CN106086090B - 一种两步微生物转化法制备r-扁桃酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种两步微生物转化法制备R‑扁桃酸的方法，所述方法为：以苯甲酰甲酸乙酯为底物，以酿酒酵母经发酵培养获得的菌体为催化剂，以pH值6‑8的缓冲液为反应介质，在20‑45℃、100‑200rpm条件下进行转化反应，获得R‑扁桃酸乙酯；以R‑扁桃酸乙酯为底物，以蜡样芽孢杆菌经发酵培养获得的菌体为催化剂，以有机溶剂为助溶剂，以pH值7‑9的缓冲液为反应介质，在20‑40℃、100‑200rpm条件下进行反应，获得R‑扁桃酸。本发明方法成本低廉，环境友好，反应条件温和；易于大规模工业化生产；操作简便，摩尔转化率较高；可将产率提高到99.8％，ee值提高到100％。

Description

一种两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种R-扁桃酸的制备，特别涉及一种以苯甲酰甲酸乙酯为原料经两步微生物转化法分别实现还原、水解过程来合成R-扁桃酸的新工艺，尤其是以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3361转化苯甲酰甲酸乙酯制备R-扁桃酸乙酯和以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC No.12336水解R-扁桃酸乙酯生成R-扁桃酸。
(二)背景技术
扁桃酸(Mandelic acid，MA)，学名α-羟基苯乙酸，又名苦杏仁酸、苯羟乙酸。手性扁桃酸是重要的氨基酸合成前体和药物中间体。R-扁桃酸是合成青霉素、头孢拉定等抗生素的重要中间体，还可以用于合成抗肿瘤药物Goniothalam us styryllactones、治疗水肿和风湿疾病的药物(+)-Crassalactone A。目前市场上对手性扁桃酸的需求远远大于对其外消旋体的需求。因此，手性扁桃酸成为热点的精细化工中间体。
扁桃酸化学式为C8H8O3，CAS号：90-64-2，分子量152.15，熔点118-121℃，易溶于水、乙醇，采用微生物不对称还原苯甲酰甲酸乙酯制备R-扁桃酸乙酯，R-扁桃酸乙酯经另一种微生物水解后生成R-扁桃酸。该途径是制备R-扁桃酸的绿色合成路线，是合成R-扁桃酸的有效方法。
光学纯扁桃酸的生产方法主要有物理化学方法、化学法和生物催化法。物理化学方法主要包括毛细管电泳法和色谱分离法。色谱法中主要有高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)。色谱法不能够实现手性扁桃酸的工业化大规模生产。化学法生产手性扁桃酸主要分为非对映体盐结晶拆分法、不对称合成法和电化学法等。采用化学法生产具有反应条件苛刻，环境污染大的缺点。生物方法生产光学纯扁桃酸主要有氧化还原法和水解法等。本发明采用酿酒酵母CGMCC No.3361不对称还原苯甲酰甲酸乙酯制备R-扁桃酸乙酯，再进一步采用蜡样芽孢杆菌CGMCC No.12336水解R-扁桃酸乙酯的两步微生物转化法制备手性扁桃酸，该过程具有反应条件温和、产物对映体过剩值高和环境友好等优点。
采用微生物转化法经苯甲酰甲酸乙酯还原、水解两步工艺制备R-扁桃酸。现有技术主要采用外消旋扁桃酸乙酯拆分方法制备R-扁桃酸，转化率理论上最高只有50％，而本方法的转化率理论上可以达到100％，本发明实施例中可以达到97.2％，R-扁桃酸的对应体过剩值达到100％。本发明的工艺过程未见专利报道，也未见到文献报道，是一种全新的、环保、节能、高效的R-扁桃酸的合成工艺。
(三)发明内容
本发明目的解决了现有技术中原料利用率低，污染大，成本高等问题。提供一种两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，采用两种催化效率高的微生物酿酒酵母CGMCCNo.3361和蜡样芽孢杆菌CGMCC No.12336，以苯甲酰甲酸乙酯为底物，经过不对称还原和水解两步反应最终合成R-扁桃酸的方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，所述方法为：步骤(1)：以苯甲酰甲酸乙酯为底物，以酿酒酵母经发酵培养获得的菌体为催化剂，以pH值6-8的缓冲液为反应介质，在20-45℃、100-200rpm条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得R-扁桃酸乙酯；步骤(2)：以R-扁桃酸乙酯为底物，以蜡样芽孢杆菌经发酵培养获得的菌体为催化剂，以有机溶剂为助溶剂，以pH值7-9的缓冲液为反应介质，在20-40℃、100-200rpm条件下进行反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得R-扁桃酸。
进一步，步骤(1)所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCCNo.3361，已在专利申请CN101709271A中公开，菌落特征：在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均匀的菌落形态。
进一步，步骤(1)所述底物用量以反应介质体积计为0.02-0.17mol/L，所述催化剂用量以湿菌体干重计，所述湿菌体用量以反应介质体积计为0.04-0.16g/ml。
