CN102936585B

CN102936585B - 一种发酵生产葡萄糖氧化酶的方法

Info

Publication number: CN102936585B
Application number: CN201210528312.0A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 陈坚; 顾磊; 堵国成; 沈伊娜; 李婷; 李梦洁; 殷政
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-12-10
Filing date: 2012-12-10
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2032-12-10
Also published as: CN102936585A

Abstract

本发明公开了一种发酵生产葡萄糖氧化酶酶活的方法，属于发酵工程领域。本发明采用本实验室在前期工作中构建的可以产较高活性葡萄糖氧化酶的重组毕赤酵母Pichia pastorisGS115-pPIC9K-GOX基因工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M 2012266。在甲醇诱导阶段通过添加山梨醇来提高葡萄糖氧化酶的酶活:即控制发酵液中甲醇残留浓度1.8%(W/V)，且甲醇与山梨醇混合添加比例为10:1(W/W)时，葡萄糖氧化酶的酶活为645.3U/mL，比不添加山梨醇(427.6U/mL)提高了50.9%，而且有效缩短了发酵周期，这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

Description

一种发酵生产葡萄糖氧化酶的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵生产葡萄糖氧化酶的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

葡萄糖氧化酶（β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase;EC 1.1.2.3.4，简称GOD），是一种富含糖基的黄体蛋白，它能够在有氧气的条件下专一性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。

葡萄糖氧化酶(GOD)是生物领域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面，将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域。

在食品工业中，由于氧的存在，引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微生物生长创造了条件。目前，许多国家已将GOD作为工人的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。利用其专一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析仪，能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量，指导生产。

在医药工业中，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析；GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生。此外，由于可以催化生成过氧化氢，还可用于对过氧化氢敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。

GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。

GOD广泛地分布于动物、植物和微生物体内，但由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源。从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富；细菌GOD产酶量少；一般采用黑曲霉（具有GRAS资格）和青霉属菌株作为GOD生产菌。

产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素。葡萄糖氧化酶大规模生产广泛采用黑曲霉或青霉发酵，但青霉和黑曲霉发酵产生过氧化氢酶，纤维素酶，淀粉酶等其他多种副产物，大量的杂蛋白对后期的分离纯化工作造成很大的困难，也增加了生产成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种发酵生产葡萄糖氧化酶的方法，以一种产葡萄糖氧化酶的基因工程菌为生产菌株，保藏编号为CCTCC NO：M 2012266，于2012年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心；其特征在于将活化后YPD扩培的菌液接入全自动发酵罐中的发酵培养基进行发酵处理，接种量为10%，以25%氨水控制pH 5.5，温度30℃，调节搅拌转速和通气量维持溶氧30%以上；当甘油耗尽DO迅速上升时，开始流加50%甘油补料生长培养基，当菌体干重达到100g/L后，停止补料；待甘油再次耗尽，继续保持基质匮乏状态约1h后，开始流加诱导培养基，诱导条件为：温度降低至20-25℃，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例为10:1-5:1（W/W），并且维持整个诱导过程的甲醇浓度为1.5-2.5%(W/V)，诱导葡萄糖氧化酶表达。

诱导条件优选：温度降低至22℃，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例为10:1（W/W），并且维持整个诱导过程的甲醇浓度为1.8%(W/V)，诱导葡萄糖氧化酶表达。

所述发酵培养基组成为（1L）：85%磷酸26.7mL/L,CaSO₄ 0.93g/L,K₂SO₄ 18.2g/L,MgSO₄·7H₂O 14.9g/L,KOH 4.13g/L,甘油40.0g/L,PTM₁ 4.35mL/L,25%氨水调pH 5.5；其中PTM₁（1L）组成为：CuSO₄,6.0g;KI,0.08g;MnSO₄,3.0g;Na₂MoO₄,0.2g;H₃BO₃,0.02g;CoCl₂,0.5g;ZnCl₂,20.0g;FeSO₄·7H₂O,65.0g;biotin,0.2g;and 98%(w/w)H₂SO₄,5mL。

所述补料生长培养基：50%(W/V)甘油，其中含12mL/L PTM₁。

所述发酵诱导培养基组成为：100%甲醇，其中含12mL/L PTM₁与山梨醇其中含12mL/L PTM₁混合之比为10：1（W/W）。

葡萄糖氧化酶的酶活测定方法：GOD活性测定一般采用邻-联(二)茴香胺分光光度法。在有氧条件下，GOD催化葡萄糖脱氢产生H₂O₂，在过氧化物酶（POD）作用下，氧供体邻-联(二)茴香胺（DH₂）被氧化成棕色产物。测540nm处吸光度的变化，根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。

本发明的有益效果：该菌株表达的葡萄糖氧化酶在3L发酵罐上酶活为645.3U/mL，比不添加山梨醇(427.6U/mL)提高了50.9%，大大提高了酶活，这为葡萄糖氧化酶的高效生产奠定了良好的基础。

生物材料保藏

一株产葡萄糖氧化酶的基因工程菌，该菌株为巴斯德毕赤酵母，命名为Pichia pastorisGS115-pPIC9K-GOX，在专利申请号为201210349289.9的专利申请中已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2012266，保藏日期为2012年7月3日。

