CN107937360A - 一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵技术领域,公开了一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵方法,该方法以保藏编号为CGMCC No.11626的毕赤酵母基因工程菌为出发菌株,采用体积比为20:1的甲醇和山梨醇进行诱导发酵,能够进一步提高GOD产量,下罐酶活达到905U/mL。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域,具体涉及葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中 的高密度发酵方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD,EC1.1.3.4)可催化β~D~葡萄糖氧 化为δ~D~葡萄糖酸和过氧化氢,其作用表现在除葡萄糖,除氧,形成过氧化 氢等方面。葡萄糖氧化酶作为一种天然的生物催化剂,安全、无毒副作用, 在食品饮料工业、畜禽养殖业、医药行业等领域中有众多应用,并且已经取 得了可观的商业价值。GOD用于面包、牛奶、果汁、啤酒等领域去氧保鲜效 果良好;在动物饲料中添加的GOD能具有抗氧化的功能,能显著抑制霉变微 生物的产生,对霉变饲料毒素也有很好的降解作用,从而提高动物免疫能力, 来代替药物促生长剂发挥作用;葡萄糖氧化酶在医药行业中,可以制备成尿 糖、血糖试纸,因其具有操作简单、无害、无毒、容易控制等优点,现在在 临床上具有广泛的应用。
GOD的大规模生产广泛采用黑曲霉或青霉菌发酵,但黑曲霉和青霉菌发 酵生产GOD过程中,过氧化氢酶、纤维素酶及淀粉酶等大量杂蛋白的存在给 纯化带来相当大的困难。因此,通过构建工程菌实现葡萄糖氧化酶的高效表 达,研制及生产高品质的GOD制剂,是一条比较经济有效的途径。
毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统已经发展成为一个成熟的外源蛋白 表达系统,已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到成功表达。近些年,毕赤 酵母被美国FDA认定为GRAS(Generally recognized as safe),为其在食品 及医药上应用铺平了道路。毕赤酵母表达外源蛋白具有表达量高、稳定性好、 培养成本低和产物易分离纯化等优点,适于大体积高密度连续发酵,具有强 且易控的醇氧化酶(Alcohol oxidase,AOX)启动子等优点,可严格控制外源基 因的表达。重组葡萄糖氧化酶基因进行毕赤酵母异源表达可有效地解决纯化 困难的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵 方法,进一步提高葡萄糖氧化酶的酶活及产量。
为了解决上述技术问题,本发明的技术方案如下:
本发明提供了一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵方法,以葡 萄糖氧化酶基因GOD转化的毕赤酵母基因工程菌为出发菌株,其保藏编号为 CGMCCNo.11626,包括如下步骤:
用质量浓度为28%的氨水调节发酵培养基的pH值为4.5~5.0,将活化的 菌种扩培液接入所述发酵培养基中,在28~30℃下通气搅拌18~24h进行发酵 处理;
在所述发酵处理的过程中,当碳源消耗完溶氧量迅速上升时,流加补料 培养基直至发酵液的OD600值为150~200;
当碳源消耗完,发酵液的溶氧量再度升高至50%以上时,开始流加诱导 培养基进行诱导发酵;所述诱导培养基含有体积比为20:1的甲醇和山梨醇, 每升所述甲醇中还含有12~14mL的PTM1;所述诱导发酵的条件为:发酵温 度为28℃,发酵液pH值为6.5,维持整个诱导过程中甲醇的终浓度在0.3%, 溶氧量始终为0;在所述诱导发酵的过程中每隔24h加维生素C,使发酵液中 维生素C的终浓度为70~90μg/L,在诱导72h时一次性加入维生素B2,使发 酵液中微生素B2的终浓度为0.8~1.2mM。
优选的,所述发酵培养基为BSM培养基,每升发酵培养基中还含有 4~4.5mLPTM1。
优选的,所述补料培养基中含有质量体积浓度为50%的甘油,每升所述 甘油中还含有10~14mL的PTM1。
优选的,所述补料培养基的流加速率为18~20mL/h/L,流加时间为 3.5~4.5h。
