CN111334538B

CN111334538B - 一种强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法

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Publication number: CN111334538B
Application number: CN202010200710.4A
Authority: CN
Inventors: 周先云; 杨家林; 潘朝旺
Original assignee: Ezhou Polytechnic
Current assignee: Ezhou Polytechnic
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2040-03-20
Also published as: CN111334538A

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法；其方法包括以下步骤：S1、制备种子液；S2、发酵：按4～8％接种量将种子液接种至发酵培养基中，在温度35～40℃、转速200～250rpm条件下培养至菌浓度OD_600nm为2.0～2.5，然后补充80～120g/L的葡萄糖和0.05～0.5g/L的诱导剂，在温度10～20℃、转速300～350rpm条件下发酵培养72～96h，得到葡萄糖酸。本发明通过在发酵过程中添加能够引起氧化应激损伤的诱导剂，促进葡萄糖转化葡萄糖酸消耗氧自由基，以缓解氧化应激损伤，实现自我防御，同时削弱产物的负反馈作用，最终提高葡萄糖酸得率。

Description

一种强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法。

背景技术

葡萄糖酸可由葡萄糖1位醛基氧化为羧基后制得，是无色至淡黄色浆状液体，易溶于水，微溶于酒精，通常使用的为含量50％的葡萄糖酸溶液。葡萄糖酸是化工、医药及食品等产品的重要中间体，可被用来生产葡萄糖酸的衍生物，也可直接作为一种产品，用在乳品工业上防止乳石沉淀，用在食品配方中作为酸味剂，也用来配制家用或工厂用清洗剂、织物加工和金属加工的助剂、皮革矾鞣剂、去藻剂、金属除锈剂、建筑工业上混凝土的塑化剂、生物降解的螯合剂及二次采油的防沉淀剂等。

目前葡萄糖酸的合成方法主要有葡萄糖的催化氧化法、双酶催化法和生物发酵法。催化氧化法在生产过程中存在着氧化时间长、副反应较多、且金属催化剂在循环使用一定次数后，催化效率下降以及金属催化剂稳定性低、易被氧气过度氧化而失活等问题；双酶催化法存在扩散限制，且酶的成本较高，酶在体外易失活等问题；生物发酵法条件温和、转化效率高、节能明显逐渐成为生产葡萄糖酸的主流方法。

葡萄糖酸及其盐在发酵生产时，主要利用黑曲霉菌进行发酵，如中国专利号CN201711192191.6公开了一种黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠的方法，包括配制黑曲霉菌悬液；在以葡萄糖为原料的种子罐中加入营养盐一配制成种子液，接入黑曲霉菌悬液进行种子培养；在以葡萄糖为原料的种子罐中加入营养盐二配制成发酵液，接入种子液进行发酵，在发酵过程中对菌丝进行检测并调整通风量和转速，使黑曲霉菌丝长度控制在10～15pm的范围内，当发酵罐中的葡萄糖含量低于3g/L的时候结束发酵；发酵液经过过滤、脱色、结晶、分离、干燥等步骤，获得葡萄糖酸钠成品。但上述方法需要控制黑曲霉菌丝长度，同时存在多种培养条件的更换，增加了培养条件的控制难度。而且，在发酵过程面临受终产物强抑制，导致发酵效率低。目前已有报道青霉属真菌(葡萄糖氧化酶协作组.点青霉(Penicillium notatum)AS3.3871葡萄糖氧化酶的研究[J].微生物学通报(1):3-7.)高产葡萄糖氧化酶，但尚未有研究将其应用于生产葡萄糖酸；其次，其在应用当中同样存在终产物强抑制的问题。

发明内容

针对现有技术所存在的上述缺点，本发明目的在于提供一种强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法，通过在发酵过程中添加能够引起氧化应激损伤的诱导剂，促进葡萄糖转化葡萄糖酸消耗氧自由基，以缓解氧化应激损伤，实现自我防御，同时削弱产物的负反馈作用，最终提高葡萄糖酸得率。

一种强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法，包括以下步骤：

S1、制备种子液：挑取纯化的绳状青霉斜面菌至种子培养基中，培养一段时间后，离心去上清液，用无菌生理盐水重悬菌体，得种子液；

S2、发酵：按4～8％接种量将种子液接种至发酵培养基中，在温度35～40℃、转速200～250rpm条件下培养至菌浓度OD_600nm为2.0～2.5，然后补充80～120g/L的葡萄糖和0.05～0.5g/L的诱导剂，在温度10～20℃、转速300～350rpm条件下发酵培养72～96h，得到葡萄糖酸。