附图说明

图1：诱导阶段山梨醇的添加对GOD酶活的影响。

图2：诱导阶段山梨醇的添加对生物量的影响。

图3：诱导阶段山梨醇的添加对GOD比酶活的影响。

具体实施方式

实施例1重组菌的3L发酵罐发酵

以本实验室前期工作中构建的Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOX为生产菌株，活化后，挑单菌落，接种于50mL YPD中(50mL培养基/500mL三角瓶),并于30℃、200r/min培养24h。将YPD中菌液接入3L全自动发酵罐(LiFlusGM BioTRON,Korea)，接种量为10%，以25%氨水控制pH 5.5，温度30℃，调节搅拌转速和通气量维持溶氧30%以上。当甘油耗尽(DO迅速上升)时，开始流加50%甘油补料生长培养基。当菌体达到100g/L后，停止补料。待甘油再次耗尽，继续保持基质匮乏状态约1h后，开始流加诱导培养基，把诱导温度降低至22℃，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例为10:1（W/W）并且维持整个诱导过程甲醇浓度为1.8%(W/V)，诱导葡萄糖氧化酶表达。

培养基：

1)种子和斜面培养基为YPD培养基（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g；斜面培养基添加琼脂20g；

2)分批发酵培养基BSM（1L）：85%磷酸26.7mL/L,CaSO4 0.93g/L,K2SO4 18.2g/L,MgSO4·7H2O 14.9g/L,KOH 4.13g/L,甘油40.0g/L,PTM₁4.35mL/L,25%氨水调pH 5.5。

3)PTM₁（1L）：CuSO₄,6.0g;KI,0.08g;MnSO₄,3.0g;Na₂MoO₄,0.2g;H₃BO₃,0.02g;CoCl₂,0.5g;ZnCl₂,20.0g;FeSO₄·7H₂O,65.0g;biotin,0.2g;and 98%(w/w)H₂SO₄,5ml

4)补料生长培养基:50%(W/V)甘油(含12mL/L PTM₁)。

5)发酵诱导培养基:100%甲醇(含12mL/LPTM₁)与山梨醇（含12mL/LPTM₁）混合之比为10：1（W/W）。

表达的葡萄糖氧化酶在3L发酵罐上酶活最高为645.3U/mL，比不添加山梨醇（427.6U/mL）提高了50.9%（图1），干重最大为227.6g/L,比不添加山梨醇（179.2g/L）提高了27%（图2），比酶活最高为86499U/g,比不添加山梨醇(54845U/g)提高了57.7%（图3）。此外，本发明采用实施例1的技术方法，为的是提高酶的产量，但在试验中我们发现，此方法不但提高了酶的产量，同时也有效缩短了发酵周期，缩短发酵周期达36小时，为本发明获得的意想不到的技术效果。

实施例2重组菌的3L发酵罐发酵

其它条件同实施例1，只改变诱导条件，把诱导温度降低至20℃，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例为10:2（W/W）并且维持整个诱导过程甲醇浓度为2.5%(W/V)，诱导葡萄糖氧化酶表达。

表达的葡萄糖氧化酶在3L发酵罐上酶活最高为600U/mL，干重最大为231.6g/L，比酶活最高为82452U/g。

实施例3重组菌的3L发酵罐发酵

其它条件同实施例1，只改变诱导条件，把诱导温度降低至25℃，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例为10:1（W/W）并且维持整个诱导过程甲醇浓度为2.0%(W/V)，诱导葡萄糖氧化酶表达。

表达的葡萄糖氧化酶在3L发酵罐上酶活最高为615U/mL，干重最大为234.2g/L，比酶活最高为83255U/g。

Claims

1.一种发酵生产葡萄糖氧化酶的方法，以一种产葡萄糖氧化酶的基因工程菌为生产菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2012266，于2012年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心；其特征在于将活化后YPD扩培的菌液接入全自动发酵罐中的发酵培养基进行发酵处理，接种量为10％，以25％氨水控制pH5.5，温度30℃，调节搅拌转速和通气量维持溶氧30％以上；当甘油耗尽溶解氧迅速上升时，开始流加50％甘油补料生长培养基，当菌体干重达到100g/L后，停止补料；待甘油再次耗尽，继续保持基质匮乏状态1h后，开始流加诱导培养基，诱导条件为：温度降低至20-25℃，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例为10:1-5:1(W/W)，并且维持整个诱导过程的甲醇浓度为1.5-2.5％(W/V)，诱导葡萄糖氧化酶表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于诱导条件优选：温度降低至22℃，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例为10:1(W/W)，并且维持整个诱导过程的甲醇浓度为1.8％(W/V)，诱导葡萄糖氧化酶表达。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组成为：85％磷酸26.7mL/L,CaSO₄0.93g/L,K₂SO₄18.2g/L,MgSO₄·7H₂O14.9g/L,KOH4.13g/L,甘油40.0g/L,PTM₁4.35mL/L,25％氨水调pH5.5；其中每升PTM₁组成为：CuSO₄,6.0g；KI,0.08g；MnSO₄,3.0g；Na₂MoO₄,0.2g；H₃BO₃,0.02g；CoCl₂,0.5g；ZnCl₂,20.0g；FeSO₄·7H₂O,65.0g；biotin,0.2g和98％(w/w)H₂SO₄,5mL。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于所述补料生长培养基：50％(W/V)甘油，其中含12mL/LPTM₁。

5.权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述诱导培养基组成为：含12mL/LPTM₁的100％甲醇与含12mL/LPTM₁的山梨醇混合之比为10：1(W/W)。