优选的,所述甲醇的流加速率前10小时为2~4g/h/L,10小时后甲醇流加 速率提高到5~6g/h/L。
优选的,所述活化的菌种扩培液接入发酵培养基中的接种量为3~10%。
优选的,所述菌种扩培液的活化步骤包括:将保藏编号为CGMCC No.11626的菌种接种到YPD培养基中,在28~30℃下震荡培养12~16h,震 荡速率为200~250rpm,得到一级种子扩培液;
将所述一级种子扩培液转接到BMGY培养基中,在28~30℃下震荡培养, 震荡速率为200~250rpm,当培养液的OD600为6~10时,得到活化的菌种扩 培液。
更优选的,所述保藏编号为CGMCC No.11626的菌种接种到YPD培养基 上的接种量为3~10%。
更优选的,所述一级种子扩培液转接到BMGY培养基中接种量为3~10%。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
毕赤酵母诱导过程通常只单一的流加甲醇作为菌生长和诱导的碳源,过 多的甲醇残余发酵液时会抑制菌的生长,导致细胞死亡,降低目的蛋白的分 泌,但如果甲醇流加量不够,一方面会影响菌的生长,同时也会减少外源蛋 白的分泌。本发明采用双碳源混合流加山梨醇诱导葡萄糖氧化酶的表达,按 一定速率流加甲醇的同时,以20:1(W/W)甲醇:山梨醇的流加速率进行双 碳源补料,毕赤酵母工程菌以山梨醇做为生长的碳源,尽可能多的让甲醇流 向诱导外源蛋白表达途径,提高GOD的分泌,同时也减少了甲醇的用量。本 发明双碳源混合流加山梨醇GOD酶活较只流加甲醇提高约10%,能够进一步 提高GOD产量,下罐酶活达到905U/mL。
本发明诱导过程中以28℃做为诱导温度,控制发酵液的pH值为6.5,进 行诱导表达。结果显示低温有助于GOD表达,28℃分泌的蛋白酶活(905U/mL) 较30℃(633U/mL)提高约10%,且pH为6时酶活(627U/mL)也没有pH为 6.5时的酶活(905U/mL)高。
本发明在诱导过程中,在发酵液中添加了维生素C和维生素B2。相较于 未添加维生素C和维生素B2的酶活(505U/mL),本发明在诱导过程中添加 了维生素C和维生素B2之后,酶活力达到905U/mL,提高了79.2%。
附图说明
图1为实施例1和对比例1不同方式诱导表达发酵GOD的酶活;
图2为实施例1和对比例3不同温度发酵GOD的酶活;
图3为实施例1和对比例4不同pH值诱导发酵GOD的酶活。
生物保藏说明
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),于2015年11月6日保藏在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区 北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,生物保藏编号为 CGMCC No.11626。
具体实施方式
本发明提供了一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵方法,通过 调整流加甲醇与山梨醇的用量和比例,达到减少甲醇用量,提高葡萄糖氧化 酶酶活的效果。
本发明以葡萄糖氧化酶基因GOD转化的毕赤酵母基因工程菌为出发菌 株,其保藏编号为CGMCCNo.11626,于2015年11月6日保藏在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心。已在申请号为201510893562.8,专利名称 为葡萄糖氧化酶基因GOD、利用其编码的蛋白、转化的巴斯德毕赤酵母及其 制备的专利中公开。
本发明将活化的上述菌种用于发酵。本发明对菌种的活化方法没有特殊 限定,采用本领域的常规活化方法即可,如先将保藏的菌种接种到YPD培养 基上进行一级活化得到一级种子扩培液,再将一级种子扩培液接种至BMGY 培养基上进行二级活化,得到扩培液。
本发明中,一级活化所用的培养基为YPD固体培养基,将保藏在固体培 养基上的菌种以3~10%的接种量接种到YPD培养基上进行一级活化培养,更优 选接种量为4~5%。本发明一级活化的温度优选为28~30℃,更优选为29℃。 一级活化优选在震荡条件下进行,优选震荡的速率为200~250rpm,更优选为 230~240rpm。在上述条件下震荡培养12~18h,优选为16h后,得到一级种子扩 培液。本发明对一级活化的设备没有特殊要求,优选在一级种子液试管中进 行培养。