进一步，步骤(1)所述催化剂按如下方法制备：(1)斜面培养：将酿酒酵母(优选Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.3361)接种至斜面培养基，26-35℃培养2-3天；所述斜面培养基组成：麦芽汁8-12g/L，酵母粉2-4g/L，蛋白胨4-6g/L，葡萄糖8-12g/L，琼脂18-22g/L，溶剂为水，pH为自然；优选所述的斜面培养基组成：麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH为自然；(2)种子培养：用接种针从斜面培养基中取一接种环菌体接种在含有100ml种子培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，获得种子液；所述种子培养基组成：葡萄糖28-32g/L，酵母粉2-4g/L，硫酸铵4-6g/L，KH2PO4 0.5-1.5g/L，K2HPO4·3H2O 0.5-1.5g/L，MgSO4 0.2-0.3g/L，溶剂为水，pH为自然；优选种子培养基组成：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4 0.25g/L，溶剂为水，pH为自然；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量接种于含有500ml发酵培养基的1000ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，获得发酵液，发酵液离心，得湿菌体；发酵培养基组成同种子培养基。
进一步，步骤(1)所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液加入3倍体积乙酸乙酯连续萃取3次，取乙酸乙酯旋转蒸发除去大部分有机溶剂后，加入无水硫酸钠脱水，抽滤，滤液旋转蒸发除去剩余的有机溶剂，即得所述R-扁桃酸乙酯，产率达99.8％，对映体过剩值达100％。
进一步，步骤(2)所述蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)Zjut ml10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.12336，保藏日期2016年4月11日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。菌落特征：在琼脂培养基上呈现白色(似蜡烛样颜色)、稍有光泽、平坦、近似圆形、质地软的菌落形态。
进一步，步骤(2)所述底物用量以反应介质体积计为0.015-0.09mol/L，所述催化剂用量以湿菌体干重计，所述湿菌体用量以反应介质体积计为0.01-0.1g/ml，所述助溶剂体积用量以反应介质体积计为5％。
进一步，步骤(2)所述助溶剂为下列之一：二甲基亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯和正己烷。
进一步，步骤(2)所述催化剂按如下方法制备：(1)斜面培养：将蜡样芽孢杆菌(优选蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌Zjut ml 10)接种至斜面培养基，26-35℃培养1-2天；所述的斜面培养基组成：葡萄糖8-10g/L，酵母膏4-6g/L，蛋白胨2-3g/L，NaCl 1-3g/L，KH2PO4 1-3g/L，K2HPO4 1-3g/L，MgSO4 0.4-0.6g/L，琼脂18-22g/L，溶剂为水，pH为7-9；优选所述的斜面培养基组成：葡萄糖9g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨2g/L，NaCl 2g/L，KH2PO4 2g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH为8；(2)种子培养：用接种针从斜面培养基中取一接种环菌体接种在含有100ml种子培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，获得种子液；种子培养基组成：葡萄糖8-10g/L，酵母膏4-6g/L，蛋白胨2-3g/L，NaCl1-3g/L，KH2PO4 1-3g/L，K2HPO4 1-3g/L，MgSO4 0.4-0.6g/L，溶剂为水，pH值为7-9；优选种子培养基组成：葡萄糖9g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨2g/L，NaCl 2g/L，KH2PO4 2g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，溶剂为水，用NaOH溶液调整液体培养基的pH值为8；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量接种于含有400ml发酵培养基的1000ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，获得发酵液，发酵液离心，得湿菌体；发酵培养基组成同种子培养基。
进一步，步骤(2)所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，离心，取上清液加入3倍体积乙酸乙酯连续萃取3次，取乙酸乙酯层旋转蒸发除去有机溶剂，加入正己烷，未反应完全的R-扁桃酸乙酯溶解于正己烷中，扁桃酸不溶于正己烷，过滤，取滤饼，即得所述R-扁桃酸，产率为97.2％，对映体过剩值为100％。
本发明中采用酿酒酵母CGMCC No.3361不对称还原苯甲酰甲酸乙酯来制备R-扁桃酸乙酯，再经蜡样芽孢杆菌CGMCC No.12336水解R-扁桃酸乙酯制备R-扁桃酸，可以获得高对映体过剩值的R-扁桃酸。