进一步的，所述诱导剂为甲萘醌。

采用上述的技术方案：葡萄糖氧化酶在有氧条件下能够将葡萄糖氧化成葡萄糖酸；在绳状青霉生长到稳定期的中后期时，加入诱导剂诱导绳状青霉细胞高效转化葡萄糖。诱导剂甲萘醌的奎宁结构能够提供一个电子给氧分子，并被氧化为半醌，且半醌可以进一步提供另一个电子给另一个双氧，并被氧化为氢醌；在醌氧化为氢醌的过程中，将形成氧自由基，氧自由基使微生物的细胞膜的处于应激下，引起膜脂质过氧化；而绳状青霉将葡萄糖氧化为葡萄糖酸的过程中可以消耗氧自由基，降低氧自由基的量，进而抑制相应的脂质过氧化产物的产生，以进行自我防御，缓解甲萘醌诱导的细胞损伤；并削弱产物的负反馈作用。因此，在低浓度甲萘醌的刺激和高浓度葡萄糖底物的胁迫下，绳状青霉可高效氧化葡萄糖生成葡萄糖酸，葡萄糖酸得率高。

培养温度前期温度较高，有利于细胞维持营养生长形态，菌体快速繁殖，从而缩短发酵周期，而在菌体处于稳定期的中后期时，已达到较高浓度，此时降低培养温度，以降低细胞生长速度，减少其自身生理代谢对葡萄糖的消耗，并在此时加入诱导剂，协同促进细胞转化葡萄糖，提高葡萄糖酸的得率。

进一步的，所述诱导剂浓度为0.2g/L。

进一步的，所述发酵培养基为：葡萄糖2～5g/L、废糖蜜5～10g/L、玉米低聚肽粉10～15g/L、硫胺素0.4～0.8g/L、半胱氨酸盐酸盐0.3～0.8g/L、谷氨酸钠3～6g/L、硫酸锌0.1～0.3g/L，余量为水；将配置好的发酵培养基置于超声发生器中，25-50KHz超声15min；超声后的培养基115℃灭菌30min。

进一步的，所述发酵培养基为：葡萄糖4g/L、废糖蜜7g/L、玉米低聚肽粉13g/L、半胱氨酸盐酸盐1.5g/L、硫胺素0.6g/L、谷氨酸钠4.5g/L、硫酸锌0.2g/L，余量为水。

在该营养条件下，营养物质的含量能够满足发酵的生产要求，可为发酵生产提供充足的营养成分，高活性的种子液移种至发酵罐后能迅速生长、迟缓期短。当营养成分低于上述配比时，菌体可利用的营养成分降低，发酵后期活性菌数量不足，导致发酵效率降低；因此营养成分高，有利于绳状青霉的生长。但是营养过分过高，会导致绳状青霉利用菌丝营养体形式过度繁殖，不进入次生代谢途径，其次，菌丝的含量高会使得发酵液变得非常粘稠，导致溶氧减少，葡萄糖氧化效率降低。培养基中半胱氨酸盐酸盐和谷氨酸钠能够调节培养基的pH值为6～8，同时所含有的活性巯基具有强还原性，能够将葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖产生的过氧化氢及时分解，从而促进酶的活性。

进一步的，所述接种重量为6％。

进一步的，所述种子液的浓度为1～5×10⁹cfu/mL。

在该种子液浓度下接入的菌体总量及浓度能够满足发酵的生产要求，可为发酵生产提供充足的代谢旺盛、生命力强的绳状青霉，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短，缩短了发酵罐中的发酵周期。当接种量低，菌体数量较少，在接种后生长缓慢，发酵结束时，发酵液中还有很高的残糖量，造成资源的浪费；当接种量高，虽然菌量多，但营养物质迅速消耗，菌体过早衰退，导致生产能力下降。

进一步的，所述发酵pH控制在6～8。

进一步的，所述种子培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

采用本发明提供的技术方案，具有如下有益效果：

1、提供一种强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法，在发酵过程中添加能够引起氧化应激损伤的诱导剂，促进葡萄糖转化葡萄糖酸消耗氧自由基，以缓解氧化应激损伤，实现自我防御，同时削弱产物的负反馈作用，最终提高葡萄糖酸得率。

2、提供强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的培养基，该培养基可使得活菌数高，葡萄糖氧化酶活性好，有利于提高葡萄糖酸得率。

