CN101054597A - 一种微生物转化生产胱氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

一种微生物转化生产胱氨酸的方法。本发明方法包括：在以恶臭假单胞菌TS－1138细胞为酶源的情况下，以羟胺为抑制剂，酶法转化底物DL－2－氨基－Δ²噻唑啉－4羧酸(DL－2－Amino－Δ²thiazoline－4－Carboxylic Acid，ATC)得到L－半胱氨酸水溶液，并通过进一步氧化方式将所述的半胱氨酸转化成胱氨酸的方法。该方法直接利用菌体细胞为酶源催化底物，取缔了固定化酶的方法，并可多次连续使用。而且在使用中可保证5次以上ATC转化为胱氨酸的转化率在90％以上。

Description

一种微生物转化生产胱氨酸的方法

【技术领域】本发明属于氨基酸的生产技术领域，涉及通过微生物催化法底物前体得到的半胱氨酸，进一步氧化生产胱氨酸的方法。

【背景技术】L-半胱氨酸和L-胱氨酸是含硫的基本氨基酸，由于其分子中含有活性的巯基，具有许多重要的生理功能，如可以增强肝功能、解除苯中毒、化痰、促进毛发生长和防止食品氧化等，广泛地用于医药、食品添加剂以及化妆品等领域。

L-半胱氨酸是非发酵法生产的氨基酸，不能像谷氨酸那样用常用的碳、氮源和其他营养物质通过微生物发酵来生产；同时，由于L-半胱氨酸的巯基活性强，化学合成步骤繁多，其产品为DL型外消旋体，拆分后才能得到L-半胱氨酸，因此很难化学合成。传统的生产方法一直沿用抽提法，即将毛发用酸(或碱)加热水解、中和、脱色、过滤、结晶获得胱氨酸，再经电解后得到L-半胱氨酸。毛发中胱氨酸，含量约为14％，国外目前毛发水解法的最高收率为9至10％，国内约为4.5至5.5％。用毛发酸解制取L-半胱氨酸，收率低，能耗高，水解过程产生难闻气体及大量废酸，环境污染严重；化学合成法制取L-半胱氨酸合成步骤繁多，两种方法均有弊端。由于微生物的培养和酶的分离技术成熟，微生物酶法转化所需要的底物来源易得、工艺简单，对环境污染的程度低。随着L-半胱氨酸用途的开拓，世界需求量年年增长，用微生物酶法转化生产L-半胱氨酸越来越引起人们的重视。因此，用微生物酶法转化合成氨基酸和某些药物将是具有广泛应用前景的新工艺路线。

1978年Sano用嗜硫氮杂环戊烯假单胞菌(Pseudomonas thiazolinophilum)AJ3854菌株产生的胞内酶，酶法水解DL-2-氨基-Δ²噻唑啉-4羧酸(DL-2-Amino-Δ²thiazoline-4-CarboxylicAcid，ATC)制取L-半胱氨酸获得成功，从40g/L ATC得到31.4g/L L-半胱氨酸，转化率为78.5％。

2002年日本的Toshikazu和Shiba报道了假单胞菌BS菌株由DL-ATC经酶法转化生成L-半胱氨酸的关键基因。它是通过L-ATC水解酶水解ATC噻唑环中C₂-S单键，以N-氨甲酰-L-半胱氨酸(L-NCC)为转化的中间产物，再经N-氨甲酰-L-半胱氨酸氨甲酰水解酶催化生成L-半胱氨酸，称为N-代途径(L-NCC途径)图1(B途径)。