本发明采用的微生物转化法制备R-扁桃酸与物理化学方法、化学合成法相比，具有以下优点：①微生物菌体易于大规模培养，可以获得大量的生物催化剂，比化学催化剂成本低廉；②生产菌株安全，环境友好，反应条件温和；③易于实现大规模工业化生产；④操作简便，摩尔转化率较高；⑤酿酒酵母CGMCC No.3361全细胞不对称还原苯甲酰甲酸乙酯来制备R-扁桃酸乙酯，全细胞中既含有氧化还原酶又含有辅酶，全细胞的还原有利于实现辅酶的原位再生，可将产率提高到99.8％，ee值提高到100％。
(四)附图说明
图1菌株Zjut ml 10与芽孢杆菌其他种属间的系统进化树。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3361，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，已在专利申请CN101709271A中公开，菌落特征：在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均匀的菌落形态。
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)Zjut ml 10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.12336，保藏日期2016年4月11日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。菌落特征：在琼脂培养基上呈现白色(似蜡烛样颜色)、稍有光泽、平坦、近似圆形、质地软的菌落形态。
本发明实施例所述底物、助溶剂和湿菌体的加入量均以磷酸盐缓冲液体积计。
一、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3361全细胞不对称还原苯甲酰甲酸乙酯来制备R-扁桃酸乙酯的实施例如下：
实施例1：
(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.3361接种至斜面培养基，30℃培养3天。所述的斜面培养基组成：麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH为自然；120℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。
(2)种子培养：用接种针从斜面培养基中取一接种环菌体接种在4瓶含有100ml种子培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，获得种子液。种子培养基组成：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4 0.25g/L，溶剂为水，pH为自然，120℃灭菌20min。
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量接种于8瓶含有500ml发酵培养基的1000ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，获得发酵液，发酵液离心，得湿菌体53.69g，干重为13.73g。发酵培养基组成同种子培养基。
(4)转化反应：在含有20ml pH为7.0的磷酸缓冲液的三角瓶中加入上述所得湿菌体至终浓度0.10g/ml(干重)，然后分别加入终浓度0.02、0.06、0.08、0.11、0.14和0.17mol/L苯甲酰甲酸乙酯，分别置于30℃、180rpm摇床中反应48h。反应结束后，将转化液离心，上清液用乙酸乙酯萃取底物和产物，采用气相色谱检测转化率和R-扁桃酸乙酯对映体过剩值，结果见表1。
R-扁桃酸乙酯摩尔转化率采用安捷伦7820气相色谱，氢火焰离子检测器，色谱柱CYCLODEX-B手性毛细管柱(0.25mm×60m×0.25μm)。分析条件为进样口温度250℃；检测器温度255℃；柱温100℃；载气为氮气；流速2.0ml/min；分流比15:1；进样量：1μL。可以检测到苯甲酰甲酸乙酯和R-扁桃酸乙酯的含量，进一步计算出反应的摩尔转化率和对映体过剩值。
(5)分离纯化：反应结束后，将反应液加入3倍体积乙酸乙酯连续萃取3次，取乙酸乙酯层旋转蒸发除去大部分有机溶剂，加入无水硫酸钠脱水，抽滤，旋转蒸发除去剩余有机溶剂，即得所述R-扁桃酸乙酯，产率为99.8％，对映体过剩值为100％。
结果表明：随着底物浓度的增加转化率出现降低的趋势，说明底物浓度过高对反应过程存在抑制作用，最佳底物浓度为0.11mol/L，R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值均可以达到100％。酿酒酵母CGMCC No.3361还原底物苯甲酰甲酸乙酯可以得到高光学纯度的R-扁桃酸乙酯，酿酒酵母CGMCC No.3361还原获得的R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值不会受到底物浓度不同的影响，在底物浓度为0.02-0.17mol/L时，R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值均为100％。
表1：底物初始浓度对转化率及R-扁桃酸乙酯对映体过剩值的影响
底物浓度(mol/L) 转化率(％) R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值(ee％)
0.02 99.2 100
0.06 99.9 100
0.08 99.8 100
0.11 99.0 100