本发明中,二级活化所用的培养基为BMGY培养基。将得到的一级种子 扩培液以3~10%的接种量接种到BMGY培养基上进行二级活化培养,更优选接 种量为4~5%。本发明二级活化的温度优选为28~30℃,更优选为29℃。二级 活化优选在震荡条件下进行,优选震荡的速率为200~250rpm,更优选为 230~240rpm。在上述条件下震荡培养12~18h,优选为16h后,培养液的OD600为6~10,更优选为10时,得到活化的菌种扩培液。本发明对二级活化的设备 没有特殊要求,优选在二级种子液摇瓶中进行培养。
活化的菌种扩培液用于葡萄糖氧化酶的高密度发酵。将活化的菌种扩培 液接入发酵培养基中进行发酵处理,优选在发酵罐中进行发酵。本发明对发 酵罐的种类和大小没有特殊限定,采用本领域技术人员所熟知的发酵罐类型 即可。
本发明中,优选采用BSM培养基作为发酵培养基。所述发酵培养基中每 升还包括4~4.5mL PTM1,更优选每升含有4.37mL PTM1。用质量浓度为28% 浓氨水调节发酵培养基的pH值至4.5~5.0,更优选为4.8,使发酵培养基适合于 毕赤酵母工程菌发酵所需的适宜pH值。同时,氨水还可以作为菌种生长的氮 源。
将上述活化的菌种扩培液接种至发酵培养基中进行发酵培养。本发明中 优选菌种扩培液在发酵培养基中的接种量为3~10%,更优选为8~9%。所述发 酵的温度为28~30℃,通气搅拌培养18~24h,更优选为20h。发酵过程中随着 菌株的生长,培养基中的溶氧量由100%逐渐降低,当碳源消耗完后溶氧量迅 速上升。
当溶氧量再度升高至40%以上,优选为50~70%时,流加补料培养基。本 发明所述补料培养基为质量体积浓度为50%的甘油,其中,每升甘油中还含 有10~14mL的PTM1,更优选为12mL的PTM1。本发明所述补料培养基的流加 速率优选为18~20mL/h/L,更优选为18.15mL/h/L。本发明所述补料培养基在上 述流加速率下优选流加3.5~4.5h,更优选为4h。此流加补料培养基的阶段培养 基中的溶氧量为0。当发酵液中的OD600值为150~200,更优选为180时,停止 流加补料培养基,进行饥饿培养。优选饥饿培养的时间为30min~1h,更优选 为40~50min。
当碳源消耗完,发酵液的溶氧量再度升高至50~70%以上时,开始流加诱 导培养基。本发明中,所述诱导培养基含有体积比为20:1的甲醇和山梨醇,每 升所述甲醇中还含有12~14mL的PTM1,进行双碳源混合流加。本发明优选甲 醇的流加速率为2~6g/h/L,更优选为前10小时流加速率为2~4g/h/L,10小时后 甲醇流加速率提高到5~6g/h/L。毕赤酵母工程菌优先以山梨醇作为生长的碳 源,尽可能多的让甲醇流向诱导外源蛋白表达途径,提高GOD的分泌,同时 也减少了甲醇的利用量。
本发明中,双碳源混合流加的诱导条件为:发酵温度为28℃,发酵液pH 值为6.5,流加甲醇的过程中维持整个诱导过程中甲醇的终浓度在0.3%,溶氧 量始终为0,诱导葡萄糖氧化酶表达。
本发明在诱导过程中还流加一定量的维生素。优选在诱导过程中,每隔 20~24h加维生素C,更优选为每隔24h加维生素C,使发酵液中维生素C的终浓 度为70~90μg/L,更优选为80μg/L。微生素C作用是防氧化。在诱导60~72h, 优选72h时一次性加入维生素B2,使发酵液中微生素B2的终浓度为
0.8~1.2mM,优选为1mM。葡萄糖氧化酶有两个亚基,每个亚基都有FAD结合 位点,连结一个FAD,FAD是GOD的辅因子。在微生素B2粉末中含有FAD, 在本发明具体实施例中在甲醇诱导后期加入1mM微生素B2,证明了FAD对 GOD表达的影响。
定时取样,监测菌体生长情况及表达的葡萄糖氧化酶活性。本发明中, 优选每隔4h取样一次检测OD600,每隔12h测定表达的葡萄糖氧化酶的活性, 并同时进行SDS~PAGE监测表达量的累积。当葡萄糖氧化酶酶活下降时,发 酵中止。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,下面结合实施例对 本发明进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中,YPD培养基、BMGY培养基、BSM培养基以及PTM1均为 按照本领域技术人员所熟知的培养基配方进行配制。
实施例1
菌株按3%接种量接种到3mL YPD培养基的一级试管种子液中,30℃,250 rpm培养12h后,按3%接种量转接到500mL装液量100mL BMGY二级种子液 摇瓶中,30℃,250rpm培养12h后,培养液OD600到10,得到活化的菌种扩培 液。