3、利用绳状青霉发酵产葡萄糖酸，扩大了发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的微生物的种质资源。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本实施例中，绳状青霉(Penicillium funiculosum)购自北京北纳创联生物技术研究院，资源编号：BNCC146925，高产葡萄糖氧化酶。发明人经过实验发现，只要通过种子培养基培养一段时间获得高活性的种子液即可在本发明的方法下实现高效率的发酵，种子液的制备过程中的参数变化对葡萄糖酸的得率影响不大，因此以下实施例皆以实施例1的方式制备种子液，对种子液的制备参数不做讨论。

实施例1

S1、制备种子液：挑取纯化的绳状青霉斜面菌至牛肉膏蛋白胨培养基，于30℃，180rpm培养20h，菌体此时处于对数生长期的中期，活性高，适用于发酵培养，然后离心去掉上清液(种子培养基)，防止种子培养基干扰发酵培养基的营养成分，之后用无菌生理盐水洗涤菌体沉淀2～3次后重悬菌体，得种子液，所述种子液的浓度为1～5×10⁹cfu/mL；

S2、发酵：按6％接种量将种子液接种至发酵培养基中，在pH 6～8、温度37℃、转速200～250rpm条件下培养至菌浓度OD_600nm为2.0～2.5，然后补充80g/L的葡萄糖和0.05g/L的诱导剂甲萘醌，在pH 6～8、温度15℃、转速300rpm条件下发酵培养72h，得到葡萄糖酸；

所述发酵培养基为：葡萄糖4g/L、废糖蜜7g/L、玉米低聚肽粉13g/L、硫酸铵1.5g/L、硫胺素0.6g/L、谷氨酸钠4.5g/L、硫酸锌0.2g/L，余量为水。

实施例2

实施例2与实施例1基本相同，其区别在于：

S2、发酵：按6％接种量将种子液接种至发酵培养基中，在pH 6～8、温度37℃、转速230rpm条件下培养至菌浓度OD_600nm为2.0～2.5，然后补充80g/L的葡萄糖和0.2g/L的诱导剂甲萘醌，在pH 6～8、温度15℃、转速330rpm条件下发酵培养72h，得到葡萄糖酸。

实施例3

实施例3与实施例1基本相同，其区别在于：

S2、发酵：按6％接种量将种子液接种至发酵培养基中，在pH 6～8、温度37℃、转速230rpm条件下培养至菌浓度OD_600nm为2.0～2.5，然后补充100g/L的葡萄糖和0.2g/L的诱导剂甲萘醌，在pH 6～8、温度15℃、转速330rpm条件下发酵培养72h，得到葡萄糖酸。

实施例4

实施例4与实施例1基本相同，其区别在于：

S2、发酵：按6％接种量将种子液接种至发酵培养基中，在pH 6～8、温度37℃、转速230rpm条件下培养至菌浓度OD_600nm为2.0～2.5，然后补充100g/L的葡萄糖和0.5g/L的诱导剂甲萘醌，在pH 6～8、温度15℃、转速330rpm条件下发酵培养72h，得到葡萄糖酸。

实施例5

实施例5与实施例1基本相同，其区别在于：

S2、发酵：按6％接种量将种子液接种至发酵培养基中，在pH 6～8、温度37℃、转速250rpm条件下培养至菌浓度OD_600nm为2.0～2.5，然后补充120g/L的葡萄糖和0.5g/L的诱导剂甲萘醌，在pH 6～8、温度15℃、转速330rpm条件下发酵培养72h，得到葡萄糖酸。

实施例6

实施例6与实施例1基本相同，其区别在于：

S2、发酵：按6％接种量将种子液接种至发酵培养基中，在pH 6～8、温度37℃、转速230rpm条件下培养至菌浓度OD_600nm为2.0～2.5，然后补充100g/L的葡萄糖和0.2g/L的诱导剂甲萘醌，在pH 6～8、温度10℃、转速330rpm条件下发酵培养72h，得到葡萄糖酸。

实施例7

实施例7与实施例1基本相同，其区别在于：

S2、发酵：按6％接种量将种子液接种至发酵培养基中，在pH 6～8、温度37℃、转速230rpm条件下培养至菌浓度OD_600nm为2.0～2.5，然后补充100g/L的葡萄糖和0.2g/L的诱导剂甲萘醌，pH 6～8、温度20℃、转速330rpm条件下发酵培养72h，得到葡萄糖酸。

对比例1

对比例1与实施例3基本相同，其区别在于：步骤S2中不添加诱导剂。

对比例2

对比例2与实施例3基本相同，其区别在于：

S2、发酵：按6％接种量将种子液接种至发酵培养基中，在pH 6～8、温度37℃、转速230rpm条件下培养至菌浓度OD_600nm为2.0～2.5，然后补充100g/L的葡萄糖和0.2g/L的诱导剂甲萘醌，在pH 6～8、温度37℃、转速330rpm条件下发酵培养72h，得到葡萄糖酸。