1997年韩国Ryu报道了以DL-ATC为底物，微生物酶法转化生成L-半胱氨酸的固定化工艺，推测此转化途径涉及三种酶，不同于N-代途径，可能为“S-代途径”。

不论由发酵法、酶催化法、合成法或其它任何方法得到的含半胱氨酸反应液，由于反应液的组成化合物复杂，并且半胱氨酸在水中的溶解度极高，在其半胱氨酸分离过程中，一般是先将最初得到的半胱氨酸进行分离和提纯，然后与强酸如盐酸或对甲苯磺酸反应而生成相应的盐。这些方法一般流程都复杂，得到的半胱氨酸产率低。所以要从复杂的发酵液中，分离出高纯度的半胱氨酸是困难的。但由于半胱氨酸相当容易氧化成胱氨酸，利用这一特性，可以先将反应液中的半胱氨酸转化成胱氨酸，使其沉淀析出，然后再将分离出的胱氨酸电解还原成半胱氨酸，从而得到纯的半胱氨酸。

【发明内容】本发明目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种在以恶臭假单胞菌TS-1138全细胞为酶源，酶法催化DL-ATC合成L-半胱氨酸，并在氧化剂的存在下氧化水溶液中的半胱氨酸成胱氨酸的方法。

本发明自行分离获得一株恶臭假单胞菌TS-1138菌株(Pseudomonas putida TS-1138)，通过相关酶的分离纯化等初步研究表明，该菌株以S-氨甲酰-L-半胱氨酸为中间产物(L-SCC)，由S-代途径(L-SCC途径)酶法合成L-半胱氨酸。合成路线见图1(A途径)。

其中所述的恶臭假单胞菌TS1138(Pseudomonas putida TS-1138)，已于2007年1月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.1920。

如图1所示，TS-1138是经过途径A，将ATC转化为L-半胱氨酸，其中有3种酶进行协同催化作用：ATC消旋酶(ATC racemase)、L-ATC水解酶(L-ATC hydrolyse)和S-氨甲酰-L-半胱氨酸酰胺水解酶(S-carbomyl-L-cysteine amidohydrolase)。ATC消旋酶催化拆分DL-ATC生成L-ATC；L-ATC水解酶水解ATC噻唑环中的C＝N双键，生成S-氨甲酰-L-半胱氨酸(L-SCC)中间产物；再经S-氨甲酰-L-半胱氨酸酰胺水解酶(L-SCC酰胺水解酶)催化生成终产物L-半胱氨酸。

本发明提供的微生物转化生产胱氨酸的方法包括：

(1)在假单胞菌TS-1138全细胞为酶源的情况下，酶法催化转化底物ATC得到L-半胱氨酸水溶液。在所述的转化反应中，TS-1138菌体用量一般占转化总体系重量百分比为的1％至25％，最佳为8％。

(2)所述的酶法催化ATC反应过程中，底物ATC的终浓度为0.1％至1.5％，最佳为0.4％。

(3)所述的ATC转化反应过程中以羟胺为脱巯基酶的抑制剂，有效地控制L-半胱氨酸的分解，所用羟胺的终浓度应为0.5mM至3.0mM，最好为1.5mM。

(4)采用氧化方式将所述的溶液中的半胱氨酸转化成胱氨酸，可使用二甲亚砜(DMSO)氧化法、双氧水氧化法或空气氧化法，其中DMSO是最有效的半胱氨酸氧化剂。DMSO氧化法是在pH为1时，添加半胱氨酸摩尔浓度的10倍的DMSO，室温条件下搅拌8小时，可实现95％以上的半胱氨酸氧化为胱氨酸。

(5)所述的全细胞催化法的特征是能够连续进行，即通过离心或膜过滤的方法分离酶源细胞及反应液，使同一批细胞能够连续参加转化反应，其中可保持5次以上ATC转化为胱氨酸的转化率在90％以上。