将活化的菌种扩培液按10%的接种量接种到10L的发酵罐中,发酵罐初始 装5.6LBSM培养基。初始发酵控制温度28℃,用28%的浓氨水控制发酵液的 pH为5.0,通过调节搅拌转速和通气量控制罐上溶氧在0。待BSM培养基中甘 油耗尽溶氧上升后,以18.15mL/h/L的速率流加含有1.2%(v/v)PTM1的50%(w/v) 甘油,待OD600到180时停止流加甘油,饥饿培养30min。
流加含有1.2%(v/v)PTM1的甲醇,前10小时的流加速率为2g/h/L,10小时 后甲醇流加速率提高到6g/h/L。同时按甲醇:山梨醇=20:1的比例流加山梨醇 进行诱导表达,同时调节搅拌转速和通气量控制溶氧在0。诱导时pH控制为 6.5,每隔24小时加一次VC溶液,使发酵罐中VC的终浓度为80μg/L;在诱导 72h时一次性加入维生素B2溶液,使发酵罐中维生素B2的终浓度为1mM。每 隔4h取样一次检测OD600,每隔12h测定表达的葡萄糖氧化酶的活性(采用邻 一联(二)茴香胺分光光度法测定GOD活性),并同时进行SDS~PAGE监测表 达量的累积。
表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐上酶活最高为905U/mL,比酶活最高为 224.5U/g。
实施例2
菌株按5%接种量接种到3mL YPD培养基的一级试管种子液中,30℃,230 rpm培养16h后,按5%接种量转接到500mL装液量100mL BMGY二级种子液 摇瓶中,30℃,230rpm培养16h后,培养液OD600到10,得到活化的菌种扩培 液。
将活化的菌种扩培液按9%的接种量接种到10L的发酵罐中,发酵罐初始 装5.6LBSM培养基。初始发酵控制温度28℃,用28%的浓氨水控制发酵液的 pH为5.0,通过调节搅拌转速和通气量控制罐上溶氧在0。待BSM培养基中甘 油耗尽溶氧上升后,以18.15mL/h/L的速率流加含有1.2%(v/v)PTM1的50%(w/v) 甘油,待OD600到180时停止流加甘油,饥饿培养40min。
流加含有1.2%(v/v)PTM1的甲醇,前10小时的流加速率为2g/h/L,10小时 后甲醇流加速率提高到6g/h/L。同时按甲醇:山梨醇=20:1的比例流加山梨醇 进行诱导表达,同时调节搅拌转速和通气量控制溶氧在0。诱导时pH控制为 6.5,每隔24小时加一次VC溶液,使发酵罐中VC的终浓度为80μg/L;在诱导 72h时一次性加入维生素B2溶液,使发酵罐中维生素B2的终浓度为1mM。每 隔4h取样一次检测OD600,每隔12h测定表达的葡萄糖氧化酶的活性(采用邻 一联(二)茴香胺分光光度法测定GOD活性),并同时进行SDS~PAGE监测表 达量的累积。
表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐上酶活最高为897U/mL,比酶活最高为 221U/g。
实施例3
菌株按8%接种量接种到3mL YPD培养基的一级试管种子液中,30℃,200 rpm培养18h后,按8%接种量转接到500mL装液量100mL BMGY二级种子液 摇瓶中,30℃,200rpm培养18h后,培养液OD600到10,得到活化的菌种扩培 液。
将活化的菌种扩培液按10%的接种量接种到10L的发酵罐中,发酵罐初始 装5.6LBSM培养基。初始发酵控制温度28℃,用28%的浓氨水控制发酵液的 pH为5.0,通过调节搅拌转速和通气量控制罐上溶氧在0。待BSM培养基中甘 油耗尽溶氧上升后,以18.15mL/h/L的速率流加含有1.2%(v/v)PTM1的50%(w/v) 甘油,待OD600到180时停止流加甘油,饥饿培养50min。
流加含有1.2%(v/v)PTM1的甲醇,前10小时的流加速率为2g/h/L,10小时 后甲醇流加速率提高到6g/h/L。同时按甲醇:山梨醇=20:1的比例流加山梨醇 进行诱导表达,同时调节搅拌转速和通气量控制溶氧在0。诱导时pH控制为 6.5,每隔24小时加一次VC溶液,使发酵罐中VC的终浓度为80μg/L;在诱导 72h时一次性加入维生素B2溶液,使发酵罐中维生素B2的终浓度为1mM。每 隔4h取样一次检测OD600,每隔12h测定表达的葡萄糖氧化酶的活性(采用邻 一联(二)茴香胺分光光度法测定GOD活性),并同时进行SDS~PAGE监测表 达量的累积。
表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐上酶活最高为885U/mL,比酶活最高为 220.5U/g。