0.14 94.7 100
0.17 88.5 100
实施例2：
在含有20ml pH为7.0的磷酸缓冲液的三角瓶中加入实施例1方法所得湿菌体至0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14和0.16g/ml(干重)，分别加入终浓度0.11mol/L苯甲酰甲酸乙酯，分别置于30℃、180rpm摇床中反应48h，反应结束后，将转化液离心，上清液用乙酸乙酯萃取底物和产物，采用气相色谱检测转化率和R-扁桃酸乙酯对映体过剩值，结果见表2。分离纯化同实施例1。
结果表明：随着菌体浓度的增加转化率出现增加的趋势，菌体量的增大说明作为生物反应催化剂的羰基还原酶量的增加，对于伴有辅酶再生的微生物转化反应而言，菌体量的增加，不仅增加了参与底物还原反应的酶量，而且同时增加了辅酶NADH或NADPH的量，辅酶量的增加将使反应向生成产物的方向移动，从而提高了菌体对底物的转化率。当菌体浓度大于0.10g/ml时，转化率变化不大，底物基本可以完全被转化。酿酒酵母CGMCCNo.3361还原底物苯甲酰甲酸乙酯可以得到高光学纯度的R-扁桃酸乙酯，酿酒酵母CGMCCNo.3361还原获得的R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值不会受到菌体浓度不同的影响，在菌体浓度添加范围为0.04-0.16g/ml时，R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值均为100％。
表2：菌体浓度对转化率及R-扁桃酸乙酯对映体过剩值的影响
菌体浓度(g/ml) 转化率(％) R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值(ee％)
0.04 82.5 100
0.06 88.9 100
0.08 92.8 100
0.10 99.0 100
0.12 99.6 100
0.14 99.9 100
0.16 99.1 100
实施例3：
在含有20ml pH为7.0的磷酸缓冲液的三角瓶中加入实施例1方法所得湿菌体至0.10g/ml(干重)，分别加入0.11mol/L苯甲酰甲酸乙酯，分别置于30℃、180rpm摇床中反应12、24、36、48和60h，反应结束后，将转化液离心，上清液用乙酸乙酯萃取底物和产物，采用气相色谱检测转化率和R-扁桃酸乙酯对映体过剩值，结果见表3。分离纯化同实施例1。
结果表明：随着转化时间的增加转化率出现增加的趋势，当反应48h时，转化率基本达到最大值。酿酒酵母CGMCC No.3361还原底物苯甲酰甲酸乙酯可以得到高光学纯度的R-扁桃酸乙酯，酿酒酵母CGMCC No.3361还原获得的R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值不会受到不同转化时间的影响，不同的转化时间下获得的R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值均为100％。
表3：转化时间对转化率及R-扁桃酸乙酯对映体过剩值的影响
实施例4：
在含有20ml pH为7.0的磷酸缓冲液的三角瓶中加入实施例1方法所得湿菌体至0.10g/ml(干重)，分别加入终浓度0.11mol/L苯甲酰甲酸乙酯，分别置于20、25、30、35、40和45℃，180rpm摇床中反应48h，反应结束后，将转化液离心，上清液用乙酸乙酯萃取底物和产物，采用气相色谱检测转化率和R-扁桃酸乙酯对映体过剩值，结果见表4。分离纯化同实施例1。
结果表明：在最佳的反应温度下，菌体细胞可以表现出很高的催化活性。当反应温度高于30℃时，菌体细胞的催化活性下降。其主要原因是在较高的温度下，菌体细胞内的羰基还原酶失活速率加快。酿酒酵母CGMCC No.3361还原底物苯甲酰甲酸乙酯可以得到高光学纯度的R-扁桃酸乙酯，酿酒酵母CGMCC No.3361还原获得的R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值不会受到不同反应温度的影响，在20-25℃范围产物R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值均为100％。
表4：温度对转化率及R-扁桃酸乙酯对映体过剩值的影响
温度(℃) 转化率(％) R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值(ee％)
20 85.7 100
25 91.2 100
30 99.0 100
35 95.4 100
40 89.5 100
45 83.2 100
实施例5：
在含有20ml pH为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的磷酸缓冲液的三角瓶中加入实施例1方法所得湿菌体至0.10g/ml(干重)，分别加入0.11mol/L苯甲酰甲酸乙酯，分别置于30℃、180rpm摇床中反应48h，反应结束后，将转化液离心，上清液用乙酸乙酯萃取底物和产物，采用气相色谱检测转化率和R-扁桃酸乙酯对映体过剩值，结果见表5。分离纯化同实施例1。
结果表明：在偏酸性或偏碱性条件下，菌体细胞的催化活性均降低。因此，转化最适缓冲液pH值为7.0。酿酒酵母CGMCC No.3361还原底物苯甲酰甲酸乙酯可以得到高光学纯度的R-扁桃酸乙酯，酿酒酵母CGMCC No.3361还原获得的R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值不会受到pH不同的影响，在pH 6.0-8.0范围内获得的R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值均为100％。
