゼ成熟配列がアスペルギル
ス・ホエチダス株ＡＴＣＣ１４９１６に由来することを
特徴とする請求項１記載の発現系。
【請求項８】請求項１〜７のいずれか１項に記載の発
現系を含み、グルコースオキシダーゼを発現させること
ができる組込みベクター。
【請求項９】プラスミドであることを特徴とする請求
項８記載の組込みベクター。
【請求項１０】プラスミドｐＦＧＯＤ。
【請求項１１】請求項８又は９記載の組込みベクター
又は請求項１０記載のプラスミドによって形質転換され
た細胞。
【請求項１２】糸状菌の細胞であることを特徴とする
請求項１１記載の形質転換細胞。
【請求項１３】糸状菌の細胞がアスペルギルス細胞で
あることを特徴とする請求項１２記載の形質転換細胞。
【請求項１４】アスペルギルス細胞がアスペルギルス
・ホエチダス細胞であることを特徴とする請求項１３記
載の形質転換細胞。
【請求項１５】グルコースオキシダーゼの細胞外生産
方法であって、下記工程：グルコースオキシダーゼを発
現及び分泌させる条件下、請求項１〜７のいずれか１項
に記載の発現系を含む組込みベクターで細胞を形質転換
する工程、形質転換細胞を適切な培養基中で培養する工程、及び分
泌グルコースオキシダーゼを回収する工程を含むことを
特徴とする方法。
【請求項１６】単離及び精製アスペルギルス・ホエチ
ダス株ＳＥ４ｔｒ。
【請求項１７】アスペルギルス・ホエチダスグルコ
アミラーゼプロモーター。
【請求項１８】アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４グ
ルコアミラーゼプロモーターをコードする配列番号７の
ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項１９】アスペルギルス・ホエチダスグルコ
アミラーゼターミネーター。
【請求項２０】アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４グ
ルコアミラーゼターミネーターをコードする配列番号８
のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項２１】請求項１１、１２、１３及び１４のい
ずれか１項に記載の形質転換細胞によって生産されたグ
ルコースオキシダーゼ。