对比例1
诱导表达时采用含有1.2%(v/v)PTM1的甲醇进行诱导,其余方法同实施例 1。
表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐上酶活最高为814.5U/mL,比酶活最高 为202.1U/g。
对比例2
发酵过程中未添加维生素C和维生素B2,其余方法同实施例1。
表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐上酶活最高为505U/mL,比酶活最高为 125.3U/g。
对比例3
发酵温度调整至30℃,其余方法同实施例1。
表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐上发酵第144h时酶活为633U/mL,比酶 活最高为157.1U/g。
对比例4
诱导表达时发酵液的pH控制为6.0,其余方法同实施例1。
表达的葡萄糖氧化酶在10L发酵罐酶活为627U/mL,比酶活最高为 155.6U/g。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普 通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润 饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高密度发酵方法,以葡萄糖氧化酶基因GOD转化的毕赤酵母基因工程菌为出发菌株,其保藏编号为CGMCCNo.11626,包括如下步骤:
用质量浓度为28%的氨水调节发酵培养基的pH值为4.5~5.0,将活化的菌种扩培液接入所述发酵培养基中,在28~30℃下通气搅拌18~24h进行发酵处理;
在所述发酵处理的过程中,当碳源消耗完溶氧量迅速上升时,流加补料培养基直至发酵液的OD600值为150~200;
当碳源消耗完,发酵液的溶氧量再度升高至40%以上时,开始流加诱导培养基进行诱导发酵;所述诱导培养基含有体积比为20:1的甲醇和山梨醇,每升所述甲醇中还含有12~14mL的PTM1;所述诱导发酵的条件为:发酵温度为28℃,发酵液pH值为6.5,维持整个诱导过程中甲醇的终浓度在0.3%,溶氧量始终为0;在所述诱导发酵的过程中每隔24h加维生素C,使发酵液中维生素C的终浓度为70~90μg/L,在诱导72h时一次性加入维生素B2,使发酵液中微生素B2的终浓度为0.8~1.2mM。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述发酵培养基为BSM培养基,每升发酵培养基中还含有4~4.5mLPTM1。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述补料培养基中含有质量体积浓度为50%的甘油,每升所述甘油中还含有10~14mL的PTM1。
4.根据权利要求1或3所述的方法,其特征在于,所述补料培养基的流加速率为18~20mL/h/L,流加时间为3.5~4.5h。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述甲醇的流加速率前10小时为2~4g/h/L,10小时后甲醇流加速率提高到5~6g/h/L。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述活化的菌种扩培液接入发酵培养基中的接种量为3~10%。
7.根据权利要求1或6所述的方法,其特征在于,所述菌种扩培液的活化步骤包括:将保藏编号为CGMCC No.11626的菌种接种到YPD培养基中,在28~30℃下震荡培养12~16h,震荡速率为200~250rpm,得到一级种子扩培液;
将所述一级种子扩培液转接到BMGY培养基中,在28~30℃下震荡培养,震荡速率为200~250rpm,当培养液的OD600为6~10时,得到活化的菌种扩培液。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述保藏编号为CGMCCNo.11626的菌种接种到YPD培养基上的接种量为3%~10%。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述一级种子扩培液转接到BMGY培养基中接种量为3%~10%。
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