表5：pH对转化率及R-扁桃酸乙酯对映体过剩值的影响
pH 转化率(％) R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值(ee％)
6.0 80.9 100
6.5 95.2 100
7.0 99.0 100
7.5 94.4 100
8.0 92.1 100
实施例6：
在含有20ml pH为7.0的磷酸缓冲液的三角瓶中加入实施例1方法所得湿菌体至0.10g/ml(干重)，分别加入0.11mol/L苯甲酰甲酸乙酯，分别置于30℃、120、140、160、180和200rpm摇床中反应48h，反应结束后，将转化液离心，上清液用适量的乙酸乙酯萃取底物和产物，采用气相色谱检测转化率和R-扁桃酸乙酯对映体过剩值。分离纯化同实施例1。
结果表明：菌体细胞在较高的摇床转速下有较高的转化率，说明较高的摇床转速有利于加快传质过程，当摇床转速高于180rpm时，转化率提高不明显，为了节约能耗，选用180rpm为较适摇床转速。酿酒酵母CGMCC No.3361还原底物苯甲酰甲酸乙酯可以得到高光学纯度的R-扁桃酸乙酯，酿酒酵母CGMCC No.3361还原获得的R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值不会受到摇床转速不同的影响。
表6：摇床转速对转化率及R-扁桃酸乙酯对映体过剩值的影响
摇床转速(rpm) 转化率(％) R-扁桃酸乙酯的对映体过剩值(ee％)
120 85.9 100
140 88.7 100
160 95.8 100
180 99.0 100
200 99.6 100
二、采用蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC No.12336发酵获得的发酵液离心获得的菌体细胞水解R-扁桃酸乙酯制备R-扁桃酸的实施例：
实施例7菌株筛选及鉴定
本发明所涉及的微生物菌种是通过以下方法筛选得到:
(1)菌种筛选：取采自浙江工业大学的土样1g加入到装有50ml无菌水的100mL锥形瓶中，摇匀，静置30min，取5ml上清液加入上盖涂满R-扁桃酸乙酯的表面皿中，熏蒸24h。
(2)平板培养：取表面皿中的上清液涂布到分离平板上，30℃培养2-3天，分离平板培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO41g/L，MgSO4 0.25g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH为自然。
(3)斜面培养：从平板中生长的菌落中挑取单菌落进行斜面培养，30℃培养2-3天至出现丰满的菌苔后，置于4℃冰箱保存，备用。斜面培养基配方同分离平板培养基。
(4)种子培养：从培养成熟的斜面挑一环菌体接入装有25mL种子培养基的100mL摇瓶中，30℃、180rpm培养24小时。种子培养基配方如下：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4 0.25g/L，pH为自然。
(5)发酵培养：以体积浓度10％的接种量将种子液转接到装有25mL发酵培养基的100mL摇瓶中，30℃、180rmp培养24小时。发酵培养基配方同种子培养基。
(6)生物转化反应：将发酵液离心得到的菌体悬浮于4ml水中，加入0.05mol/L的R-扁桃酸乙酯，置30℃、180rpm摇床中转化48h。转化结束后，离心得到上清液，过滤，采用高效液相色谱法分析目的产物的含量以及产物的光学纯度，收集转化率和光学纯度高的菌株，筛选获得菌株Zjut ml 10。
(7)菌种鉴定：
菌株Zjut ml 10分子学鉴定
按SK8255(细菌)试剂盒操作提取菌株Zjut ml 10总DNA，以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′扩增菌株的16SrDNA基因，再将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳切胶纯化。再经测序确认所述菌株Zjut ml 10的16S rDNA基因序列如下(SEQ ID NO：1):
ATGCAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT-ATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGT-CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAACCAGCCG。
将Zjut ml 10菌株的16S rDNA序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对(BLAST)，得到菌株的系统发育树，如图1所示，结果表明：Zjut ml 10菌株与芽孢杆菌属(Bacillus)的部分菌株序列同源性较高。Zjut ml 10菌株与Bacilluscereus；S9菌株(NCBI登录号为KF951357)的序列同源性达到100％。根据分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，记为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)Zjut ml 10，保藏编号CGMCC No.12336。
实施例8：