(6)得到的胱氨酸溶液通过浓缩，调节pH为5，胱氨酸以晶体形式析出，再通过过滤或抽滤的方式可得到胱氨酸晶体。

所述的菌体细胞酶源是通过发酵的方法得到的，其中发酵条件为：温度28至30℃，pH 6.2至6.8，转速：350至450r/min，通气量：150至300L/h。

在本发明实例中，采用Gaitonde法来测定半胱氨酸的含量，具体方法如下：精确称取一定量L-半胱氨酸标准品，溶于一定量0.05M HCl中，制备终浓度为500mg/L的标准母液，进一步用蒸馏水将上述母液分别稀释为10，20，……，100mg/L的标准溶液。取一定量的标准溶液或待测样品溶液的稀释液0.2mL，加入0.2mL冰醋酸，再加入0.2mL酸性茚三酮试剂，于沸水浴中反应10min，然后立即在冷水中冷却，最后加入2.4mL酒精，使总体积为3mL。放置10min后，于560nm下测定其吸光度，以浓度和吸光度绘制标准曲线。通过该标准曲线计算出未知溶液中的半胱氨酸浓度。

在本发明实例中还涉及到胱氨酸浓度的分析方法：先将含有胱氨酸的溶液稀释到100mg/L，并与等体积的2mM 1，4-二硫苏糖醇溶液混合，添加2N的NaOH以调节pH值到8.0至8.5，在室温下静置1小时，使胱氨酸完全还原成半胱氨酸，再通过上述方法测定溶液中总的半胱氨酸的浓度。并同时分析溶液中未经1，4-二硫苏糖醇还原时的半胱氨酸含量，再通过总的半胱氨酸的浓度减去还原前的半胱氨酸的浓度，得到胱氨酸的浓度。

在本发明实例中，L-半胱氨酸转化率计算公式如下：

$C(\%)=\frac{M_2\·N}{M_1}\×100\%=\frac{\frac{W_2}{{\mathrm{MW}}_2}\·N}{\frac{W_1}{{\mathrm{MW}}_1}}\×100\%=\frac{\frac{W_2}{121}\·N}{\frac{W_1}{146}}\×100\%$

其中：

C——ATC转化为L-半胱氨酸的摩尔转化率；

N——茚三酮反应的稀释倍数；

MW₁——ATC的分子量；

M₁——转化反应液中的ATC的摩尔浓度；

W₁——转化反应液中的ATC的质量浓度；

MW₂——L-半胱氨酸的分子量；

M₂——茚三酮反应稀释液中L-半胱氨酸的摩尔浓度；

W₂——茚三酮反应稀释液中L-半胱氨酸的质量浓度；

本发明的优点和积极效果：通常在裂解菌体利用细胞内的胞内酶，酶法催化底物的转化反应中，酶的稳定性差、易失活，一般不能重复使用；而固定化的方法步骤比较繁杂，而且或多或少对酶活力有一定影响。而本发明方法以恶臭假单胞菌TS-1138细胞为酶源，不需要胞内酶的分离与精制，并以羟胺为抑制剂，直接利用菌体细胞转化底物ATC得到L-半胱氨酸水溶液，并进一步通过氧化方式将所述的半胱氨酸转化成胱氨酸的方法。该方法直接利用细胞为酶源直接催化底物，取缔了固定化酶的方法，可多次连续使用，其中可保持5次以上ATC转化为半胱氨酸的转化率在90％以上。

【附图说明】

图1：微生物转化ATC合成L-半胱氨酸的代谢途径示意图；

图2：羟胺浓度对转化率的影响曲线。

【具体实施方式】

实施例1

假单胞菌TS-1138菌悬液的制备

从平板上挑取一环假单胞菌TS-1138接入50mL种子培养基中(葡萄糖20g，ATC 3g，玉米浆5g，尿素3g，NaCl 1.5g，MnSO₄·H₂O 0.1g，K₂HPO₄ 3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，定容至1L，pH 7.5)，28℃ 120r/min培养16小时后，以1％接种量转接到7L产酶培养基中(葡萄糖30g，ATC 4g，玉米浆1g，尿素3g，NaCl 1.5g，MnSO₄·H₂O 0.1g，K₂HPO₄ 3g，MgSO₄·7H₂O0.5g，FeSO4·7H₂O 0.01g，定容至1L，pH 7.5)，在10L发酵罐中进行发酵培养，发酵条件如下：温度：29℃；pH：6.5；转速：400r/min；通气量：200L/h。发酵14至16小时后，离心，收集菌体，用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH8.0)洗涤菌体1至2次，称得菌体湿重为180g。称取一定量的上述菌体，加入甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，制得终浓度为25％的菌悬液。