对比例3

对比例3与实施例3基本相同，其区别在于：发酵培养基以0.2M磷酸钾缓冲液替换半胱氨酸盐酸盐和谷氨酸钠维持发酵pH值为6～8。

对比例4

对比例4与实施例3基本相同，其区别在于：发酵培养基以13g/L蛋白胨替换13g/L玉米低聚肽粉作为氮源。

应用例

在反应结束后，采用二硝基水杨酸法和葡萄糖酸试剂盒(购自艾美捷科技有限公司，产品货号：K683-100)分别测定转化溶液中葡萄糖和葡萄糖酸的含量。活菌数采用平板计数法。葡萄糖氧化酶活性测定方法参见“毛秋霞,黄永芳,陈甜女,et al.几种葡萄糖氧化酶部分性质的比较[J].华南农业大学学报,2000,21(2):54-56.”。

葡萄糖酸转化率＝发酵液葡萄糖酸浓度(moL/L)/投料葡萄糖浓度(moL/L)。

表1采用实施例1～7和对比例1～4的方法转化葡萄糖产葡萄糖酸的结果

诱导剂对细胞的损伤呈现剂量依赖性，分析对比例1和实施例1～5的数据可知，随着诱导剂浓度的适当提高，葡萄糖的转化率提高，而对应的葡萄糖氧化酶活性提高，说明诱导剂虽然能引起氧化应激损伤，但细胞本身可通过提高葡萄糖氧化酶活性，加速葡萄糖的转化，进而加速氧自由基的消耗，抵消氧化应激损伤；但是诱导剂的浓度进一步升高至0.5g/L以上后，将引起细胞的过度损伤，活菌数大大降低，因此，发酵速率变慢，葡萄糖酸的得率降低。实施例2和3相比，底物浓度适度升高，在底物的胁迫下，有利于提高酶的活性，提高得率，但是当葡萄糖浓度进一步升高，高浓度的葡萄糖会引起渗透压的降低，不利于菌体繁殖和酶活性的提高，因此，实施例5的活菌数和酶活菌低于实施例4。

分析对比例2和实施例1～5的数据可知，后期在高温条件下进行发酵，会造成菌体大量利用葡萄糖进行营养生长，此时虽然残留葡萄糖的量较低，但葡萄糖酸的转化率同样较低；通过适当降低温度控制菌体在后期发酵过程中的生长以减少其自身生理代谢对葡萄糖的消耗，有利于葡萄糖酸的转化率提高(实施例3、6和7)，温度降低，使得营养生长速度降低，促使菌体进入稳定期，利用葡萄糖产生葡萄糖酸，然而温度过低，菌体整体代谢活性降低，不利于发酵进行，因此，发酵温度设为10～20℃，更优选为15℃，此时的营养生长和次生代谢达到较好的平衡。

分析对比例3～4和实施例1～5的数据可知，当改变培养基的组分，尤其是改变缓冲液，不仅活菌数降低，而且葡萄糖氧化酶活性也随之降低，因此，葡萄糖酸的得率较低。

Claims

1.一种强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2、发酵：按4～8％接种量将种子液接种至发酵培养基中，在温度35～40℃、转速200～250rpm条件下培养至菌浓度OD 600nm为2.0～2.5，然后补充80～120g/L的葡萄糖和0.05～0.5g/L的诱导剂，在温度10～20℃、转速300～350rpm条件下发酵培养72～96h，得到葡萄糖酸；所述诱导剂为甲萘醌。

2.如权利要求1所述的强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述诱导剂浓度为0.2g/L。

3.如权利要求1所述的强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：葡萄糖2～5g/L、废糖蜜5～10g/L、玉米低聚肽粉10～15g/L、硫胺素0.4～0.8g/L、半胱氨酸盐酸盐0.3～0.8g/L、谷氨酸钠3～6g/L、硫酸锌0.1～0.3g/L，余量为水。

4.如权利要求3所述的强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：葡萄糖4g/L、废糖蜜7g/L、玉米低聚肽粉13g/L、半胱氨酸盐酸盐1.5g/L、硫胺素0.6g/L、谷氨酸钠4.5g/L、硫酸锌0.2g/L，余量为水。

5.如权利要求1所述的强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，步骤S2中，所述种子液的接种量为6％。

6.如权利要求1所述的强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述种子液的浓度为1～5×10⁹cfu/mL。

7.如权利要求1所述的强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述发酵pH控制在6～8。

8.如权利要求1所述的强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述种子培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。