(1)斜面培养：将蜡样芽孢杆菌CGMCC No.12336接种至斜面培养基，30℃培养2天。所述的斜面培养基组成：葡萄糖9g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨2g/L，NaCl 2g/L，KH2PO4 2g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH为8；120℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。
(2)种子培养：用接种针从斜面培养基中取一接种环菌体接种在3瓶含有100ml种子培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，获得种子液。种子培养基组成：葡萄糖9g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨2g/L，NaCl 2g/L，KH2PO4 2g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO40.5g/L，溶剂为水，用NaOH溶液调整液体培养基的pH值为8，120℃灭菌20min。
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量接种于6瓶含有400ml发酵培养基的1000ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，获得发酵液，发酵液离心，得湿菌体8.74g，干重为2.79g。发酵培养基组成同种子培养基。
(4)转化反应：在含有4ml pH 8.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入上述所得湿菌体0.01、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10g/ml(干重)，加入终浓度0.06mol/L R-扁桃酸乙酯(实施例6制备)，添加体积浓度5％的甲醇作为助溶剂，分别置于30℃、180rpm摇床中反应48h。反应结束后，将转化液离心、过滤，用高效液相色谱测定转化液中底物的摩尔转化率和对映体过剩值，结果见表7。
R-扁桃酸摩尔转化率采用安捷伦1200高效液相色谱分析检测。色谱柱为反相C18(250×4.6mm,5μm)色谱柱，流动相为6.0mmol/L L-苯丙氨酸和3.0mmol/L CuSO4的水-甲醇(体积比为90∶10)溶液；流速为0.5ml/min；UV检测波长为300nm。可以检测到R-扁桃酸的含量，进一步计算出反应的摩尔转化率。
(5)分离纯化：反应结束后，离心，取上清液加入3倍体积乙酸乙酯连续萃取3次，取乙酸乙酯层旋转蒸发除去有机溶剂，加入正己烷，未反应完全的R-扁桃酸乙酯溶解于正己烷中，扁桃酸不溶于正己烷，过滤即得所述R-扁桃酸，产率达97.2％，对映体过剩值均为100％。
结果表明：随着菌体浓度的增加转化率逐渐提高，菌体量的增大，生物反应催化剂的脂肪酶量增加，提高了菌体对底物的转化率。当底物与脂肪酶结合达到饱和时，增加菌体浓度，转化率增加不明显，因此，最佳的菌体浓度(干重)为0.08g/ml。蜡样芽孢杆菌CGMCCNo.12336水解底物R-扁桃酸乙酯可以得到高光学纯度的R-扁桃酸，R-扁桃酸的对映体过剩值达到100％。
表7：菌体浓度对转化率及R-扁桃酸对映体过剩值的影响
实施例9：
在含有4ml pH 8.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入实施例8方法所得湿菌体至0.08g/ml(干重)，加入R-扁桃酸乙酯(实施例6制备)，使其初始浓度分别为0.015、0.030、0.045、0.060、0.075和0.090mol/L，添加体积浓度5％的甲醇作为助溶剂，置于30℃、180rpm的摇床中反应48h。反应结束后，将转化液离心、过滤，用高效液相色谱测定转化液中底物的摩尔转化率和对映体过剩值，结果见表8。分离纯化同实施例8。
结果表明：随着底物初始浓度的增加转化率逐渐降低，说明底物初始浓度过高对反应过程存在抑制作用，最佳底物浓度为0.060mol/L。蜡样芽孢杆菌CGMCC No.12336水解底物R-扁桃酸乙酯可以得到高光学纯度的R-扁桃酸，产物R-扁桃酸的对映体过剩值达到100％。
表8底物初始浓度对转化率及R-扁桃酸对映体过剩值的影响
底物初始浓度(mol/L) 转化率(％) R-扁桃酸的对映体过剩值(ee％)
0.015 100 100
0.030 100 100
0.045 100 100
0.060 97.0 100
0.075 84.0 100
0.090 63.5 100
实施例10：
在含有4ml pH 8.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入实施例8方法所得湿菌体至0.08g/ml(干重)，加入0.06mol/L R-扁桃酸乙酯(实施例6制备)，以蒸馏水为空白对照，添加5％(V/V体积比)不同类型的有机溶剂，包括DMSO、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯和正己烷，置于30℃、180rpm的摇床中反应48h。反应结束后，将转化液离心、过滤，用高效液相色谱测定转化液中底物的摩尔转化率和对映体过剩值，结果见表9。分离纯化同实施例8。
结果表明：由于底物在水溶液中溶解度较差，在反应体系中加入有机溶剂作为助溶剂以增加细胞的通透性，有利于底物和产物在细胞内外的传质，不同的助溶剂对底物的转化有不同的影响，其中甲醇对提高底物转化率的效果最好，因此，选择5％(V/V体积比)甲醇作为助溶剂。蜡样芽孢杆菌CGMCC No.12336水解底物R-扁桃酸乙酯可以得到高光学纯度的R-扁桃酸，R-扁桃酸的对映体过剩值达到100％。