实施例2

抑制剂羟胺对提高半胱氨酸转化率的影响

在100mL三角瓶中加入0.6％的ATC溶液(含有0.6％ATC，0.6％ K₂HPO₄，pH 7.5至8.0)20mL，加入终浓度为0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，5.0，8.0，10.0mM不同剂量的羟胺，再向每个三角瓶中加入上述实施例1的TS-1138菌悬液10mL，混匀。37℃恒温，反应2.5小时。取一定量的反应液，离心，去沉淀，稀释到一定浓度，采用Gaitonde法来测定半胱氨酸的含量，以不加菌悬液的反应液作空白对照。与标准曲线对比，计算出半胱氨酸量，并计算出相应的转化率，结果见图2。

如图2结果所示，在没有羟胺为抑制剂的条件下，ATC转化为半胱氨酸的摩尔转化率为65％左右，在底物中加入0.5，1.0，1.5，2.0，3.0mM羟胺后，转化率可以达到80％以上。特别当羟胺浓度为1.0，1.5和2.0mM时，转化率可以保持在90％以上。最佳为1.5mM，其转化率可以达到95.7％。

实施例3

不同的氧化条件对制备胱氨酸的影响

为考察DMSO、H₂O₂以及空气对半胱氨酸的氧化能力。本实验在0.1M L-半胱氨酸水溶液(pH 1)中，分别加入不同的剂量的DMSO、H₂O₂以及通入空气，在室温下氧化8小时后，分别测定L-半胱氨酸的氧化率及胱氨酸的得率，结果如表1所示。

       表1不同氧化剂氧化半胱氨酸的用量考察

氧化剂种类	氧化剂浓度与用量	半胱氨酸氧化率(％)	胱氨酸收率(％)
				DMSO	0.01M	2.46	1.54
0.1M	30.50	29.7
			0.5M		72.57	70.66
0.8M	92.42	87.8
			1.0M		97.4	91.6
1.5M	98.3	84.2
			2.0M		97.8	79.63
H2O2	0.01M	43.5					10.4
			0.1M	71.27	14.66
	0.5M	92.76				11.77
			0.8M	99.43	5.67
	1.0M	98.54				0
			1.5M	99.87	0
	2.0M	99.21				0
			空气	1.5L/min	28.04		26.6
2.5L/min	38.24	37.3

由实验结果可以看出，DMSO和H₂O₂均可以有效的氧化半胱氨酸。当DMSO和H₂O₂的浓度分别在0.8M及0.5M以上时，半胱氨酸的氧化率均可以达到90％以上。其中DMSO可以将大部分半胱氨酸氧化为胱氨酸，半胱氨酸的氧化与胱氨酸的生成呈线性关系。由于H₂O₂为强氧化剂，即使半胱氨酸的氧化率接近100％，而生成的胱氨酸会进一步被氧化生成磺基丙氨酸，因此胱氨酸生成率很低。因此对于浓度为0.1M的半胱氨酸，所用的氧化剂以DMSO为最好，最佳反应浓度为1.0M。

实施例4

DMSO氧化条件的考察

为考察DMSO氧化时间、浓度与半胱氨酸氧化率的关系。本实验在0.1M L-半胱氨酸水溶液(pH 1)中，分别加入0.5，1.0，1.5M不同的剂量的DMSO，在室温下氧化2至12小时后，分别测定L-半胱氨酸的氧化率及胱氨酸的得率，结果如表2所示。