表9：助溶剂种类对转化率及R-扁桃酸对映体过剩值的影响
助溶剂种类 转化率(％) R-扁桃酸的对映体过剩值(ee％)
水 85.2 100
甲醇 97.0 100
乙醇 38.7 100
异丙醇 37.6 100
乙酸乙酯 30.1 100
正己烷 65.5 100
DMSO 80.9 100
实施例11：
在含有4ml pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入实施例8方法所得湿菌体至0.08g/ml(干重)，加入0.06mol/L R-扁桃酸乙酯(实施例6制备)，添加5％的甲醇作为助溶剂，分别置于30℃、180rpm摇床中反应48h。反应结束后，将转化液离心、过滤，用高效液相色谱测定转化液中底物的摩尔转化率和对映体过剩值，结果见表10。分离纯化同实施例8。
结果表明：菌体细胞在pH值为5.0-6.0的强酸环境中转化反应受到强烈抑制，转化率低，而在pH值为7.0-9.0的范围内菌体转化率较高，其中在pH值为8.0附近的转化率最高，当pH大于8.0，转化率又开始逐渐降低，因此将pH值为8.0作为该菌的最适转化pH。蜡样芽孢杆菌CGMCC No.12336水解底物R-扁桃酸乙酯可以得到高光学纯度的R-扁桃酸，R-扁桃酸的对映体过剩值达到100％。
表10：pH对转化率及R-扁桃酸对映体过剩值的影响
实施例12：
在含有4ml pH 8.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入实施例8方法所得湿菌体至0.08g/ml(干重)，加入0.06mol/L R-扁桃酸乙酯(实施例6制备)，添加5％的甲醇作为助溶剂，分别置于20、25、30、35和40℃，180rpm摇床中反应48h。反应结束后，将转化液离心、过滤，用高效液相色谱测定转化液中底物的摩尔转化率和对映体过剩值，结果见表11。分离纯化同实施例8。
结果表明：菌体细胞在20-30℃时转化率逐渐提高，酶的活性增加，当反应温度高于30℃时，菌体细胞的催化活性下降。其主要原因是在较高的温度下，菌体细胞内的脂肪酶失活速率加快。因此，选择30℃为最适转化温度。蜡样芽孢杆菌CGMCC No.12336水解底物R-扁桃酸乙酯可以得到高光学纯度的R-扁桃酸，R-扁桃酸的对映体过剩值达到100％。
表11：转化温度对转化率及R-扁桃酸对映体过剩值的影响
转化温度(℃) 转化率(％) R-扁桃酸的对映体过剩值(ee％)
20 76.2 100
25 88.7 100
30 97.0 100
35 84.7 100
40 54.2 100
实施例13：
在含有4ml pH 8.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入实施例8所得湿菌体至0.08g/ml(干重)，加入0.06mol/L R-扁桃酸乙酯(实施例6制备)，添加体积浓度5％的甲醇作为助溶剂，分别置于30℃、180rpm摇床中反应12、24、36、48、60和72h。反应结束后，将转化液离心、过滤，用高效液相色谱测定转化液中底物的摩尔转化率和对映体过剩值，结果见表12。分离纯化同实施例8。
结果表明：随着转化时间的增加转化率出现增加的趋势，当反应48h时，转化率基本达到最大值，随着反应时间的继续延长，转化率并没有大的变化。蜡样芽孢杆菌CGMCCNo.12336水解底物R-扁桃酸乙酯可以得到高光学纯度的R-扁桃酸，R-扁桃酸的对映体过剩值达到100％。
表12：转化时间对转化率及R-扁桃酸对映体过剩值的影响
转化时间(h) 转化率(％) R-扁桃酸的对映体过剩值(ee％)
12 33.3 100
24 56.9 100
36 75.6 100
48 97.0 100
60 96.8 100
72 97.6 100
实施例14：
在含有4ml pH 8.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入实施例8所得湿菌体至0.08g/ml(干重)，加入0.06mol/L R-扁桃酸乙酯(实施例6制备)，添加体积浓度5％的甲醇作为助溶剂，分别置于30℃，摇床转速分别为100、120、140、160、180和200rpm的摇床中反应48h。反应结束后，将转化液离心、过滤，用高效液相色谱测定转化液中底物的摩尔转化率和对映体过剩值，结果见表13。分离纯化同实施例8。
结果表明：菌体细胞在较高的摇床转速下有较高的转化率，说明较高的摇床转速有利于底物和产物在细胞内外的传质，当摇床转速高于180rpm时，转化率提高不明显，为了节约能耗，选用180rpm为较适摇床转速。蜡样芽孢杆菌CGMCC No.12336水解底物R-扁桃酸乙酯可以得到高光学纯度的R-扁桃酸，R-扁桃酸的对映体过剩值达到100％。
表13：摇床转速对转化率及R-扁桃酸对映体过剩值的影响
摇床转速(rpm) 转化率(％) R-扁桃酸的对映体过剩值(ee％)
100 72.1 100
120 81.4 100
140 87.7 100
160 90.4 100
180 97.0 100
200 96.5 100

Claims (7)

1.一种两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，其特征在于所述方法为：(1)以苯甲酰甲酸乙酯为底物，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3361经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以pH值6-8的缓冲液为反应介质，在20-45℃、100-200rpm条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得R-扁桃酸乙酯；(2)以R-扁桃酸乙酯为底物，以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)Zjut ml 10经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以有机溶剂为助溶剂，以pH值7-9的缓冲液为反应介质，在20-40℃、100-200rpm条件下进行反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得R-扁桃酸；所述助溶剂为下列之一：二甲基亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯和正己烷；所述蜡样芽孢杆菌Zjut ml 10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.12336，保藏日期2016年4月11日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
2.如权利要求1所述两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤(1)所述底物用量以反应介质体积计为0.02-0.17mol/L，所述催化剂用量以湿菌体干重计，所述湿菌体用量以反应介质体积计为0.04-0.16g/ml。
3.如权利要求1所述两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤(1)所述催化剂按如下方法制备：(1)斜面培养：将酿酒酵母接种至斜面培养基，26-35℃培养2-3天；所述的斜面培养基组成：麦芽汁8-12g/L，酵母粉2-4g/L，蛋白胨4-6g/L，葡萄糖8-12g/L，琼脂18-22g/L，溶剂为水，pH为自然；(2)种子培养：用接种针从斜面培养基中取一接种环菌体接种在含有100ml种子培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h获得种子液；种子培养基组成：葡萄糖28-32g/L，酵母粉2-4g/L，硫酸铵4-6g/L，KH2PO4 0.5-1.5g/L，K2HPO4·3H2O 0.5-1.5g/L，MgSO4 0.2-0.3g/L，溶剂为水，pH为自然；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量接种于含有500ml发酵培养基的1000ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，获得发酵液，发酵液离心，得湿菌体；发酵培养基组成同种子培养基。
4.如权利要求1所述两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤(1)所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液加入乙酸乙酯连续萃取，取乙酸乙酯层旋转蒸发除去大部分有机溶剂，加入无水硫酸钠脱水，抽滤，滤液旋转蒸发除去剩余有机溶剂，即得所述R-扁桃酸乙酯。
5.如权利要求1所述两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤(2)所述底物用量以反应介质体积计为0.015-0.09mol/L，所述催化剂用量以湿菌体干重计，所述湿菌体用量以反应介质体积计为0.01-0.1g/ml，所述助溶剂体积用量以反应介质体积计为5％。
6.如权利要求1所述两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤(2)所述催化剂按如下方法制备：(1)斜面培养：将蜡样芽孢杆菌接种至斜面培养基，26-35℃培养1-2天；所述的斜面培养基组成：葡萄糖8-10g/L，酵母膏4-6g/L，蛋白胨2-3g/L，NaCl 1-3g/L，KH2PO4 1-3g/L，K2HPO4 1-3g/L，MgSO4 0.4-0.6g/L，琼脂18-22g/L，溶剂为水，pH为7-9；(2)种子培养：用接种针从斜面培养基中取一接种环菌体接种在含有100ml种子培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，获得种子液；所述种子培养基组成：葡萄糖8-10g/L，酵母膏4-6g/L，蛋白胨2-3g/L，NaCl 1-3g/L，KH2PO4 1-3g/L，K2HPO4 1-3g/L，MgSO40.4-0.6g/L，溶剂为水，pH值为7-9；(3)将种子液以体积浓度10％的接种量接种于含有400ml发酵培养基的1000ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，获得发酵液，发酵液离心，得湿菌体；发酵培养基组成同种子培养基。
7.如权利要求1所述两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤(2)所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，反应液离心，取上清液加入乙酸乙酯连续萃取，取乙酸乙酯层旋转蒸发除去有机溶剂，加入正己烷，过滤，取滤饼，即得所述R-扁桃酸。
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