                      表2DMSO氧化半胱氨酸条件的考察

DMSO浓度(M)	氧化率与收率(％)	时间(小时)
								2	4	6	8	10	12
		0.5	半胱氨酸氧化率	64.7	72.1	78.3	81.2							82.4	83.5
胱氨酸收率	58.6							69.3	74.5	76.7	77.6	78.2
			1.0	半胱氨酸氧化率	69.4	79.7	87.1						96.7	97.8	97.5
胱氨酸收率	64.5	74.3						80.6	90.9	91.4	90.2
				1.5	半胱氨酸氧化率	76.5	87.2					94.2	96.8	97.7	96.4
胱氨酸收率	73.2	78.9	83.4					85.9	87.1	86.3

如表2所示，使用0.5，1.0，1.5M的DMSO氧化8小时以后，半胱氨酸的氧化率及胱氨酸得率均没有明显的提高，证明在8小时时基本上已经实现了半胱氨酸的完全氧化。而在2至6小时内，1.5M DMSO的氧化率明显高于1.0M。但随着时间延长，高浓度的氧化优势渐渐失去，因此，使用1.0M DMSO作为半胱氨酸的氧化剂，在室温条件下氧化0.1M的半胱氨酸，氧化8小时为最佳时间。

实施例5

TS-1138菌体细胞的使用次数与胱氨酸转化率的关系

在一个内容积为500mL并装有搅拌器的容器中，分别加入含有0.6％ ATC，0.6％K₂HPQ₄和1.5mM羟胺的水溶液300mL，以及含有25％TS-1138湿菌体的150mL菌悬液。用5％的氢氧化钠水溶液调整pH值至7.5至8.0，置于37℃恒温水浴中，搅拌反应2.5小时。

反应完成后，在4℃条件下12000rpm离心15分钟后，将固液分离，收集沉淀作为酶源细胞，用于下次反应。上清液为含有半胱氨酸的混合液。用浓盐酸调整pH至1.0左右，再添加DMSO使终浓度达到1.0M，室温下搅拌8小时。用2N的氢氧化钠水溶液调整溶液pH值至5.0，使胱氨酸析出，过滤干燥后得胱氨酸粉末。

取上述沉淀后的TS-1138细胞，以150mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液重悬，再加入到上述同样的300mL含有0.6％ATC，0.6％磷酸氢二钾和1.5mM羟胺的溶液中，调整pH值7.5至8.0，37℃水浴中继续反应2.5小时，以下过程同上。离心后沉淀作为酶源可再次反应，液相可用于获得胱氨酸。

同一批菌体连续反应8次，分别测定反应过程中的L-半胱氨酸的转化率和胱氨酸的收率。如表3所示，前6次ATC转化成L-半胱氨酸的转化率均可以在95％以上，胱氨酸的收率也可以保持在90％以上。

                      表3.TS-1138菌体细胞的使用次数的考察

反应次数	ATC添加量(g)	L-半胱氨酸的转化率		胱氨酸的收率
						L-半胱氨酸量(g)	摩尔转化率(％)	胱氨酸量(g)	收率(％)
		1	1.8	1.466	98.2					1.386	93.6
2	1.8					1.467	98.3	1.375	92.8
		3	1.8	1.449	97.1					1.379	93.1
4	1.8					1.461	97.9	1.369	92.4
		5	1.8	1.437	96.3					1.358	91.7
6	1.8					1.432	96.0	1.356	91.5
		7	1.8	0.753	50.5					0.666	45.0
8	1.8					0.309	20.7	0.224	15.1

实施例6

以TS-1138菌体细胞连续转化ATC生产胱氨酸

在一个内容积为2500mL并装有搅拌器的容器中，分别加入含有0.6％ATC，0.6％K₂HPO₄和1.5mM羟胺的底物原料溶液1400mL，和含有25％TS-1138菌悬液700mL。用5％的氢氧化钠水溶液调整pH值至7.5至8.0，置于37℃恒温水浴中，反应2.5小时后，使用中空纤维素膜MIF-503过滤分离细胞和反应液。其中ATC和L-半胱氨酸等小分子随反应液被滤出，TS-1138细胞以高浓度菌悬液形式被保留。滤出液经浓盐酸调pH值至1.0后，再添加终浓度为1.0M的DMSO，室温下搅拌8小时。用2N的氢氧化钠水溶液调整溶液pH值至5.0，析出胱氨酸结晶，过滤干燥后得胱氨酸白色粉末。

上述浓缩后的TS-1138细胞，可重悬于700mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，再加入至上述1400mL底物原料溶液中，调整pH值7.5至8.0，37℃继续反应2.5小时，以下过程同上。

同一批菌体连续反应8次，分别测定每次反应过程中的L-半胱氨酸的转化率和胱氨酸的收率。如表4所示，前5次内ATC转化生成胱氨酸的收率可以保持在90％之上。

                 表4.连续转化生产胱氨酸的条件考察

反应次数	ATC添加量(g)	L-半胱氨酸的转化率		胱氨酸的收率
						L-半胱氨酸量(g)	转化率(％)	胱氨酸量(g)	收率(％)
		1	8.4	6.857	98.5					6.572	94.4
2	8.4					6.767	97.2	6.565	94.3
		3	8.4	6.739	96.8					6.523	93.7
4	8.4					6.676	95.9	6.460	92.8
		5	8.4	6.488	93.2					6.300	90.5
6	8.4					5.806	83.4	5.416	77.8
		7	8.4	4.421	63.5					3.948	56.7
8	8.4					2.841	40.8	2.193	31.5

Claims (8)

1.一种微生物转化生产胱氨酸的方法，其特征在于包括：

以恶臭假单胞菌TS-1138细胞为酶源的条件下，以羟胺为抑制剂，酶法转化底物DL-2-氨基-Δ2噻唑啉-4羧酸(DL-2-Amino-Δ2thiazoline-4-Carboxylic Acid，ATC)得到L-半胱氨酸水溶液，并进一步通过氧化方式将所述的半胱氨酸转化成胱氨酸；

其中，TS-1138菌体用量占转化总体系重量百分比为1％至25％，转化体系中所用羟胺的浓度应为0.5mM至3.0mM，底物ATC的初始浓度为0.1％至1.5％。

2.按权利要求1所述的微生物转化生产胱氨酸的方法，其特征在于所述的假单胞菌TS1138(Pseudomonas putida TS-1138)，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.1920。

3.按权利要求1所述的微生物转化生产胱氨酸的方法，其特征在于所述的细胞为酶源催化ATC反应过程中，底物ATC的初始浓度最佳为0.4％。

4.按权利要求1所述的微生物转化生产胱氨酸的方法，其特征在于TS-1138菌体用量占转化总体系重量百分比最好为8％。

5.按权利要求1所述的微生物转化生产胱氨酸的方法，其特征在于所述的ATC转化反应过程中以羟胺为半胱氨酸分解的抑制剂，转化体系中所用羟胺的浓度最好为1.5mM。

6.按权利要求1所述的微生物转化生产胱氨酸的方法，其特征在于所述的氧化法是二甲亚砜氧化法；该氧化法是在pH为1时，添加半胱氨酸摩尔浓度的10倍的二甲亚砜，室温条件下搅拌8小时以上，将半胱氨酸氧化为胱氨酸。

7.按权利要求1所述的微生物转化生产胱氨酸的方法，其特征在于所述的酶催化法能够连续发生，即通过高速离心或膜过滤的方法分离酶源细胞及反应液，使同一批细胞能够连续参加转化反应，其中可保持5次以上ATC转化为半胱氨酸的转化率在90％以上。

8.按权利要求1所述的微生物转化生产胱氨酸的方法，其特征在于，其中得到的胱氨酸溶液，调节pH为5，胱氨酸以晶体形式析出，通过过滤或抽滤的方式得到胱氨酸晶体。

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